Антагоністичні властивості пробіотичного штаму Lactobacillus gasseri 55 збагаченого селеном

Размещено на http://www.allbest.ru/

УДК 576.8.095.38

DOI: 10.15587/2313-8416.2016.58827

АНТАГОНІСТИЧНІ ВЛАСТИВОСТІ ПРОБІОТИЧНОГО ШТАМУ LACTOBACILLUS GASSERI 55 ЗБАГАЧЕНОГО СЕЛЕНОМ

© К.С. Огірчук, Н.К. Коваленко

Вивчено антагоністичну активність пробіотичного штаму Lactobacillus gasseri 55, вирощеного на поживному середовищі, що містить 8 мг/л селеніту натрію. Встановлено, що культивування штаму Lactobacillus gasseri 55 у середовищі з селеном підсилює його антагоністичну дію щодо всіх тест-штамів умовно патогенних мікроорганізмів, окрім Salmonella enterica. Виявлено синергетичний ефект антагонізму завдяки сумісного використання селеніту та пробіотичного штаму щодо Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis та Pseudomonas aeruginosa

Ключові слова: пробіотики, Lactobacillus gasseri, антагоністична активність, селеніт натрію

пробіотичний штам антагонізм селеніт

It was studied the antagonistic activity of probiotic strain Lactobacillus gasseri 55 grown on nutrient medium containing 8 mg/l of sodium selenite. It was established that the cultivation of the strain Lactobacillus gasseri 55 in an environment with selenium enhances its antagonistic effect on all the test strains opportunistic microorganisms than Salmonella enterica. It was discovered the synergy effect through antagonism sharing selenite and probiotic strain on Escherichia coli, Staphylococcus epidermidis and Pseudomonas aeruginosa

Keywords: probiotics, Lactobacillus gasseri, antagonistic activity, sodium selenite

Вступ

Селен (Se) - есенціальний мікроелемент, дефіцит якого є причиною послаблення здоров'я населення в багатьох країнах світу. Його функції включають в себе регулювання обміну речовин, антиоксидантний захист, підвищення імунітету, формування кісткової тканини, підсилення репродуктивної функції, профілактика раку, уповільнення старіння [1]. Додавання селеніту натрію як неорганічної форми Se в раціон харчування з одного боку визнано першочерговою мірою на шляху до покращення стану здоров'я людей і тварин при різних захворюваннях, а з іншого боку використання його в деяких країнах було обмежено через токсичність і здатність до забруднення навколишнього середовища. Органічні форми Se є менш токсичними, але не менш ефективними, ніж оксид селену та селеніт [2, 3]. У зв'язку з цим, останнім часом, зростає інтерес до використання органічного селену в раціоні харчування людей і тварин в якості харчових добавок та функціональних продуктів. Найбільше визнання отримали різноманітні селен- збагачені біологічні продукти: пшениця, фрукти, овочі, мікроорганізми (дріжджі, мікроскопічні водорості, лактобацили) тощо. Чільне місце серед цих продуктів займають лактобацили, оскільки лише вони здатні накопичувати селен в клітинах у вигляді селен-цистеїну, який входить до складу активного центру глутатіонпероксидази - головного ферменту, що захищає клітини від оксидативного стресу. Ще однією цікавою особливістю МКБ є здатність відновлювати іони селену Se+4 до елементарного селену Se0 в процесі детоксикації. Вільний селен у вигляді наночастинок накопичується біля клітинної стінки бактерій а також виділяється в позаклітинний простір [4].

Молочнокислі бактерії (МКБ) характеризуються рядом біологічних властивостей, що дозволяють використовувати їх в складі пробіотичних препаратів для корекції мікрофлори макроорганізму, зокрема кишечнику, а також при різних патологічних станах. Необхідною ознакою лактобактерій є їх антагоністична активність щодо патогенної та умовно патогенної мікрофлори [5, 6].

Вивчення антагоністичних властивостей молочнокислих бактерій як складової частини нормальної мікрофлори травного тракту людей різних вікових груп набуває в наш час особливої актуальності у зв'язку з несприятливими екологічними умовами, а також широким розповсюдженням дисбактеріозів, які ускладнюють стан здоров'я людини на фоні захворювань різної етіології [5, 7].

