Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА НАСЛЕДСТВЕННОГО ГЕМОХРОМАТОЗА HFE У НАСЕЛЕНИЯ СИБИРИ

03.02.07 - генетика

Михайлова Светлана Владимировна

НОВОСИБИРСК 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте цитологии и генетики Сибирского отделения РАН в лаборатории молекулярных основ генетики животных, г. Новосибирск

Научный руководитель: кандидат биологических наук Ромащенко А.Г. Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Меркулова Т.И. Институт цитологии и генетики СО РАН г. Новосибирск

доктор биологических наук Бунева В.Н. Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН г. Новосибирск

Ведущее учреждение Институт молекулярной генетики РАН г. Москва

Защита диссертации состоится 2010г. на утреннем заседании диссертационного совета Д003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (383) 3331278, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность. Выяснение закономерностей внутривидовой фенотипической изменчивости человека является одной из важнейших проблем современной биологии. Концептуально полагают, что вариабельность геномов определяет всё разнообразие фенотипических проявлений, в т.ч. и патологических. Оценка влияния структуры генома на фенотип осложняется разветвлённой многоуровневой системой регуляции экспрессии генетического материала и плейотропизмом генов. Решение задач, имеющих отношение к выяснению влияния генотипа на фенотип, усложняется также диплоидностью генома. На современном этапе развития функциональной геномики изучение вклада полиморфизмов отдельного гена в фенотипические характеристики организма требует применения комплексного подхода и корректного выбора объекта для коррелятивных оценок. Моногенные заболевания считаются наиболее простой моделью для таких исследований. Аутосомно - рецессивное заболевание наследственный гемохроматоз (НГ) первоначально относили именно к таким болезням, поэтому генетическая предрасположенность к данному заболеванию широко исследовалась в последние годы во всём мире.

Термин «гемохроматоз» был введён в 19 веке для обозначения заболевания, симптомы которого проявлялись в накоплении железа в паренхимальных тканях с их сопутствующим повреждением. Классической триадой считают цирроз печени, сахарный диабет и нарушение пигментации кожи, развивающиеся у людей среднего возраста, преимущественно мужчин. В 1996г группа исследователей методом позиционного клонирования обнаружила, что НГ ассоциирован с геном HLA-H, кодирующим неклассический белок МНС1 [Feder et al., 1996]. В 1997г Номенклатурный комитет факторов системы HLA переименовал кодируемый геном белок в HFE (high Fe) [Bodmer et al., 1997]. Было установлено, что этот белок является негативным регулятором трансферринового рецептора типа 1 [Gross et al., 1998; Feder et al., 1998], а также одним из основных регуляторов экспрессии хепсидина - белка, который определяет сорбцию железа в кишечнике и концентрацию железа в сыворотке крови [Roetto et al., 2003; Makui et al., 2005]. Большинство пациентов c НГ имели генотипы C282Y/C282Y и C282Y/H63D этого гена [Feder et al., 1996]. При генотипировании популяционных выборок различных этнических групп по мутациям C282Y и H63D было установлено, что частоты этих аллелей максимальны в государствах Европы и минимальны в Юго-Восточной Азии. Это предполагает достаточно высокую заболеваемость НГ в странах Западной Европы, чего, однако, не наблюдается. В настоящее время признано, что носительство генотипа C282Y/C282Y или C282Y/H63D является одним из основных условий развития НГ типа 1 (НГ1), но клиническая пенетрантность этих генотипов невысока [Beutler et al., 2002, 2003; Ajioka and Kusher, 2003; McCune and Worwood, 2003]. При этом показано, что частоты аллелей C282Y, H63D, а также по некоторым данным и S65C, повышены среди пациентов с синдромом перегрузки железом и рядом других мультифакториальных заболеваний. Отсутствие экзонных мутаций этого гена на хромосомах значительного числа пациентов с НГ в некоторых этнических группах послужило причиной поиска мутаций в некодирующих областях этого гена, которые могли бы влиять на его экспрессию. В результате этого было найдено значительное количество нейтральных в отношении НГ1 интронных мутаций. В число наиболее полиморфных сайтов гена HFE у человека входят IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g. Их распространение оказалось расоспецифичными, поэтому они часто используются для филогенетического анализа [Beutler and West, 1997; Aguilar-Martinez et al., 1999; Rochette et al., 1999]. Однако представленные в литературе результаты гаплотипического анализа гена HFE противоречивы.

