Способ стабилизации биологических свойств лептоспир при хранении

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Способ стабилизации биологических свойств лептоспир при хранении

В.В. Зайцев

Аннотация

Автором статьи изучена стабилизация и поддержание свойств лептоспир на питательных средах разного состава, разработан способ контроля признаков их вирулентности и жизнеспособности. На основании проведенных исследований предложена рецептура питательной среды, в состав которой входит сыворотка крови овец (кроликов), фосфатный буфер с рН 7,0-7,4 и фактор биосинтеза специфических антигенов в соотношении 1:18:1.

Annotation

The article examines stabilization and maintenance of leptospirs' properties in nutritive mediums of different composition. We have developed a method of control of signs of their virulence and viability. On the basis of conducted research we have suggested composition of nutritive medium, which includes serum of blood of sheep (rabbits), phosphate buffer with pH 7.0-7.4 and factor of biosynthesis of specific antigens in correlation of 1:18:1.

Введение и анализ источников

вирулентность антиген бактерия

Вирулентность лептоспир является одним из наиболее вариабельных, сравнительно быстро, легко и безвозвратно утрачиваемых в лабораторных условиях признаков. С потерей вирулентности, как правило, снижается антигенная и, самое главное, иммуногенная активность штаммов лептоспир. Отсюда понятен интерес к вопросу о стабильном сохранении вирулентности у лептоспир.

Ряд авторов сообщают о поддержании штаммов лептоспир в вирулентном состоянии путем их пассажа через организм морских свинок, золотистых хомячков, крольчат 8-10-дневного возраста при хранении в жидком азоте (при температуре минус 1960С), при температуре минус 60-700С. Однако в целом вопрос о сохранении вирулентных свойств штаммов нуждается в изучении и уточнении.

В литературе имеются работы, посвященные изучению морфологии колоний лептоспир, выращенных на плотных питательных средах различного состава [1, 4, 8]. При этом обращает на себя внимание многообразие описываемых типов колоний [7]. Основным фактором, обуславливающим многообразие типов, считается состав питательной среды [3].

В то же время в литературе имеются сведения об изменении морфологии колоний лептоспир по мере их роста и развития [4].

Плотные питательные среды широко используются в бактериологии для селекции и отбора различных бактерий по типу колоний. В настоящее время отсутствуют рекомендации об использовании плотных питательных сред определенного состава для контроля вирулентности и жизнеспособности лептоспир. Жизнеспособность контролируется визуально по проценту подвижных особей лептоспир в поле зрения микроскопа [8].

Сублимация - широко распространенный метод сохранения различных видов микроорганизмов - до настоящего времени не используется для поддержания лептоспир. При сублимации микроорганизмы переходят в состояние анабиоза с частичным или полным прекращением обменных процессов.

Многочисленные литературные данные свидетельствуют в пользу лиофилизации, которая позволяет сохранить самые лабильные культуры [2, 5, 6].

Проблемы сушки культур лептоспир, в отличие от других микроорганизмов, остается до сих пор нерешенными. Поэтому разработка условий стабилизации лептоспир путем сублимации является актуальной задачей.

Цель исследований - разработать перспективный способ стабилизации лептоспир в процессе длительного хранения.

Методы исследования

В работе по оптимизации условий стабилизации лептоспир использовали 6 штаммов: L. pomona ВГНКИ-6; L. tarassovi ВГНКИ-4; L. grippothyphosa ВГНКИ-1; L. icterrohaemorragia ВГНКИ-2; L. conicola ВГНКИ-3; L. hardjo ВГНКИ-5.

Первым этапом работы явилась стабилизация и поддержание свойств лептоспир на питательных средах.

Поставленная цель достигалась тем, что к смеси белковой основы, буферного раствора добавляли фактор биосинтеза специфических антигенов.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что среда для пересева лептоспирозных бактерий содержит сыворотку крови овец и фосфатный буфер с рН 7,0-7,4 и дополнительно фактор биосинтеза специфических антигенов.

Сыворотку крови овец, фактор биосинтеза специфических антигенов и фосфатно-буферный раствор смешивают в соотношении 1:1:18 или 2:1:17.

Для проведения исследований готовили питательные среды 8 способами:

Способ 1. Из яремной вены овец производили забор крови. После образования сгустка форменных элементов и фибрина отделяли сыворотку, прогревали при температуре 56-580С в течение 30-60 минут. Инактивированную сыворотку фильтровали последовательно через фильтры с величиной пор 1,0 мкм, 0,45 мкм и 0,22 мкм. Среду готовили путем смешивания сыворотки крови овец, фактора биосинтеза и фосфатно-буферного раствора в соотношении 1:1:18.

