Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности её использования в селекции и семеноводстве

Размещено на http://www.allbest.ru/

Учреждение Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Изменчивость в культуре картофеля (Solanum tuberosum L.) in vitro и возможности её использования в селекции и семеноводстве

03.01.06 - биотехнология

Леонова Нина Семеновна

Улан-Удэ - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институт цитологии и генетики Сибирского отделения РАН, г. Новосибирск

Ведущая организация Сибирский Институт физиологии и биохимии растений, г. Иркутск

Защита диссертации состоится 2009 года на заседании диссертационного совета Д 212.039.02 в Восточно-Сибирском Государственном Технологическом Университете МОБРФ по адресу: 670013 Республика Бурятия г. Улан-Удэ, ул. Ключевская, 40а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Восточно-Сибирского Государственного Технологического Университета

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь регионального диссертационного совета, доктор технических наук, и.о. профессора Н.И. Хамнаева.

Общая характеристика работы

Актуальность работы

Картофель в качестве продовольственной культуры потребляют более 3-х млрд человек населения планеты, и его выращивают в 150 странах мира. Одна из проблем производства картофеля состоит в том, что он в значительной степени поражается вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями и вредителями. Восприимчивость картофеля к болезням и вредителям сделала его культурой номер два в мире по использованию пестицидов. Экономическая ситуация в России требует создания новых сортов картофеля, отличающихся от сортов «интенсивного типа», которые были главной задачей селекции в период 90-х годов прошлого века. Современные сорта должны обладать комплексной устойчивостью к вирусным заболеваниям к фитофторозу, колорадскому жуку и к цистообразующим нематодам. Кроме того, в каждой конкретной зоне возделывания картофеля существуют патогены локального значения. В Сибири, где длинная холодная весна и жаркое сухое лето, возделываемые сорта должны обладать устойчивостью к ризоктониозу. Использование методов биотехнологии и генетической инженерии открывает новые перспективы получения таких растений. Нельзя утверждать, что с помощью одной лишь сельскохозяйственной биотехнологии можно решить все имеющиеся в мире проблемы, связанные с нехваткой продовольствия, но также и нельзя настаивать на том, что необеспеченность продовольствием можно устранить без применения биотехнологии. Необходимость внедрения в сельское хозяйство нетрадиционных технологий, которые позволили бы поднять на новый уровень производство продуктов питания, в последние годы ощущается все с большей остротой. Для селекционного процесса аспекты клеточной биотехнологии растений имеют огромные перспективы. Одно из важнейших направлений в биотехнологии растений занимает клеточная селекция. Методы клеточной селекции лежат в основе ряда технологий промышленного выращивания клеточных культур, а также оздоровления от вирусных и других инфекций вегетативно размножаемых культур.

Наряду с прикладными биотехнологическими аспектами применения новых подходов селекции неоценимо значение этих работ для развития фундаментальных вопросов генетики и эпигенетики, а также молекулярной биологии и физиологии растений.

Настоящее исследование имеет теоретико-прикладной характер и представляет определенный интерес: как в биологическом, так и в генетико-селекционном плане.

Цель и задачи исследования

Цель заключалась в оценке фенотипической и генетико-биохимической изменчивости в культуре картофеля in vitro под воздействием экзогенных факторов и выявлении возможности использования данной изменчивости в создании новых методов селекции.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

1. Проанализировать фенотипы спонтанных сомаклональных вариантов, возникающих при регенерации в культуре картофеля in vitro, и почковых вариаций.

2. Выявить возможность использования культурального фильтрата Rhizoctonia solani в качестве селективного фактора для получения форм картофеля, устойчивых к данному патогену

3. Изучить влияние фитогормонального состава сред и других экзогенных факторов культивирования in vitro на экспрессию генов, контролирующих синтез белка и аминокислотный состав растворимых белков картофеля, на разных стадиях дифференциации.

4. Проследить влияние фитогормонального состава сред культивирования и стадии дифференциации на экспрессию генов, контролирующих изоферментны.

5. Оценить возможность использования бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, в качестве противовирусного препарата при оздоровлении картофеля от вирусной инфекции методом апикальной меристемы, при микроклональном размножении и создании трансгенных форм.

6. Создать коллекцию генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы от вирусной и грибной инфекции, и показать преимущество использования оздоровленного картофеля в оригинальном семеноводстве Западно-Сибирского региона для получения высоких урожаев экологически безопасного товарного картофеля.

Научная новизна работы

Установлено, что наблюдаемая в ходе онтогенеза изменчивость экспрессии генов, кодирующих растворимые белки и изоферменты, в культуре in vitro носит обратимый характер.

Разработан метод селекции на устойчивость к патогенному грибу Rhizoctonia solani на основе использования культурального фильтрата данного гриба в качестве селективного фактора. Показано, что можно получать направленные сомаклональные изменения, проводя отбор с помощью селективных факторов не только на клеточном уровне, но и на уровне интактных растений, что позволяет вести селекцию, минуя стадию регенерации, являющуюся самым «узким» местом в процессе получения направленных изменений. картофель сомаклональный фитогормональный

Разработан метод оздоровления картофеля от вирусной инфекции путем воздействия бактериальной эндонуклеазы Serratia marcescens на культивируемую апикальную меристему, и получены генетически модифицированные растения картофеля, экспрессирующие ген секреторной нуклеазы Serratia marcescens на сорте Белоярский ранний.

Практическая значимость работы

Разработанный метод оздоровления картофеля от вирусной, бактериальной и грибной инфекций путем применения в качестве хемиотерапевтического препарата бактериальной эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens, помогает не только существенно повысить выживаемость вычленяемой меристемы, но и увеличить выход здоровых растений из регенерировавших меристем. Это существенно облегчает и удешевляет биотехнологические стадии в семеноводстве как самые трудозатратные при оздоровлении картофеля и служит стимулирующим фактором при микроклональном размножении.