Подробное популяционное исследование полиморфизма гена HFE среди населения Европы и оценка его вклада в развитие патологий, связанных с перегрузкой организма железом, оказалось недостаточным для ответов на все возникшие вопросы. Остались невыясненным, каковы географические границы распространения аллелей C282Y, H63D и S65C, с какими генетическими маркерами 6-й хромосомы они сцеплены за пределами Европы. Так же неясны причины низкой клинической пенетрантности генотипов C282Y/C282Y и C282Y/H63D. Неизвестны причины обнаружения различающихся наборов мРНК HFE разными исследователями [Rhodes and Trowsdale, 1999; Jeffrey et al., 1999; Thйnie et al., 2000; Sбnchez et al., 2001].

Целью исследования была оценка полиморфизма гена наследственного гемохроматоза типа 1 человека HFE среди населения России и выяснение возможных связей его ОНП и гаплотипов с патологиями, вызванными нарушением метаболизма железа.

Задачи исследования

1. Создание надёжных тест-систем для генотипирования распространённых экзонных (C282Y, H63D, S65C) и интронных (IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g) полиморфизмов гена HFE.

2. Определение частот встречаемости экзонных и интронных полиморфизмов и гаплотипов среди контрастных в расовом отношении групп населения России.

3. Оценка предрасположенности к нарушениям метаболизма железа, связанным с носительством экзонных мутаций гена HFE, на территории России.

4. Контекстный анализ последовательностей ДНК, содержащих интронные полиморфизмы IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE.

5. Выяснение потенциальной функциональной значимости полиморфизмов IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g.

Научная новизна.

1. Разработаны оригинальные методики для выявления мажорных мутаций (C282Y, H63D, S65C) гена HFE, ассоциированные с наследственным гемохроматозом. Впервые были определены частоты аллелей с этими экзонными мутациями гена HFE в различных этнических группах России и оценена предрасположенность к наследственному гемохроматозу 1-го типа в разных этнических группах.

2. Идентифицированы гаплотипы по полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE. Обнаружено 4 варианта (TTG, TTA, CTA, CCA) из 8-ми теоретически возможных.

3. Установлена сцепленность каждой из мажорных мутаций гена HFE во всех исследованных этнических группах России с определённым вариантом интронного гаплотипа по полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g этого гена, а именно C282Y -с TTG, H63D -с CTA и S65C- с CCA.

4. Определена потенциальная функциональная роль интронных полиморфизмов IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE на различных стадиях формирования сплайсосомы в пре-мРНК.

5. Ассоциативным анализом показано влияние аллеля IVS4(-44)t на формирование патологического фенотипа синдрома перегрузки железом.

Положения, выносимые на защиту. На защиту выносится доказательство этноспецифического распределения среди населения России полиморфизмов C282Y, H63D и S65C в экзонах, а так же полиморфизмов IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g в интронах гена HFE, кодирующего неклассический белок МНС1, регулятор метаболизма железа. Носительство аллелей C282Y, H63D и S65C гена HFE не является достаточным фактором для формирования нарушений метаболизма железа. Интронные полиморфизмы гена HFE потенциально могут влиять на особенности сплайсинга и изменять состав кодируемых геном мРНК у человека.