Способ 2. Способ осуществляли аналогично примеру 1, но для приготовления среды использовали сыворотку крови кролика. Сыворотку крови кролика, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 1:1:18.

Способ 3. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови овец, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 2:1:17.

Способ 4. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови кролика, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 2:1:17.

Способ 5. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови овец, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 1:1:23.

Способ 6. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови кролика, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 1:1:23.

Способ 7. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови овец, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 6:3:41.

Способ 8. Способ осуществляли аналогично способу 1, но сыворотку крови кролика, фактор биосинтеза и фосфатно-буферный раствор смешивали в соотношении 6:3:41.

Для оценки антигенной активности лептоспиры пересевали 10-кратно с интервалом 5 суток на приготовленной питательной среде и вводили внутривенно кроликам по 15 млн. микробных клеток. Через 24 суток у иммунизированных животных производили забор крови и учет титров специфических антител в РМА.

На втором этапе работ разрабатывали способ контроля признаков вирулентности и жизнеспособности лептоспир.

Для выращивания лептоспир в опытах использовали следующие питательные среды:

- сывороточная питательная среда на основе сыворотки барана с препаратом БСТ (ССБ-БСТ);

- сывороточная питательная среда на основе сыворотки барана (ССБ);

- сывороточная витаминизированная среда с липополисахаридом сальмонелл (СВС-ЛПСС);

- сывороточная витаминизированная среда с липополисахаридом эшерихий (СВС-ЛПСЭ).

На все варианты питательных сред засевали лептоспиры разных серогрупп и инкубировали в течение 7, 10, 12, 15 и 20 суток при температуре 280С.

Концентрацию выросших лептоспир определяли с помощью микроскопа в темном поле зрения (увеличение микроскопа х 400).

Культуры лептоспир смешивали с защитными средами разного состава: снятым молоком (СМ), нормальной сывороткой барана (НСБ) и сахарозо-желатиновой средой (СЖС).

Культуры лептоспир, выращенные на средах разного состава, смешивали с защитными средами, фасовали по 5 см3 во флаконы и укупоривали резиновой пробкой типа «УЛ» и замораживали в течение 24 часов при температуре минус 600С.

Также культуры лептоспир, выращенные на ССБ, концентрировали в 10 раз и замораживали.

В отдельных опытах в культуры лептоспир до замораживания добавляли стабилизирующий раствор (СР) в концентрации 0,05%.

Количество жизнеспособных лептоспир устанавливали на плотных питательных средах разного состава:

среда №1 - сывороточная среда с 10% сыворотки крови овец, 1% агар-агара «Дифко» и 89% фосфатно-буферного раствора;

среда №2 - сывороточная среда с 10% сыворотки крови овец, 1% агар-агара «Дифко», 10% липополисахаридов сальмонелл (ЛПСС) и 79% фосфатно-буферного раствора.

Посев лептоспир на указанные питательные среды проводили по методу Дригальского. Опыты ставили не мене чем в 3-4 повторностях. Всего было проведено 3240 исследований.

Посевы лептоспир на плотных средах инкубировали в термостате при температуре 280С. Наблюдение за ростом лептоспир и формированием колоний проводили ежедневно в течение 21 суток.

Для определения жизнеспособности клеток культуры лептоспир, выращенных на разных средах, разводили от 10-1 до 10-8 питательной средой и высевали в чашки Петри с плотной средой из разведений 10-7 и 10-8 в объеме 0,1 см3. Учет количества жизнеспособных клеток вели через 15 суток.

Культуры через 7, 14 и 21 день выращивания смешивали в соотношении 1:1, 1:2, 1:3, 1:4 и 1:9 с защитной средой, фасовали во флаконы емкостью 10,0 см 3 по 1,0; 2,5 и 5,0 см 3, замораживали в течение 24-36 часов при температуре минус 400С, а затем высушивали в течение 112-116 часов. При этом подогрев включали через 42 часа сублимации.

Содержание жизнеспособных клеток устанавливали путем посева на плотную среду №2.

1. Основная часть

При изучении стабилизации и поддержания вирулентных свойств лептоспир на питательных средах, приготовленных разными способами, нами получены следующие результаты:

Способ 1. Титр антител в сыворотках крови кроликов к лептоспирам серогрупп Pomona, Tarassovi, Grippothyphosa, Icteroharmorrhagiae, Conicola и Sejroe составил соответственно 1:1600, 1:800, 1:1600, 1:800, 1:800 и 1:1600.

