Анализ регенерационной способности подсолнечника в культуре in vitro

Размещено на http://www.allbest.ru/

анализ регенерационной способности подсолнечника в культуре in vitro

м.о. Моисеева,

т.в. никонович,

О.П. Шатарнов

В статье проанализирована регенерационная способность подсолнечника в культуре in vitro. Описано получение листового органогенеза у различных линий подсолнечника. Изложены сведения о методах стерилизации семян подсолнечника в культуре in vitro, зависимости каллусогенеза от типа первичного экспланта и изучаемого генотипа. Описаны морфогенетические характеристики полученных каллусных культур 14 линий подсолнечника и гибрида F₁ Поиск.

The article analyzes regeneration ability of sunflower in vitro. We have described leaf organogenesis in different lines of sunflower. We have presented data about the methods of sterilization of sunflower seeds in vitro and dependences of callusogenesis on the type of primary explants and examined genotype. We have also described morphogenetic characteristics of obtained callus cultures of 14 sunflower lines and hybrid F₁ Poisk.

Подсолнечник (Helianthus annuus L.) является одной из ценных сельскохозяйственных культур. Он служит источником как пищевого, так и технического масла, является ценной кормовой культурой, содержащей большое количество легкоусвояемых белков. Для более широкого использования этой культуры необходимо создание новых сортов, устойчивых к действию различных биотических и абиотических факторов применительно к условиям Беларуси. При получении скороспелых, устойчивых к болезням сортов и гибридов подсолнечника наряду с традиционными методами селекции применяются биотехнологические методы. Использование изолированных клеток, тканей и органов позволяет сократить селекционный процесс и повысить его эффективность. При этом необходимо иметь формы, способные в условиях in vitro легко образовывать каллус и формировать растения-регенераты. Каллусная ткань - один из видов клеточной регенерации, возникает путем неорганизованной пролиферации дедифференцированных клеток растения. Установлено, что процессы каллусообразования видои сортоспецифичны [4, с. 116-124].

Подсолнечник относится к видам с низкой воспроизводимой системой регенерации побегов в культуре in vitro. Известно, что регенерационная способность подсолнечника in vitro зависит от генотипа, типа используемого экспланта и состава искусственной питательной среды [1; 5, с. 27-33].

Цель исследований - изучение регенерационной способности изолированных тканей подсолнечника в культуре in vitro для разработки эффективных методов регенерации растений, которые необходимы для успешного проведения соматической гибридизации, клеточной селекции, получения гаплоидов и дигаплоидов.

В задачи исследований входило: отработка методики стерилизации семян подсолнечника при введении их в культуру in vitro, выбор оптимального типа экспланта, выявление линий, обладающих высокой регенерационной способностью, оптимизация состава искусственных питательных сред для получения листового органогенеза.

Анализ источников

За последние годы рядом ученых разработано несколько способов регенерации подсолнечника. В них используется либо органогенез, и они исходят из культуры одиночных клеток или тканей [6, 17, 13, 14, 15], либо из культуры протопластов [7, 8, 9, 10] или соматического эмбриогенеза [16, 17, 19]. Однако регенерация растений остается проблематичной.

Соматический эмбриогенез у подсолнечника впервые описали Paterson и Everett. Каллус ими был получен из гипокотиля. Они наблюдали меристематические центры развития эмбриоидов, внешний вид и формирование которых подобны зиготическим зародышам подсолнечника [16]. подсолнечник гибрид стерилизация каллусогенез

С незрелыми зиготическими зародышами одинаковы также соматические зародыши, полученные на поверхности семядоли [11] и гипокотиля [12]. Зародыши были хорошо сформированы и развились в полноценные растения. В обоих случаях культура была получена на твердой питательной среде.

В 1990 г. Pelissier и al. описали результаты регенерации подсолнечника путем соматического эмбриогенеза. Эмбриоиды, которые сформировались из клеток эпидермиса в жидкой питательной среде, были помещены на твердую питательную среду, чтобы получить вторичные зародыши, из которых регенерировали целые растения [17].

