Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами

Размещено на http://allbest.ru

На правах рукописи

Автореферат диссертации

на соискание ученой степени доктора биологических наук

Молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические подходы для ускоренного создания селекционного материала растений с заданными свойствами

специальности: 03.01.06 - биотехнология (том числе нанобиотехнологии); 03.02.07 - генетика

Карлов Геннадий Ильич

Москва 2010

Работа выполнена в Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева

Научный консультант: Доктор биологических наук, профессор Л.И.Хрусталева

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук А.В.Поляков

Доктор биологических наук А.А.Поморцев

Доктор сельскохозяйственных наук Н.И.Тимин

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии РАСХН

Защита состоится « » октября 2010 г. в 14:30 на заседании диссертационного совета Д.220.043.10 при Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева по адресу: 127550, г.Москва, ул.Тимирязевская, 49. Факс: +7(495) 9777001, сайт www.timacad.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке им. Н.И.Железнова РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева.

Автореферат разослан « » 2010 г. и размещен на сайте http://www.vak.edu.gov.ru

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук Л.С.Большакова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Важной и актуальной проблемой в селекции растений является задача создания селекционного материала с заданными свойствами. Создание такого материала до сих пор остается сложной и, в отдельных случаях, трудновыполнимой задачей. С одной стороны, с появлением технологий генной инженерии стало возможным создание таких растений. Однако, несовершенство этих технологий и возможность генетической модификации только единичных признаков не всегда позволяет применять их на практике. С другой стороны классическими методами селекции создано огромное количество ценного селекционного материала. Применение и интеграция новых технологий молекулярно-генетической оценки этого материала в селекционный процесс позволит значительно сократить время создания генотипов с заданными свойствами.

За последние два десятилетия использование молекулярно-генетических методов позволило исследовать физическую и функциональную организацию геномов многих сельскохозяйственных культур (Collard and Mackil, 2007). Одним из основных понятий, объединяющих эти методы, является понятие «молекулярно-генетический маркер». Внедрение ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому (Francia at al. 2005). В настоящее время разработано большое количество типов молекулярно-генетических маркеров, которые основаны на различных классах последовательностей геномной ДНК. Они позволяют выявлять генетическое разнообразие на молекулярном уровне организации ДНК, что является базисом, на котором основаны все дальнейшие теоретические (филогения, изучение организации генома) и прикладные (картирование, маркирование генов, генотипирование) исследования.

При отборе нужных генотипов в расщепляющихся популяциях, селекционер сталкивается обычно со следующими проблемами:

1) Для отбора генотипа по заданному признаку необходима большая расщепляющаяся популяция;

2) Необходимо дождаться нужного поколения (F₅, F₆);

3) Становится достаточно сложно проводить отбор в популяции по нужному признаку, если его проявление зависит от условий окружающей среды;

4) Чаще всего приходится ждать до поздних этапов онтогенеза растений, чтобы провести отбор по признаку;

5) Трудно проводить накопление генов, например устойчивости, так как сложно провести отбор генов в присутствии уже существующих (Gupta and Varshney, 2000).

Помочь решить данные проблемы может использование близко сцепленных с признаком молекулярных маркеров, полученных различными методами.

До недавнего времени в селекции сельскохозяйственных культур использовались только морфологические маркеры. Они могли проявляться на различных этапах развития растений, идентифицироваться визуально или в результате биохимических исследований. При этом проявление тех или иных признаков в значительно степени зависит от условий внешней среды. Традиционные методы селекции на устойчивость требуют создания инфекционных фонов и трудоемкую оценку каждого образца. Проведение таких работ связано со значительными затратами труда и времени. Селекционный процесс для однолетних культур затягивается до 10, а для двулетних до 20 лет.

Использование ДНК-маркеров позволяет значительно сократить затраты труда, ускорить и удешевить селекционный процесс, а также контролировать перенос хозяйственно-ценных генов от одного организма другому. Наиболее эффективными молекулярными маркерами являются те, которые основаны на характерных особенностях нуклеотидных последовательностей самих генов. Для разработки таких ДНК-маркеров необходимо выявить различия в структуре последовательностей ДНК локусов (генов) у форм растений отличающихся по проявлению признака, например по устойчивости к фитопатогену.

Цель и задачи исследования. Цель исследований - разработка комплексной системы анализа геномов растений, основанной на использовании современных молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических технологий для эффективной и ускоренной селекции растений

Задачи исследования

1. Разработать систему идентификации родительских геномов и мониторинга чужеродного генетического материала в селекционных программах с использованием межвидовой гибридизации.

2. Изучить особенности организации геномов растений, представителей различных семейств, для разработки эффективных ДНК-маркеров.

3. Разработать методологию использования молекулярных и молекулярно-цитогенетических маркеров на различных этапах селекционного процесса.

4. Разработать новые подходы изучения механизмов формирования 2n-гамет с целью преодоления межвидовой несовместимости при создании ценного селекционного материала.

5. Исследовать возможности использования ISSR-PCR-маркеров для оценки исходного селекционного материала и при создании эффективных ДНК-маркеров.

6. Клонировать и охарактеризовать последовательности генов устойчивости растений и их аналогов.

7. Создать ДНК-маркеры на хозяйственно-ценные гены томата, риса, огурца, малины и хмеля.

Научная новизна и практическая значимость. Адаптирована методика геномной in situ гибридизации на межвидовых гибридах лилий и изучен геномный состав этих гибридов, получаемых с использованием 2n-гамет. Вперые установлен механизм формирования 2n-гамет у межвидовых гибридов лилий, основанный на редукции первого деления мейоза (FDR). На основе разработанного метода многоцветной геномной in situ гибридизации на лилиях впервые подтверждена возможность создания трехгеномных гибридов (2n=36). генный растениеводство селекция сельскохозяйственный

Разработана оптимизированная методика совместного применения дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и ДНК-маркирования, позволяющая проводить эффективное выявление межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.