Научно-практическая значимость. Произведена оценка вклада носительства аллелей C282Y и H63D гена HFE в риск возникновения наследственного гемохроматоза 1-го типа и некоторых патологий, связанных с нарушением метаболизма железа, а также на продолжительность жизни человека на территории России. Результаты данного исследования могут быть использованы в подразделениях Минздравсоцразвития России. На разработанную тест-систему диагностики мутаций C282Y и H63D гена HFE получен Патент на изобретение № 2144566, 2000г «Способ диагностики предрасположенности к гемохроматозу». Тест - система используется среди медицинских генетиков для диагностики наследственного гемохроматоза.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на IV Российской конференции «Гепатология сегодня», 1999г. Москва, Российская конференция «Гепатология сегодня», Москва, 2001, IV ISTC Scientific Advisory Committee Seminar on “Basic Science in ISTC Activities”, Novosibirsk, 2001, II Объединённой научной сессии СО РАН и СО РАМН «Новые технологии в медицине», Новосибирск, 2002, II Международной конференции «Математическая биология и биоинформатика», Пущино, 2008, V съезде ВОГиС, посвящённом 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина, Москва, 2009.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 33 работы, из них 7 в рецензируемой печати, в том числе 1 патент РФ, 5 статей в журналах из списка ВАК.

Структура и объём работы. Работа изложена на 137 страницах машинописного текста и состоит из введения, 4-х глав, выводов и списка литературы, включающего 293 источника. Текст проиллюстрирован 17-ю рисунками и содержит 19 таблиц.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Выборки. Выборка русских была сформирована из жителей г. Новосибирска, Тамбова и Челябинской области (447 чел). Выборка финно-угров состоит из представителей народностей мордвы, хантов и манси (104 чел). Тувинцы (110 чел), алтайцы (102 чел), казахи (62 чел), нивхи (32 чел) и чукчи (125 чел) представляют монголоидную расу. В выборку пациентов с хроническими диффузными заболеваниями печени включено 185 чел, среди них выделены пациенты с синдромом перегрузки железом (59 чел). Выборку пациентов с гемохроматозом составили 13 чел. Выборка пациентов с болезнью Альцгеймера (222 чел) состояла из лиц с поздней формой этого заболевания. Выборка пациентов с сахарным диабетом (СД) была составлена из 148 чел., страдавших разными формами СД и находившимися на лечении в Отделении эндокринологии Областной больницы, г.Тамбова. Выборка долгожителей (271 чел) была сформирована из лиц старше 90-летнего возраста. Гаплотипичесий анализ был проведён для 359 представителей разных этнических групп.

Методы. Молекулярно-генетический анализ ДНК включал в себя выделение, очистку, ПЦР-ПДРФ анализ, а в сомнительных случаях секвенирование. Доверительные интервалы оценок частот аллелей были подсчитаны по формуле: vp(1-p)/2N, где p частота аллеля, N - размер выборки. Соблюдение соотношения Харди-Вайнберга было оценено методом хи-квадрат. Для определения неравновесия по сцеплению между экзонными мутациями и интронными гаплотипами был выполнен анализ таблиц сопряжённости. Для выявления взаимосвязи между аллелями с различными интронными гаплотипами использовали опубликованные ранее данные гаплотипического разнообразия локуса HFE [Toomajian and Kreitman, 2002]. Метод Dollo parsimony (программа DOLLOP пакета PHYLIP) [Felsenstein, 1989] с параметрами по умолчанию был применён к этим данным для построения эволюционного дерева. База данных ДНК экзонинтронных границ генов человека для контекстного анализа была загружена из http://hsc.utoledo.edu/bioinfo/eid/, [Fedorov et al., 2001]. Для анализа последовательностей ДНК и РНК использовалась информация баз данных http://www.ncbi.nlm.nih.gov, http://genome.ucsc.edu и http://genome.ewha.ac.kr.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Результаты оценки частот наиболее распространённых экзонных полиморфизмов C282Y, H63D и S65C гена HFE в этнических группах Сибири приведены в табл. 1. Русские по частотам каждой из трёх мутаций гена HFE близки к этническим группах Центральной Европы [Merryweather-Clarke et al., 2000]. Частота носительства генотипа C282Y/C282Y, предрасполагающего к развитию наследственного гемохроматоза 1 типа, составляет 0.0012 у русских. В обследованных монголоидных и финно-угорских этнических группах Сибири частота замены C282У не превышает 1%. Неожиданным является факт выявления у финно-угров высокой частоты варианта 63D гена HFE, характерной для европеоидных популяций, при отсутствии варианта 282Y, подобно большинству азиатских популяций. Монголоидные этнические группы гетерогенны по частоте замены H63D (1-8%). Мутация S65C обнаружена только у русских, чукчей и манси.