Анализ многочисленных источников показал, что для получения каллусов могут быть использованы различные типы эксплантов: незрелые зародыши, зрелые зародыши, проростки на стадии первых листьев, 5-7-дневные проростки, сегменты гипокотиля, сегменты семядоли, стебли, листья. В качестве питательной среды для каллусогенеза и регенерации растений чаще всего использовалась среда Мурасиге-Скуга с добавлением сахарозы 30 г/л и различных концентраций и сочетаний регуляторов роста. При этом выход растений-регенерантов подсолнечника из каллусов оставался очень низким [3, 4, 5, 18].

Наиболее эффективная регенерация получена при использовании метода, не предполагающего дедифференциации клеток экспланта и последующей вторичной дифференциации тканей и органов из каллуса, так называемая прямая регенерация растений непосредственно из тканей экспланта. При этом в качестве эксплантов использовались части растений, содержащие меристемы (зрелые или незрелые зародыши). Именно при использовании данного метода получены наиболее значительные результаты по регенерации растений. Но даже в этом случае генотип оказывал решающее значение на результат культивирования [5].

Методы исследования

Объектами исследований являлись 14 линий подсолнечника: М 605/04А, М 511/08А, М 571/08А, М 611/08А, М 743/08А, М 685/07А, М 1099/08А, М 1117/08А, М 701/08А, М 780/04Rf, М 418а/08 Rf, М 426/08Rf, М 718/04Rf, М 605/04В и гибрид F₁ Поиск. Линии и гибрид белоруской селекции предоставлены Институтом генетики и цитологии НАН Беларуси. Проведение асептических приемов с изолированными тканями осуществлялось общепринятыми методами для культуры in vitro [2, 3].

На этапе введения в культуру in vitro отрабатывались методы стерилизации. Неочищенные семена без механических повреждений помещались на 10 минут в 3% раствор кальцинированной соды, нагретый до 50єС. Затем семена очищались и погружались в 70% этанол на 1-2 мин. Далее применялись следующие способы стерилизации.

Способ стерилизации №1: семена помещались в 0,01% раствор сулемы на 5 мин., затем в 10% раствор гипохлорита кальция на 20 мин.

Способ стерилизации №2: семена помещались в 10% раствор гипохлорита кальция на 35 мин.

В условиях ламинар-бокса семена промывались дистиллированной автоклавированной водой 3-4 раза.

Стерильные семена высаживались в пробирки с уменьшенной на половину по основному составу питательной средой Мурасиге-Скуга (1/2 MС) и культивировались в световой комнате при температуре 24-26єС, освещенности 4-6 тыс. люкс и 16-часовом фотопериоде. Через 7 дней подсчитывались инфицированные и погибшие семена.

Для выявления оптимального типа экспланта применялись 7-дневные проростки подсолнечника. В качестве исходных эксплантов использовались сегменты стебля, семядолей и эпидермиса гипокотиля. Они культивировались на искусственной питательной среде Мурасиге-Скуга (МС), содержащей 1,0 мг/л б-нафтилуксусной кислоты (НУК) и 1,0 мг/л 6-бензиламинопурина (6-БАП) в условиях полной темноты. Через 6 недель определялся оптимальный тип экспланта и анализировался каллусогенез in vitro у различных линий подсолнечника.

Для выявления условий, способствующих каллусогенезу и регенерации растений, сегменты эпидермиса гипокотиля культивировались на пяти вариантах питательных сред, отличающихся различными видами и концентрациями регуляторов роста:

1) МС, дополненная 1 мг/л НУК и 1 мг/л 6-БАП;

2) МС, дополненная 1 мг/л НУК и 1 мг/л кинетин;

3) МС, дополненная 1 мг/л НУК и 1,5 мг/л 6-БАП;

4) МС, дополненная 1 мг/л НУК и 1,5 мг/л кинетин;

5) МС, дополненная 3 мг/л НУК и 3 мг/л 6-БАП.