На основе разработанного метода создана коллекция генофонда оздоровленного картофеля, которая служит базовым фондом для оригинального семеноводства в Западно-Сибирском регионе.

На основе использования в качестве селективного фактора культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani получены формы картофеля, устойчивые к ризоктониозу.

Результаты исследований использованы и внедрены:

Полученные в данной работе результаты позволяют дать следующие рекомендации.

1. Следует шире применять методы клеточных технологий в сочетании с отбором для получения исходного материала с ценными селекционными признаками.

2. Для создания устойчивых сортов следует применять разработанный нами метод получения устойчивых к R. soliani форм на основе использования для отбора интактных растений вместо клеточной культуры.

3. При оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы целесообразно использовать нуклеазы, которые не только снижают уровень вирусной инфекции, но и стимулируют приживаемость вычлененных меристем и увеличивают выход безвирусных растений.

4. Для семеноводства картофеля необходимо обязательно использовать оздоровленный материал и выращивать из него товарную продукцию, используя 4-6-ую репродукции после миниклубней, так как, начиная с 7-ой репродукции, резко сокращается продуктивность растений и лежкость клубней. Индивидуальным производителям необходимо передавать семенной материал 2-3-го года репродукции после миниклубней, поскольку они сами еще в течение последующих 2-3 лет наращивают посадочный материал.

Апробация работы

Основные результаты были представлены на: 4-ом Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987); 5-м Съезде ВОГиС (Москва, 1987); Всесоюзном симпозиуме "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987); Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (Новосибирск, 1988); Межреспубликанском совещании "Нуклеазы микроорганизмов и их практическое использование" (Рига, 1989); Международной конференции «Частная генетика растений» (Киев, 1989); Международной конференции "Биология культивируемых клеток растений" (Алма-Ата, 1993); Международной конференции "Молекулярно-генетические маркеры и селекция растений" (Киев, 1994); 6-ом Съезде ВОГИС (Саратов, 1994); 3-ем Российском семинаре "Новые методы биотехнологии растений" (Пущино, 1995); Международной конференции "Биология клеток растений, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997); "Third International symposium in Rhizoctonia" [ISR-2001] National Chung Hsing University Taichung (Taiwan, 2001); Генетико-селекционных школах (Новосибирск, 1994, 1999, 2004); Международной конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); IV Международной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Ульяновск, 2002,); Международных конференциях Института картофелеводства НАН Беларуси (Минск, 2003, 2007, 2008); 2-ой Конференции Московского общества генетиков и селекционеров имени Н.И.Вавилова (Москва, 2003); Международной научно-практической конференции «Современные технологии производства сельскохозяйственных культур в Сибири» (Новосибирск, 2005); Международной научно-практической конференции «Научное обеспечение картофелеводства Сибири и Дальнего Востока: состояние, проблемы и перспективные направления» (Кемерово, 2006); Международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007).

В 1991г. работа была награждена серебряной медалью ВДНХ СССР «За научные разработки по применению бактериальной эндонуклеазы в борьбе с вирусным вырождением картофеля». В 2000 г. на Сибирской ярмарке на выставке «Наука 2000 городу и области» за создание коллекции генофонда оздоровленного картофеля работа была награждена малой золотой медалью выставки.

Публикации, авторские свидетельства, патенты

По теме исследования опубликовано 34 работы, в том числе 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ для публикации основных научных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

Издан каталог «Распространенные и перспективные сорта картофеля коллекции ИЦиГ СО РАН».

Кроме того, получено авторское свидетельство «Способ выращивания картофеля» от 15.04.1990г. № 1585328 и патент «Способ селекции картофеля на устойчивость к ризоктониозу» № 2217906 от 10.12.2003 г., Москва.

Структура диссертации

Диссертация изложена на 220 страницах машинописного текста, состоит из следующих глав: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение исследования, Использование в семеноводстве, Выводы и Литература. Библиографический указатель включает 276 источников, из них 93 публикаций в отечественной литературе, 183 в зарубежной печати. Диссертация иллюстрирована 29 рисунками и содержит 26 таблиц.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Изменения в культуре in vitro можно вызвать как на клеточном уровне, так и на уровне интактных растений, а, используя селективные факторы, можно получать направленные изменения. Это показано в селекционном процессе с помощью разработанного нами метода получения устойчивых к Rhizoctonia solani растений картофеля.

2. Экспрессия генов, контролирующих синтез растворимых белков и изоферментов, а также аминокислотный состав, изменяются в зависимости от стадии дифференциации в культуре in vitro. Возникающие новые состояния экспрессии генов стабильны в период прохождения той или иной стадии дифференциации, но носят обратимый характер: спектры белка и изоферментов при переходе от интактных растений к каллусной культуре изменяются, но у растений-регенерантов вновь восстанавливаются, что указывает на наличие процессов репрессии и дерепрессии генов в зависимости от стадии дифференциации. Стабильность и обратимость выявляемых изменений свидетельствует о том, что данные изменения могут иметь эпигенетическую природу.

3. В культуре in vitro электрофоретические спектры растворимых белков и изоферментов изменяются в зависимости от фитогормонального состава сред культивирования.

4. Бактериальная эндонуклеаза, продуцируемая Sеrratia. marcescens, обладает как противовирусным, так и стимулирующим эффектом при оздоровлении картофеля методом апикальной меристемы и при микроклональном размножении. Стимулирующий эффект от воздействия эндонуклеазы в культуре in vitro сохраняется и после высадки обработанной пробирочной культуры в почву.