Впервые продемонстрирована возможность использования высокоповторяющейся геномспецифичной последовательности ДНК GenBR-1 для визуализации генома B капустных в разном геномном окружении.

С помощью флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) впервые установлена геномная организация высокоповторяющихся последовательностей ДНК Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов томата. Показано, что у томата ретротранспозоны локализованы в прицентромерных гетерохроматиновых регионах хромосом. Подтверждена эффективность использования пахитенных хромосом томата для такого анализа. Для растений с крупными геномами (лилии, крокусы, тюльпаны и лук) показано равномерное распределение Ty-1-copia-подобных ретротранспозонов, за исключением C-бэндинг положительных регионов хромосом, где они не выявляются.

Впервые клонирована высокоповторяющаяся субтеломерная последовательность ДНК хмеля. С помощью FISH анализа показана субтеломерная локализация этой последовательности на хромосомах. Выявлено, что эта последовательность может служить цитогенетическим маркером для идентификации хромосом хмеля. Впервые установлено, что последовательности генов рибосомной РНК (45S и 5S) являются эффективными цитогенетическими маркерами для идентификации трех из 10 хромосом хмеля с использованием флуоресцентной гибридизации in situ.

Выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК (ISSR) на видовом и межвидовом уровнях у видов Solanum, Humulus lupulus, Cucumber и Rubus. Рекомендован набор ISSR праймеров для анализа исходных родительских и гибридных форм при внутри- и межвидовой гибридизации, а также форм растений томата с различным уровнем интрогрессии генетического материала. На основе выявленного полиморфизма ISSR создана интегрированная генетическая карта межмикросателлитных последовательностей ДНК томата и высокоэффективные ДНК-маркеры для выявления пола у растений хмеля и признака ремонтантности малины.

Впервые проведено клонирование двух последовательностей ДНК, специфичных для хромосомы Y мужских растений хмеля. На основе анализа клонированных последовательностей созданы эффективные ДНК маркеры для выявления пола растений хмеля, которые могут использоваться в селекционном процессе.

Впервые клонированы фрагменты последовательностей генов устойчивости подсолнечника остролистного. Установлена их высокая степень гомологии с ранее клонированными генами устойчивости растений.

Идентифицированы молекулярные маркеры WA-типа ЦМС риса. Идентифицированы и картированы молекулярные маркеры, тесно сцепленные с геном восстановления фертильности Rf4, расположенные на длинном плече 10-й хромосомы риса.

Продемонстрирована высокая эффективность сравнительного анализа ДНК локусов генов устойчивости у устойчивых и неустойчивых генотипов растений для создания надежных ДНК-маркеров. Созданы кодоминантные CAPS-маркеры генов устойчивости к фузариозу (I2) и ветрициллезу (Ve) томата. Созданы ДНК диагностикумы на гены устойчивости томата - к фузариозу и вертициллезу, хмеля - на определение пола растений, риса - на ЦМС и ген восстановления фертильности, и оптимизированы условия применения ДНК маркеров на гены устойчивости томата к нематоде, ВТМ, кладоспориозу. Предложены оптимальные высокопроизводительные методики выделения ДНК для массового скрининга селекционного материала. Разработаны методы и схемы высокопроизводительной оценки на наличие хозяйственно-ценных признаков в исходном селекционном материале с помощью ДНК технологий. Получены перспективные формы томата, сочетающие несколько генов устойчивости к болезням и вредителям в одном генотипе, и создан коммерческий гибрид F₁.

Выносимые на защиту положения:

1.Методология использования молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических методов в селекции основанная на:

· достижениях в геномике и биоинформатике;

· надежности и эффективности молекулярно-генетических и молекулярно-цитогенетических ДНК-маркеров;

· возможности ускорения селекционного процесса в два раза и сокращения расходов при создании гибридов F₁ овощных культур;

· предлагаемой схеме интеграции ДНК технологий для сопровождения селекционного процесса.

2. Схема интегрированных исследований для сопровождения селекционного процесса.

3. Эффективные ДНК-маркеры для селекции растений по хозяйственно-ценным признакам.

4. Механизм формирования 2n-гамет межвидовых гибридов лилий, основанный на редукции первого деления мейоза (FDR).

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на XIX International Symposium on Improvement of Ornamental Plants (Angers, France, 1999), Fifth International Solanaceae Conference (Nijmegen, 2000), Международной научно-практической конференции «Селекция и семеноводство овощных культур в XXI в.» (Москва, 2000), научной конференции «Памяти Грегора Менделя» (Москва, 2001), научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения А.Р.Жебрака и 70-летию образования кафедр генетики в Московской с.-х. академии им. К.А.Тимирязева (Москва, 2002), International Hop Growers` Convention (Dobrna-Ћalec, Slovenia 2003), 2-й научной конференции МОГИС им.Н.И.Вавилова «Актуальные проблемы генетики» (Москва, 2003), 4th International Iran and Russian Conference in Agriculture and Natural Resources (Shakhrekord, Iran, 2004), XV Federation of European Societies of Plant Biology (FESPB) Congress (Lyon, France, 2006), Второй Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке: состояние, проблемы, перспективы» (Санкт-Петербург, 2007), International Conference “Molecular Mapping and Marker Assisted Selection in Plants” (Vienna, Austria, 2008), международной конференции «Научное наследие Н.И.Вавилова - фундамент развития отечественного и мирового сельского хозяйства» (Москва, 2007), конференциях преподавателей и сотрудников РГАУ-МСХА имени К.А.Тимирязева 1997-2008 гг.

