Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Морфофункциональная характеристика механизмов никотиновой холинергической регуляции нейрон-глиальных взаимодействий и метаболической активности в симпатическом ганглии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая Характеристика Работы

Актуальность проблемы

Фундаментальной проблемой нейробиологии является выяснение механизмов, обеспечивающих функционирование тканевых элементов нервной системы. Во многом ее решение зависит от знания синаптических процессов - важнейшего звена, обеспечивающего интегративную деятельность нервной системы. В ряду нейротрансмиттерных систем особую роль играют никотиновые холинергические синапсы паравертебральных симпатических ганглиев, образованные преганглионарными волокнами. Никотиновые холинорецепторы в указанных синапсах представляют ключевое функциональное звено, через которое осуществляется передача информации в ганглиях и происходит активизация автономной нервной системы (Ноздрачев А.Д., Фатеев М.М., 2002; De Biassi M. et al., 2000; De Biassi M., 2002).

Важным интегративно-координационным центром автономной регуляции является краниальный шейный ганглий, через никотиновые холинорецепторы которого осуществляется контроль общего сосудистого тонуса и гемодинамических показателей, обеспечивается деятельность эпифиза и регуляция многих других жизненно важных висцеральных функций (Ноздрачев А.Д., Пушкарев Ю.П., 1980; Skok V., 2002; Wang N. et al., 2004; Asamoto K., 2005).

Правомерно в связи с этим предполагать, что столь значимая функциональная роль никотиновых холинорецепторов в информационном обеспечении краниального шейного, равно как и других экстрамуральных симпатических ганглиев, должна определенным образом проявиться и в участии этих рецепторов в молекулярно-клеточных механизмах непосредственно организующих деятельность самих симпатических ганглиев. Такая постановка вопроса представляет вполне понятный теоретический и практический интерес, как с точки зрения выяснения общих принципов организации работы периферических ганглиев, так и в плане изучения последствий модуляции активности периферических никотиновых холинорецепторов, как объекта воздействия наркотических субстанций и лекарственных препаратов.

Объективной основой для проведения исследования в обозначенном направлении служит значительное число экспериментальных данных последних лет, полученных в отношении других отделов нервной системы, которые показывают, что роль синаптических процессов не ограничивается обеспечением только лишь информационной связи между нейронами. Напротив, эти данные позволяют рассматривать соответствующие синапсы в качестве биохимически самоорганизующихся систем, которые располагают собственными механизмами контроля за всеми этапами белкового синтеза в постсинаптических нейронах (Tiedge H., 2005; Hirokawa N., 2006; Pfeiffer B., Huber K., 2006) и непосредственно участвуют в таком специфическом клеточном механизме, как нейрон-глиальное взаимодействие (Fellin T., Carmignoto G., 2004; Hertz L., 2004; Magistretti P., 2006). Вместе с тем нейротрофическая роль синаптического сигнала через никотиновые холинорецепторы в регуляторных механизмах симпатических ганглиев не изучена.

Цель исследования - установить морфофункциональные закономерности метаболического ответа краниального шейного симпатического ганглия и входящих в его состав нейронов и сателлитных глиоцитов на экспериментально вызванные изменения в численности свободно функционирующих никотиновых холинергических рецепторов.

Задачи:

Установить закономерности в изменениях содержания рРНК в симпатических нейронах и окружающих нейроны сателлитных глиоцитах при применении разных доз ганглиоблокатора, вызывающих блокирование относительно небольшого, значительного числа никотиновых холинорецепторов и полное блокирование никотиновых холинорецепторов, а также в ходе последующего восстановления численности функционирующих никотиновых холинорецепторов после применения разных моделей блокады.

Выявить закономерности в изменениях активности ферментативной системы ЛДГ при частичном и полном блокировании никотиновых холино-рецепторов в симпатическом ганглии, а также в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах.

Определить основные закономерности в изменениях содержания аденилатных макроэргов (АТФ, АДФ, АМФ) в симпатическом ганглии, связанные с частичным и полным блокированием никотиновых холинорецепторов, а также динамику этих показателей в процессе последующего восстановления после прекращения действия блокады.