Содержание работы

Введение

Работа посвящена изучению физиолого-биохимических и генетических процессов, происходящих при культивировании картофеля in vitro, а также анализу влияния состава сред культивирования на прохождение стадий дифференциации, дедифференциации и редифференциации, и выявлению возможности направленного влияния на происходящие на данных стадиях изменения для их практического использования.

1. Обзор литературы

Метод культуры растительных клеток in vitro широко используется для решения многих фундаментальных вопросов клеточной биологии, физиологии и генетики растений. Было установлено, что многие фенотипические и генотипические изменения, обнаруженные среди растений, прошедших стадию неорганизованного роста, являются следствием культивирования in vitro. Дальнейшие исследования подтвердили, что прохождение клетками стадии неорганизованного роста in vitro способствует их изменению и возникновению новых форм растений - сомаклональных вариантов. Генетическая природа и механизмы возникновения соматических изменений пока мало изучены. Поэтому для управления сомаклональной изменчивостью важно понять её причины и размах. Хотя расшифровка первичной нуклеотидной последовательности ДНК позволила ответить на ряд важнейших вопросов о структурной организации генома, тем не менее, полученных данных пока недостаточно для понимания закономерностей реализации наследственной информации в ходе индивидуального развития и механизмов формирования широкого фенотипического разнообразия организмов.

Суть проблемы сводится к выяснению механизмов, обеспечивающих специализацию клеток, обладающих одним и тем же геномом. Гены, детерминирующие какой-либо признак, действительно остаются в онтогенезе у каждого организма одинаковыми, но для каждого из них существует своя схема регулирования их активности в той или иной клетке. Обратимые изменения активности генов в процессе индивидуального развития организма, не связанные с нарушением нуклеотидной последовательности ДНК, но приводящие к сохранению неактивного или активного состояния генов в ряду клеточных поколений, называют эпигенетическими (Гвоздев, 1999). Элементарным событием дифференцировки может быть процесс репрессии или дерепрессии гена, а элементарным событием морфогенеза предлагается считать наработку белка каким-либо геном, активированным на данной стадии развития (Голубовский, 2000). Основное понятие эпигенетики - эпиген - означает, что ген может находиться в двух состояниях: активном или неактивном, и переход гена из одного состояния в другое не обусловлен изменениями в его первичной структуре (Голубовский, 1996; Малецкий и др., 2005).

Совершенно очевидно, что клетки организма, обладающие одинаковым генотипом, могут иметь бесконечное множество эпигенотипов, а реализация генотипа в фенотип осуществляется сквозь призму эпигенотипа. Эти процессы, по-видимому, аналогичны процессам, происходящим при выращивании растений в культуре in vitro. К эпигенетической изменчивости следует отнести также изменчивость, выявляемую в потомствах, полученных путем вегетативного размножения. Эту изменчивость Дарвин назвал почковой вариацией.

Изменения активности генов, происходящих в культуре in vitro, появление почковых вариаций и возможности их использования в селекционных процессах мы попытались проследить в своих исследованиях.

Немаловажной проблемой является и проблема вирусного вырождения картофеля, решать которую на данном этапе пока можно только в культуре in vitro.

2. Материалы и методы

Все работы выполнены на растениях коллекции генофонда картофеля, оздоровленного методом апикальной меристемы и поддерживаемого в асептических условиях. Растения выращивали при температуре 24-26⁰С с 16-ти часовым фотопериодом при освещенности в 4000 люкс. При оздоровлении исходного материала дополнительно применялся разработанный нами метод хемиотерапии с использованием эндонуклеазы, продуцируемой Serratia marcescens. Селекция на устойчивость к ризоктониозу проводилась на средах MS (Murashige, Skoog 1962) с добавлением культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani двух штаммов.

Изменение экспрессии генов, контролирующих синтез водорастворимых белков и изоферментов картофеля в культуре in vitro, определяли по электрофоретическим спектрам, выявляемым после электрофореза белков в полиакриламидном геле и изоферментов - в крахмальном геле.

Для оценки устойчивости к патогену Rhizoctonia solani растения картофеля высаживали в вазоны с грунтом, искусственно зараженным двумя штаммами R.solani.

При изучении влияния эндонуклеазы на концентрацию вирусов в растениях картофеля, а также на развитие и рост растений использовали стерильный коммерческий препарат бактериальной эндонуклеазы с активностью 10000-20000 ед. на миллиграмм препарата (МЕ), произведенный НИКТИ Биологически активных веществ. Данный препарат бактериальной эндонуклеазы получен из микроорганизма Serratia marcescens штамм В-10 M-I. Наличие вирусов в растениях определяли электронно-микроскопическим и иммуно-ферментным методами. Использовали методические указания производителей иммуноферментных диагностикумов.

При статистической обработке полученных результатов использовали методики, представленные в руководствах «Статистические методы в применении к исследованиям в сельском хозяйстве и биологии» (1961) и «Прикладная статистика на компьютере» (2004).

