Дослідження особливостей культивування грибів-базидіоміцетів

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

ВСТУП

Гриби, як частина гетеротрофного блоку організмів, постійно перебувають під впливом різноманітних екологічних чинників середовища, перш за все, кліматичних та едафічних. Екологічний стан довкілля впливає й на сезонність їх плодоношення та поширення у регіоні. Вони дуже чутливі до змін навколишнього середовища, активно накопичують більшість токсичних речовин, викидів та залишків різної природи з субстрату, ґрунту, деревини, води, повітря тощо. Крім значної ролі в кругообігу речовин та енергії в природі, базидіоміцети знайшли широке коло застосування у різних галузях господарства: як продукт харчування, багатий на білки, вуглеводи, мінеральні речовини та вітаміни; в агрохімії - для переробки сировини та грубих кормів та як компоненти мінеральних добрив; у плодоовочеконсервному виробництві [21].

Базидіоміцети - одна з найважливіших трофічних груп грибів, які грають у лісових екосистемах величезну роль. Гриби здійснюють послідовне розкладання лігніно-целюлозних комплексів деревини, сприяють утворенню гумусу, а також трансформують у ланцюзі харчування через плодові тіла і комах-міцетофаги різні мікроелементи. Крім того, вони представляють собою цінний біологічний ресурс [34].

Зростання фармацевтичної та косметичної, харчової, текстильної та фарбувальної, паперово-целюлозної промисловості, біопалива та інших індустрій залежить від розвитку виробництва ферментів [14].

Тільки зниження собівартості ферментів дозволить збільшити масштаби їх промислового виробництва та використання в багатьох видах промисловості, сільському господарстві, біоремедіації.

Вирішенням цієї проблеми є розроблений високоефективний спосіб виробництва ферменту (лаказа і марганець-пероксидаза) з виключно високим (2-50 разів більше) виходом і низькою собівартістю, що ґрунтується на використанні дереворуйнівного гриба, рослинних відходів і специфічних індукторів синтезу ферментів [14]. Потужна позаклітинна ферментативна система грибів-базидіоміцетів дозволяє їм утилізувати важкодеградуючі полімери клітинних стінок деревини до повного розкладання. Це стимулює інтерес до інтенсивного дослідження таких грибів [33]. Традиційно вищих базидіоміцетів розглядаються як джерела різноманітних ферментів.

Метою даної роботи був пошук найбільш активних продуцентів Mn- залежної пероксидази серед вищих базидіоміцетів та порівняти їх ферментативну активність. В ході її виконання вирішувались наступні завдання:

1) Пошук нових штамів базидіальних грибів, які здатні до активного синтезу Mn-залежної пероксидази.

2) Порівняти активність Mn-залежної пероксидази базидіальних грибів при поверхневому та глибинному культивуванні.

1. ОГЛЯД ЛІТЕРАТУРИ

1.1. Види та будова пероксидази

Пероксидаза відноситься до групи двокомпонентних ферментів, у складі яких гемін, представлений протопорфирином IX в комплексі з тривалентним залізом, і поліпептидний ланцюг, який включає від 203 до 308 амінокислот ( залежно від природи формує компактну третинну структуру, представлену двома доменами - великим і малим). Фермент має розмір білкової глобули рівний 50А. Гемін нековалентний закріплений в поглибленні поліпептидного ланцюга між доменами, і утримується там за рахунок гідрофобних зв'язків і сольового містка, утвореного між залишком пропіонової кислоти геміну з однією з аміногруп апобілку[30].

Розташовуючись в гідрофобній порожнині апобілку, гемін орієнтований так, що його пропіоново-кислі залишки спрямовані до поверхні, а вінілові групи протопорфирина обернені у внутрішню частину білку[31].

Пероксид аза - глікопротеїд, для якого носієм мінливості можуть бути вуглеводні компоненти. Такий компонент може повідомляти молекулі якісно новий стан і регулювати відношення ферменту до різних змін середовища. Вуглеводна частина надає білку набагато більшу специфічність[35].

Відомо, що пероксидаза має не лише пероксидазні, але і оксидазні властивості : каталізує окислення багатьох з'єднань за рахунок неактивного молекулярного кисню. Експериментальні дані свідчать про те, що пероксидаза пов'язана з багатьма метаболічними перетвореннями, які відбуваються в клітинах. Пероксидаза бере активну участь в процесі делігніфікації деревини і регуляції процесів пероксидного окислення ліпідів (основа нових способів переробки деревини) [6].

Цей ензим має унікальні властивості: розчиняється у воді, має високу специфічність по окиснику, стійкість зберігання, широкий спектр використання, висока вартість чистого препарату [6].

Розглянемо існуючі види пероксидаз. Mn- пероксидази - неспецифічні оксидоредуктази, широко поширені в природі, беруть участь в процесі деполімеризації лігніну; що каталізують окислювальне розщеплювання багатьох ароматичних, гетероциклічних, хлорорганічних речовин. Каталітичну дію оксидоредуктази можна розділити на дві стадії: 1) ензимне окислення субстрату з утворенням реакційно-здібних проміжних продуктів - феноксильних радикалів і хінонів при окисленні фенольних груп, арильних радикалів при окисленні нефенольних субстратів або Mn³⁺ при окисленні Mn^2+; 2) пост-ензиматичні спонтанні реакції, що ініціюються вільними радикалами. Пост-ензиматична вільно-радикальна стадія істотно розширює набір субстратів, що піддаються окислювальній атаці[20].

Мn-залежна пероксидаза - гемвмістний фермент, що бере участь в деполяризації синтетичного лігніну[10]. Вона окислює фенольні з'єднання у присутності перекису водню . Уперше виділена з культуральної рідини гриба Ph. chrysosporium. Принцип функціонування ферменту полягає в окисленні Мn²⁺ до Мn³⁺ з використанням пероксиду водню в якості окисника. Активність ферменту стимулюється простими органічними кислотами, які стабілізують іон Мn^3+. В результаті взаємодії останнього з кислотами утворюється хелат, що має окислювальні властивості[10]. Регенерація Мn здійснюється зв'язаною реакцією розкладання перекису водню. За відсутності в середовищі Н₂О₂ Мn-залежна пероксидаза здатна продукувати пероксид водню[29].

Mn-пероксидаза продукується виключно грибами роду Basidiomycetеs, утворюючи колонії з родом Lignocelluloses. Природною функцієюMn-пероксидази є руйнування комплексного лігнін-полімера, забезпечуючи тим самим стійкість і міцність усім вищим рослинам. Mn- пероксидаза окислює Мn (II) іони (Mn²⁺⁾ в іони Mn (III), що мають високу реакційну здатність, - (Mn³⁺).

Мn ³⁺ проявляє стійкість до високих редокс-потенціалам за допомогою хелатних з'єднань з органічними кислотами ( тобто малоновою, оксалатною). Хелатні з'єднання Mn³⁺ насправді окислюються агентом комплексуMn-пероксидази, діючи як низькомолекулярний редокс-медіатор.