Для оценки вклада мутаций гена HFE в развитие патологических процессов в организме человека проводили генотипирование выборок пациентов с различными хроническими заболеваниями и выборки долгожителей. Результаты приведены в табл.2.

Таблица 1. Генотипы и частоты аллелей с мутациями C282Y, H63D и S65C гена HFE в некоторых этнических группах Сибири.

Примечание: n - размер выборки, * - генотипированной по аллелям C282Y и H63D, цифра в скобках -генотипированной также и по аллелю S65C.

Среди пациентов с НГ доля гомозигот C282Y/C282Y была снижена по сравнению с западно-европейскими выборками (50-100%) и составила 30%, тогда как доля гетерозигот C282Y/H63D была повышена с 3-8% до 15%. Это указывает на более существенный вклад других генетических и средовых факторов в формирование клиники гемохроматоза в России. Среди долгожителей обнаружено достоверное снижение (ч²=6.69, p=0.01) частоты аллеля C282Y по сравнению с популяционной выборкой русских. Это соответствует данным, полученным в Дании [Bathum et al., 2001] и указывает на негативное влияние носительства C282Y на продолжительность жизни. Частота аллеля 63D гена HFE достоверно повышена в выборках пациентов с гемохроматозом, синдромом перегрузки железом, сахарным диабетом и болезнью Альцгеймера по сравнению с популяционной выборкой русских. Однако, судя по высокой представленности 63D у долгожителей, нельзя предполагать её однозначно негативный эффект. Среди пациентов с СД типа 2 было выявлено 2 носителя генотипа C282Y/C282Y, у которых диабет оказался следствием развития недиагностированного НГ1.

При оценке зависимости показателей железа крови от генотипа по HFE в выборке здоровых женщин (173 чел) г. Новосибирска не выявлено достоверных различий между носителями разных генотипов. Это может быть объяснено с одной стороны небольшим размером выборки, а с другой - ранее показанной на европейских выборках невысокой биохимической пенетрантностью содержащих мутации генотипов, в особенности у женщин.

Образцы ДНК из популяционных выборок и образцы ДНК пациентов (русских) с различными хроническими заболеваниями, подвергли гаплотипическому анализу по трём интронным полиморфизмам IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g гена HFE. Результаты гаплотипического анализа приведены в табл. 3. Во всех проанализированных этнических группах Сибири нами обнаружено 4 варианта гаплотипов по полиморфизмам IVS2(+4)t/c, IVS4(-44)t/c и IVS5(-47)a/g: TTG, CTA, TTA и CCA из 8-ми теоретически возможных. Показана высокая достоверность сцепленности мутаций C282Y с гаплотипом TTG (ч²=76.0, P =2.7Ч10^-18), H63D - с CTA (ч²=271.8, P =4.7Ч10^-61) и S65C - с CCA (ч²=26.8, P =2.3Ч10^-7).

Таблица 2. Частоты генотипов и аллелей гена HFE в выборках пациентов с различными хроническими заболеваниями.

Примечание: n - размер выборки, , СПЖ- синдром перегрузки железом. Жирным шрифтом выделены показатели, имеющие достоверные (* p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001 ) отличия от контроля.

Таблица 3. Аллель-специфическая сцепленность мутаций С282Y, H63D и S65C гена HFE с интронными гаплотипами по полиморфным сайтам IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g в этнических группах Сибири.

Примечание: * - дополнительная выборка носителей замен C282Y, H63D и S65C,использовавшаяся для анализа сцепления, выделение серым - однозначно определяемые генотипы, которые использовались для оценки неравновесия по сцеплению, курсив - наиболее вероятный генотип из возможных, N -не исследовались.