Связь работы с крупными научными программами. Исследования проводились в рамках проектов РФФИ (00-04-49561-а, 01-04-06522-мас, 06-04-49753-а), государственных контрактов с Министерством образования Российской Федерации в рамках ФцНТП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники» на 2002--2006 годы", государственных контрактов с Федеральным агентством по науке и инновациям в рамках ФЦП "Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы" и ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, а также государственных контрактов с Министерством сельского хозяйства Российской Федерации.

Публикации. По материалам докторской диссертации опубликовано 65 работ, из них 25 научных работ в рецензируемых журналах из «Перечня…» ВАК РФ, 1 патент на изобретение и 1 авторское свидетельство.

Личный вклад соискателя. Экспериментальные результаты получены автором лично и совместно с коллегами из центра молекулярной биотехнологии, кафедры генетики, международного института исследований растений PRI (Wageningen, Нидерланды), Университета Хохенхайма (Германия), а также с аспирантами и студентами, работавшими под руководством диссертанта. Соискателю принадлежат разработка программы исследования, схемы основных экспериментов и теоретическое обобщение полученных результатов. Доля личного участия в публикациях, выполненных в соавторстве, пропорциональна числу соавторов. Автор выражает большую благодарность научному консультанту, д.б.н., профессору Л.И.Хрусталевой, а также сотрудниками центра молекулярной биотехнологии, кафедры генетики, аспирантам и студентам, которые принимали участие в экспериментальных работах и обсуждении результатов. Автор выражает признательность Григорию Федоровичу Монахосу, директору селекционной станции им. Н.Н. Тимофеева, и Александру Александровичу Соловьеву, заведующему кафедрой генетики РГАУ-МСХА, за предоставленный селекционный растительный материал для проведения исследований и ценные советы. Особую признательность автор выражает академику РАСХН В.С.Шевелухе за помощь, поддержку и ценные советы при обсуждении полученных результатов исследований.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на ____стр. машинописного текста, включает____таблицы, ____рисунка, состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и обсуждения, выводов, списка литературы включающего___ отечественных и зарубежных источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования выполнены в 1996-2009 годах в Российском государственном аграрном университете - МСХА имени К.А.Тимирязева.

В работе использовали 6 форм межвидовых гибридов лилий (PRI, Wageningen), семена первичных тритикале АД-1, АД-3, АД-4, межамфиплоидного гибрида (МАГ) и перспективных линий тритикале 491-07 и 497-07 (ГНУ НИИСХ Юго-Востока), селекционные формы тритикале, сорта и линии яровой и озимой пшеницы, коллекцию видов томата и их межвидовые гибриды и моносомно-дополненные формы (кафедра генетики РГАУ-МСХА), расщепляющиеся по хозяйственно-ценным признакам селекционные популяции томата (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева, агрофирмы «Ильинична», «Гавриш», «Манул»), набор видов Brassicaceae с геномом В (коллекция ВНИИ сельскохозяйственной биотехнологии), коллекцию из более 60 форм и сортов хмеля (ВНИПТИХ, Цивильск, Центр молекулярной биотехнологии РГАУ-МСХА, Университет г.Штутгарта, Германия), ЦМС линии капусты пекинской Brassica pekinensis (Селекционная станция имени Н.Н.Тимофеева), селекционные линии риса с WA-типом ЦМС и генами восстановления фертильности (Иран) (4 ЦМС линии: Neda-A, IR67017-180-2-1-2-А, Usen-A, IR68897-A, 4 их соответствующих фертильных аналогов (линий закрепителей) Neda-B, IR67017-180-2-1-2-B, Usen-B, IR68897-B; 7 фертильных линий восстановителей: IR24, IR28, Amol2, IR36 IR62030, IR60966, Amol1; 7 Популяций F2), аллоцитоплазматические линии пшеницы (РУДН), 64 образца ДНК, выделенные из растений F₂ расщепляющейся популяции межвидового гибрида S. lycopersicum Х S. pennellii (образцы ДНК подготовлены и предоставлены док. A. W. van Heusden, PRI, Wageningen, The Netherlands).

Цитологические препараты готовили по стандартным методикам приготовления постоянных препаратов методами раздавливания и распластывания митотических и мейотических хромосом (Пухальский и др., 2004; Zhong X.-B. et al., 1996).

Геномную in situ гибридизацию осуществляли по стандартной методике (Schwarzacher., 1992), с некоторыми модификациями. Хромосомы контрокрашивали пропидий-йодидом или DAPI 1 мг/мл. Анализ результатов проводили на флуоресцентных микроскопах “Axiophot” и “AxioImager” (“Zeiss”, Германия) с соответствующими системами фильтров. Для анализа изображений производили фотосъемку на пленку Fuji 400 или использовали цифровую фотокамеру с соответствующим программным обеспечением. После проявки пленку сканировали в компьютер и обрабатывали изображение, используя программу Photoshop CS.

Выделение ДНК осуществляли из молодых листьев или семядолей вегетирующих растений, а также этиолированных проростков пшеницы, ржи и тритикале по стандартным методикам с некоторыми модификациями (Bernatzky and Tanksley, 1986; Van der Beek et al., 1991; Fulton et al., 1995).

Праймеры для амплификации и флуоресцентные ДНК-зонды синтезированы в ЗАО «Синтол», Москва. Амплификацию проводили на амплификаторах «Терцик» («ДНК-технология», Москва) и «DNA Engine Tetrad 2» (Bio-Rad, USA). Детекцию флуоресценции осуществляли на приборе «Джин» с программным обеспечением фирмы изготовителя («ДНК-технология», Москва). Условия проведения амплификации были индивидуальны для каждого из праймеров. В некоторых случаях производили оптимизацию условий амплификации.

Продукты ПЦР разделяли в 1,5-2% агарозном геле с буфером ТВЕ при напряженности поля 6 V/см. В качестве маркера молекулярного размера использовали «100 bp leader» (Fermentas).