Аналіз літературних даних та постановка проблеми

Останнім часом в літературі велика увага приділяється синтетичним селен-органічним сполукам (таким як 2,4,6,-три-пара-метоксифенілселено-пірилі- ум хлорид, пергідроселеноксантен та 9-пара-хлоро- фенілоктагідро-селеноксантен), які проявляють антимікробну активність in vitro відносно патогенних бактерій (Staphylococcus aureus, Staphylococcus simu- lans, Salmonella typhimurium, Escherichia coli та Bacillus cereus), грибів та вірусів [1, 8]. Поряд із цим лише поодинокі роботи присвячені вивченню антимікробних властивостей наночастинок елементарного селену. Так, Tran (2009) показав ефективність 0,2 % наночастинок селену у целюлозній оболонці відносно Pseudomonas aeruginosa та Staphylococcus aureus [2]. При вивченні дії елементарного селену на біоплі- вку клінічно важливих штамів УПМ, Khalid (2014) встановив, що найбільш чутливим до дії селену виявилися E.coli та S. aureus [9]. В присутності 6,25 мг/мл селену в середовищі пригнічувався ріст 95 % клітин цих штамів і лише 34 % клітин P. aeruginosa, тоді як повне інгібування росту псевдомонад спостерігалось при 25 мг/мл селену.

В даний час було кілька повідомлень про використання комбінованих ефектів пробіотичних штамів МКБ, збагачених селеном, в органічних формах, таких як селенометіонін і селеноцистеїн, проти патогенної мікрофлори. Так, Yang показав антагоністичну дію in vitro та in vivo селен- збагачених пробіотиків Lactobacillus acidophilus, L. rhamnosus GG та Streptococcus thermophilus відносно патогенного штаму E.coli, а Kheradmand встановив антифунгальну дію збагачених наноселеном штамів L. plantarum та L. johnsonii проти Candida albicans [3, 10].

Ціль та задачі дослідження.

Проведені дослідження ставили за мету визначити вплив селеніту натрію на антимікробну активність штаму Lactobacillus gasseri 55.

Для досягнення поставленої мети вирішувалися наступні задачі:

культивування досліджуваного штаму в кукурудзяному середовищі з 8 мг/л селеніту натрію;

вивчення інгібуючої дії супернатанту культуральної рідини L. gasseri 55 відносно клінічно важливих штамів умовно патогенних мікроорганізмів.

Матеріали та методи дослідження антагоністичної активності штаму Lactobacillus gasseri 55 збагаченого селенітом натрію.

Об'єктом дослідження був пробіотичний штам L. gasseri 55, виділений з кишечника людини в процесі дослідження мікрофлори жінок постменопаузального віку здорових та хворих на остеопороз [11, 12]. Для культивування штаму Lactobacillus gasseri 55 використовували кукурудзяне середовище, що забезпечує оптимальний ріст та виживаність культури в умовах збагачення селеном. Культуру інкубували в термостаті за температури 37 °С протягом 24-48 годин.

Антагоністичні властивості лактобактерій вивчали щодо 9 тест-штамів умовно патогенних мікроорганізмів: Pseudomonas aeruginosa B-900, Proteus vulgaris B-905, Escherichia coli B-906, Staphylococcus aureus B-904, Staphylococcus epidermidis B-919, Klebsiella pneumoniae B-920, Salmonella enterica var. abony B-921, Shigella flexneri ГИСК 337, що зберігалися в Української колекції мікроорганізмів Інституту мікробіології і вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України.