У доповненні до лігніну, хелатирований Mn ³⁺ окислює різні ароматичні і аліфатичні сполуки з втратою водню і/або електрона, результатом чого є утворення радикалів, які ініціюють величезну кількість спонтанних реакцій, таких як зв'язування кисню, реакції розщеплювання і декарбоксилювання.

Як широко відомий фермент, Mn- пероксидаза в змозі мінералізовувати органічні субстанції, включаючи органополлютанти, тобто 2,4,6 тринітротолуол (ТНТ), бензопирен, пентахлорофенол (ПХФ) і галогенированні гумінові кислоти безпосередньо до діоксиду вуглецю (ферментативне окислення).

Каталізоване Mn-пероксидазою ферментативне окислення органічних сполук сприяє утворенню вторинних медіаторів [17].

Разом з лігнін-пероксидазою і Mn-пероксидазою у деяких грибів був виявлений третій лігнінолітичний фермент - гібридна Мn-пероксидаза, що поєднує в собі властивості раніше відкритих лігнінолітичних пероксидаз. Гриб Partus tigrinus 8/18 є ефективною деструктатором лігніну, наявність лігнін пероксидази у складі його лігнінолітичного ферментного комплексу виявлено не було, проте гриб має високу активність Мn-пероксидази і лакази. Mn-пероксидаза гриба P. tigrinus 8/18 спочатку була описана як звичайна Mn- пероксидаза, були охарактеризовані молекулярні властивості ферменту і Мn^2+-залежні реакції, показана здатність окислювати НАДН в оксидазній реакції - без перекису водню . Проте, незвичайні властивості гібридної Мn-пероксидази гриба Partus tigrinus 8/18, механізм окислення НАДН, а також участь різних форм ферменту в цьому процесі детально не були вивчені[22].

Можна припустити, що найімовірніше, бактеріальні Mn- пероксидази, разом з іншими фенолоксидазами, здатні благотворно впливати на зростання і розвиток сільськогосподарських культур, за рахунок руйнування токсичних для рослин фенольних з'єднань, що знаходяться в грунті [17].

1.2. Механізм дії пероксидази

Пероксидаза здатна каталізувати реакції оксидазного, пероксидазного, оксигеназного окислення субстрату. Не маючи специфічності в реакціях індивідуального пероксидазного окислення, фермент здатний придбавати вибірковість в реакціях спільного окислення субстратів. Хоча участь ферменту в оксигеназных реакціях мало досліджена[30].

Ензим має оксидазну і пероксидазну функції, це дозволяє припустити, що в каталітичній дії ферменту можуть брати участь два незалежні активні центри пероксидази, просторово розділених, хоча і близько розташованих один від одного на молекулі ферменту [14].

Після того, як Бах і Шода отримали рослинну пероксидазу ( пероксидаза хріну) у фізіологічно чистому стані (тобто ту, що не містить інших ферментів), вони намагалися вивчити механізм дії цього ферменту. Дія пероксидази характеризувалася кількістю пурпурогалина, пірогалолу, що утворюються при окисленні, перекисом водню, і визначалося ваговим шляхом. Виявилось, що при надлишку пероксидази дія пропорційна кількості перекису водню, а при надлишку перекису водню- прямо пропорційна кількості пероксидази. Таким чином, пероксидаза і перекис водню реагують, в постійному відношенні, з утворенням проміжної речовини. Далі було встановлено, що пероксидаза споживається в процесі окислення так само, як перекис водню .

Щоб вивчити швидкість реакції, досліджували дію пероксидази на окислення йодистоводневої кислоти перекисом водню; йод, що виділявся, визначався 0,01 N розчином гіпосульфіту. Виявилось, що чим більше концентрації пероксидази, тим швидше цей фермент виводиться з ладу. Криві швидкості реакції показують на початку реакції зростання, залежне від концентрації ферменту, а потім йдуть також як і, в контрольних дослідах (без пероксидази). Якщо вибрати порівнянні стадії реакції, виявляється, що дія пероксидази поза сумнівом наслідує закон діючих мас[3].

При пероксидазному окисленні двох субстратів відзначається активація окислення одного субстрату і інгібірування іншого [26]. При цьому активації піддається окислення повільно окислюваного субстрату і часткове або повне інгібірування перетворення швидкоокислювального субстрату. Дослідження цих реакцій дозволить розібратися в можливостях механізму дії пероксидази і з урахуванням цих реакцій виявити особливості функціонування пероксидази в рослинних і тваринних тканинах, а також розширити аналітичне застосування ферменту[30].

1.3 Лігнін та його окислення

Лігнін (від лат. lignum - дерево) - складний (сітчастий) ароматичний природний полімер, який входить до складу наземних рослин, продукт біосинтезу. Після целюлози - лігнін найпоширеніший полімер на землі, який грає важливу роль в природному кругообігу вуглецю. Виникнення лігніну відбулося в ході еволюції при переході рослин від водного до наземного способу життя для забезпечення жорсткості і стійкості стебел і стовбурів (подібно хітину членистоногих).

Як відомо, рослинна тканина складається головним чином з целюлози, геміцелюлози та лігніну. У деревині хвойних порід міститься 23-38% лігніну, в листяних породах - 14-25%, в соломі злаків 12 - 20% від маси. Лігнін розташований в клітинних стінках і міжклітинному просторі рослин і скріплює целюлозні волокна. Разом з геміцелюлозами він визначає механічну міцність стовбурів і стебел. Лігнін забезпечує герметичність клітинних стінок (для води і поживних речовин) і завдяки вмісту в ньому фарбникам визначає колір одеревенілій тканині.

Лігнін міцно фізично і хімічно інкорпорований в структурі рослинної тканини та ефективне виділення його звідти промисловими методами представляє дуже складну інженерну задачу. Прийнято розрізняти протолігнін, - лігнін міститься всередині рослини в його природній формі, і технічні його форми, отримані витягом з рослинної тканини за допомогою різних фізико-хімічних методів. Лігнін не виготовляють спеціально; він і його хімічно модифіковані форми є відходами біохімічного виробництва. У ході фізико-хімічної переробки рослинної тканини молекулярна маса лігніну зменшується в кілька разів, а його хімічна активність зростає.

У гідролізної промисловості отримують порошковий, так званий гідролізний лігнін. У целлюлозном виробництві утворюються водорозчинні форми лігніну. Існують дві основні технології варіння целюлози, більш поширене сульфатне варіння (лужне) і менш вживана сульфитне (кислотне) варіння.

Лігнін отримується в сульфатному виробництві, так званий сульфатний лігнін у великій мірі утилізується в енергетичних установках целюлозних заводів.

У сульфітному виробництві утворюються розчини сульфітних лігнінів (лігносульфонатів), частина яких накопичується в лігнохраниліщах, а частина йде зі стічними водами підприємства в річки і озера.