Клонирование ПЦР-продуктов проводили с помощью набора pGEM®-T Easy Vector Systems (Promega, USA) в соответствии с инструкцией, предложенной производителем.

Анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью программных пакетов GeneDoc (Multiple sequence alignment editor and shading utility. Ver. 2.6.002. Copyright^© by K. Nicholas), Clone manager 6 version 6.00 (Sci Ed Central). Поиск гомологичных последовательностей и их анализ проводили в открытых базах генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), Sol Genomic Network (http://www.sgn.cornell.edu/about/tomato_project), EMBL-EBI (http://www.ebi.ac.uk).

Филогенетическая модель родства исследованных видов была построена путем обработки данных ISSR-PCR-анализ с помощью кластерного анализа по методу невзвешенного попарного арифметического среднего UPGMA (Nei et al., 1983). В качестве филогенетической дистанции между двумя видами брали отношение полученных при сравнении количества полиморфных ISSR-фрагментов к общему количеству ISSR-фрагментов.

Обработку данных по расщеплению и расчет генетических расстояний проводили с помощью программного пакета MapMaker/EXP 3.0 (Lincoln et al. 1992). Для анализа сцепления по отдельным маркерам, частота рекомбинации между маркером и локусом была рассчитана с использованием метода максимального правдоподобия (Allard, 1956).

Результаты И обсуждение

1. РАЗРАБОТКА СИСТЕМЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ РОДИТЕЛЬСКИХ ГЕНОМОВ И МОНИТОРИНГА ЧУЖЕРОДНОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА В СЕЛЕКЦИОННЫХ ПРОГРАММАХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ОТДАЛЕННОЙ ГИБРИДИЗАЦИИ

Успешная межвидовая гибридизация является базой для интрогрессии хозяйственно-ценных признаков в культурные растения. В зависимости от объекта, целей и задач, стоящих в процессе интрогрессии генетического материала, требуется разработка различных систем мониторинга чужеродного генетического материала. Они могут быть основаны на молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методах, как в отдельности, так и их комлексе.

1.1 Молекулярно-цитогенетические методы

Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий. В процессе межвидовой гибридизации в международном центре исследований растений PRI, Нидерланды, создан ряд форм и гибридов лилий разного уровня плоидности и геномного состава. Ранее было показано, что фертильные растения межвидовых гибридов лилий образуют 2n-гаметы (Van Tuyl, J.M. et al., 1989, Tuyl, J.M. et al., 1997). Однако механизм возникновения таких гамет и возможность их использования в селекционных программах по созданию новых форм лилий оставались неизвестными. В нашей работе была впервые использована геномная гибридизация in situ для идентификации родительских геномов в межвидовых гибридах лилий, а также выяснения механизмов возникновения 2n гамет.

Гибрид F₁: L.longiflorum 'Gelria' х азиатский гибрид 'Whilito' (LA). В результате геномной in situ гибридизации оказалось возможным четко различить оба родительских генома, L. longiflorum и азиатского гибрида, в LА-гибриде (рис.1а).

Рис 1 . Геномная гибридизация in situ на межвидовых гибридах лилий. a. F₁:(L.longiflorum х азиатский гибрид (синие хромосомы) (LA) b. F₁ (азиатский гибрид х [L.longif1orum х азиатский гибрид (ALA)] c. F₁ восточный гибрид (красные хромосомы) х (L. longiflorum х азиатский гибрид). Стрелками указаны сайты рекомбинации. L.longiflorum - зеленые хромосомы, азиатский гибрид - синие хромосомы, восточный гибрид - красные хромосомы).

Двенадцать хромосом с зеленой флуоресценцией принадлежат L. longiflorum. Проба равномерно гибридизовалась по всей длине этих хромосом. Остальные двенадцать хромосом с синей флуоресценцией принадлежат азиатскому гибриду 'Whilito' и визуализованы методом контрокрашивания красителем DAPI. Нами наблюдался очень низкий уровень перекрестной гибридизации меченой ДНК L.longiflorum на хромосомы, имеющие происхождение от азиатского гибрида 'Whilito'. Сайты гибридизации генов рибосомной ДНК были детектированы на трех хромосомах, имеющих происхождение от L. longiflorum и на трех - от азиатского гибрида.

Гибриды F₁: Азиатский гибрид х (L.longif1orum х азиатский гибрид) (ALA). На рисунке 1b показан результат геномной in situ гибридизации на растении ALA-2. В качестве пробы были использованы ДНК L.longiflorum (зеленая флуоресценция) и ДНК плазмиды рТА 71 (красная флуоресценция), контрокрашивали DAPI (синяя флуоресценция). Это растение является триплоидом(2n=36) вследствие образования нередуцированных 2n-гамет LА-гибридом, который использовался в качестве отцовской формы для получения ALA растений. В растении ALA-l обнаружено пять рекомбинантных хромосом, восемь нерекомбинантных хромосом от L. longifloruт и двадцать три хромосомы азиатского гибрида. Одна из рекомбинантных хромосом содержала четыре сегмента, полученных от геномов L. longifloruт и Азиатского гибрида, что указывает на три сайта рекомбинации (рис 1b). Три хромосомы имели два сайта кроссинговера и одна хромосома имела один сайт, который был близко расположен к рДНК региону хромосомы азиатского гибрида. В общей сложности в ALA-l было обнаружено десять точек рекомбинации и было обнаружено два и семь рДНК-сайтов, принадлежащих L. longifloruт и азиатскому гибриду соответственно.