Для оценки популяционных частот гаплотипов использовали данные по частотам аллелей с экзонными мутациями (Табл.1) и частотам интронных гаплотипов в хромосомах WT (Табл.3). Результаты приведены в табл.4.

ген наследственный гемохроматоз полиморфизм

Таблица 4. Частоты аллей с интронными гаплотипами (TTG, CTA, CCA, TTA) гена HFE в этнических группах Сибири.

Примечание: * частоты аллелей рассчитаны как fЧw, где f частота определённого интронного гаплотипа в хромосомах типа WT (из табл. 3), w - частота аллеля WT из табл. 1. Частоты аллелей с мутациями были взяты из табл. 1.

В группе центрально-азиатских монголоидов наиболее часты варианты, содержащие самый «молодой» гаплотип CCA. У финно-угров, чукчей и русских преобладает TTG. Аллели, содержащие наиболее древний гаплотип ТТА, представлены с близкими частотами (12-17%) во всех группах, кроме финно-угров и чукчей, у последних его частота составляет 2 и 4%, соответственно. Аллели с гаплотипом СТА практически отсутствуют у чукчей. Таким образом, распределение гаплотипов и генотипов гена HFE этноспецифично, при этом арктические монголоиды (чукчи) отличаются от центрально-азиатских. Анализ последовательностей гена HFE у представителей трёх разных выборок (Африка, Азия, Европа), взятых из [Toomajian and Kreitman, 2002], показал, что наиболее структурно гетерогенными являются последовательности гена с гаплотипами TTG и CTA. Они были разделены нами на эволюционно различающиеся подгруппы, обозначенные как TTG1, 2, 3 и CTA1, 2, 3, в соответствии с наборами присутствующих в них ОНП. Согласно данным анализа было построено бескорневое эволюционное дерево последовательностей ДНК этого гена, оно приведено на рис.1. Очевидно, что в ходе эволюции нуклеотидные последовательности гена HFE существенно дивергировали. Исходя из полученной структуры дерева, можно предположить, что замена IVS2(+4)t>c независимо появлялась минимум трижды в разных последовательностях гена HFE в ходе эволюции человека. Подобная конвергентность её появления может свидетельствовать в пользу предположения о функциональной значимости полиморфного сайта.

Рисунок 1. Эволюционное дерево, построенное методом минимальной парсимонии, показывающее взаимосвязь между последовательностями гена HFE человека с гаплотипами TTG, CTA, CCA и TTA с отмеченными мутациями по данным из [Toomajian and Kreitman, 2002] и нашим данным.

Примечание: нумерация полиморфных сайтов дана согласно последовательности из GenBank acc. no. Z92910, белым цветом выделены предполагаемые точки возникновения IVS2(+4)t>c.

Контекстный анализ участков ДНК в местах расположения интронных полиморфизмов показал, что они потенциально могут влиять на сплайсинг пре-мРНК гена HFE. IVS2(+4)t/c находится в интронной части донорного сайта сплайсинга и потенциально может влияет на выбор 5'сайта сплайсинга (5'cc) U1 РНП. В пользу неслучайности закрепления этой замены говорит также присутствие С в позиции (+4) этого интрона у большинства генов ортологов.

IVS4(-44)t/c расположен в позиции (-5) одного из 3-х близко расположенных потенциальных 5'cc интрона 4. При удержании фрагментов ДНК этого интрона в составе мРНК возможно образование растворимого варианта белка HFE за счёт криптического стоп-кодона, расположенного в начале интрона 4. Позиция (-5) 5'cc в экзоне 4 консервативна у генов ортологов HFE, этот факт косвенно указывает на её значимость в донорном сайте сплайсинга. Т.о. замена в одном из 5'cc потенциально может оказывать влияние на выбор 5'сс при сплайсинге мРНК с удержанием фрагмента интрона 4.