У хімічному сенсі лігнін - поняття умовне і узагальнююче. Як немає двох однакових людей, так і немає двох однакових лігнінів. Прийнято вважати, що молекула лігніну складається з атомів вуглецю, кисню і водню. У літературі зустрічається декілька варіантів формули лігніну.

Загальною структурною одиницею всіх видів лігніну є фенілпропан (C₉H₁₀), а відмінності пов'язані з різним вмістом функціональних груп. Відповідно з сучасними знаннями лігнін - складний тривимірний сітчастий полімер, який має ароматичну природу, що виходить в результаті поліконденсації кількох монолігнолів - коричних спиртів (паракумарового, конеферілового, сінапового) (рис. 1.1).



Рис. 1.1. Мономери лігніну (1-паракумаровий спирт; 2-конеферіловий спирт; 3-сінаповий спирт).

Лігнін практично не засвоюється при травленні у вищих тварин; в природі його переробкою зайняті різні гриби, комахи, земляні хробаки і бактерії. Головну роль у цьому процесі відіграють гриби-базидіоміцети. До них відносять багато грибів, що живуть як на живих, так і на мертвих деревах, а так само гриби, які розкладають листовий опад. Серед лігнінолітичних грибів є їстівні (опеньок, глива, печериця).

Деградація полімерного лігніну відбувається під впливом позаклітинних ферментів-оксидоредуктаз грибів. До даних ферментам в першу чергу відносяться лінінолітичні пероксидази: лігнін-пероксидаза і Mn-пероксідза, а так само позаклітинна оксидаза - лакказа. Так само лігнінолітичний комплекс грибів містить допоміжні ферменти, в першу чергу виробляють перекис водню для пероксидаз і активні ферми кисню. Сюди включають такі ферменти як піранозооксідаза, глюкзооксідаза, гліоксальоксідаза, алклгольарілоксідаза і целлобіозозодегідрогеназа.

Основним продуктом розкладання лігніну в природі є гумус. Декомпозиція лігніну в природних умовах відбувається в присутності інших елементів рослинної тканини - целюлози і геміцелюлози[11].

В даний час в усьому світі ведеться інтенсивна розробка технологій на основі базидіальних лігнінолітичних грибів та їх ферментів як для обробки лігніноцеллюлозних матеріалів, так і для утилізації лігнінвмісних відходів, що накопичуються в природі у величезних кількостях [36].

Дереворуйнівні базидіоміцети відрізняються високим вмістом окисно-відновних ферментів, в першу чергу пероксидази, Мп-пероксидази, тирозинази і лакказу [11].

Мn-залежна пероксидаза - гемвмістний фермент , що бере участь в деполяризації синтетичного лігніну. Вона окисляє фенольні сполуки в присутності перекису водню. Проявляє активність в середовищі, що містить Мn, має молекулярну масу 46 кДа. Вперше виділена з культуральної рідини гриба Ph. chrysosporium. Принцип функціонування ферменту полягає в окислення Мn^{2 +} до Мn^{3 +} з використанням пероксиду водню в якості окислювача. Активність ферменту стимулюється простими органічними кислотами, які стабілізують іон Мn^{3 +.} У результаті взаємодії останнього з кислотами утворюється хелат, що володіє окислювальними властивостями [36]. Регенерація Мn здійснюється сполученою реакцією розкладання перекису водню. При відсутності в середовищі Н₂0₂ Мn-залежна пероксидаза здатна продукувати пероксид водню.

LiP, MnP і лакказу вважаються ключовими ферментами в окислюванні фенольних і нефенольних структур лігніну до катіонрадікалов, що піддаються потім серії неферментативних реакцій, які включають розщеплення С-С і С-О-зв'язків і фрагментацію тривимірної сітки лігніну. Існує кілька думок про дію ферментів на лігнін. Деякі дослідники стверджують, що деполимеризация матриці лігніну та інших високомолекулярних субстратів опосредуется низькомолекулярним деметоксіфенільним медіатором типу вератрола, утворюючим під дією ферменту стабільну катіонрадикальну частинку [36].

Дещо інший характер носить ферментативне окислення діметоксілірованних ароматичних сполук. Так, 1,2,4,5-тетраметоксібензол окислюється пероксидом водню в присутності всіх вищерозглянутих ферментів через катоіонрадікал до 2,5-диметокси-п- і 4,5-диметокси-о-бензохинона в співвідношенні 4: 1 з виділенням двох молей метанолу на моль субстрату. При цьому у разі пероксидази хинон атоми кисню запозичуються з молекул води, тобто відбувається відщеплення метоксильної групи як цілого. Взагалі, катіонрадікали є короткоживущими проміжними продуктами при окислюванні ді-і тетраметоксібензолов та їх похідних. Їх освіта включає як ферментативні так і цілий ряд послідовних неферментативних стадій.

Прикладом в даному випадку може служити окислення 3,4-діметоксібензілового спирту (вератрола) до вератрової альдегіду. В процесі окислення зачіпає не ароматичне кільце, а, в основному, бічний ланцюг. Утворений катіонрадікал піддається неферментативним перетворенням в результаті нуклеофільної атаки молекулою води: відбувається відщеплення протона з утворенням бензильного радикала [32].

В аеробних умовах цей радикал може приєднувати молекулу кисню, утворюючи при цьому оксібензілпероксірадікал. Розкладання останнього дає супероксіданіон і вератральдегід (до 83%).

Таким чином, при ферментативному окисленні ароматичних субстратів кисень відповідає за утворення пероксирадикалів, які можуть потім залучати до ланцюгової неферментативної реакції нові молекули субстрату, значно прискорюючи його перетворення. Але роль кисню в даному процесі особливо важлива, так як необхідно долати явище рекомбінації вуглецевих радикалів, утворених при викиді протона катіонрадікаламі - безпосередніми продуктами ферментативного окислення [32].

1.4 Проблема субстратної специфічності пероксидаз

гриб пероксидаза ферментативний культивування

Кожен фермент має свій власний профіль субстратної специфічності, і нині, на жаль, не можна заздалегідь передбачити, яка буде активність ферменту по відношенню до вибраного донора електронів. Прокаріотичні та грибні пероксидази на додаток до класичних штучних донорів електронів мають свої специфічні субстрати. У лігнін-пероксидазі Trp171 грає роль специфічного центру зв'язування вератрового спирту (модельний субстрат, що імітує частину молекули лігніну)[41].

Мутант Mn-пероксидази Ser168Trp, імітуючий лігнінпероксидазу, активний по відношенню до вератрового спирту[48].

Серед субстратів пероксидази зустрічаються функціонально активні речовини (аскорбінова кислота, сечова кислота, адреналін, НАДН, люмінол, феноли, ИУК та ін.). Пероксидаза бере участь у фотосинтезі, регуляції зростання рослин і лігніфікації [16].