Установлены раннее неизвестные принципы морфофункциональной организации симпатического ганглия, которые базируются на том, что синаптические сигналы, поступающие через никотиновые холинорецепторы симпатических нейронов, управляют метаболическими процессами и мобилизуют специфические клеточные механизмы в симпатическом ганглии, выс-тупая в качестве системообразующего фактора, обеспечивающего его активную деятельность.

Впервые показано, что в симпатическом ганглии нейроны и окружающие нейроны сателлитные глиоциты при определенных условиях образуют единую функционально - метаболическую систему. Выявлены ранее неизвестные условия и характер взаимодействия между этими типами клеток, которые заключаются в том, что нейроны и сателлитные глиоциты в симпатическом ганглии вступают в метаболическое взаимодействие только при наличии синаптического сигнала, поступающего через никотиновые холино-рецепторы симпатических нейронов. При этом метаболическая активность и энергетические механизмы сателлитных глиоцитов регулируются функциональным состоянием нейронов, которые через ионотропные никотиновые холинорецепторы осуществляют интеграцию своего собственного метаболизма с метаболизмом окружающих сателлитных глиоцитов.

В эксперименте впервые показано, что в симпатическом ганглии соз-даются условия для энергетического взаимодействия между симпатическими нейронами и сателлитными глиоцитами и существует высокая вероятность реализации в краниальном шейном ганглии механизма энергетического гомеостаза на основе клеточной интеграции, описываемого гипотезой ANLSH (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) для головного мозга, которая пред-полагает существование между глиоцитами (астроцитами) и нейронами лактатного челночного механизма.

Впервые определен изоферментный спектр ЛДГ для краниального шейного ганглия и изоферментный профиль ЛДГ для симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов.

Научно-практическая значимость

На основании анализа динамики метаболических процессов при модуляциях синаптического холинергического сигнала разработана функционально-информационная модель регуляции краниального шейного симпатического ганглия. Синаптический сигнал, поступающий через никотиновые холинорецепторы в синапсах симпатических нейронов, является для симпатического ганглия системообразующим фактором, который трансформирует и направляет метаболизм и создает специфическую клеточную интеграцию в ганглии для выполнения этим органом адекватной функции.

В рамках представленной модели установлено следующее.

§ Синаптический сигнал, через никотиновые холинорецепторы симпатических нейронов:

- управляет метаболическим статусом симпатического ганглия, осуществляя регуляцию базового уровня энергетического гомеостаза и изменяя активность белок-синтезирующей системы нейронов и саттелитных глиоцитов.

- потенцирует формирование специфической межклеточной интегративной единицы, связывая симпатические нейроны и соседние сателлитные глиоциты в единую функционально - метаболическую систему.

§ В отсутствие холинергического синаптического сигнала в симпатическом ганглии оказываются задействованными механизмы, поддерживающие только его системы жизнеобеспечения, а симпатические нейроны и сателлитные глиоциты представляют собой метаболически обособленные друг от друга клеточные системы.

§ На клеточном уровне показано, что синаптический сигнал через никотиновые холинергические рецепторы:

- индуктивно воздействует на метаболическую активность симпатических нейронов, вызывая в них повышение уровня активности белок-синтезирующей системы;

- модулирует в нейронах активность белок-синтезирующей системы;

- обеспечивает энергетический гомеостаз в нейронах, по крайней мере, на уровне регуляции активности ферментативной системы ЛДГ;

- обеспечивает синхронизацию процессов синтеза белка в нейронах и соседних сателлитных глиоцитах на уровне трансляции, и детерминирует анаэробную направленность изоферментного профиля ЛДГ в сателлитных глиоцитах.

Внедрение

Результаты исследования нейротрофического значения синаптической передачи через никотиновые холинорецепторы и ее роли в нейрон-глиальном взаимодействии в симпатическом ганглии используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедрах гистологии и эмбриологии Российского государственного медицинского университета и анатомии и гистологии животных Московской академии ветеринарной медицины и биотехнологии.