3. Результаты и обсуждение

3.1 Фенотипическая изменчивость у картофеля и возможности её использования

3.1.1 Фенотипическая изменчивость в культуре in vitro

Несмотря на то, что использование сомаклональных вариаций в селекции предложено четверть века тому назад (Larkin, Skowcroft, 1981), на их основе создано очень мало сортов. Причины лежат в высокой частоте вариаций, «ухудшающих» селекционные качества, и низкой частоте «улучшающих» вариаций, а также в длительной нестабильности семенных потомств при семенном размножении растений. Важным фактором, влияющим на сомаклональную изменчивость, являются условия регенерации растений, среди которых важнейшее место принадлежит среде культивирования. Находящиеся в условиях in vitro недифференцированные каллусные культуры лишены тонкой, сбалансированной регуляции, присущей целостному организму. В связи с этим на стабильность и изменчивость каллусной культуры сильное влияние оказывает длительность ее пребывания в стадии неорганизованного роста. Как правило, при соматическом эмбриогенезе время прохождения цикла дедифференцированная клетка - растение значительно короче, чем при регенерации растений через органогенез и, следовательно, степень изменчивости при соматическом эмбриогенезе ниже, а сходство получаемого материала и исходного родительского генотипа может быть выше. Таким образом, различные типы морфогенеза (соматический эмбриогенез или органогенез), регулируемые главным образом содержанием и соотношением экзогенных фитогормонов, могут неодинаково сказываться на геноме и приводить к изменениям, по-разному проявляющимся впоследствии на фенотипе растений. Таким образом, от пути регенерации растений зависит степень их генетической изменчивости (Ammirato, 1983; Сидоров и др., 1985). Поэтому все большее значение приобретают работы, целью которых является направленная регуляция генетических процессов. Значительные успехи в индукции различных вариантов и форм растений при использовании методов культуры in vitro достигнуты при работе с вегетативно размножаемыми растениями, новые варианты которых, обладающие важными хозяйственными наследуемыми признаками, могут быстро тиражироваться.

В задачу наших исследований входил анализ спонтанной сомаклональной изменчивости среди растений разных сортов картофеля. В качестве маркерных признаков были взяты: форма и высота куста, форма и окраска клубня, окраска цветка и цвет мякоти.

Данные морфологического анализа представлены в таблице 1.

Таблица 1. Сомаклональная изменчивость растений-регенерантов картофеля

Сорт	Общее количество регенерантов	Количество регенерантов с измененной морфологией
		Форма и высота куста	Окраска цветка	Форма клубня	Окраска клубня	Цвет мякоти
Мутант-987	186	16		4
Приекульский	25	2		1
Темп	40
Лорх	57
Xenia	208	89		36	44

Как видно из представленных данных, не по всем выбранным маркерным признакам выявлена изменчивость. Так, стабильными оказались окраска цветка и цвет мякоти. Неизменность окраски цветка очень хорошо согласуется с тем, что цветок относится к консервативным органам, характеризующимся очень слабой изменчивостью. Регенеранты каждого из исследованных сортов сохранили окраску цветка: Мутант-987 - розовую окраску, а сорта Приекульский, Темп и Лорх - белую, сорт Xenia - красно-фиолетовую. Менее изученным является признак окраски мякоти. Все исследованные нами сорта имели белую окраску мякоти, и только сорт Xenia имел желтую окраску мякоти. Все типы окраски мякоти сохранились и в регенерантах.

Различия по степени изменчивости выявлены также и между сортами. Самым интересным в этом отношении оказался сорт Xenia, который обладал большой изменчивостью по окраске и форме клубня. Исходный сорт имеет округлую форму клубня с глубокими глазками, с красно-фиолетовой окраской кожуры и желтой мякотью. У сомаклонов отмечены все переходы в окраске клубня от красно-фиолетовой до желтой, включая пестроокрашенные.

Генетикой окраски клубня начали заниматься в начале ХХ века. Р.Саламан (Salaman, 1910) установил три независимых фактора окраски клубней: R - для красного окрашивания, Р - синего и D - фактор проявления окраски. Растения с генами R и Р, но без гена D имеют белые клубни, генотипы РD - синие и RD - красные.

У исследуемых нами 5 сортов мутант-987 имел светло-розовую окраску клубней, а Приекульский, Темп и Лорх - белую, сорт Xenia - красно- фиолетовую. Наличие яркой хорошо выраженной окраски клубней свидетельствует о том, что сорт Xenia имел экспрессивный ген проявления D. Наличие полиморфизма и мозаицизма среди полученных регенерантов свидетельствует о репрессии фактора проявления окраски D не только в части потомства, но и в отдельных частях клубня. В классических работах McClintock показано, что мозаицизм является характерным признаком эпигенетической изменчивости.

Форма клубня варьировала от округлой до продолговатой. Каждый измененный клубень стал родоначальником клона, и эти клоны изучались в полевых условиях. Измененная окраска и форма клубня сохранялись в течение 10 репродукций. Высокая частота обнаруженных изменений, на много порядков превышающая частоту мутационных событий, а также сохранение этих изменений в ряду поколений клонов свидетельствуют о том, что данные изменения можно классифицировать как эпигенетические и вегетативно-наследуемые.

Таким образом, полученные данные позволяют сделать вывод о том, что сомаклональная изменчивость зависит от генотипа исходного растения, и она может быть источником генетической изменчивости по целому ряду признаков.

Мощным стимулом для изучения сомаклональной изменчивости явилась возможность практического применения спонтанной вариабельности in vitro, как эффективного источника получения новых форм растений у важных сельскохозяйственных культур. В то же время метод получения генетически измененных форм растений через культуру in vitro имеет существенные недостатки. Один из главных недостатков - отсутствие методов направленной селекции нужных вариантов. В ряде случаев процесс получения спонтанных сомаклональных вариантов, их идентификация и оценка в полевых опытах заканчивались отрицательными результатами.

Важное значение приобретает исследование возможности индукции определенных признаков. Поэтому индуцированный мутагенез часто используется для получения широкого спектра мутантов, позволяющего перейти от изучения классической системы ген - признак к уровню ген - фермент, т.е. к уровню цепей реакций биосинтеза.

Анализ мутаций хлорофиллдефектности широко используется в работах по изучению мутационной активности мутагенов, по определению частоты мутаций и подбору оптимальных мутагенных доз. А разработанные для многих видов растений методы культивирования in vitro изолированных тканей, клеток и регенерации из них растений, в сочетании с различными приемами мутагенеза, стали новым ценным инструментом для получения различных мутантных форм.