Існує три групи субстратів. У разі першої групи, механізм їх окислення включає перенесення феррильного кисню на субстрат, для якого потрібна пряма взаємодія субстрату з феррильным киснем. Підвищена активність перенесення кисню в мутантах HRP His42Ala, His42Glu і в подвійному мутантові His42Val/Arg38His служить прямим доказом більшої відкритості дистальної кишені при введенні вказаних мутацій [44]. Субстрати другої групи зв'язуються поблизу активного центру ферменту. Результати білкової інженерії HRP і визначення кристалічної структури комплексів ферменту з інгібітором і одним з субстратів вказують на доступність активного центру для фенольних субстратів. У третій групі субстратів, якщо припускати відсутність специфічних взаємодій субстрату з активним центром, очевидно, що субстратна специфічність повинна визначатися редокс-потенціалами субстратів і окислених форм ферменту і їх стабільністю, оскільки каталітичний процес є окислювально-відновною реакцією.

Субстратом Mn-пероксидази (MnP) служить іон двовалентного марганцю, локалізований усередині молекули ферменту . Спрямований мутагенез залишків, що координують іон марганцю, що знаходиться на відстані 11 Е від заліза гема, знижує каталітичну активність ферменту . Витончена робота по спрямованому мутагенезу Мn- пероксидази, виконана в лабораторії Оста, показала що заміна залишку Ser168, що займає в MnP позицію аналогічну залишку Trp171 в лігнін-пероксидазі, на залишок триптофану дозволяє створити центр зв'язування вератрового спирту в Мn- пероксидазі. На відміну від нативного і рекомбінантного ферменту дикого типу, мутантна форма МnP Ser168Trp не лише повністю зберігає активність по відношенню до Mn^2+, але і окислює численні субстрати LIP - як невеликі молекули, так і полімери. Введений в молекулу MnP залишок триптофану став центром для ефективного окислення різних субстратів LIP, які для нативної форми MnP є поганими субстратами або не є такими взагалі. Функціональна подібність між мутантною формою MnP Ser168Trp і лігнін-пероксидазою служить доказом виняткової ролі Trp171 в субстратній специфічності LiP[47].

1.5 Роль пероксидаз

Присутність ферменту в хлоропластах вказує на його участь в окислювально-відновних реакціях в процесі фотосинтезу, а виявлення пероксидази в мітохондріях - на участь в енергетичному обміні клітини. Значна пероксидазна активність визначена в очищених препаратах рибосом, і, як вважають автори, фермент міцно пов'язаний з їх структурою, являючись, мабуть, складовою частиною цих органел. Специфічний набір ізопероксидаз є присутнім в паренхімних клітинах бульб картоплі, визначаючи диференціацію цих клітин. Максимальна пероксидазна активність виявлена в епідермісі і судинно-волокнистих пучках- тканин чайної рослини.

На підставі цитохімічних досліджень пероксидазна активність була виявлена в цитоплазмі, клітинній стінці, хромосомах і ядерцях. У молодих клітинах кінчиків лука найвища активність пероксидази зосереджена в ядрах. Це свідчить про можливу участь пероксидази в специфічній ядерній функції, а оскільки частина ізоензимів є лужними білками, то не виключено, що вони можуть виконувати функцію, подібну до функції гістонів. Дані про роль пероксидази в клітинах, отримані на основі цитохімічних досліджень, знаходять все більше підтверджень і на біохімічному рівні[3]. Питання про можливий реакційний зв'язок пероксидази з білками має принципове значення для розуміння ролі цього ферменту в зараженому організмі як тварин, так і рослин. Антивірусна дія системи пероксидази хріну-йодид калія-перекись водню було випробувано для вірусу мозаїки південних бобів, який швидко інактивувався при відповідній обробці. Оскільки основними субстратами ферменту пероксидази є фенольні з'єднання, то система пероксидаза-йодид калія-перекись водню і феноли можуть складати частину загального захисного механізму рослин. Тому нині потрібні пошук і розробка тестів оцінки функціональної активності імунних реакцій рослинних організмів, в яких задіяна і пероксидаза[3].

У основі дихання лежить ряд ферментативних окислювальних і окислювально-відновних реакцій, що послідовно змінюють один одного в довгому ланцюзі хімічних перетворень. Мимовільне окислення, як і усі повільно протікаючі процеси, доступно дії каталізаторів, що у багато разів збільшують його первинну швидкість. У організмах такими каталізаторами є окислювальні ферменти, і на їх вивченні зосередив свою увагу А. Н. Бах. Він виділив ці ферменти з великого числа різноманітних рослинних об'єктів і піддав препарати такому досконалому очищенню, яку тільки дозволяла та, що існувала тоді лабораторна техніка. Разом з оксидазою, що виробляє окислення за допомогою кисню повітря, А. Н. Бах встановив широке поширення у рослинному світі і іншого окислювального ферменту - пероксидази(рослинна пероксидаза). Її фізіологічна роль до робіт А. Н. Баха представлялася абсолютно загадковою, оскільки вона окислює тільки за рахунок перекису водню, а це з'єднання вважалося невластивим живій природі [3].

Нині у всьому світі ведеться інтенсивна розробка біотехнології на основі лігнолітичних ферментів базидіальних грибів як для обробки лігноцеллюлозних матеріалів, так і для утилізації лігніновмістних відходів. Оскільки згідно з існуючими уявленнями основна роль в процесах біодеградації природних полімерів і ксенобіотиків базидіоміцетами належить позаклітинним ферментам, та все більша увага приділяється дослідженню основних ферментів, що входять до складу мультиферментного екстрацелюлярного комплексу : лакази, лігнін-пероксидази і Mn- пероксидази [45].

Утворення лігнинів властиве усім судинним рослинам. Їх синтез і включення у вторинну клітинну стінку рослин, що вийшли на сушу, стали важливим еволюційним кроком, що привів до формування сучасної наземної рослинності. По своїй хімічній природі лігніни є нерегулярними тривимірними полімерами фенольної природи. Їх попередниками виступають оксикоричні спирти. Під дією пероксидази клітинних стінок і перекису водню, що утворюється, оксикоричні спирти окислюються до феноксильних радикалів. Останні довільно, без участі ферментів, полімеризуються. При цьому фібрили целюлози і геміцелюлози залучаються до утворення клітинної стінки. Так, в деревині хвойних порід клітинна стінка на 20-35 % складається з лігніну, целюлози припадає на частку 40 % і на долю геміцелюлози - 30 %, Лігніни не є речовинами з певним складом. Навіть у одній рослині, узяті з різних його частин, вони мають відмінності. Це властиво також і різновіковим рослинам одного виду [37].

Клітинні стінки вищих рослин можна порівняти із залізобетоном, в який поміщені целюлозні волокна, матрикс і лігнін. Нас цікавить останнє з'єднання, важливою властивістю якого є його стійкість до різних мікроорганізмів. І другий аспект - це те, що утворення лігніну йде за участю поліфенолоксидази, лакази (фенолоксидази) і пероксидази [19].