Апробация работы

Основные материалы диссертации были представлены на IX и X Всесоюзных съездах анатомов, гистологов и эмбриологов (г. Минск, 1981 и

г. Полтава, 1986); VII и VIII конгрессах международной ассоциации морфо-логов (г. Казань, 2004 и г. Орел, 2006); VII Всероссийской конференции по патологии клетки (г. Москва, 2005); 5-й Всероссийской конференции «Бабухинские чтения в Орле» (г. Орел, 2006); Конференциях ГУ НИИ морфологии человека РАМН «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г. Москва, 2005, 2006, 2008), межлабораторной конференции в ГУ НИИ морфологии человека РАМН (декабрь, 2007 г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 печатные работы, из них 8 в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 276 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 42 рисунками и микрофотографиями, содержит 36 таблиц и одну схему. Список литературы включает 418 источников, из которых 110 отечественных и 308 зарубежных.

Содержание работы

Работа выполнена на материале краниальных шейных симпатических ганглиев (КШСГ) половозрелых кроликов породы шиншилла (питомник «Столбовая»). В эксперименте использовано 103 животных, 124 ганглия, проанализировано 3568 симпатических нейронов и 5647 сателлитных глиоцитов.

При работе с экспериментальными животными руководствовались приказами Минздрава СССР №755 от 12.08.1977 г. и Минздрава РФ №267 от 19.06.2003 г. На проведение экспериментов получено разрешение

Комиссии по биоэтике ГУ НИИ морфологии человека РАМН (Протокол №3 от. 21.04.2005 г.)

Экспериментальная модель. Для оценки роли никотиновых холино-рецепторов (нХР) применялось экспериментально индуцированное и управляемое изменение эффективности синаптического влияния через нХР.

С этой целью использовали холинолитик димеколин. Холинолитический эффект препарата заключается в блокировании нХР в синапсах симпатических нейронов, число которых последовательно возрастает с увеличением дозы ганглиоблокатора (Скок В.И. и соавт., 1987; Бровцына Н.Б. и соавт., 1996). Димеколин характеризуется высокой холинолитической активностью, максимальный блокирующего эффект препарата наступает через 1 час, с продолжительностью действия около 3-х часов, и слабой выраженностью побочного действия (Шарапов И.М., 1962; Вышинская Т.Е., 1965; Першин Б.Н., 1966).

Эксперимент планировали в соответствии с установленной для кро-ликов фармакодинамикой препарата (Шарапов И.М.1961, 1962; Першин Б.Н., 1966). Применяли однократное подкожное введение ганглиоблокатора в дозах 10, 30 и 50 мг/кг живого веса, первая из которых превышает пороговую дозу и вызывает частичное блокирование, а последняя приводит к практически полному блокированию нХР. После введения препарата в каждой из указанных доз в разные сериях опыта материал брали через 1, 3, 5, 7, 9 и 11 часов.

Исследовали:

рРНК - ключевой параметр белкового синтеза (Grannemann S., Baserga S., 2004; Dresios J. et al., 2006).

Ферментативную систему ЛДГ, которая осуществляет регуляцию субстратного обеспечения энергетических процессов (Зимин Ю.В. и др., 2001; Gladden L., 2004) и принимает участие в ряде других механизмах внутриклеточной регуляции (Popanda O. et al., 1998; Beeckman S., Kanasek E., 1996).

Аденилатные макроэрги (АТФ, АДФ, АМФ), уровень содержания, которых характеризует энергетический статус и общую интеграцию биохимических процессов (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977, 1988; Dzeja P., Terzic A., 2003).

Содержание нуклеиновых кислот определяли в цитоплазме нейронов и в сателлитных глиоцитах методом сканирующей фотографической цито-фотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977) на микрофотометре ИФО-451 (фирма ЛОМО).