Так как наилучшие результаты по регенерации растений подсолнечника в культуре in vitro были представлены в публикации Пелисье с соавторами [17], подходы, предложенные авторами, использовались нами для оценки регенерационной способности исследуемых линий.

Эксперимент состоял из трех пассажей. На I-ом пассаже применялось три варианта питательных сред, которые были выявлены как оптимальные на предыдущем этапе эксперимента.

1. МС, дополненная 1,0 мг/л НУК и 1,0 мг/л 6-БАП.

2. МС, дополненная 1,0 мг/л НУК и 1,5 мг/л 6-БАП.

3. МС, дополненная 3,0 мг/л НУК и 3,0 мг/л 6-БАП.

На указанные варианты питательных сред высаживались сегменты эпидермиса гипокотиля и культивировались в условиях полной темноты. Через 5 недель полученные каллусы пересаживались на питательную среду Ѕ МС без регуляторов роста (II пассаж), где выращивались 4 недели. Следующий III-й пассаж длился 6 недель, в течение которых каллусы культивировались на питательной среде МС, содержащей 0,2 мг/л 6-БАП и повышенную концентрацию сахарозы (120 г/л). В конце III-его пассажа оценивались следующие признаки: масса каллуса (мг), индекс роста каллуса (отношение массы каллуса в конце пассажа к массе первоначального экспланта), наличие органогенеза.

Основная часть

При введении в культуру in vitro семян необходимо отработать методы их эффективной стерилизации. В качестве основных стерилизующих агентов использовались гипохлорит кальция и сулема (табл. 1).

Таблица 1. Влияние различных стерилизующих растворов на количество стерильных жизнеспособных семян.

При использовании раствора гипохлорита кальция было получено 63,8% стерильных семян, что в 1,6 раза меньше, чем при последовательном применении сулемы и гипохлорита кальция. Использование данного сочетания стерилизующих агентов давало возможность получить 100%-ый стерильный материал. Таким образом, сочетание сулемы и гипохлорита кальция способствовало увеличению выхода стерильных семян.

Выявлено также, что после обработки семян гипохлоритом кальция некоторые из них полностью или частично приобретали темно-зеленый или бледно-серый цвет. У таких семян при дальнейшем их культивировании проявлялась бактериальная инфекция, либо они не прорастали. Семена, меняющие цвет в процессе стерилизации, целесообразно выбраковывать.

Известно, что любой орган растения может служить источником эксплантов. При изучении каллусогенеза подсолнечника в условиях in vitro использовались различные его части. Выявлено, что каллусообразование зависит от типа исходного экспланта. При культивировании сегментов стебля каллус, образовывали шесть линий. Сегменты семядолей не образовывали каллус и для получения растений-регенерантов использовать их не целесообразно. Лучшими типами эксплантов являлись сегменты эпидермиса гипокотиля. Из них образовывали каллус все исследуемые линии.

Кроме того, установлено, что способность эксплантов к каллусогенезу зависит также от особенностей исследуемого генотипа. В нашем эксперименте большинство линий образовывало каллус рыхлой консистенции, с высоким процентом некротизации. Морфогенный каллус формировали только четыре линии: М511/08А, М611/08А, М780/04Rf, М718/04Rf. Каллус этих линий характеризовался плотной консистенцией и отсутствием некротизированных участков. Таким образом, указанные линии являются наиболее перспективными по каллусогенезу in vitro.

Плотный морфогенный каллус был получен при использовании в качестве регуляторов роста НУК и 6-БАП в различных концентрациях. Эти варианты питательных сред применялись нами для дальнейшей работы по получению растений-регенерантов подсолнечника.

Формирование растений путем органогенеза состоит в проявлении и росте побегов из каллуса. Для получения органогенеза in vitro у подсолнечника использовались составы питательных сред, представленные в табл. 2.

Таблица 2. Составы искусственных питательных сред, способствующие формированию органогенеза у подсолнечника в культуре in vitro.