Вплив іонів селену на антагоністичну активність молочнокислих бактерій вивчали методом мікротитраційних планшетів [13] з невеликою модифікацією. Досліджували антагоністичну дію на тест-штами УПМ супернатанту культуральної рідини Lactobacillus gasseri 55 вирощеного з та без 8 мг/л селеніту натрію в середовищі, а також вивчали дію неорганічного селену, внесеного в кукурудзяне середовище. Супернатанти культуральної рідини досліджуваного штаму були отримані з 24-годинної культури Lactobacillus gasseri 55, вирощеної на кукурудзяному середовищі, шляхом центрифугування при 8000 об/хв протягом 15 хв і подальшого фільтрування через бактеріальні фільтри (Millipore, 0,22 мкм). Після цього 80 мкл фільтрату вносили в планшет для мікротитрування. Індикаторні штами вирощували на соєводекстрозному бульоні протягом 18-24 годин за температури 37 °С, двічі промивали стерильним розчином фосфатно- сольового буфера (PBS, рН 7,2) і ресуспендували в PBS. Суспензію тест-мікроорганізму з оптичною густиною А620нм=0,5, отримували у відповідному середовищі, сконцентрованому в 5 разів, після чого 20 мкл вносили в лунку мікропланшету. Після 2448 годин інкубації інтенсивність росту тест-штаму визначали за допомогою мікропланшетного рідеру Multiscan FC виробництва Thermo scientific (США) при довжині хвилі 620 нм. Тест-культури, вирощені у відповідному середовищі без супернатанта куль- туральної рідини або кукурудзяного середовища, були використані в якості позитивного контролю. Облік результатів проводили через 18-20 годин.

Статистичний аналіз проводили, використовуючи пакети програм «Excel» та «STATISTrcA10». Відмінності між величинами вважали достовірними при р<0,05.

Результати досліджень антагоністичної активності штаму L. gasseri 55 щодо умовно патогенних мікроорганізмів.

В ході дослідження вивчали також вплив середовища культивування, збагаченого селенітом, на виживаність тест-штамів УПМ (рис. 1).

Показано посилення росту S. epidermidis та P. aeruginosa під впливом кукурудзяного середовища у 3 та 2 рази відповідно, а виживаність S. aureus, K. pneumoniae та S. enterica - навпаки складала лише 40-50 %. Додавання селеніту натрію в середовище культивування практично не впливало на його інгібуючу дію щодо вищезгаданих тест-штамів. Найси- льнішу інгібуючу дію спричиняв супернатант куль- туральної рідини L. gasseri 55 щодо S. enterica (20 %),

S. aureus (25 %) S. flexneri та K. pneumoniae (35 %), а також E. coli, P. vulgaris (50 %). Показано, що культивування з селеном штаму L. gasseri 55 підсилює його антагоністичну дію щодо всіх тест-штамів УПМ, окрім S. enterica та S. flexneri. Найбільший синергетичний ефект селеніту та пробіотичного штаму виявлений щодо S. epidermidis, P. aeruginosa (виживаність тест-штамів зменшилась майже у 10 разів) та E. coli (1,5 раза).

При додаванні досліджуваних речовин до тест- штамів у розведенні 1:10 (рис. 2) спостерігали слабку стимулюючу дію щодо S. epidermidis (105-120 %), P. vulgaris та P. aeruginosa (130-140 % відповідно).

Показано, що виживаність S. aureus та K. pneumoniae при додаванні кукурудзяного середовища до соєво-декстрозного бульйону в розведенні 1:10 становить 45 % та 70 % відповідно, а додавання неорганічного селену до складу кукурудзяного середовища знижувало цей показник в 2 рази. Однак, протилежний ефект виявлено при дії супернатанту культуральної рідини L. gasseri 55, збагаченого селеном, на S. aureus, а саме підвищення виживаності з 5 до 45 %, порівняно з супернатантом без селену. Найбільший синергетичний ефект селеніту та про- біотичного штаму в розведенні 1:10 виявлений щодо S. enterica. Так, виживаність даного тест-штаму при дії супернатанту культуральної рідини L. gasse- ri 55 складала майже 50 %, а присутність селеніт- іонів в середовищі культивування посилювала інгібуючу дію супернатанту культуральної рідини вдвічі (25 %). Встановлено, що досліджувані речовини у розведенні 1:10 не впливають на виживаність E. coli та S. flexneri.

Обговорення результатів дослідження антагоністичної активності пробіотичного штаму Lactobacillus gasseri 55.

Використання пробіотиків є визнаною альтернативою хіміотерапевтичним засобам при лікуванні дисбіозів різної етіології. В цій роботі ми оцінювали взаємодію селеніту натрію та пробіотичного штаму L. gasseri 55 на антимікробну активність щодо клінічно важливих штамів умовно патогенних мікроорганізмів.