Способ 2. Титр антител составил соответственно 1:1600, 1:800, 1:3200, 1:1600, 1:800 и 1:1600.

Способ 3. Титр антител составил соответственно 1:1600, 1:800, 1:3200, 1:1600, 1:800 и 1:1600.

Способ 4. Титр антител составил соответственно 1:1600, 1:800, 1:1600, 1:1600, 1:800 и 1:1600.

Способ 5. Титр антител составил соответственно 1:400, 1:400, 1:800, 1:400, 1:400 и 1:800.

Способ 6. Титр антител составил соответственно 1:400, 1:400, 1:800, 1:800, 1:400 и 1:400.

Способ 7. Титр антител составил соответственно 1:400, 1:400, 1:400, 1:800, 1:400 и 1:400.

Способ 8. Титр антител составил соответственно 1:400, 1:400, 1:800, 1:400, 1:400 и 1:400.

Из представленных данных видно, что лептоспиры всех серогрупп при выращивании на питательной среде, приготовленной путем смешивания сыворотки крови овец и кроликов, фактора биосинтеза и фосфатно-буферного раствора в соотношении 1:1:18 и 2:1:17, не утрачивали антигенной активности (титр 1:800 и выше).

Смешивание компонентов среды при других соотношениях, напротив, способствует снижению антигенной активности выращенных лептоспир (титр 1:400).

Важным моментом при проведении стабилизации жизнеспособности лептоспир при их хранении было первоначально подобрать состав жидкой среды для культивирования, которая бы обеспечивала не только высокое накопление лептоспир, но и их жизнеспособность.

Для этого разные серотипы микроорганизмов высевали на среды разного состава и инкубировали при температуре 280С.

Из результатов, представленных в таблице, видно, что предлагаемые оптимизированные сывороточные среды обеспечивают не только высокое общее накопление лептоспир, но и высокую их жизнеспособность.

Таблица 1 Влияние состава среды на жизнеспособность лептоспир

В ходе исследований по изучению влияния состава среды на выживаемость замороженных культур лептоспир установлено, что оптимизированная сывороточная среда, особенно с СР, обеспечивала сохранение жизнеспособности лептоспир до 32,5-35,0%.

В процессе концентрирования происходит травмирование и нарушение структуры лептоспир, которые усугубляются в процессе замораживания - оттаивания.

Следует отметить, что более эффективную реактивацию обеспечивала плотная оптимизированная сывороточная среда №2. Результаты учета жизнеспособности на этой среде на 32-36% были выше, чем на среде №1.

Результаты исследований по разработке способа контроля признаков вирулентности и жизнеспособности лептоспир показали, что рост авирулентных клонов штаммов микроорганизмов опережал рост патогенных на 2,9-4,15 дней. Причем эта закономерность наблюдалась при культивировании на всех испытанных средах. Наблюдения за динамикой развития колоний у всех штаммов лептоспир позволили выделить 3 основных периода их формирования:

1) период поверхностного роста;

2) период внедрения в агар;

3) период глубокого врастания.

Период поверхностного роста характеризовался появлением в верхнем слое агара мелких точечных колоний в виде зерен или пушинок, которые постепенно увеличивались в диаметре, разрастаясь по поверхности. Колонии далее приобретали округлую форму с постепенно истончающимися краями. Диаметр их колебался от 1 до 8 мм.

Продолжительность первого периода у авирулентных клонов составляла 4,2±1,1 сут., у патогенных - 7,1±1,36 сут.

Колонии во втором периоде становились полупрозрачными, увеличивались в диаметре. Характерной особенностью колоний этого периода являлось начало их внедрения в агар, что приводило к уплотнению краев и формированию ободка. Можно предположить, что ободок является самостоятельным структурным элементом, так как при слиянии близкорастущих колоний он исчезал. Продолжительность этого периода по времени составляет 7-18 сут. и более. Размер колоний в этот период варьировал в широком диапазоне - от 2 до 8 мм в диаметре. Это зависело от скорости размножения, быстроты внедрения в агар и состава питательной среды.

В третьем периоде происходило дальнейшее углубление колоний лептоспир в толщу агара до самого дна чашки.

Колонии, глубоко вросшие в агар, продолжали активно увеличиваться в диаметре еще в течение 20-27 суток, достигая максимальных размеров.