В связи с тем, что картофель является тетраплоидом с перекрестным типом размножения, уровень гетерозиготности его сортов достаточно высок. Поэтому для сохранения сортоспецифической гетерозиготности картофеля, как вегетативно размножаемой культуры, метод обработки мутагеном семян неприемлем, так как при такой обработке сортовые признаки расщепляются в потомстве. В данной ситуации при использовании картофеля в селекции in vitro эффективным оказался метод обработки мутагеном черенков и интактных растений.

Классическим примером может служить модельная система хлорофиллдефектных мутантов, где хлорофиллдефектность является маркером при проведении отборов. Анализ мутаций хлорофиллдефектности широко используется в работах по мутационной активности мутагенов, по определению частоты мутаций и оптимальных мутагенных доз.

Для получения хлорофиллдефектных форм мы использовали уже не метод клеточной селекции, где на клеточном уровне ведутся обработки, а затем из измененной клеточной культуры получают регенеранты, а метод почковых мутаций. Для мутагенеза используются побеги с пазушными почками растущих in vitro растений картофеля. Использование такого метода позволяет избегать стадию регенерации при получении мутантных форм. В наших экспериментах зеленые интактные пробирочные растения были обработаны химическим мутагеном ЭМС (этилметансульфонатом) и расчеренкованны. В полученных микроклонах из пазух данных черенков выделялись химерные по хлорофиллдефектности растения (рис.1).

Образовавшиеся пестролистные формы снова пропускали через этап микроклонального размножения. Данную процедуру повторяли несколько раз. Но уже во втором после обработки мутагеном вегетативном потомстве из почки, расположенной в пазухе химерного листа, наблюдалось выщепление однородных хлорофиллдефектных побегов. В некоторых случаях растения характеризовались различными морфологическими аномалиями и угнетенным ростом.

Рис. 1. Химерное хлорофиллдефектное растение сорта Deziree

Абсолютная частота появления пестролистных химер, определяемая как отношение количества пестролистных растений к общему числу высаженных после обработки мутагеном черенков, для сорта Лошицкий равнялось 17,8%, для Дезире - 26,4%, для сорта Темп - 38,6%. При дальнейшем микроклональном размножении и отборе на хлорофиллдефектность были отобраны почти полностью хлорофиллдефектные растения. Зеленая часть листа у таких растний была только вдоль основных жилок, или оставалась лишь небольшим сегментом у основания. Такие растения при микроклональном размножении поддерживались в течение 3-х лет, т.е. не менее 30 вегетативных репродукций в пробирочной культуре.

Результаты проведенного модельного эксперимента по получению хлорофиллдефектных растений показали, что можно получать почковые вариации, и данные изменения будут сохраняться в последующих репродукциях у вегетативно размножаемых культур. Но используемые в качестве индуктора почковых вариаций химические мутагены дают большой процент хлорофиллдефектности, что крайне нежелательно для получения продуктивных форм. Это явление хлорофиллдефектности при использовании химических мутагенов отмечено не только у вегетативно размножаемых форм, но и у растений с семенным размножением, например у кукурузы.

Стабильность проявления измененных признаков свидетельствует о возможности и необходимости более эффективного внедрения различных приемов сомаклональной изменчивости в практику селекционной работы. Наиболее реальным является применение сомаклональной изменчивости для улучшения или «доработки» уже существующих сортов или линий по отдельным признакам.

Поэтому остается актуальным дальнейшее изучение регуляции изменчивости, определение условий увеличения спектра сомаклональной изменчивости. В каждом конкретном случае необходимо детальное изучение природы сомаклональной изменчивости, анализ наследования новых признаков и наличие селективных факторов для отбора нужных сомаклональных вариантов.

При использовании методов биотехнологии в селекционном процессе решающую роль играет наличие селективных сред и надежных маркерных признаков. Так, с использованием селективных сред можно вести отбор растений на устойчивость к ряду болезней, например к белой гнили (Калашникова и др., 2009). Проведение данных экспериментов позволило нам разработать метод получения направленных изменений с использованием селективных факторов.

3.1.2 Использование культурального фильтрата Rhizoctonia solani в селекции картофеля in vitro

Ризоктониоз картофеля известен во всех странах, где возделывают картофель. Это заболевание распространено в США, странах Западной Европы и является наиболее распространенным и вредоносным заболеванием картофеля в Сибири. Потери урожая от него составляют 17-30%, а в отдельные годы достигают 45%. Оно вызывается грибом Rhizoctonia solani. Сильное поражение подземных органов ведет к образованию уродливых и мелких клубней, т.е. снижению урожая на 15-35% в зависимости от климатических условий. Особенно сильно ризоктониоз развивается в жаркую и сухую погоду или при затяжной холодной весне, что характерно для Сибири. Именно поэтому наши исследования были направлены на изучение возможности создания форм, устойчивых к данному заболеванию.

В связи с развитием методов биотехнологии проводится поиск новой стратегии в селекции картофеля. Это связано с тем, что картофель, будучи вегетативно размножаемой культурой, стал частично стерильным. Стерильность сортов картофеля проявляется в том, что часть сортов просто не цветет, другие сорта цветут, но не дают ягод, а третьи образуют ягоды, в которых отсутствуют семена. Поэтому селекционеры сталкиваются со значительными трудностями при подборе комбинационных пар для скрещивания и получения гибридов. Все это делает актуальным создание новых методов индукции in vitro и выявления сомаклональных изменений и их селективного отбора.

Цель наших исследований состояла в разработке метода селективного отбора устойчивых к ризоктониозу форм картофеля с использованием биотехнологических методов. Схема эксперимента состояла в индукции изменчивости с помощью облучения и последующего отбора на средах с культуральным фильтратом гриба Rhizoctonia solani, который использовался в качестве селективного фактора.