В растении ALA-2 (2n=36) выявлено три рекомбинантных хромосомы, 10 принадлежащих L.longifloruт и 23 азиатскому гибриду. Две рекомбинантные хромосомы имели по два сайта кроссинговера и одна - один сайт. Три и шесть сайтов рДНК, принадлежащих L. longifloruт и азиатскому гибриду соответственно, было обнаружено в этом растении. Растение ALA-3 (2n=36) имело 12 хромосом от L. longif1oruт и 24 хромосомы азиатского гибрида. В растении ALA-4 было обнаружено 48 хромосом, из них 12 имеют свое происхождение от L. longif1oruт.

Гибрид F₁: Восточный гибрид х (L. longiflorum х азиатский гибрид) (OLA). Для визуализации и анализа геномной организации трехвидового гибрида мы успешно использовали метод многоцветной геномной in situ гибридизации. В растении OLA (2n=36) все три родительских генома были четко различимы (рис 1c). Анализ кариотипа показал, что данный гибрид содержит по 12 гомеологичных нерекомбинантных хромосом каждого родителя L.longiflorum, восточный гибрид и азиатский гибрид.

Итак, адаптированный нами применительно к лилиям метод геномной in situ гибридизации позволил четко различить геномы L.longiflorum, восточных и азиатских лилий в гибридах, полученных при их скрещиваниях. Исходя из этого, мы можем заключить, что L.longiflorum, восточная и азиатская лилии содержат в своих геномах различающиеся семейства высоко- и среднеповторяющейся ДНК. Изменчивость этих типов ДНК считается источником дифференциации видов (Dеаn and Schmidt, 1995). Такая дифференциация и позволяет визуализовать геномы в межвидовых гибридах с использованием геномной in situ гибридизации (Schwarzacher et аl. 1992).

Мониторинг чужеродного хроматина при интрогрессии генетического материала от одного вида к другому является очень важным. На данный момент геномная in situ гибридизация - наиболее эффективный метод для такого мониторинга и позволяет четко установить геномный состав межвидовых гибридов. Нами этот метод успешно применен на межвидовых гибридах лилий. При этом нам удалось визуализовать сайты рекомбинации и таким образом показать возможность интрогрессии генетического материала. Основным преимуществом метода геномной гибридизации in situ является и то, что интрогрессию в гибридах лилий из-за слабой изученности их геномов, невозможно установить с использованием других молекулярных методов (RFLP, RAPD, AFLP и др.).

Успех интрогрессии полностью зависит от гомеологической рекомбинации между родительскими геномами в мейозе F₁ гибридов и от их фертильности (van Tuyl and DeJeu, 1997). Растения F₁ L. longiflorum х азиатский гибрид обычно полностью стерильны. Для преодоления этой проблемы на лилиях в настоящее время используются два подхода: митотическое удвоение хромосом и применение растений, формирующих нередуцированные 2n-гаметы (van Tuyl et аl, 1989). Последний подход наиболее предпочтителен для селекционных программ, в которых упор делается на использование интрогрессии генетического материала от одного вида к другому. Формирование нередуцированных гамет связано обычно с двумя типами нарушения мейоза: 1. отсутствием первого мейотического деления (first division restitution - FDR); 2. отсутствием второго мейотического деления (second division restitution - SDR) (Mok and Peloquin, 1975; МсСоу, 1982; Hermsen, 1984). Для использования гибридных растений, формирующих 2n-гаметы в селекционных программах, необходимо знать путь формирования таких гамет (FDR или SDR). В нередуцированных гаметах, образующихся в результате FDR, в каждую гамету попадают несестринские хроматиды каждой гомологичной хромосомы, в то время как в результате SDR сестринские хроматиды попадают в одну гамету (Ramana, 1979). В случае межвидовых гибридов по одной хроматиде от каждого родителя попадает в гаметы, сформированные в результате FDR. Отсутствие гомологичных хромосом L.longiflorum в ALA и OLA гибридах указывает на механизм FDR формирования 2n-гамет в LА-гибридах, которые были использованы в качестве отцовской формы

При анализе геномов гибридных растений ALA-I и ALA-2 нами продемонстрировано наличие рекомбинации между геномами L.longiflorum и азиатских гибридов. Эти данные указывают на формирование хиазм в процессе формирования 2n-гамет. Отсутствие рекомбинантных хромосом в растениях АLА-3, ALA-4 и OLA, вероятно, связано с полным подавлением или низким уровнем спаривания между гомеологичными хромосомами.

Использование наряду с геномной пробой рибосомальной ДНК рТа 71 позволило получить дополнительную информацию и идентифицировать хромосомы, несущие ядрышкообразующие регионы. Проанализировав распределение рДНК в ALA-1 растении, мы также получили дополнительное подтверждение образования 2n-гамет через FDR механизм.

Таким образом, использование геномной гибридизации in situ позволило получить нам ценную информацию о частоте рекомбинации между геномами L. longiflorum и азиатского гибрида в образующих 2n гаметы F₁-гибридах. Результаты нашей работы указывают на то, что такие F₁-гибриды могут быть использованы для интрогрессии генетического материала от одного вида к другому.

Геномная гибридизация in situ на моносомно дополненных линиях томата. Геномная гибридизация in situ продемонстрировала свою эффективность и в случае анализа дополненных линий томата по второй хромосоме S. lycopersicoides. При этом мониторинг чужеродного хроматина в геноме томата возможно было проводить, как на митотических, так и мейотических хромосомах.

1.2 Совместное использование молекулярно-цитогенетических и молекулярно-генетических методов

Тритикале - это относительно новая и перспективня культура, получившая признание производителей сельскохозяйственной продукции в последние десятилетия. В производстве представлены в основном гексаплоидные тритикале.

Причем, как демонстрируют исследования, перспективные линии и сорта тритикале часто несут замещения или транслокации (Zillinsky, 1980; Gustafson, Lukaszewsky, 1984; Соловьев, 2007).