IVS5(-47)a/g находится внутри нуклеотидного блока, который гомологичен домену U6 мяРНК, ответственному за связь с U4 мяРНК, и одновременно комплементарен фрагменту U2 мяРНК. Этот полиморфизм потенциально может влиять на скорость сборки сплайсосомы между экзонами 5 и 6. Предположение о возможной функциональной значимости этих интронных полиморфизмов подтверждается существованием большого набора изоформ мРНК гена HFE, представленных в базах данных.

Вариабельность структуры ДНК на участках гена, причастных к регуляции сплайсинга, может влиять на состав паттерна изоформ мРНК HFE. Таким образом, носители различных генотипов по гену HFE могут различаться наборами альтернативных мРНК, что, в свою очередь, может влиять на их фенотипические характеристики в норме и при патологиях. Данное предположение требует экспериментальной проверки.

При сравнении частот гаплотипов в популяционной выборке русских, выборках долгожителей и пациентов с СПЖ было обнаружено, что в последней из них снижено количество аллелей с гаплотипом ССА. Частоты варианта IVS4(-44)c, определяющего аллель ССА приведены в табл.5.

Таблица 5. Частоты генотипов и аллелей по полиморфизму IVS4(-44)t/c гена HFE в выборках долгожителей, пациентов с синдромом перегрузки железом (СПЖ) и популяционном контроле.

Примечание: n - размер выборки, * p<0.05.

Показано достоверное отличие выборки пациентов с СПЖ от популяционной выборки русских по частотам аллеля IVS4(-44)с без мутации S65C (ч²=4.02, p<0.05). Носительство этого варианта может, таким образом, препятствовать развитию СПЖ в качестве осложнения хронических заболеваний печени. Однако очевидно, что необходимо дальнейшие исследования для получения более точной информации

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В настоящей работе представлены результаты генотипирования 1618 представителей различных этнических групп России по аллелям С282Y, H63D и S65C гена HFE, из них для 359 было проведено генотипирование по трём интронным полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g этого гена.

В результате показано существование 4 вариантов интронных гаплотипов: TTG, CTA, CCA и TTA. Аллели с экзонными полиморфизмами С282Y, H63D и S65C оказались сцеплены с гаплотипами TTG, CTA и CCA, соответственно. Распределение полиморфизмов, гаплотипов и генотипов гена HFE этноспецифично.

Контекстный анализ участков ДНК в местах расположения интронных полиморфизмов выявил потенциальную возможность их влияния на особенности сплайсинга и в результате на состав кодируемых геном мРНК.

1. Распределение аллелей с экзонными мутациями гена регулятора метаболизма железа HFE на территории России этноспецифично: C282Y за единичными исключениями встречается только у русских, S65C с равными частотами у русских, манси и чукчей, H63D с максимальными частотами обнаружена у финно-угров и русских, практически отсутствует у чукчей, а остальные монголоидные популяции по этому признаку занимают промежуточное положение.

2. Частота генотипа C282Y/C282Y, обусловливающий генетическую предрасположенность к развитию наследственного гемохроматоза 1 типа, составляет у русских 0.0012. В других этнических группах России вероятность развития этого заболевания крайне низка.

3. Среди пациентов с наследственным гемохроматозом доля гомозигот C282Y/C282Y составляет только 30%, что указывает на значительную роль других факторов в формировании данного заболевания на территории России. 4. Частота аллеля 63D гена HFE достоверно повышена в выборках пациентов с гемохроматозом, синдромом перегрузки железом, сахарным диабетом и болезнью Альцгеймера относительно популяционной выборки. Изменений в частоте этого аллеля у долгожителей не обнаружено, что указывает на отсутствие однозначно негативного эффекта от его носительства.

5. У долгожителей наблюдается достоверное снижение частоты аллеля C282Y гена HFE относительно популяционной, что может указывать на негативное влияние носительства данного аллеля на продолжительность жизни.

6. Из 8-ми возможных интронных гаплотипов по полиморфизмам IVS2(+4)t/c IVS4(-44)t/c, IVS5(-47)a/g гена HFE в исследованных этнических группах России обнаружено только 4: TTG, ТТА, CTA и CCA.