В ході роботи було встановлено, що супернатант культуральної рідини L. gasseri 55 в різному ступені пригнічує ріст S. enterica, S. aureus, K. pneumoniae, S. flexneri, P. vulgaris та E. coli, тоді як збагачення культури селеном суттєво підсилює інгібуючу дію пробіотичного штаму щодо всіх досліджуваних умовно патогенних мікроорганізмів. Найсильніший синергічний ефект пробіотичного штаму і селену відмічено щодо S. epidermidis і P. aeruginosa, ріст яких суттєво підсилювався при наявності безселенового супернатанту в середовищі. Збагачення супернатанту gasseri 55 селеном не впливало на інгібування росту S. enterica та S. flexneri.

В попередніх дослідженнях [14] нами було показано, що в процесі культивування в середовищі з 8 мг/л селеніту натрію пробіотичний штам L. gasseri 55 накопичує в біомасі 33 % селену. З літературних даних відомо, що при цьому значна кількість селену накопичується в середині самої клітини мікроорганізму у вигляді органічних сполук - селенометіоніну та селеноцистеїну. А в процесі детоксикаційного відновлення неорганічної форми Se4+ до елементарного селену Se0 у вигляді наночастинок, які обумовлюють червоне забарвлення культуральної рідини лактобактерій [3, 15]. Таким чином, можна припустити, що синергічна антимікробна дія L. gasseri 55 та селену відбувається за рахунок посилення продукції екзометаболітів штаму (молочної кислоти, пероксиду водню), а також антибактеріального ефекту наночастинок селену.

Висновки

В даній роботі показано антимікробні властивості пробіотичного штаму L. gasseri 55, збагаченого селеном, щодо широкого спектру клінічно важливих штамів умовно патогенних мікроорганізмів, серед яких вперше досліджено вплив селену на S. enterica, K. pneumoniae, S. flexneri, P. vulgaris, та S. epidermidis. Встановлено, що селен-збагачені пробіотики поєднують у собі корисні властивості лактобактерій з перевагами органічного селену і можуть виступати в якості пребіотиків завдяки посиленню антагоністичних властивостей штаму-продуценту і чинити подвійний позитивний ефект на організм людини і тварин.

Література

1. Pietka-Ottlik, M. New Organoselenium Compounds Active against Pathogenic Bacteria, Fungi and Viruses [Text] /

2. M. Pietka-Ottlik, H. Wojtowicz-Miochowska, K. Koiodziejc- zyk, E. Piasecki, J. Miochowski // Chemical and Pharmaceutical Bulletin. - 2008. - Vol. 56, Issue 10. - Р. 1423-1427. doi: 10.1248/cpb.56.1423

3. Tran, P. L. Organoselenium Coating on Cellulose Inhibits the Formation of Biofilms by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus [Text] / P. L. Tran, A. A. Hammond, T. Mosley, J. Cortez, T. Gray, J. A. Colmer-Hamood et. al // Applied and Environmental Microbiology. - 2009. - Vol. 75, Issue 11. - Р. 3586-3592. doi: 10.1128/aem.02683-08

4. Yang, J. Antibacterial action of selenium-enriched probiotics against pathogenic Escherichia coli [Text] / J. Yang, K. Huang, S. Qin, X. Wu, Z. Zhao, F. Chen // Digestive Diseases and Sciences. - 2008. - Vol. 54, Issue 2. - P. 246-254. doi: 10.1007/s10620-008-0361-4

5. Yazdi, M. H. Selenium nanoparticle-enriched Lactobacillus brevis causes more efficient immune responses in vivo and reduces the liver metastasis in metastatic form of mouse breast cancer [Text] / M. Yazdi, M. Mahdavi, N. Setayesh, M. Esfandyar, A. Shahverdi // DARU Jornal of Farmaceuticals Science. - 2013. - Vol. 21, Issue 1. - P. 33. doi: 10.1186/2008-2231-21-33

6. Jamalifar, H. Antimicrobial activity of different Lactobacillus species against multi-drug resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa [Text] / H. Jamalifar, H. Rahimi, N. Sa- madi, A. Shahverdi, Z. Sharifian, F. Hosseini, H. Eslahi, M. Faze- li // Iran. J. Microbiol. - 2011. - Vol. 3, Issue 1. - Р. 21-25.