Для этого материал заключали в парафин в режиме, не приводящем к потерям нуклеиновых кислот (Гореликов П.Л, 1977, 1979), изготовляли срезы толщиной 5-7 мкм. Толщину парафиновых срезов измеряли пред-ложенным нами методом (Гореликов П.Л, 1975) с помощью микроскопа ОРИМ - 1 (фирма ЛОМО). Срезы окрашивали по методу Эйнарсона и фото-графировали в максимуме поглощения красителя (575 ммк) на специально для этой цели подобранную фотопленку КН-3 (Гореликов П.Л., Лебедев Э.А., 1977). Результаты, пересчитывали на 1 мкм толщины срезов.

Полученные в нейронах и сателлитных глиоцитах цитохимические сдвиги относили за счет изменений рРНК, так как в цитоплазме нейронов нуклеиновые кислоты в основном представлены рРНК (Гайцхоки В.С., 1980), а в глиоцитах, в которых по существу определяется суммарное количество РНК+ДНК, изменениями глиальной ДНК можно пренебречь, поскольку в зре-лой нервной ткани она характеризуется стабильностью (Peters A., Sethares C., 2004). Объем выборки в контроле и во всех сериях опыта составлял в среднем 100 - 200 клеток каждого типа взятых от отдельного животного.

Активность ЛДГ, Н и М ее изоформ в нейронах и окружающих их сателлитных глиоцитах определяли методом интегральной цитофотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977) на цитофотометре МИФ-1 (фирма ЛОМО) на криостатных срезах после гистохимического окрашивания тетранитросиним тетразолием по методу Брумберга В.А. и Певзнера Л.З. (1975), позволяющему проводить количественную оценку активности фермента. Объем выборки составлял в контроле и в опыте по 150 нейронов и 210 - 300 сателлитных глиоцитов от каждого животного.

Содержание АТФ, АДФ, АМФ в ганглии определяли методом рас-пределительной тонкослойной хроматографии на силуфоловых пластинках, с последующим количественным спектрофотометрическим определением раз-деленных нуклеотидов на спектрофотометре СФ-16 (фирма ЛОМО) в УФ диапазоне (260 ммк).

Активность изоферментов ЛДГ определяли в относительных единицах методом фотографической фотометрии (Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977). Разделение изоферментов осуществляли с помощью диск-элекрофореза в полиакриламидном геле (ПАГ) в микромодификации Панавене Д.П. (1974) после окрашивания нитросиним тетразолием. После фотографирования в максимуме поглощения формазана (569 ммк) на специально подобранную для этой цели Аэрофотопленку, электрофореграммы денситометрировали на микрофотометре ИФО-451 (фирма ЛОМО).

При исследовании всех показателей в контроле и в каждой из серий опыта использовано по 3-5 животных.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием общепринятых методов параметрической (t-критерий, корреляционный ана-лиз) и непараметрической (U-критерий) статистик с помощью компьютерных программ «Microsoft Excel 97», , «STATISTICA». При оценке статистичес-кой значимости коэффициентов корреляции (r) применяли преобразование Фишера.

Результаты исследований и их обсуждение

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на метаболическую активность симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов

Влияние функционирующих никотиновых холинорецепторов на проявления метаболической активности в нейронах и глиоцитах

Примененная в работе экспериментальная модель дозированной синаптической блокады дает возможность создавать динамически изменяющийся численный баланс между нХР, которые вследствие блокирования находятся, в инактивированном состоянии, и нХР, которые, напротив, остаются незанятыми ганглиоблокатором и, следовательно, сохраняют способность активно функционировать, и сопоставить эти изменения с цитохимическими сдвигами, происходящими в это время в исследуемых клетках.

Такой анализ позволил установить, что при синаптической блокаде нХР динамика формирования метаболических сдвигов в нейронах и соседних с ними сателлитных глиоцитах существенно различается.

В нейронах блокада, независимо от уровня блокирования холинорецепторов, вызывает стереотипный цитохимический ответ - выраженные колебания содержания рРНК, которые вместе с ослаблением и окончанием блокирующего воздействия постепенно затухают (рис. 1а, б, в). Важной особенностью наблюдаемых колебаний является то, что они происходят на уровне заметно превышающем контрольный.