Замещения и транслокации хромосом позволяют решать проблемы, характерные для яровой тритикале, как это показано в отношении признаков хлебопекарных качеств зерна, устойчивости к прорастанию на корню, толерантности к ионам алюминия и другие (Rybka, 2003; Oracka and Јapiсski, 2006; Wos et al., 2006).

Таким образом, идентификация и подробная молекулярно-генетическая характеристика таких линий является важной проблемой. Эта информация будет основой для создания новых перспективных линий тритикале с заданными свойствами.

Идентификация хромосом и их участков может быть выполнена с использованием различных методов - дифференциального окрашивания, молекулярного маркирования, геномной гибридизации in situ. Применение комплексного подхода с использованием разных методов позволяет осуществлять надежную идентификацию хромосомных наборов тритикале.

С целью разработки такого подхода в нашей работе использовалась модельная линия тритикале 131/7, несущая пшенично-ржаную транслокацию.

Для идентификации хромосом, вовлеченных в эту транслокацию, применяли в комплексе молекулярно-генетические и молекулярно-цитогенетические методы.

На первом этапе была физически картирована точка транслокации с использованием адаптированного нами метода гeномной гибридизации in situ после дифференциального окрашивания на одной и той же метафазной пластинке (Рис.2).

После анализа рисунка дифференциального окрашивания хромосом нами определено, что в геноме линии 131/7 присутствует замещение 2В хромосомы на 2D-хромосому и транслокация длинного плеча хромосомы 2В в хромосому 2R.

Однако, применение только цитологических маркеров для характеристики хромосом не может полностью исключить ошибок при идентификации генетического материала (Devos et al., 2000, Pestsova et al., 2000; Salina et al., 2003).



Рис.2. Совмещение дифференциального окрашивания и гибридизации in situ на одной и той же метафазной пластинке хромосом линии тритикале 131/7 (генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).

Для подтверждения данных молекулярно-цитогенетического анализа нами был использован метод молекулярного маркирования.

Для этого экспериментальным путем были подобраны микросателлитные маркеры, специфичные для конкретных хромосом. Отсутствие амплификации таких маркеров на других геномах дало возможность нам использовать их как STS-маркеры.

Это позволило удешевить проведение такого анализа, так как не требуется проведение дорогостоящего денатурирующего гель-электрофореза. К преимуществам такого подхода можно отнести и отсутствие необходимости выявления полиморфизма исходных форм, участвовавших в создании тритикале.

Нами были подобраны следующие микросателлитные маркеры на длинное и короткое плечи 2В хромосомы: Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332,Xgwm120, Xwmc441, Xbarc167, Xbarc1064, Xbarc1139, Xwmc592, Xwmc477, Xbarc13, Xgwm429 (рис. 3), а также маркеры, специфичные на короткое и длинное плечо всех хромосом генома D (Табл.1).

Таблица 1.

Результаты амплификации микросателлитных маркеров, специфичных для D-генома у линии тритикале 131/7.

Локализация	SSR- маркер	Наличие амплификации	Локализация	SSR-маркер	Наличие амплификации
1DL	Xbarc271	-	4DS	Xwmc285	-
1DS	Xbarc149	-	5DL	Xbarc110	-
2DL	Xgwm349	+	5DS	Xwmc233	-
2DS	Xwmc111	+	6DL	Xbarc1030	-
3DL	Xbarc270	-	6DS	Xbarc196	-
3DS	Xbarc6	-	7DL	Xbarc53	-
4DL	Xbarc1183	-	7DS	Xwmc506	-

Примечание: здесь и далее + маркер присутствует, - - маркер отсутствует.

Рис 3. Локализация точки транслокации между хромосомой пшеницы и ржи на физической и генетической картах.

Маркеры Xwmc317, Xwmc361, Xwmc332, Xgwm120, Xwmc441, Xbarc167, Xbarc1064, Xbarc1147, локализованные в длинном плече хромосомы 2В, присутствовали в геноме линии 131/7. Маркеры Xwmc592, Xwmc477, Xbarc13, Xgwm429 отсутствовали в геноме линии 131/7 (рис. 3).

Таким образом, точка рекомбинации находится между маркерами Xwmc592, локус 63,9 сМ, и Xwmc441, локус 76,8 сМ, по карте сцепления (Wheat, Consensus SSR, 2004 NA-SSR-2004-2B, http://wheat.pw.usda.gov). По физической карте (Wheat, Physical, SSR, http://wheat.pw.usda.gov) точка рекомбинации располагается в районе C-2BL2-0.36.

Для подтверждения замещения хромосомы 2R на хромосому 2D использовали молекулярный STS-маркер на локус запасного белка Sec-2, картированный в коротком плече хромосомы 2R.

Выявление интрогрессии хроматина ржи в геном пшеницы. Для выявления хроматина генома ржи мы использовали рожь-специфичный ДНК-маркер (RYE) (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997, Katto et al., 2004). С помощью этого маркера можно идентифицировать даже небольшие интрогрессии хроматина ржи (Ribeiro-Carvalhot et. al., 1997).

Рис 4. Электрофорез продуктов ПЦР с праймерами, специфичными на генетический материал ржи (1. Аллоцитоплазматическая линия пшеницы (3.2/94), 2. Аллоцитоплазматическая линия пшеницы (8/96), 3. Тритикале 131/7, 4. Рожь `Вятка' К-9367, 5. Пшеница мягкая `Энита').

Как видно из рисунка 4 наличие амплификации наблюдается только у линий с наличием хроматина ржи. При этом наличие цитоплазмы ржи не оказывает никакого влияния на амплификацию. При анализе селекционных линий тритикале с использованием этого маркера была выявлена линия, предполагаемый октаплоидный амфидиплоид АД-4, с наличием амплификации по этому маркеру, однако, фенотипически являющаяся мягкой пшеницей. Молекулярно-цитогенетический анализ показал, что предполагаемый октаплоидный амфидиплоид АД-4 имел в своем генотипе 42 пшеничные хромосомы, при этом одна пара хромосом после геномной гибридизации in situ показала гибридизацию с меткой на рожь в субтеломерном участке (рис. 5).