Для индукции изменений обработку исходного материала химическими мутагенами мы считали нецелесообразной, потому что она дает, как правило, большой процент хлорофиллдефектных вариаций, как было сказано выше. Поэтому мы использовали обработку гамма лучами, для чего исходные интактные пробирочные растения картофеля, выращенные in vitro, облучали гамма лучами в дозе 1500-4000 рентген. Наиболее удачной оказалась доза в 3000 рентген. Облученные растения разрезали на черенки, каждый из которых имел по нескольку пазушных почек. Черенки высаживали на селективную среду, состоящую из среды MS и культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani, представленного двумя штаммами Rhizoctonia solani AG-3, отличающимися по фитотоксичности. Исследовалось в общей сложности более 100 различных вариантов, чтобы подобрать для каждого сорта сублетальную концентрацию культурального фильтрата (Рис. 2). Контроль выращивали только на среде MS. В дальнейшей работе использовали те концентрации, на которых выжили единичные растения. На рис. 2 такая концентрация была в пробе №3.

Сначала черенки помещали на среду, содержащую менее токсичный штамм № 1. Выжившие побеги микроклонально размножали на среде MS и высаживали на новую селективную среду, содержащую более фитотоксичный штамм № 2. Для более жесткого отбора на среде со штаммом № 2 преимущественно использовали концентрацию культурального фильтрата выше 75%.

Добавление культурального фильтрата ведет к ингибированию роста побегов из пазушных почек и корней, которое усиливается по мере увеличения концентрации культурального фильтрата, как первого, так и второго штаммов. Состояние черенков ухудшалось с увеличением концентрации фильтрата и, соответственно, токсинов. Наблюдалось пожелтение, а затем потемнение ткани, в дальнейшем растения погибали. Однако единичные побеги выживали (рис. 2, комбинация 3). Процент выживаемости варьировал в зависимости от сорта картофеля и концентрации культурального фильтрата. Эти выжившие единичные побеги отсаживали на обычную микроклональную среду, а выросшие из них растения подвергали вторичному отбору.



Рис. 2. Отбор на разных концентрациях культурального фильтрата гриба Rhizoctonia solani (штамм №1). К - контроль. Растения растут на среде MS; 1 - 1 часть культурального фильтрата + 3 части среды MS; 2 - 2 части культурального фильтрата + 2 части среды MS; 3 - 3 части культурального фильтрата + 1 часть среды MS; 4 - 100% культурального фильтрата.

Выжившие на второй селективной среде почки снова микроклонально размножали, и растения высаживали в вазоны с грунтом, искусственно зараженным одновременно двумя штаммами R. solani. Через 3 месяца вегетации проводили учет на зараженность и определяли индекс развития болезни R, который определяли по формуле:

R = ? (а • в) • 100% ? N•K,

где: а - количество пораженных стеблей; в - соответствующий балл поражения; N - количество учтенных растений; К - высший балл шкалы.

Растения, имеющие при выращивании в вазонах с зараженным грунтом нулевой индекс развития болезни, считали устойчивыми. Такие растения картофеля отбирали и передавали в селекционные учреждения для дальнейшего изучения и использования в в селекционных схемах в качестве исходного материала, устойчивого к ризоктониозу (таблица 2).

Таблица 2. Влияние отбора на культуральном фильтрате R. solani на устойчивость картофеля к ризоктониозу

Сорт	Обработка	Концентрация культурального фильтрата R. solani (%)	Индекс Развития болезни в %
		Первый отбор	второй отбор
Санте	Контроль (необлученные)	0	0	40
	3000 рентген	40	0	20
	3000 рентген	20	100	0
	3000 рентген	50	100	0
Адретта	Контроль (необлученные)	0	0	80
	3000 рентген	40	0	60
	3000 рентген	20	100	0
	3000 рентген	50	100	0

Проведенный двукратный отбор при очень жестких условиях второго отбора на 100% культуральном фильтрате штамма № 2 дает возможность отобрать растения с нулевым индексом развития болезни, т.е. устойчивые формы. Растения сорта Санте при однократном отборе на первой селективной среде с 40% концентрацией культурального фильтрата имели индекс развития болезни 20%, а прошедшие двукратный отбор имели нулевой индекс развития болезни. Растения сорта Адретта менее устойчивы к ризоктониозу. В контроле растения сорта Санте имели 40% индекс развития болезни, а Адретты 80% и растения после однократного отбора имели индекс 60%. Но после двукратного отбора некоторые растения имели нулевой индекс.

О том, что сорта имеют разную устойчивость к ризоктониозу говорят и данные приведенные в таблице 3.

В связи с тем, что в данном эксперименте использовали сразу два воздействия на растения (облучение и культуральный фильтрат), предварительно использовали два контроля на сортах Русте и Ранний желтый. Эти контроли характеризовались тем, что в них использовались либо облученные, либо необлученные растения, но в обоих случаях не было культурального фильтрата в средах выращивания. Контрольные исследования показали, что облучение либо не влияет на развитие болезни (у сорта Русте), либо только слегка снижает индекс развития болезни (у сорта Ранний желтый). Эти контрольные эксперименты позволили далее оценивать роль генотипа сорта в ответе на воздействие культурального фильтрата гриба.

Так, сорта Роза Сибири, Ранний желтый и Русте более устойчивы, чем Снегирь и Адретта. Но на всех сортах, даже после однократного отбора, удалось получить растения более устойчивые. Так у сортов Роза Сибири и Ранний желтый получили растения с нулевым индексом развития болезни сразу после первого отбора, а у неустойчивых сортов получены у сорта Снегирь растения с 20% индексом по сравнению с 60% в контроле, а у Адретты с 30% по сравнению с 80% индексом в контроле.