7. Mezaini, A. Antibacterial activity of some lactic acid bacteria isolated from an Algerian dairy product [Text] / A. Me- zaini, N.-E. Chihib, A. D. Bouras, N. Nedjar-Arroume, J. Pierre Hornez // Journal of Environmental and Public Health. - 2009. - Vol. 2009. - P. 1-6. doi: 10.1155/2009/678495

8. Jarvis, W. R. Predominant pathogens in hospital infections [Text] / W. R. Jarvis, W. J. Martone // Journal of Antimicrobial Chemotherapy. - 1992. - Vol. 29. - Р. 19-24. doi: 10.1093/jac/29.suppl_a.19

9. Radhakrishna, P. M. Synthesis and Antibacterial Activity of Novel Organoselenium Compounds [Text] / P. M. Ra- dhakrishna, K. C. Sharadamma, H. M. Vagdevi, P. M. Abhilek- ha, M. S. Rubeena, K. Nischal // International Journal of Chemistry. - 2010. - Vol. 2, Issue 2. doi: 10.5539/ijc.v2n2p149

10. Khalid, A. Q. Antibacterial effects of of pure metals on clinically important bacteria growing in planktonic cultures and biofilms [Text] / A. Q. Khalid, B. O. Al Johny, M. Wain- wright // African Jornal of Microbiology Research. - 2014. - Vol. 8, Issue 10. - P. 1080-1088. doi: 10.5897/ajmr2013.5893

11. Kheradmand, E. The antimicrobial effects of selenium nanoparticle-enriched probiotics and their fermented broth against Candida albicans [Text] / E. Kheradmand, F. Rafii, M. Yazdi, A. Sepahi, A. Shahverdi, M. Oveisi // DARU Jornal of Farmaceuticals Science. - 2014. - Vol. 22, Issue 1. - P. 48. doi: 10.1186/2008-2231-22-48

12. Коваленко, Н. К. Мікробіоценоз кишечнику та харчування здорових і хворих на остеопороз жінок старшого віку [Текст] / Н. К. Коваленко, К. С. Огірчук, О. А. Полтавська, В. В. Поворознюк, Н. І. Дзерович // Miкробioл. Журн. - 2012. - Т. 74, № 4. - С. 57-63.

13. Огірчук, К. С. Антагоністичні властивості молочнокислих бактерій виділених від жінок практично здорових і хворих на остеопороз [Текст] / К. С. Огірчук, Н. К. Ковавленко, О. А. Полтавська // Мікробіологічний журнал. - 2013. - Т. 75, № 1. - С. 21-27.

14. Collado, M. C. Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains [Text] / M. C. Collado, M. Hernandez, Y. Sanz // J. Food Protect. - 2005. - Vol. 68, Issue 5. - P. 1034-1040.

15. Огірчук, К. Вплив різних концентрацій селеніту натрію на мікроелементний склад біомаси Lactobacillus Acidophilus 55 [Текст]: конф. / К. Огірчук, Н. Коваленко, А. Самчук, О. Пономаренко. - Львів, 2015. - С. 201-202.

16. Tran, P. A. Selenium nanoparticles inhibit Staphylococcus aureus growth [Text] / P. A. Tran, T. J. Webster // International Journal of Nanomedicine. - 2011. - P. 1553. doi: 10.2147/ijn.s21729

References

1. Pietka-Ottlik, M., Wojtowicz-Miochowska, H., Ko- lodziejczyk, K., Piasecki, E., Miochowski, J. (2008). New Or- ganoselenium Compounds Active against Pathogenic Bacteria, Fungi and Viruses. Chemical & pharmaceutical bulletin, 56 (10), 1423-1427. doi: 10.1248/cpb.56.1423