Трудність вивчення процесу лігніфікації в тому, що лігнін не є індивідуальним з'єднанням строго певного складу. По своїй хімічній природі він є тривимірним полімером, до складу якого входять з'єднання різної фенольної природи. Синтез лігніну йде через шикимову кислоту, а також включає з'єднання С6-СЗ-ряда, до якого відносяться оксикоричні спирти : кумаровий, коніфериловий і синаповий. З числа оксибензойних кислот ванілінова і особливо бузкова кислоти у вигляді ефірів також включаються в лігнін [15]. В цьому випадку для з'єднань лігніну характерний складноефирний зв'язок, що утворюється за рахунок фенольної гідроксильної групи однієї молекули фенолкарбонової кислоти і карбоксильної групи інший. Так, деякі фенольні з'єднання, наприклад п-кумаровая і ферулова кислоти, можуть бути пов'язані ефірними зв'язками з лігнінами, а їх перетворення йдуть за участю ферменту пероксидази, вбудованого в клітинну стінку. Попередниками синтезу лігніну у трав'янистих рослин є фенілаланін і тирозин. Цей короткий перелік молекул, що беруть участь в утворенні лігніну, у тому числі поліфенолоксидаза, лаказа і пероксидаза, які каталізують утворення цього складного полімерного з'єднання клітинних стінок, дає змогу говорити про складність розшифровки метаболічного взаємозв'язку різних сполук в процесі лігніфікації [3].

1.6 Важливість деструкції деревини під дією ферментів базидіальних грибів

Деревина є природним полімерним композиційним матеріалом, основними компонентами якого є високомолекулярні з'єднання. Вона є цінною поновлюваною вуглецьвмісною сировиною, хімічною переробкою якої отримують більше 20 тисяч найменувань різних матеріалів, продуктів і виробів.

Хімія деревини є теоретичною основою процесів хімічної технології виробництва целюлози, паперу, лісохімічних продуктів, продуктів гідролізу, деревних плит і пластинок, захисту деревини, матеріалів і виробів деревообробки [1].

Зростання фармацевтичної і косметичної, харчової, текстильної і фарбувальної, паперово-целюлозної промисловості, біопалива і інших індустрій залежить від розвитку виробництва ферментів. Розвиток ринку ферментів залежить від двох взаємозв'язаних чинників - можливості і економічної доцільності їх застосування і можливості їх промислового виробництва. Для використання цих ферментів в індустріальних маштабах потрібна їх величезна кількість. Проблемою є низька врожайність отримуваних біоферментів, що обумовлює їх високу собівартість. Тільки пониження собівартості ферментів дозволить збільшити масштаби їх промислового виробництва і використання у багатьох видах промисловості, сільському господарстві, біоремедиації.

Вирішенням цієї проблеми є розроблений високоефективний спосіб виробництва ферменту (лаказа і марганець-пероксидаза) з виключно високим (2-50 разів більше) виходом і низькою собівартістю, що ґрунтується на використанні дереворуйнівного гриба, рослинних відходів і специфічних індукторів синтезу ферментів.

Здатність грибів руйнувати лігніновий компонент деревини відома давно. Найбільш активними деструкціями лігніну в природі є гриби білої гнілі, які утворюють гетерогенну групу, що складається переважно з базидіоміцетів, що відносяться до сімейств Agaricaceae, Corticaceae, Pleurotaceae, Strophariaceae і декількох аскоміцетів [14]. Оскільки в якості лігнінолітиків вивчені переважно базидіоміцети, то у вузькому сенсі під грибами білої гнілі зазвичай розуміють лігнінолітичні базидіоміцети. Найдетальніше вивчені Phanerochaete chrysosporium, Coriolus versicolor і Pleurotus ostreatus [28].

Лігнін - глобулярний нестереорегулярний нерозчинний полімер. Його молекулярна маса більше 10 000. Складається із залишків фенілпропана, сполучених декількома типами вуглець - вуглецевих і ефірних зв'язків. Молекули цієї ароматичної речовини при утворенні лігніну з'єднуються один з одним випадковим чином за допомогою різних хімічних зв'язків що не подаються хімічному розщеплюванню. У рослин лігнін утворює комплекс з геміцелюлозою, в яку поміщені пучки, що проводять. Лігнін обумовлює ригідність рослин, а також їх стійкість до механічних ушкоджень і дії мікробів [7].

Дереворуйнівні базидіоміцети відрізняються високим вмістом окислювально-відновних ферментів, в першу чергу пероксидази, Мn-пероксидази, тирозинази і лакази [26]. Вищі базидіоміцети по складу лігнолітичних ферментів об'єднують в наступні групи.

До першої групи увійшли гриби, що мають лаказу, лігнін- і марганець-пероксидазну активністю Phellinus ріпі, Trametes hirsuta, Bjerkandera adusta, Phanerochaete chrysosporium.

Друга група представлена грибами Lentinus edodes, Panus tigrinus, P. chrysosporium, Dichomitus squalens, Mn-, що володіють, пероксидазною і лакказной активністю.

Третя група характеризується лігнінпероксидазною і лакказною активністю - гриби Trametes versicolor, Phlebia radiate, Pleurotus ostreatus.

Гриби, що становлять четверту групу визначені як Pleurotus ostreatus, P. eringii, В. adusta і для них характерна лаказа, арилалкогольоксидаза і інші ароматичні оксидази [24].

Люди давно і широко використовують гриби як продукт харчування. Гриби багаті білками: в їх сухій речовині 20-30% припадає на частку чистого білку. У них містяться жири, мінеральні речовини, мікроелементи. До останніх відносять залізо, кальцій, цинк, йод, калій, фосфор. У сироїжках протеолітичні ферменти базидіоміцетів давно і успішно застосовуються в харчовій промисловості. Наприклад, з культур Irpex lacteus, Fomitopsis pinicola і Russula decolorans виділені, детально вивчені і використовуються в сироварінні протеїназы, замінюючі сичужний фермент. Також є перспективним використання протеїназы плодових тіл гливи звичайної . Сироїжка червона містить фермент, сприяючий згортанню молока. Ленінградські учені і вологодські фахівці створили ферментний препарат з сироїжки для виготовлення високоякісних сортів сиру, назвавши його руссулін - від її латинської родової назви Руссула. Він замінює сичужний фермент у виробництві сирів. Активність руссуліну дуже висока: півграма за півгодини зтворожує 100 л молока [18].

Інженерне втілення отримали біопластики, для склеювання яких використовують культуральне середовище гриба. До теперішнього часу в FPL розроблена система обробки технологічної тріски, побудована на основі використання двох стрічкових конвеєрів. Тріска, переміщаючись по першому конвеєру, піддається паровій стерилізації. На другому конвеєрі вона остуджується очищеним повітрям і піддається обробці спеціальною суспензією, що містить культуру гриба і харчові регулятори. Після цих процедур тріска поступає у бурти, де проходить двотижневу ферментацію. За вказаною схемою співробітниками FPL був закладений великомасштабний експеримент з 50 тонною деревної тріски, підсумки якої продемонстрували високу відтворюваність результатів, отриманих в лабораторних умовах. Таким чином, співробітники FPL довели можливість використання біопластика в промислових масштабах [8].