Рис. 5. Геномная in situ гибридизация линии пшеницы АД-4 (Генетический материал ржи имеет желтый цвет, пшеницы - красный).

Эти данные позволяют отнести АД-4 к мягким пшеницам (2n=42), при этом пара хромосом её в субтеломерном регионе несёт интрогреcсию генетического материала ржи. Это и обуславливает амплификацию рожь-специфичного маркера (RYE).

Таким образом, на примере линии АД-4 можно видеть, что наличие амплификации рожь-специфичного маркера и маркеров на D-геном совсем не обязательно могут следовать о том, что данная форма является октаплоидной тритикале. То есть использование только молекулярных маркеров без цитогенетических оценок может привести к получению ложных результатов.

Таким образом, рожь-специфичный маркер (RYE) можно использовать для выявления истинных аллоцитоплазматических линий пшеницы с цитоплазмой ржи, не несущих в своем геноме интрогрессий хроматина ржи, а также для быстрого скрининга линий и гибридов пшеницы на наличие хроматина ржи. Разработанная нами методика скрининга, основанная на совместном использовании дифференциального окрашивания хромосом, геномной гибридизации in situ и анализа с использованием молекулярных ДНК маркеров, позволяет проводить эффективное выявление замещений и межгеномных транслокаций у тритикале и пшеницы.

1.3 Конвертирование днк-маркеров в молекулярно-цитогенетические маркеры на примере капустных, хмеля и томата

Молекулярно-цитогенетическое маркирование генома В капустных с использованием геном-специфичного ДНК маркера. На растениях с относительно небольшим содержанием ДНК на геном, применение геномной гибридизации in situ во многих случаях затруднено. Это, прежде всего, связано с относительно низким количеством видоспецифичных повторяющихся последовательностей ДНК в сравнении с крупными геномами. Применение геном-специфичных повторяюшихся последовательностей ДНК для FISH-анализа может помочь в преодолении это проблемы.

Ранее Панкиным с соавторами (2006) была клонирована высокоповторяющаяся последовательность GenBR1, специфичная для генома В капустных. С использованием флуоресцентной гибридизации in situ эта последовательность нами была локализована на хромосомных препаратах видов с различным геномным составом. В результате было выявлено, что эта последовательность локализуется в прицентромерных регионах всех хромосом генома В (рис.6).



Рис.6. Флуоресцентная гибридизация in situ маркера GenBR-1 на метафазных пластинках трех видов Brassica a. B.carinata CGN04035, b. B.nigra CGN06639, c. B.napus TAA02.

Таким образом эта последовательность может служить не только молекулярным, но и цитогенетическим маркером генома В капустных.

Хромосом-специфичные маркеры на примере половых хромосом хмеля. Хмель обыкновенный (H. lupulus) имеет 20 хромосом и характеризуется XX/XY-системой половых хромосом. Отличия в структурной организации между половыми хромосомами и аутосомами могут быть установлены при их цитогенетическом изучении. Механизм их эволюционного формирования и структурно-молекулярные различия к настоящему времени остаются мало изученными.

В нашем исследовании было проведено кариотипирование мужских и женских растений хмеля с использованием методов молекулярной цитогенетики. На первом этапе были использованы цитогенетические маркеры на основе последовательностей рибосомальных генов и дифференциального DAPI-окрашивания (Рис.7). В результате использования последовательностей рибосомальных генов были четко идентифицированы три из десяти хромосом. Между мужскими и женскими генотипами различий по этим хромосомам не наблюдалось. При наложении результатов с результатами DAPI-окрашивания удалось идентифицировать половые хромосомы. При этом Х хромосома, в отличие от других хромосом, имела DAPI положительный бэнд в прицентромерной области (Рис.7). Однако, воспроизводимость такого метода окрашивания не высока.

Рис.7. Идиограмма кариотипа мужских и женских растений хмеля обыкновенного. (Верхняя часть - DAPI окрашивание, нижняя - FISH маркеры).

Для создания надежного цитогенетического маркера половых хромосом хмеля нами было проведено клонирование и изучение высокоповторяющейся субтеломерной последовательности ДНК хмеля обыкновенного. В результате рестрикционного анализа геномной ДНК хмеля была выделена, клонирована и локализована на хромосомах повторяющаяся последовательность ДНК размером 380 п.о. Эта последовательность является надежным цитогенетическим маркером половых хромосом хмеля (Рис.8).

Рис.8. Кариограмма хмеля обыкновенного (1-9 - аутосомы, 10 - половые хромосомы (X - слева и Y - справа))

Повторяющиеся последовательности как молекулярно-цитогенетические маркеры для изучения их хромосомной организации. Повторяющиеся последовательности ДНК занимают до 90 и более процентов генома растений. Они группируются в кластеры тандемно организованных последовательностей ДНК или диспергированы по всему геному. Значительная часть диспергированных повторов представляет собой мобильные генетические элементы. Информация о локализации ретротранспозонов на хромосомах позволит судить о том, какая часть генома может быть замаркирована с помощью молекулярных маркеров, полученных на основе последовательностей ДНК ретротранспозонов.

Рис. 9. Результат флуоресцентной in situ гибридизации на хромосомы S. lycopersicum меченным продуктом реакции ПЦР с вырожденными праймерами на участок обратной транскриптазы ретротранспозона Ty1-copia (красный) и 45S рДНК (зеленый). A - сигнал на метафазных хромосомах; Б - пахитенные хромосомы томата; В - сигнал на митотической и пахитенной 6 хромосоме томата; Г - сигнал на пахитенных хромосомах томата

Нами проведена амплификация пула фрагментов гена обратной транскриптазы Ty1-copia-подобных ретротранспозонов томата, тюльпана, лука и ирисов.