Кроме того, из сопоставления модуляций при разных условиях блокирования следует, что уровень первоначально заблокированных нХР детерминирует также и относительную быстроту цитохимического ответа, и размах происходящих при этом колебаний. В самом деле, наблюдаемое максимальное увеличение содержания рРНК наступает тем раньше и по величине амплитуды оно тем больше, чем большим является количество сохра-няющихся при данной модели блокады активных нХР (рис. 1). Так при минимальном блокировании нХР максимальное отклонение наблюдается через 1 час и его величина относительно контроля составляет 72% (рис. 1а). При увеличении численности блокированных нХР максимальное отклонение наблюдается позже, только через 5 часов, и уже со значительно меньшей амплитудой - на 49% выше контрольного уровня, (рис. 1б), при полном блокировании максимально возможное отклонение наступают еще позже - через 7 часов и является при этом наименьшим - увеличение только на 35%.

Таким образом, полученные экспериментальные данные дают основания заключить, что нХР в симпатическом ганглии весьма специфично проявляют себя в формировании метаболизма рРНК в нейронах. Не оказывая заметного влияния на базовый уровень этого показателя, характеризующийинтактные нейроны, данные рецепторы принимают участие в индуктивных механизмах, которые в ответ на изменения внешних условий запускают динамические изменения рРНК в нейрональной цитоплазме и при этом, по всей вероятности, одновременно модулируют необходимый уровень и интенсивность цитохимического ответа.

Эффект блокирования нХР проявляется и на морфологическом уровне, что находит свое выражение в структурных перестройках хроматофильной субстанции в цитоплазме нейронов.

При полной блокаде холинорецепторов (через 1 час после введения ганглиоблокатора) в нейронах наблюдается тотальный хроматолиз. В это время основную массу нейронов представляют клетки, в которых имеет место выраженное «измельчение» хроматофильной зернистости и значительное просветление участков цитоплазмы, в которых нисслевская субстанция не просматривается. В известной мере такая структурная реорганизация хрома-тофильной субстанции свидетельствует о существенной дезинтеграции эргастоплазмы (Pullen A., 1990; Heus R., Diegenbach P., 1992).

В то же время при частичном блокировании нХР изменения хромато-фильной субстанции носят в эти же сроки разнонаправленный характер. При блокировании незначительного числа рецепторов наблюдается гиперхроматоз. В этом случае большая часть нейронов представлена клетками с крупнозернистой формой хроматофильной субстанции в цитоплазме, которая местами переходит в крупноглыбчатую форму. При этом глыбки укрупняются настолько, что теряют свою обособленность и формируют в цитоплазме однородную плотную массу, которая в норме не встречается. При возраста-нии численности заблокированных нХР морфологическая картина представ-лена, напротив, умеренным хроматолизом. В подавляющем большинстве ней-ронов хроматофильная субстанция в значительной степени диспергирована, в отдельных участках цитоплазмы наблюдается разрежение базофильного ма-териала с заметным уменьшением размера зернистости.

Все отмеченные изменения обратимы и, независимо от числа первоначально заблокированных холинорецепторов, ослабление и окончание блокады в последующие сроки (3 - 11 часов) сопровождаются постепенной нормализацией хроматофильной субстанции.

Наблюдаемая морфологическая картина позволяет говорить о том, что степень трансформационных изменений хроматофильной субстанции характеризует, прежде всего, масштабность количественных модуляций рРНК: значительное увеличение содержания рРНК проявляются в гиперхроматозе, менее выраженные по величине изменения этого показателя, напротив, сопровождает умеренный хроматолиз.

Представленные данные, с учетом результатов количественного анализа цитохимических изменений рРНК и то, что на светооптическом уровне хроматофильная субстанция по существу представляет эргастоплазму нейрона и ее базофильные гранулы располагаются в местах интенсивного белкового синтеза (Pannese E., 1994; Крстич Р.В., 2001), подтверждают конкретный вклад никотиновых холинорецепторов в регуляцию белково-синтезирующего аппарата симпатических нейронов, по крайней мере, на уровне трансляции.