На основе этих экспериментов был разработан метод селекции на устойчивость к ризоктониозу, с использованием биотехнологических методов почковых мутаций. Предложеный метод позволяет уменьшить объемы исследуемого материала, заменив трудоемкие полевые работы при традиционной селекции на биотехнологические методы. Кроме того, данный метод, основанный на использовании почковых мутаций, позволяет исключить стадию каллусной культуры и, соответственно, стадию регенерации, являющиеся узким местом в биотехнологических методах при их использовании на всех культурах и особенно на картофеле.

Таблица 3. Влияние генотипа сорта картофеля на результаты отбора на культуральном фильтрате R. solani к заболеванию ризоктониозом

Обработка	Сорт	Концентрация фильтрата, %	Индекс развития болезни в %
Контроль (облученные)	Русте	0	40
Контроль (необлученные)	Русте	0	40
3000 рентген	Русте	50	20
Контроль (облученные)	Ранний желтый	0	20
Контроль (необлученные)	Ранний желтый	0	30
3000 рентген	Ранний желтый	50	0
Контроль (необлученные)	Роза Сибири	0	30
3000 рентген	Роза Сибири	50	0
Контроль (необлученные)	Снегирь	0	60
3000 рентген	Снегирь	50	20
Контроль (необлученные)	Адретта	0	80
3000 рентген	Адретта	50	30

Необходимость замены клеточной селекции на метод почковых вариаций обусловлена тем, что у картофеля практически нельзя получить регенеранты из суспензионной культуры, и у картофеля отсутствует соматический эмбриогенез. При регенерации из каллусной культуры через органогенез трудно избежать сомаклональной изменчивости, возникающей при неорганизованном росте каллуса. Но картофель хорошо переносит микроклональное размножение, что и было использовано нами.

Наличие же селективных факторов при отборе в селекционном процессе с использованием методов биотехнологии играет решающую роль. Так с использованием селективных сред можно вести отбор растений на устойчивость к ряду болезней.

Предложенный способ отбора форм, устойчивых к ризоктониозу, имеет существенные преимущества по сравнению с другими биотехнологическими методами селекции. Во-первых, не возникает сложностей с регенерацией, особенно мутантных форм. Во-вторых, данный метод приобретает особое значение для селекции вегетативно размножаемых растений, так как позволяет выделять формы с характерной сортовой гетерогенностью и избегать сомаклональную изменчивость, возникающую при неорганизованном росте каллусной ткани. В третьих, применение этого метода in vitro по сравнению с классическим методом значительно сокращает время на получение новых форм и, соответственно, затрат труда, так как уменьшает физические объемы экспериментального материала. Для экспресс-оценки на устойчивость сортового материала картофеля к ризоктониозу, достаточно провести только одну стадию выращивания исследуемого материала на провокационной селективной среде, содержащей 50-80% культурального фильтрата R. solani.

Нам удалось установить, что сорта по своей устойчивости разделяются на более устойчивые и менее устойчивые. Среди более устойчивых сортов скорее можно выделить формы с очень высокой полевой устойчивостью. Но даже среди сортов с низким уровнем устойчивости также можно найти после первого отбора формы более устойчивые, чем исходные формы.

На разработанный метод получен патент.

3.2 Экспрессия генов, контролирующих общие белки и изоферменты, в культуре in vitro

Селекция картофеля традиционно ведётся по фенотипическим признакам, даже несмотря на бурное развитие молекулярно-генетических маркеров (Hosaka et.al.,1994). Хотя использование молекулярных маркеров в культуре in vitro, где мало фенотипических маркерных признаков, могло бы дать возможность более глубокого понимания происходящих биотехнологических процессов. В наших исследованиях мы попытались использовать в качестве маркеров электрофоретические спектры общих белков и изоферментов.

3.2.1 Изменение экспрессии генов, контролирующих общие белки в культуре in vitro под действием фитогормонов

Белки - первые визуально распознаваемые продукты экспрессии генов, поэтому полиморфизм растворимых белков является мощным инструментом при изучении генетической изменчивости (Barta, 2003). Целью наших исследований было изучение динамики экспрессии белков в культуре in vitro в процессах дифференциации, дедифференциации и редифференциации, а также в онтогенезе каллусной культуры. При селекционных процессах очень важно знать, как ведут себя эти маркерные признаки на разных стадиях дифференциации организма в культуре in vitro. Именно на этот вопрос мы попытались ответить в своих исследованиях, изучая полиморфизм растворимых белков картофеля в культуре in vitro.

В проведенных исследованиях нами было установлено, что электрофоретический спектр водорастворимых белков интактных растений картофеля, выращенных в культуре in vitro, состоит из 42-45 компонентов, а у каллусов - только из 22-25. Для удобства рассмотрения мы условно разделили их на 3 зоны (схема 1). А - быстро подвижные компоненты (БК), В - средне подвижные компоненты (СК), С - медленно подвижные компоненты (МК).

В белках каллусов, как было сказано, содержится 20-25 компонентов, причем полностью отсутствуют белки зоны А (быстроподвижные компоненты) и всего 3 компонента в зоне В - среднеподвижных. У регенерантов, полученных из этих каллусов, белковый спектр полностью восстанавливается и содержит компоненты всех трех зон. Двенадцать компонентов в зонах В и С являются общими для белков исход-ных растений, регенерантов и каллуса (схема 1). Компонентные составы белка из каллуса Мутанта - 987 и сорта Xenia сходны и отличаются только по двум медленноподвижным компонентам (40 и 41), присутствующим у сорта Xenia (схема 1).