Найбільший інтерес для консервації з використанням базидіальних грибів представляють тирса, кородеревинні відходи, тріска зважаючи на підвищений, в порівнянні з іншими відходами, вміст лігніну, скоп, активні надмірні або зважаючи на наявність в них підвищеної концентрації небезпечних хлорорганічних сполук - діоксин. Для цих відходів базидіоміцети є універсальним біоконсерватором, що забезпечує не лише деградацію лігніну і целюлози, але і діоксину. При розробці технологій рекультивації забруднених земель відходами ЦБП особливий інтерес до базидіальних грибів викликається їх стійкістю до присутності в середовищі важких металів, що дозволяє використати ці гриби як для очищення грунтів, забруднених важкими металами, так і при комплексних забрудненнях. Згідно з даними, отриманими в роботі, базидіальний гриб T. versicolor мав високу стійкість до Cd, Zn, Ni, Co, Cr, Mo, Pb, Hg, Sn. Крім того, поглинання металів грибами може відбуватися не лише внаслідок адсорбційних процесів, як у разі бактерій, але також і завдяки активному транспорту металів в клітини [42,43].

Базидіальні гриби можуть використовуватися при очищенні стічних вод для розкладання пульпи, що утворюється на целюлозно-паперових комбінатах (ЦПК), і різних барвників, присутніх в стічних водах. Зокрема, штами базидиальных грибів знайшли застосування при обробці стічних вод ЦПК і твердих відходів ЦПК, що містять хлорорганічні ароматичні сполуки [38].

Основна функція базидіоміцетів в природі -разкладання лігніну і целюлози, і саме ця здатність привертає пильну увагу дослідників як з точки зору розуміння механізмів цього процесу, так з метою розробки біотехнології утилізації деревних і рослинних відходів.

Підвівши підсумки, можна сказати, що нині використання базидіальних грибів в технологіях переробки і утилізації техногенних утворень і відходів можливо по наступних основних напрямах:

- очищення забруднених вод (у тому числі стічні води текстильної промисловості і ЦПК; води, забруднених нафтовими вуглеводнями; стічні води, що утворюються при виробництві маслинової олії; рідкі відходи, що утворюються при виробництві цукру з цукрового буряка або цукрової тростини; водна суспензія, що залишається після коагуляції латексу при виробництві гуми; стічні води, що містять важкі метали і радіонукліди);

- очищення забруднених ґрунтів, у тому числі, забруднених ксенобіотиками і, важкими металами;

- розкладання важкодеградуючих субстратів, у тому числі лігнін і лігнін-целюлозних відходів, низькоенергетичного вугілля і синтетичних полімерів.

2. ОБ'ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Дослідження проводили на 12 штамах таких вищих базидіальних грибів, як (таблиця 2.1.):

- Ірпекс молочно-білий (Irpex lacteus) - вид грибів, що відноситься до роду Ірпекс (Irpex) сімейства Фанерохетові (Phanerochaetaceae). Один з найбільш широко поширених грибів у світі, викликає білу гниль деревини. Плодові тіла однолітні, розпростерті або з невеликим шапинкових відгином, черепитчасто зливаються, шкірясті. Верхня поверхня відгину борозниста, опушена, біла або сірувата, потім буріє. Край плівчастий, часто більш світлий. Тканина білого кольору, тонка, до 0,5 мм (рідко до 2 мм) завтовшки.

- Дедалеопсіс горбистий (Daedaleopsis confragosa). Довжина плодового тіла 3-18 см, ширина - 4-10см, часто буває веєроподібним, з тонким краєм, сидячим, поодиноким або черепитчасто розташованим, корковим. Поверхня радіально-зморшкувата, іноді бородавчаста, з концентричними зонами, рудувата, жовто-бура. Зустрічається протягом усього року на пнях і валежних стовбурах листяних порід, особливо часто на вербі.

- Стереум жорстковолосистий (Stereum hirsutum). Плодові тіла дрібні, до 2-3 см завдовжки, тонкі, розпростерто-відігнуті, зазвичай численні. Верхня поверхня сіра або жовтувато-сіра, жорстко-волосиста, зі слабким помаранчевим відтінком, при висиханні - вицвітає. Зустрічається дуже широко на деревині листяних порід. Уражена деревина спочатку жовтіє, потім блідне; процес гниття відбувається швидко, особливо за підвищеної вологості повітря.

- Трутовик різнобарвний, або Траметес різнобарвний (Trametes versicolor) - широко поширений гриб-трутовик, сапрофіт. Плодове тіло: багаторічне, довжиною 5-8 см і шириною 3-5 см, напівкругле, веєроподібне, рідше розеткоподібне (в торці стовбура), сидяче, прикріплене боком, часто зросле, іноді звужене в основі, тонке, шовковисте, оксамитове зверху, з концентричними тонкими звивистими різнокольоровими зонами поперемінно ворсистими і шовковистим або майже голими і з мінливим забарвленням від майже чорного, блакитно-бурого до коричневого, охряно-жовтого, сіро-жовтого, часто зі світлим краєм і зеленуватим підставою (після висихання часто майже біла). Зростає з середини червня до пізньої осені (кінець жовтня) на мертвій деревині, стосах, пнях листяних дерев (береза, дуб), рідко на хвойних (ялина), черепицеподібними групами, зустрічається часто. Росте швидко, викликає білу серцевину гниль.

- Трутовик жорстковолосистий (Trametes hirsuta). Плодові тіла однолітні, зимуючі, зазвичай у вигляді напівкруглих або ниркоподібно- веероподібних сидячих капелюшків, рідше розпростерто-відігнуті або розеткоподібні, прирослі до дерева невеликим підставками, діаметром 4 - 12 см, як правило, плоскі, тонкі (товщиною 0,3 - 1, 5 см), поодинокі або зібрані в групи. Поверхня жорсткошорстна або щетиниста, концентрично зонально-борозниста (зони рідкісні), від білуватої, попелясто-сірогї до жовтувато-або коричнево-сірох, іноді з зеленуватим відтінком від водоростей. Зростаючі пучками відносно довгі волоски (до 4-5 мм) вертикальні, грубі, жорсткі, більш-менш ламкі, сірі.

- Край гострий, тонкий, іноді хвилястий або лопатєвий. Мешкає на пнях, гілках, сухостійних і відмираючих стовбурах листяних дерев (черемха, вільха, береза, верба, дуб, горобина, бук, граб, осика, тополя, яблуня, груша та ін.). Росте як в тіньових лісах (особливо часто в заростях черемхи), так і на лісових галявинах, вирубках. Може розвиватися в дерев'яних будівлях і на парканах, розташованих поблизу крайки лісу. Зустрічається протягом усього теплого періоду, в м'якому кліматі цілий рік.