В сателлитных глиоцитах блокада также, как и в нейронах вызывает стереотипный для этих клеток цитохимический ответ - существенные колебания содержания рРНК (рис. 1а, б, в). Вместе с тем динамика этого показателя имеет свои особенности. В отличие от нейронов, в глиоцитах изменения при всех уровнях блокирования нХР характеризуются четко выраженным фазным характером, и в них можно выделить три различных фазы (рис. 1 а, б, в).

Фаза подъема, во время которой в глиоцитах происходит увеличение содержания рРНК. Указанный сдвиг отмечается в первые часы после введения ганглиоблокатора при всех уровнях блокирования нХР и его величина прямо не связана с количеством блокированных нХР. Так ампли-туда изменений рРНК в глиоцитах при блокаде большого количества нХР и при полной блокаде нХР (рис. 1в) оказывается практически одинаковой (р 0,05).

Фаза нормализации, во время которой содержание рРНК в глиоцитах временно нормализуется.

Фаза снижения, во время которой содержание рРНК в глиоцитах снижается.

Фазный характер количественных сдвигов рРНК в сателлитных глиоцитах скорее всего является частным проявлением общих закономерностей в динамике синтетической активности глиоцитов разных отделов нервной сис-темы, которые при различных воздействиях отвечают, как правило, разно-направленными относительно контрольного уровня модуляциями содержания рРНК (Гейнисман Ю.Я., 1974; Мац В.Н., 1994).

Таким образом, симпатические нейроны и окружающие их глиоциты характеризуются различной метаболической реакцией в ответ на нарушение синаптических процессов, вызванных блокадой.

Нейрон-глиальная метаболическая корреляция при разных уровнях блокирования никотиновых холинорецепторов

В модуляциях содержания рРНК в нейронах и окружающих нейроны сателлитных глиоцитах в условиях частичной блокады, сохраняющей в синапсах некоторое количество незаблокированных и, следовательно, функционально активных нХР, обнаруживается высокая, статистически достоверная положительная корреляционная зависимость.

Напротив, при полном блокировании нХР такая корреляционная зависимость между указанными клеточными системами отсутствует.

Высокая согласованность в динамике количественных изменений рРНК между симпатическими нейронами и соседними с ними сателлитными глиоцитами при наличии активных нХР и отсутствие таковой при полном блокировании нХР позволяет полагать, что в симпатическом ганглии существует механизм, координирующий метаболические изменения рРНК в нейронах и глиоцитах. Необходимым компонентом этого механизма координации является медиаторное взаимодействие с нХР, расположенных в синапсах симпатических нейронов.

Таким образом, из анализа полученных данных, следует, что в механизмах управления работой симпатического ганглия существует важное функциональное звено, представленное никотиновыми холинергическими синапсами (нХР).

На основании полученных экспериментальных данных можно заключить, что, во-первых, синаптический сигнал через нХР оказывает индуктивное и модулирующее воздействие на активность белок-синтезирующей системы в симпатических нейронах КШСГ вызывая, в ответ на вызванные блокадой изменения синаптической активности, повышение функционального потенциала этой системы.

Во-вторых, через медиаторное взаимодействие с нХР симпатические нейроны сопрягают свою метаболическую активность с метаболической активностью соседних с ними сателлитных глиоцитов, по крайней мере, на уровне количественных изменений рРНК в этих клетках.

2. Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на энергетические процессы в симпатическом ганглии

Особенности изоферментного спектра ЛДГ интактного ганглия и входящих в его состав симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов

В связи с тем, что спектр изоферментов ЛДГ характеризует высокая органная и тканевая специфичность (Райдер К., Тейлор К., 1983) для решения поставленных в работе задач необходимо было определить в КШСГ кроликов не исследованный до настоящего времени изоферментный состав ЛДГ. На основании полученных электрофореграмм установлено, что в интактном ганглии ферментативная система ЛДГ представлена всеми пятью основными изоферментами (рис. 2). Наиболее активны из них анодные фракции ЛДГ-1 и ЛДГ-2, суммарный вклад которых в общую активность ЛДГ составляет более 50% от активности остальных изоформ (ЛДГ-3, ЛДГ-4 и ЛДГ-5).