Сортоспецифичность компонентного состава белков, выявленная в интактных растениях, сохраняется и в каллусе. Различия между сортами чаще всего проявляются на уровне интенсивности отдельных компонентов белкового спектра. Однако некоторые сорта имеют фракции белка, характерные именно этому сорту. При сравнении электрофоретических компонентов белка у каллусов, выращенных на средах с разным фитогормональным составом, установлено влияние последнего на количественный и качественный состав белка (рис. 3).

Схема 1. Электрофоретические спектры белка картофеля

Рис. 3. Электрофоретические спектры белка исходных форм и каллусов, выращенных на разных средах. 1-4 - сорт Приекульский ранний; 6-9 - сорт Берлихенген; 11-14 - сорт Xenia; 15-18 - Мутант 987; 1,6,11,15 - исходное растение; 2,7,12,16 - каллус на каллусной среде; 3,8,13,17 - каллус на регенерационной среде; 4,9,14,18 - каллус на среде без гормонов.

В экспериментах по изучению влияния ауксинов на компонентный состав белка подтвердилась основная особенность каллусной культуры: в электрофоретических спектрах белка отсутствуют компоненты быстромигрирующей зоны А и существенно меньше компонентов в зоне среднеподвижных компонентов (зона В). Сортоспецифичные компоненты проявляются на всех средах выращивания (рис.4).

Рис. 4. Электрофоретический спектр белка каллусов картофеля, выращенных на средах с разными ауксинами. 1-4 - на среде с 2,4Д 2 мг/л; 5-8 - на среде с ИУК 0,5мг/л; 9-12 - на среде с HУK 10 мг/л; 13-16 - на среде с НУК 8 мг/л + кинетин 2 мг/л; 1,5,9,13 - сорт Хеniа; 2,6,10,14-сорт Приекульский; 3,7,11,15 - Мутант-987; 4,8,12,16 - сорт Седов.

В исследованиях было установлено также, что это сокращение электрофоретического спектра белка в каллусной культуре не зависит от фитогормонального состава сред, на которых выращивается данная каллусная культура, а зависит от стадии дифференциации. При анализе электрофоретических спектров белков регенерантов, полученных из этих каллусных культур, установлено, что их компонентный состав восстанавливается и чаще всего соответствует сортовому спектру исходного растения, хотя иногда могут выявляться изменения в одном или нескольких компонентах или в интенсивности их проявления.

Полученные данные указывают на то, что отмеченные выше различия в спектрах белков каллуса картофеля обусловлены репрессией и дерепрессией, что можно рассматривать как эпигенетические изменения экспрессии генов, контролирующих синтез белков. Замолкание в каллусах большого числа генов сменяется их активацией и полным восстановлением спектра белков у регенерантов. При восстановлении белкового спектра сортоспецифичность в экспрессии генов, контролирующих синтез белка, сохраняется.

Динамика аминокислотного состава растворимого белка картофеля в культуре in vitro

При селекции картофеля на клеточном уровне для более полного использования генетического потенциала необходимо изучить как можно больше физиологических и биохимических процессов, которые проходят и на стадии каллусной культуры, и в период морфогенеза. Это необходимо, прежде всего, для того, чтобы знать, на каких этапах можно влиять на генотип картофеля с целью его изменения, и как с помощью молекулярно-генетических маркеров контролировать сохранность его сортотипичности при меристемном оздоровлении от вирусной инфекции и при дальнейшем микроклональном размножении. Такими биохимическими маркерами могли бы быть не только электрофоретические спектры белков, но и аминокислотный состав суммарного белка растений (Конарев, 1983). Поэтому мы считали необходимым исследовать состав аминокислот и их соотношение на разных стадиях дифференциации в культуре in vitro картофеля.

Обнаружено, что аминокислотный состав общего белка исходных форм, выращенных в асептических условиях, каллусов и регенерантов в основном сходен (рис. 5, 6). Но имеются некоторые отличия, характерные только для каллусной культуры. В каллусной культуре есть тирозин (от 2 до 5%), а в интактных растениях исходной формы и у растений регенерантов он отсутствует или наблюдается только его следовое количество. Это установлено на каллусных культурах четырех изученных нами сортов (рис. 7). В интактных растениях исходных форм сорта Xeniа и мутантной формы - М-987 и у их регенерантов отсутствует 3 аминокислоты: цистеин, метионин и тирозин из числа исследованных нами аминокислот (рис. 5, 6, 8), а в каллусной культуре отсутствуют только две: цистеин и метионин, а тирозин присутствует. Но известно, что тирозин получается из фенилаланина, которого в интактных растениях как в исходных формах, так и у регенерантов, больше, чем в каллусной культуре почти в 2 раза. Профили кривых соотношения аминокислот исходных растений, выращенных в резко отличающихся условиях (теплица и культура in vitro), оказались близкими (рис. 9), но в условиях теплицы в листьях растений наблюдалось повышенное содержание аспарагина, глутамина и аргинина по сравнению с растениями, выращенными в пробирочной культуре.

В исходных формах, вне зависимости от условий выращивания, также отсутствуют 3 аминокислоты из исследованных. Хотя электрофоретические спектры белков исходных растений и их каллусов резко отличаются, содержание аминокислот в белках этих форм существенно не различается. Несмотря на то, что компонентный состав белков каллуса гораздо беднее, чем у исходной формы и регенерантов, аминокислотный состав растворимого белка каллусов даже на 1 аминокислоту (тирозин) больше.

Рис. 5. Аминокислотный состав общего белка формы Мутант-987.

Вероятно, специфика экспрессивности белков у каллусной культуры, имеющей только половинный состав компонентов белка исходных растений и регенерантов, обусловлена не отсутствием соответствующих аминокислот для синтеза белка, а отсутствием экспрессии генов, контролирующих синтез данных форм белка в каллусной культуре, или из-за отсутствия их функции на данной стадии онтогенеза.

...