Выявленная закономерность формирования колоний прослеживалась на всех испытанных средах и у всех исследуемых штаммов лептоспир и не зависела от их видовой и серогрупповой принадлежности.

По темпу роста и формирования колоний, а также по их размерам клоны патогенных лептоспир отставали от сапрофитных.

Размер колоний, глубина и скорость врастания различных штаммов зависела от состава питательных сред, плотности посева, рН, температуры культивирования.

Появление колоний лептоспир в одной чашке происходило не одномоментно, что приводило к обнаружению колоний, находящихся в разных периодах формирования и имевших в связи с этим различные морфологические признаки.

Отмечено также, что развитие колоний могло прекратиться на любом из описанных периодов развития. Это явления отмечается у патогенных клонов.

Нами были выявлены колонии неправильной формы и неоднородной структуры, которые неглубоко врастали в агар в виде отдельных узелков. Колонии такого типа следует отнести к «R»-форме.

Учитывая вышеизложенное, следует сделать вывод, что изменение морфологии колоний лептоспир следует проводить с учетом периода их развития.

В ходе проведенных исследований нами установлено, что лептоспиры независимо от видовой принадлежности и серотипа формируют на плотной питательной среде идентичные по морфологии колонии. В зависимости от срока культивирования колонии лептоспир претерпевают морфологические изменения, последовательно сменяющиеся в связи с тремя периодами развития: периодом поверхностного роста, периодом внедрения в агар и периодом глубокого врастания.

С целью стабилизации свойств лептоспир отбирали колонии округлой формы диаметром 6-10 мм, которые не переходили во 2-й период развития, а также проявляли рост в 1-м периоде развития с 7 по 15 сутки, или колонии, диаметр которых в 3-м периоде развития составляет 12-18 мм.

Для отбора клонов штаммов лептоспир наиболее предпочтительно использовать плотную среду №2, которая позволяет на 23-32% больше выявить жизнеспособных клеток, т.к. является более оптимизированной.

Таким образом, использование новых плотных питательных сред позволило вести целенаправленный отбор штаммов по фактору патогенности и жизнеспособности.

Из результатов исследований, направленных на оптимизацию условий стабилизации лептоспир, установлено, что наиболее высокая жизнеспособность лептоспир отмечается при смешивании культуры лептоспир и защитной среды в соотношении 4:1 и фасовке в объеме 2,5 см3.

Заключение

Для стабилизации и поддержания свойств лептоспир предложена среда, в состав которой входит сыворотка крови овец (кроликов), фосфатный буфер с рН 7,0-7,4 и фактор биосинтеза специфических антигенов в соотношении 1:18:1.

Литература

1. Ананьина, Ю.В. К характеристике патогенных свойств лептоспир: автореф. дис. … канд. мед. наук / Ю.В. Ананьина. М., 1974. 22 с.

2. Панин, А.П. Вакцина против лептоспироза животных лиофилизированная / А.Н. Панин [и др.] // Ветеринария. 2002. №1. С. 21-24.

3. Ситьков, В.И. Изготовление и испытание малобелковой питательной среды для культивирования лептоспир / В.И. Ситьков, В.И. Бобрышев, И.К. Тутов // Сб.науч. тр. Ставропольской ГСХА. Ставрополь, 1994. С. 42-45.

4. Ситьков, В.И. Новая питательная среда для культивирования лептоспир / В.И. Ситьков, В.И. Бобрышев, И.К. Тутов // Материалы Междунар. конф. Барнаул, 1995. С. 98-99.

5. Ситьков, В.И. Совершенствование технологии промышленного изготовления вакцины для профилактики лептоспироза животных / В.И. Ситьков // Сб. науч. трудов Ставропольской ГСХА. Ставрополь, 1995. С. 33-35.

6. Ситьков, В.И. Основные биотехнологические приемы изготовления вакцин для профилактики лептоспироза / В.И. Ситьков // Материалы Всесоюз. конф. РАН. Ставрополь, 1996. С. 32-33.

7. Ситьков, В.И. Научные и практические основы промышленного производства и применения вакцин: дисс. … д-ра вет. наук / В.И. Ситьков. М., 1997. С. 29-33.

8. Соболева, Г.Л. Рост лептоспир в альбуминовой питательной среде / Г.Л. Соболева // Биологические препараты против инфекционных болезней животных. М., 1981. С. 51-54.

Размещено на Allbest.ru