В связи с этим КШСГ кролика можно отнести к категории органов, в которых превалирует активность, так называемых, изоформ ЛДГ сердечного типа (Райдер К., Тейлор К., 1983; Зимин Ю.В. с соавт., 2001).

Цитохимический анализ изоферментного состава ЛДГ подтверждает основные результаты, полученные при изучении ферментативной системы ЛДГ на уровне симпатического ганглия. Также как и в ганглии, в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах выявляется высокая активность Н и М-изоформ ЛДГ (рис. 4). Вместе с тем в указанных клетках обнаруживаются важные принципиальные различия в соотношении активности меж-ду Н и М изоформами ЛДГ (рис. 4).

В нейронах, как и в симпатическом ганглии, в спектре ЛДГ преобладает активность Н-изоформ (Н/М > 1). Такая особенность изоферментного профиля ЛДГ нейронов и ганглия в целом выглядит закономерной, так как высокий уровень активности Н-изоформ необходим для реализации высоко-эффективной аэробной фазы энергопродукции (Хочачка П., Сомеро Дж., 1977; Gladden L., 2004).

Вместе с тем изоферментный профиль ЛДГ расположенных вокруг нейронов сателлитных глиоцитов характеризуется противоположной направленностью (рис. 4). В этих клетках наиболее активны М-изоформы (Н/М < 1), что свидетельствует, с учетом субстратной специфичности М-изоформ (Pellerin L., 2003; Bouzier-Sore A., et al., 2003), о том, что сателлитные глиоциты продуцируют лактат в значительно большем количестве, чем нейроны.

Выявленные на клеточном уровне различия ферментативных систем ЛДГ указывают, таким образом, на существование в симпатическом ганглии градиента в распределении лактата между симпатическими нейронами и окружающими их сателлитными глиоцитами. Наличие такого градиента между клетками, в соответствии с современными представлениями биоэнергетики (Gladden L., 2004; Philp A. et al., 2005; Schurr A., 2006), создает принципиальные возможности для осуществления межклеточного транспорта лактата, который может использоваться в качестве дополнительного энергетического ресурса для интенсивно работающих клеток. Именно существование такого механизма на основе трансферта лактата через глиосинаптические контакты в активно работающие нейроны из астроцитов, которые имеют точно такую же, как и сателлитные глиоциты, анаэробную направленность энергетического обмена, предусматривается в головном мозге в соответствии с концепцией лактатного челночного механизма ANLSH (astrocyte-neuron lactate shuttle hypothesis) (Pellerin L., 2003; Pellerin L., Magistretty P., 2004; Pierre K., Pellerin L., 2005).

Можно полагать в связи с вышеизложенным, что установленные разли-чия в ферментативных системах ЛДГ симпатических нейронов и сателлитных глиоцитов характеризуют те же клеточные механизмы энергетического взаимодействия, которые предусматриваются концепцией ANLSH, и сателлитные глиоциты симпатического ганглия наделены подобно астроцитам функциями энергообеспечения нейронов.

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на ферментативную активность и изоферментный профиль ЛДГ в симпатическом ганглии

Синаптическая блокада нХР, как частичная, так и полная, ингибирует в значительной мере активность всей ферментативной системы ЛДГ.

Наибольшие по величине сдвиги наблюдаются уже при частичном блокировании нХР. В этих условиях синаптической блокады происходит полное исчезновение катодных фракций (ЛДГ-4 и ЛДГ-5). Активность остающихся в спектре анодных фракций (ЛДГ-1 и ЛДГ-2) и гибридной формы ЛДГ-3, при этом, резко снижается, составляя значительно меньше половины (29%, 30% и 13% соответственно) от активности этих изоформ в контроле (рис. 3). Сле-ствием этих изменений является значительное снижение (более чем в 5 раз) активности общей ЛДГ.