С использованием метода флуоресцентной in situ гибридизации у растений с крупными геномами (тюльпан, лук, ирисы) нами выявлено относительно равномерное распределение сигнала по всей длинне хромосом, за исключением сайтов ядрышкообразующих регионов и тандемноорганизованных последовательностей ДНК. В отличие от вышеуказанных растений при флуоресцентной гибридизации in situ ретротрансозонов на пахитенные хромосомы томата выявлена их локализация в прицентромерном гетерохроматине (Рис. 9). Методом Саузерн-гибридизации показана локализация Ty1-copia-подобных ретротранспозонов в высокометилированных областях генома томата.

1.4 Молекулярно-генетические методы анализа геномов растений для идентификации генетического материала у отдаленных гибридов

Использование ISSR-PCR. Молекулярно-генетические методы анализа, основанные на проведении полимеразной цепной реакции (ПЦР), за последние 20 лет стали одними из самых популярных и используются в настоящее время для изучения многих видов организмов. Они отличаются высокой эффективностью, производительностью, хорошей воспроизводимостью и относительной экономичностью. Позволяют выявлять молекулярные маркеры на хозяйственно-ценные признаки. Все вышеперечисленные достоинства в полной мере относятся к методу ISSR-PCR, основанному на амплификации межмикросателлитных последовательностей геномной ДНК с помощью праймеров, созданных на основе того или иного микросателлита (Zietkiewicz et al., 1994). К достоинствам этого метода можно отнести и его универсальность, возможность использования на различных организмах, в том числе и на видах с мало изученными геномами.

В качестве модельного объекта в этом исследовании был использован томат. Для изучения полиморфизма межмикросателлитных последовательностей ДНК видов рода Solanum было использовано 14 ISSR-праймеров. Каждый из 14 праймеров был использован для проведения ISSR-PCR геномной ДНК каждого из пяти видов: S. cheesmanii, S. habrochaites, S. humboldtii, S. lycopersicum, S. pennellii в трёх повторностях, с трехкратным повторением. С помощью 9 из 14 ISSR-праймеров были получены четкие электрофоретические профили для каждого из пяти видов томата. Пример, полученных профилей с использованием праймеров К13 и К15, представлен на рис.10. При сравнении ISSR-профилей видов томата был выявлен высокий полиморфизм межмикросателлитных последовательностей ДНК исследованных видов томата. Наибольшее количество ISSR-фрагментов было получено при использовании праймеров К16 и К17, основанных на динуклеотидном повторе [CA], а наименьшее - при использовании праймера К15 - [GT]8YC.

Рис. 10. ISSR-профили пяти видов томата - а-б, справа налево: S. cheesmanii, S. hirsutum, S. humboldtii, S.lycopersicum, S. pennellii, полученные с использованием двух праймеров: а - К13, б - К15.

Проведение ISSR-PCR с праймером К10 на растении F₁ межвидового гибрида S.lycopersicum X S. hirsutum, позволило получить электрофоретический профиль ISSR-фрагментов геномной ДНК данного гибрида, в котором присутствовали все ISSR-фрагменты, характерные для обеих родительских форм (рис.11). Однако не все ISSR-праймеры обладали способностью идентифицировать данный гибрид. ISSR-фрагменты, типичные для S. hirsutum, не всегда выявлялись в профилях проанализированного гибрида. Также наблюдалось появление фрагментов не свойственных ни для одной из родительских форм.

Рис.11. Идентификация межвидового гибрида S.lycopersicum (Mo504) X S. hirsutum с помощью ISSR-праймера К10. Справа налево: Маркер размеров, S. hirsutum, F1 L. esculentum (Mo504) X S. hirsutum, S. esculentum (Mo504).

Таким образом, с помощью ISSR-PCR была выявлена высокая степень полиморфизма межмикросателлитных последовательностей у пяти видов рода Solanum, выбранных в качестве объектов исследования в данной работе. Это позволило провести четкое генотипическое маркирование проанализированных видов томата. Так же была проведена идентификация растения, полученного при проведении межвидовой гибридизации S.lycopersicum X S. hirsutum.

Использование ISSR-PCR для мониторинга интрогрессии чужеродного хроматина на примере линий томата S.lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Для проверки возможности использования метода ISSR-PCR для выявления интрогресси и создания генетических карт были использованы две линии S.lycopersicum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями в хромосоме 6. Используя карту интрогрессий в хромосоме 6 линий WSL6 и IL 6-3 (Weide et al., 1993), мы смогли провести физическую локализацию 13 ISSR-маркеров на хромосоме 6 S.lycopersicum в соответствии с регионами интрогрессий (рис. 12).

Рис. 12 Физическое картирование ISSR-маркеров на линиях L. esculentum WSL6 и IL 6-3 с интрогрессиями

Пять из 13 маркеров расположены в самом протяжённом регионе хромосомы, который соответствует участку интрогрессии линии WSL6, включая короткое плечо, большую часть длинного плеча и исключая только область перекрытия интрогрессии WSL6 с участком интрогрессии IL6-3 (Рис.13). В этой области также локализованы морфологические маркеры yv и m-2. Четыре маркера расположены в регионе длинного плеча хромосомы 6, который соответствует интрогрессии IL6-3, не включая область его перекрытия с интрогрессией WSL6. В данном участке также расположен ген gib-1. Ещё 4 ISSR-маркера локализованы в самой узкой области, которая расположена вокруг морфологического маркера с и соответствует участку перекрытия интрогрессий линий WSL6 и IL6-3.

...