Каждый из экзонных полиморфизмов C282Y, H63D и S65C сцеплен только с определённым интронным гаплотипом: TTG, CTA, CCA, соответственно. Распределение гаплотипов гена HFE на территории России этноспецифично, следовательно, ОНП и гаплотипы гена HFE информативны в качестве аутосомных молекулярных маркеров для филогенетического анализа.

7. Из данных контекстного анализа участков ДНК в местах локализации интронных полиморфизмов гена HFE следует, что эти ОНП потенциально значимы для сплайсинга пре-мРНК. IVS2(+4)t/c потенциально может влиять на выбор 5'сайта сплайсинга посредством U1 РНП. IVS4(-44)t/c потенциально может воздействовать на процесс удержания последовательности ДНК интрона 4 в составе мРНК HFE и, опосредованно, на образование растворимого варианта белка. IVS5(-47)a/g потенциально может оказывать влияние на взаимодействие пре-мРНК с U6 и U2 РНП и изменять скорость сборки сплайсосомы вблизи экзона 5.

Таким образом, носители различных генотипов по интронным гаплотипам гена HFE потенциально могут различаться наборами экспрессируемых альтернативных мРНК.

8. Особенности накопления замен в ходе эволюции последовательностей гена HFE указывают на неоднократность возникновения замены в 4-ой позиции интрона 2 (IVS2(+4)t->c). Это может являться независимым подтверждением функциональной значимости этой замены.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ромащенко А.Г., Михайлова С.В., Воевода М.И., Кобзев В.Ф. Способ диагностики предрасположенности к гемохроматозу. Патент на изобретение № 2144566, 2000г

2. Кулагина Е.А., Михайлова С.В. Хронические диффузные заболевания печени с синдромом перегрузки железом // Бюллетень СО РАМН, 2000, №2 (96), С. 74-77. (список ВАК)

3. Михайлова С.В., Кобзев В.Ф., Ромащенко А.Г., Хаснулин, Воевода М.И Распространение аллелей C282Y, H63D и S65C гена HFE и предрасположенности к нарушениям метаболизма железа в популяциях России // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2001, Т.XI, №4, С.13-17. (список ВАК)

4. Михайлова С.В., Кобзев В.Ф., Куликов И.В., Ромащенко А.Г., Хаснулин В.И., Воевода М.И. Полиморфизм гена HFE, ассоциированного с наследственным гемохроматозом, в популяциях России // Генетика, 2003 Т.39 № 7C. 988-995. (список ВАК)

5. Михайлова С.В., Кобзев В.Ф., Куликов И.В., Ромащенко А.Г., Хаснулин В.И, Воевода М.И. Распространённость аллелей С282Y, H63D и S65C гена HFE, ассоциированного с наследственным гемохроматозом в популяциях народов Сибири // Сборник «Генофонд населения Сибири» Изд-во НИИ археологии и этнографии СО РАН Новосибирск 2003 С. 82-86.

6. Кулагина Е.А., Михайлова С.В., Ромащенко А.Г., Воевода М.И., Курилович С.А. Полиморфизм гена HFE у больных хроническим гепатитом С // Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии, 2005, №4, С.29-34. (список ВАК)

7. Михайлова С.В. , Онопченко О.В., Суханов А.В., Максимов В.Н., Гаскина Т.К., Ромащенко А.Г., Воевода М.И. Гаплотипический анализ гена HFE в популяции русских и среди пациентов с мультифакториальными заболеваниями // Вестник ВОГиС, 2006. Т. 10, №3, С. 504-513. (список ВАК)

8. Михайлова С.В., Бабенко В.Н., Максимов В.Н. , Воевода М.И., Кобзев В.Ф., Ромащенко А.Г. Оценка потенциальной функциональной значимости полиморфизмов IVS2(+4) t/c, IVS4(-44) t/c и IVS5(-47) a/g гена HFE, ассоциированного с наследственным гемохроматозом человека // Математическая биология и биоинформатика, 2008 Т.3. №2 С. 60-68.

Размещено на Allbest.ru