В редуцированном таким образом спектре ЛДГ, состоящем только из трех изоферментов, заметно выражена поляризация между активностью анодных фракций ЛДГ-1 и ЛДГ-2, на долю которых приходится 86% всей активности ферментативной системы ЛДГ, и активностью гибридной изо-формы ЛДГ-3 (рис. 3). На долю последней приходится только 14% всей активности ЛДГ, в связи, с чем она не вносит заметный вклад в общую активность ЛДГ.

В результате таких изменений, в спектре ЛДГ при частичной блокаде нХР вклад (83%) Н-субъединиц в общую активность ЛДГ, по сравнению с нормой заметно возрастает (рис. 3). Это означает, с учетом функциональной значимости Н и М изоформ (Pellerin L., 2003; Gladden L., 2004), что метаболическая направленность ферментативной системы ЛДГ и характер ее воз-действия на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при блокировании рецепторов меняются: основной процесс наработки пирувата из лактата сохраняется, тогда как катализация обратного процесса - превращения пирувата в лактат в значительной степени снижается.

Следует при этом подчеркнуть, что в силу резкого, почти пятикратного падения активности ЛДГ, в результате которого активность фермента составляет только 19% от уровня контроля (рис. 3), сама по себе степень участия ферментативной системы ЛДГ в реализации аэробной фазы энергопродукции при частичном блокировании нХР в целом оказывается существенно сниженной.

При полном блокировании нХР процесс сжатия спектра ЛДГ продолжается. Из спектра окончательно исчезает гибридная форма изофермента ЛДГ-3 и в составе ферментативной системы ЛДГ остаются только две изоформы: ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Активность этих изоформ, по сравнению с условиями частичного блокирования рецепторов, при этом еще более снижается.

Следует подчеркнуть, что, и при частичном блокировании и при полном блокировании нХР, сохраняется полная синхронность в изменениях ЛДГ-1 и ЛДГ-2. В результате этого уровень остаточной активности одинаков для ЛДГ-1 и ЛДГ-2. Этот показатель (16%), равно как остаточная активность ЛДГ в целом (9%), существенно ниже (р 0,01), чем величина этих показателей при частичном блокировании никотиновых рецепторов.

В редуцированном таким образом спектре, полностью представленным только двумя изоферментами, суммарный вклад в ферментативную активность Н-субъединиц составляет 89%, а М-субъединиц - всего 11%. Это говорит о том, что метаболическая направленность ферментативной системы ЛДГ и ее воздействие на энергопродуцирующие механизмы в ганглии при полной блокаде нХР приобретают практически односторонний характер, ориентированный на превращение лактата в пируват, на фоне практически полного прекращения обратной реакции с участием ЛДГ - превращения пирувата в лактат.

Редукция изоферментного состава и крайне низкий уровень активности ЛДГ при полном блокировании никотиновых холинорецепторов значительно ограничивает потенциальные возможности ферментативной системы ЛДГ для участия в энергопродуцирующих механизмах ганглия.

Таким образом, частичная блокада нХР в симпатическом ганглии вызывает редукцию спектра ЛДГ и значительное снижение активности всей ферментативной системы ЛДГ. Полная блокада нХР практически исключает участие этого фермента, как в энергообеспечении, так и в других процессах метаболизма. Вместе с этим блокирование холинорецепторов трансформирует функциональную направленность ферментативной системы ЛДГ, существенно сдвигая катализируемую этой системой реакцию взаимопревращения пирувата и лактата в сторону преимущественного образования пирувата.

Полученные результаты позволяют заключить, что органноспецифичный для КШСГ изоферментный состав и активность ЛДГ поддерживаются только при нормально функционирующих нейрональных никотиновых холинорецепторах и указывают на важную роль этих рецепторов в механизмах гомеостаза ферментативной системы ЛДГ.

Влияние блокирования никотиновых холинорецепторов на ферментативную систему ЛДГ в симпатических нейронах и сателлитных глиоцитах