- Меріпілус гігантський (Meripilus giganteus) - гриб роду Meripilus сімейства Меріпілові. Фітопатогени, викликає «білу гниль» у широколистяних дерев, як правило, у бука. Поширений по всій північній півкулі, часто зустрічається в Європі. Зростає біля основи стовбурів і пнів багатьох листяних дерев, з яких особливо воліє бук і дуб, як виняток зустрічається на хвойних. Часто плодові тіла утворюються на ґрунті з трав'янистим покривом в зоні колишніх, зруйнованих пнів.

Таблиця 2.1. Штами грибів, використаних для проведення досліджень

№	Гриби	Штами	Рік ізоляції	Дерево-хазяїн
1	Irpex lacteus	K-1	2002	Fraxinus excelsior
2	Irpex lacteus	A-Дoн-02	2002	Prunus armeniaca
3	Irpex lacteus	Д-1	1997	Prunus cerasus
4	Daedaleopsis confragosa	AnSc-1	2008	Salix alba
5	Stereum hirsutum	S.hirs	2012	Populus tremula
6	Trametes versicolor	T.v	2012	Fraxinus excelsior
7	Irpex lacteus	Il-b	2011	Populus alba
8	Irpex lacteus	Il-m	2012	Fraxinus excelsior
9	T. hirsuta	H.a	2012	Prunus padus
10	T. hirsuta	3	2011	Betula pendula
11	T. versicolor	4	2011	Fraxinus excelsior
12	Meripilus giganteus	M.gig	2012	Quercus robur

Штами культивували на живильному середовищі Чапека наступного складу (г/л): NaNO₃ - 2; K₂HPO₄ -1; MgSO₄-0.5; KCl-0.5; FeSO₄-сліди; MnSO₄-0.1; лігносульфанат - 1. pH живильного середовища доводили до 5 за допомогою 10-% HCl. Культивування культур проводили протягом 14 діб за температури 30-32 °C.

Проводили глибинне та поверхневе культивування. Глибинне культивування здійснювалося за допомогою лабораторної качалки зі швидкістю 100 хитань на хвилину.

В ході визначення активності Mn-пероксидази використовували метод Керстена-Кірка. Виготовляли реакційну суміш, яка містила 50 mM сукцинатний буферний розчин (pH 6.0), 0,01 %-ий розчин конго червоного, 10 мкл розчину ферменту. Дослідження проводили у трикратній повторності. Статистичну обробку здійснювали методом дисперсійного аналізу, порівняння середніх -- методом Дункана.[27]

3. РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

3.1 Ферментативна активність за поверхневого культивування

За поверхневого культивування досліджувані штами базидіальних грибів проявляли різну ферментативну активність на 7 та 14 добу.

Найбільшу активність проявили штами К-1 I. lacteus (7 доба - 22,7 од/мг білка; 14 доба - 15,9 од/мг білка), А-Дон-02 I. lacteus (7 доба 13,1 од/мг білка; 14 доба - 14,6 од/мг білка), Д-1 I. lacteus (7 доба - 20, 017 од/мг білка; 14 доба - 10,060 од/мг білка), Іl-m I. lacteus (7 доба - 14, 477 од/мг білка; 14 доба - 8.467 од/мг білка ) та Іl-b I. lacteus (7 доба -12, 033 од/мг білка; 14 доба - 7, 103 од/мг білка).

Можна помітити, що активність синтезу Mn- залежної пероксидази цих штамів на 14 добу зменшується ( крім штаму А- Дон-02 I. Lacteus ).

В штамах Дон-02 I. lacteus, AnSc-1 Daedaleopsis confragosa, T.vers T. versicolor , S.hirs Stereum hirsutum, H.an T. Hirsuta , 3 T. hirsute , 4 T. versicolor, M.gig Meripilus giganteus активність Mn- залежної пероксидази значно менша, що свідчить про те, що їм краще підходить глибинне культивування (рис. 3.1.).

В цілому, активність синтезу Mn- залежної пероксидази варіювала від 22, 7 од/мг білка (К-1 I. lacteus) до 0,0 од/мг білка (H.a T. hirsuta).

Пояснити те, що ферментативна активність відрізнялась на 7 та 14 добу можна тим, що різні штами грибів неоднаково пристосовуються до нових умов. У всіх штамів швидкість процесу пристосування відрізняється.

Штами одного й того ж виду можуть вести себе по різному, тому й проявляється різна ферментативна активність штамів.

Пояснити це можна тим, що гриби одного виду ростуть на різних деревах при різних умовах, тому отримують різну кількість поживних речовин. Виходячи з цього, гриб синтезує різну кількість ферментів. В даному випадку найкращі результати показали штами грибу Irpex lacteus. Це можна пояснити тим, що гриби цього виду, маючи дуже розвинену ферментативну систему, вражають білою гниллю дерева.

Рис. 3.1. Активність Mn-залежної пероксидази при поверхневому культивуванні

3.2 Ферментативна активність при глибинному культивуванні

При глибинному культивуванні такі штами, як К-1 I. lacteus (7 доба -16, 3 од/мг білка; 14 доба - 10, 9 од/мг білка), А-Дон-02 I. lacteus (7 доба - 15, 3 од/мг білка; 14 доба - 17, 5 од/мг білка), Д-1 I. lacteus (7 доба -14, 1 од/мг білка; 14 доба - 13, 2 од/мг білка), AnSc-1 Daedaleopsis confragosa (7 доба - 12, 1 од/мг білка; 14 доба - 5, 1 од/мг білка), Іl-m I. lacteus (7 доба - 15, 4 од/мг білка; 14 доба - 12, 4 од/мг білка) та Іl-в I. lacteus (7 доба -15, 0 од/мг білка; 14 доба - 8, 8 од/мг білка) проявили більшу активність синтезу Mn-залежної пероксидази, на відміну інших. На 14 добу активність впала у штамах К-1 I. lacteus , Д-1 I. lacteus , Іl-в I. lacteus , Іl- m I. lacteus (рис 3.2.). Пояснити те, що ферментативна активність відрізнялась на 7 та 14 добу можна тим, що різні штами грибів неоднаково пристосовуються до нових умов.

В цілому ферментативна активність варіювала від 16,3 од/мг білка (К-1 I. lacteus ) до 0,2 од/мг білка ( штам 4 T. versicolor). Це можна пояснити тим, що в різних штамах накопичується різна кількість ферментів.

В даному випадку найкращі результати показали штами грибу Irpex lacteus. Це можна пояснити тим, що гриби цього виду, маючи дуже розвинену ферментативну систему, вражають білою гниллю дерева.

Рис. 3.2. Активність Mn-залежної пероксидази при глибинному культивуванні

3.3 Порівняння ферментативної активності при поверхневому та глибинному культивуванні

Порівняємо активності кожного штаму при глибинному та поверхневому культивуванні.