2. Tran, P. L., Hammond, A. A., Mosley, T., Cortez, J., Gray, T., Colmer-Hamood, J. A. et. al (2009). Organoselenium Coating on Cellulose Inhibits the Formation of Biofilms by Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus. Applied and Environmental Microbiology, 75 (11), 3586-3592. doi: 10.1128/ aem.02683-08

3. Yang, J., Huang, K., Qin, S., Wu, X., Zhao, Z., Chen, F. (2008). Antibacterial Action of Selenium-Enriched Probiotics Against Pathogenic Escherichia coli. Digestive Diseases and Sciences, 54 (2), 246-254. doi: 10.1007/s10620-008-0361-4

4. Yazdi, M., Mahdavi, M., Setayesh, N., Esfandyar, M., Shahverdi, A. (2013). Selenium nanoparticle-enriched Lactobacillus brevis causes more efficient immune responses in vivo and reduces the liver metastasis in metastatic form of mouse breast cancer. DARU Journal of Pharmaceutical Sciences, 21 (1), 33. doi: 10.1186/2008-2231-21-33

5. Jamalifar, H., Rahimi, H., Samadi, N., Shahverdi, A., Sharifian, Z., Hosseini, F., Eslahi, H., Fazeli, M. (2011). Antimicrobial activity of different Lactobacillus species against multi-drug resistant clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa, Iran. J. Microbiol., 3 (1), 21-25.

6. Mezaini, A., chihib, N.-E., Dilmi Bouras, A., Ne- djar-Arroume, N., Hornez, J. P. (2009). Antibacterial Activity of Some Lactic Acid Bacteria Isolated from an Algerian Dairy Product. Journal of Environmental and Public Health, 2009, 1-6. doi: 10.1155/2009/678495

7. Jarvis, W. R., Martone, W. J. (1992). Predominant pathogens in hospital infections. Journal of Antimicrobial Chemotherapy, 29, 19-24. doi: 10.1093/jac/29.suppl_a.19

8. Radhakrishna, P. M., Sharadamma, K. C., Vagde- vi, H. M., Abhilekha, P. M., Rubeena, M. S., Nischal, K. (2010). Synthesis and Antibacterial Activity of Novel Orga- noselenium Compounds. International Journal of Chemistry, 2 (2). doi: 10.5539/ijc.v2n2p149

9. Khalid, A. Q., Al Johny, B. O., Wainwright, M. (2014). Antibacterial effects of of pure metals on clinically important bacteria growing in planktonic cultures and biofilms.

10. African Jornal of Microbiology Research, 8 (10), 1080-1088. doi: 10.5897/ajmr2013.5893

11. Kheradmand, E., Rafii, F., Yazdi, M., Sepahi, A., Shahverdi, A., Oveisi, M. (2014). The antimicrobial effects of selenium nanoparticle-enriched probiotics and their fermented broth against Candida albicans. DARU Jornal of Farmaceuticals Science, 22 (1), 48. doi: 10.1186/20082231-22-48

12. Kovalenko, N. K., Ogirchuk, K. S., Poltavska, O. A., Povoroznyuk, V. V., Dzerovich, N. I. (2012). Microbiocenosis of intestine and nutrition of healthy and osteoporotic patients older women. Mikrobiol. Z., 74 (4), 57-63.

13. Kovalenko, N. K., Ogirchuk, K. S., Poltavska, O. A. (2013). Study of antagonistic properties of lactic acid bacteria isolated from women in normal and osteoporosis. Mikrobiol. Z., 75 (1), 21-27.

14. Collado, M. C., Hernandez, M., Sanz, Y. (2005). Production of bacteriocin-like inhibitory compounds by human fecal Bifidobacterium strains. J. Food Protect, 68 (5), 1034-1040.

15. Ohirchuk, K., Kovalenko, N., Samchuk, A., Ponomarenko, O. (2015). The effect of different concentrations of sodium selenite on the trace-element composition biomass of Lactobacillus acidophilus 55. Lviv, 201-202.

16. Tran, P. A., Webster, T. J. (2011). Selenium nanoparticles inhibit Staphylococcus aureus growth. International Journal of Nanomedicine, 1553. doi: 10.2147/ijn.s21729

Размещено на Allbest.ru