Поскольку на I-ом пассаже экспланты культивировались на питательных средах разного гормонального состава, а затем условия II-го и III-го пассажей были одинаковыми, следует проанализировать, какая основа для каллусогенеза и органогенеза закладывалась на I-ом пассаже культивирования эксплантов.

Результаты эксперимента показали (табл. 3), что при культивировании эксплантов подсолнечника на I-ом пассаже на питательной среде, содержащей НУК и 6-БАП в концентрациях 1 мг/л, образование морфогенного каллуса наблюдалось только у линии М1117/08А и F₁ Поиск. У них был получен более высокий индекс роста, который составил 4,0 и 4,4. Остальные линии на данном варианте питательной среды не отличались высокими показателями массы каллуса или индекса роста и не образовали морфогенный каллус. Органогенез в этом варианте эксперимента не наблюдался.

Таблица 3. Влияние состава питательной среды на I-ом пассаже на каллусогенез и органогенез линий подсолнечника в культуре in vitro.

* отсутствие морфогенного каллуса, органогенеза; + наличие морфогенного каллуса, органогенеза; 1 - питательная среда, содержащая 1 мг/л НУК и 1 мг/л 6-БАП; 2 - питательная среда, содержащая 1 мг/л НУК и 1,5 мг/л 6-БАП; 3 - питательная среда, содержащая 3 мг/л НУК и 3 мг/л 6-БАП.

При культивировании на I-ом пассаже на питательной среде, содержащей НУК в концентрации 1 мг/л и 6-БАП в концентрации 1,5 мг/л, большинство линий образовывало морфогенный каллус, кроме М571/08А, М743/08А, М426/08Rf, М 605/04В. Масса каллуса находилась в пределах от 10,0 до 64,1 мг. Самой высокой масса каллуса была у линий М685/07А и М1099/08А, индекс роста у них был выше, чем у остальных линий, в среднем в 2 раза. Данный гормональный состав питательной среды закладывал основу для формирования листового органогенеза из клеток каллуса линий М780/04Rf и М718/04Rf, у которых индекс роста составил 4,3-4,5, а масса каллуса была 30,2 и 45,1.

Морфогенный каллус в варианте, в котором на I-ом пассаже применялась питательная среда, содержащая НУК и 6-БАП в концентрациях 3 мг/л, не образовали следующие линии: М571/08А, М685/07А, М418а/08Rf, М426/08Rf. Индекс роста каллуса был высоким у линий М605/04А, М611/08А, М1099/08А и составил от 8,5 до 11,9. Данный гормональный состав питательной среды также закладывал основу для формирования листового органогенеза из клеток каллуса линий М1099/08А, М 701/08А и М780/04Rf, их индекс роста находился в пределах от 4,7 до 9,6, а масса каллуса составляла 49,2, 48,1 и 60 мг соответственно.

Таким образом, определены условия in vitro, при которых возможно получать из клеток эпидермиса гипокотиля морфогенный каллус, способный к образованию листового органогенеза. Выявлены линии подсолнечника, наиболее перспективные по каллусогенезу и органогенезу in vitro.

заключение

1. Отработан метод стерилизации семян подсолнечника, позволяющий получать 100% стерильных семян, которые при отборе неповрежденных семян сохраняют всхожесть и дают возможность получать растения для работы в культуре in vitro.

2. Для получения каллусогенеза подсолнечника в культуре in vitro целесообразно использовать сегменты эпидермиса гипокотиля, так как из этого типа экспланта образовывали каллус все исследуемые линии.

3. Выявлено, что процесс образования каллуса зависит от особенностей исследуемого генотипа. Наиболее перспективными линиями по каллусогенезу являются линии М511/08А, М611/08А, М780/04Rf, М718/04Rf.

4. Для получения растений-регенерантов подсолнечника в культуре in vitro целесообразно использовать питательные среды МС, содержащие 1,0 мг/л НУК и 1,5 мг/л 6-БАП, а также НУК и 6-БАП по 3 мг/л, так как это сочетание и концентрации регуляторов роста способствовали формированию морфогенного каллуса и листового органогенеза.