Штам К-1 I. lacteus проявляє більшу активність при поверхневому культивуванні ( на 7 добу різниця 6, 3 од/мг білка; на 14 добу 5, 0 од/мг білка). В обох випадках ферментативна активність падає на 14 добу.

Штаму А-Дон-02 I. lacteus більше підходить глибинне культивування, Д-1 I. lacteus - поверхневе, AnSc-1 Daedaleopsis confragosa - глибинне, T.vers T. versicolor - глибинне, S.hirs Stereum hirsutum - глибинне,Іl-в I. lacteus - глибинне, Іl-m I. lacteus - глибинне, H.an T. hirsuta - глибинне, штаму 3 T. Hirsute - глибинне, штаму 4 T. versicolor - глибинне та штаму M.gig Meripilus giganteus - поверхневе.

Підвівши підсумки можна сказати, що для більшості штамів зібраних базидіоміцетів краще підходить глибинне культивування. А гриб, який найкраще синтезує Mn- залежну пероксидазу - це Irpex lacteus. Всі штами цього грибу мають високу ферментативну активність, в порівнянні з іншими.

Метод глибинного культивування володіє цілим рядом переваг в порівнянні з поверхневим вирощуванням. Механічне перемішування і безперервна аерація створюють сприятливі умови для доступу поживних речовин і кисню до всіх клітин міцелію, забезпечуючи однаково сприятливі умови для росту і накопичення продуктів метаболізму. Глибинне вирощування проводиться строго в певних умовах, відповідних фізіологічним потребам гриба, з дотриманням стерильності на всіх етапах ферментаційного процесу. Глибинний процес більш економічний, так як при цьому скорочується термін ферментації і збільшується кількість одержуваного продукту.

4. ПОРІВНЯННЯ ОТРИМАНИХ РЕЗУЛЬТАТІВ З ЛІТЕРАТУРНИМИ ДАНИМИ

Для отримання даних щодо доцільності використання отриманих результатів у біотехнології та сучасній науці, було проведено порівняння значень із літературними (див. табл. 4.1.).

Таблиця 4.1. Порівняння отриманих результатів із даними літератури

№	Препарат	Організм-продуцент	Активність (од/мг)	Література
1	K-1	Irpex lacteus	22,7
2	A-Дoн-02		15,3
3	Д-1		20,0
4	Il-b		15,0
5	Il-m		15,6
6	AnSc-1	Daedaleopsis confragosa	12,1
7	S.hirs	Stereum hirsutum	1,1
8	T.vers	Trametes versicolor	2,3
9	4		0,2
10	H.an	Trametes hirsuta	1,0
11	3		5,2
12	Tram.		10,0	[13]
13	M.gig	Meripilus giganteus	6,5
14	Sp245	Azospirillum Brasilense	70,4	[17]
15	Pl. Ostreatus	Pleurotus ostreatus	170,0	[4]
16	P. tig	Panus tigrinus	1,2	[9]
17	Panus tig		25,0	[39]
18	Trich. Asper	Trichoderma asperellum	0,1	[5]
19	P. cycl	Penicillium cyclopium	0,1
20	072	C. hirsutus	12,6	[40]
21	0275	CerrenaMaxima	51,6
22	Tram. Max	Trametes maxima	8,0	[13]

Проаналізувавши данні таблиці, можна зробити висновок, що лише 4 штами з літературних даних проявили більшу активність, ніж досліджені (це штами 0275 CerrenaMaxima, Panus tig Panus tigrinus, Pl. Ostreatus Pleurotus ostreatus, Sp245 Azospirillum Brasilense). Це пов'язано з тим, що субстрати для вирощування відрізнялись. Кращим субстратом є березова та соснова тирса ( штами 0275 CerrenaMaxima та Panus tig Panus tigrinus вирощувались саме на цьому субстраті та показали високі результати ).

Досліджені в ході курсової роботи штами K-1, A-Дoн-02, Д-1, Il-b, Il-m були отримані з гриба Irpex lacteus та проявили найбільшу активність. Виходячи з цього, можна казати, що для даного виду були підібрані найкращі умови культивування та поживне середовище.

На продуктивність Mn-пероксидаз суттєво впливають умови культивування, доба та середовища для вирощування. Отримані результати можуть вказувати на можливість використання даних штамів-продуцентів для розкладу та деградації лігнінвмісних відходів.

ВИСНОВКИ

1) В ході роботи визначили найбільш активні штами базидіоміцетів. А сама, це штам К-1 ( гриб Irpex lacteus ),А- Дон-02 (гриб Irpex lacteus ), Д-1 (Irpex lacteus), AnSc-1( гриб Daedaleopsis confragosa), Іl-в (гриб Irpex lacteus), Іl-m (гриб Irpex lacteus). Можна зробити висновок, що грибом, який найкраще синтезує Mn- залежну пероксидазу є Irpex lacteus.

2) Порівнявши ферментативну активність всіх штамів, можна сказати, що краще для синтезу грибами Mn-залежної пероксидази, підходить глибинне культивування. У всіх штамів, крім К-1 I. lacteus та Д-1

I. lacteus , при глибинному культивуванні показники активності більші, ніж при поверхневому вирощуванні.

ЛІТЕРАТУРА

1. Азаров В.И., Буров А.В., Оболенская А.В. Химия древесины и синтетических полимеров : Учебник для вузов . СПБ.:1999. 628 с.

2. Андреева В.А. Фермент пероксидаза; Участие в защитном механизме растений / М.; Наука, 1988.-- 128 с.--15ВЫ 5-02-003944-6.

3. Бах А.Н. Собрание трудов по химии и биохимии/Москва.-1950

4. Беловежец Л.А. Деструкция модельных соедтнений лигнина пионерными штаммами грибов-колонизаторов древесных отходов. Иркутск.- 2009.

5. Глик Б. Молекулярная биотехнология Принципы и применение: пер. с англ. / Б. Глик, Дж. Пастернал. - М.: Мир, 2002. - 589 с.

6. Даниляк Н.И. Ферментные системы высших базидиомицетов / Н.И. Даниляк, В.Д. Семичаевский, Л.Г. Дудченко, И.А. Трутнева; под ред. Н.И. Даниляк. - Киев: Наук. Думка, 1989. - 280 с.

7. Кадималиев Д.А. Влияние полимерных судстратов на биосинтез ферментов лигнолитического комплекса грибом Panus tigrinus. 2000.-23с.

8. Кадималиев Д.А. Фундаментальные и прикладные основы биотехнологии экологически безопасных композиционных материалов / Д.А. Кадималиев, В.В. Ревин, Н.А. Атыкян, В.В. Шутова; под ред. проф. В.Д. Самуилова. -Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2004. - 192 с.

9. Кадималиев Д.А. Фундаментальные и прикладные основы биотехнологии экологически безопасных композиционных материалов / Д.А. Кадималиев, В.В. Ревин, Н.А. Атыкян, В.В. Шутова; под ред. проф. В.Д. Самуилова. ? Саранск: Изд-во Мордов. ун-та, 2004. ? 192 с.

...