Литература

1. Биотехнология растений: культура клеток / пер. с англ. В.И. Негрука; с предисл. Р.Г. Бутенко. М.: Агропромиздат, 1989. 280 с.

2. Бугара, А.М. Культура неоплодотворенных завязей и семяпочек in vitro как способ получения гаплоидных растений / А.М. Бугара, Л.В. Русин // Физиология и биохимия культурных растений. 1988. Т. 20. №5.

3. Калинин, Ф.Л. Методы культуры тканей в физиологии и биохимии растений / Ф.Л. Калинин, В.В. Сарнацкая, В.Е. Полищук. Киев: Наук. думка, 1980. 488 с.

4. Нгуен, Тхань Хай. Экспериментальный морфогенез в культуре изолированных клеток и тканей подсолнечника (Helianthus annus L.) / Нгуен Тхань Хай // Известия ТСХА. 2007. Вып. 2. С. 116-124.

5. Нескородов, Я.Б. Метод регенерации in vitro побегов подсолнечника из асептических семян, как эксплантов для генетической трансформации / Я.Б. Нескородов, Я.В. Мишуткина, А.К. Гапоненко, К.Г. Скрябин // Биотехнология. 2007. №6. С. 27-33.

6. Alissa, A., Jonard R., Serieys H., Vincourt P. (1986) La culture d'embryons isolйs in vitro dans un programme d'amйlioration du Tournesol. C R. Acad. Sci Paris 302: 161-164.

7. Chandler, J.M., Beard B.H. 1983 Embryo culture of Helianthus hybrids. Crop Sci 23: 1004-1007.

8. Dupuis, J.M., Gomiero M., Plantevin C. and Chagvardieff P. (1988) Differentiation de formes embryoпdes issues de protoplastes de tounesol (Helianthus annuus L.). C.R. Acad. Sci. Paris 307: 465-468.

9. Espinasse, A., C. Lay & J. Volin (1989) Effects of growth regulator concentrations and explant size on shoot organogenesis form callus derived from zygotic embryos of sunflower (Helianthus annuus L.). Plant Cell, Tissue and Organ Culture 17: 171-181.

10. Espinasse, A, Lay C., Dybing C.D. (1985) Factors controlling in vitro development of sunflower embryos. Agronomie 5: 825-832.

11. Finer, J.J. (1987) Direct somatic embryogenesis and plant rйgйnйration from immature embryos of hybrid sunflower (Helianthus annuus L.) on a high sucrose-containing mйdium. Plant Cell Rйpons 6: 372-374.

12. Freyssinet, M. & Freyssinet G. (1988) Fertile plant rйgйnйration from sunflower (Helianthusannuus L.) immature embryos. Plant Science 56: 177-181.

13. Greco, B., Tanzarella A.O., Carrozzo G., Blanco A. (1984) Callus induction and shoot rйgйnйration in sunflower (Helianthus annuus L.). Plant Science Letter 36: 73-77.

14. McCann, A.W., Cooley G. & van Dreser J. (1988) A System for routine plantlet rйgйnйration of sunflower (Helianthus annuus L.) from immature embryo-derived callus. Plant Cell, Tissue and Organ Culture 14: 103-110.

15. Murashige, T. Plant propagation througt tissue culture / T. Murashige // Ann. Rev. Plant Physiol. 1974. №25. P. 135-166.

16. Paterson, K.E., Everett N.P. (1985) Rйgйnйration of Helianthus annuus inbred plants from callus. Plant Science 42: 125-132.

17. Pйlissier, B., Bouchefra O., Pйpin R., Freyssinet G. (1990) Production of isolated somatic embryo from sunflower thin cell layers. Plant Cell Reports 9: 47-50.

18. Power, C.J. (1987) Organogenesis from Helianthus annuus inbreds and hybrids from the cotylйdons of zygotic embyos. Amer J Bot 74: 497-503.

19. Prado, E. & Berville A. (1990) Induction of somatic embryo development byliquid culture in sunflower (Helianthus annuus L.). Plant Science 67: 73-82.

Размещено на Allbest.ru