Размещено на http://www.Allbest.ru/

Размещено на http://www.Allbest.ru/

Специальность 03.00.13 - «Физиология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Тема:

Физиологические механизмы адаптивных функций в раннем онтогенезе русского осетра Acipenser Gueldenstaedtii Brandt

Бойко Наталья Евгеньевна

Санкт-Петербург - 2008

Работа выполнена в Азовском научно- исследовательском институте рыбного хозяйства (ФГУП АзНИИРХ), г. Ростов-на-Дону и Институте эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова, г. Санкт - Петербург.

Научные консультанты:

академик РАН Ноздрачев Александр Данилович;

доктор биологических наук, профессор Григорьян Роман Ашотович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Баранникова Ирина Александровна

Заслуженный деятель науки, доктор медицинских наук, профессор Шаляпина Вера Георгиевна

доктор биологических наук, профессор Краюшкина Людмила Сергеевна

Ведущая организация: ФГУП Государственный научно-исследовательский Институт озерного и речного хозяйства, «ГОСНИОРХ»

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке им. А.М. Горького при Санкт-Петербургском государственном университете.

Ученый секретарь диссертационного Совета доктор биологических наук, профессор Н.П. Алексеев

Общая характеристика работы

Актуальность работы. Начиная с 60-х годов, популяция осетровых рыб в бассейне Азовского моря поддерживается исключительно за счет искусственного разведения, теоретическая база которого создана многолетними трудами отечественных ученых (Державин, 1947; Гербильский, 1951, 1957, 1962, 1967; Драгомиров, 1953; Баранникова, 1950, 1954, 1975; Детлаф, Гинзбург, 1954; Шмальгаузен, 1968). В последнее десятилетие резкое сокращение объемов искусственного воспроизводства осетровых, наряду с усиленным их выловом вызвало почти полное исчезновение этих ценных видов. Совершенно очевидно, что в условиях ненадежной продуктивности естественного водоема наращивание объемов выпуска молоди, а также формирование культивируемых популяций осетровых рыб невозможно без совершенствования биотехнологических норм, позволяющих сократить потери при выращивании. Ранний онтогенез, как известно, характеризуется наибольшей физиологической лабильностью. В связи с этим изучение специфики раннего онтогенеза осетровых рыб как периода, где взаимодействие внутренних закономерностей развития с лимитирующими факторами среды имеет решающее значение для жизнестойкости рыб, актуально не только в теоретическом, но и практическом плане.

Проблеме адаптаций животных посвящено множество работ, в которых отражены самые разнообразные аспекты этого явления (Краюшкина, 1967, 1977, 1998; Ноздрачев и др., 2003; Ноздрачев, Лапицкий, 2005; Озернюк, 2000; Хлебович, 1974, 1981). Исследованиями на высших животных показано участие эндокринной системы в приспособительных реакциях организма в ранние периоды развития (Шаляпина и др, 1995, 2001). В отечественной литературе обсуждалась роль гормональных механизмов в онтогенетических адаптациях рыб. Известно, что у осетровых рыб гормональный фон определяет миграционное состояние взрослых рыб (Баранникова, 1975, 1997). Для ранних личиночных стадий костистых рыб доказана определяющая роль гормонального статуса в выборе поведенческой стратегии (Павлов и др., 1997). Возможность рассматривать функциональную пластичность, отнесенную к ранним, постэмбриональным стадиям осетровых рыб, появилась благодаря морфофизиологическим исследованиям возрастных изменений нейроэндокринной системы, связанных с регуляцией активности щитовидной железы (Яковлева, 1952, 1964). Однако до настоящего времени нет данных об участии гормонов щитовидной железы в общем гормональном балансе организма на первых личиночных стадиях и возможности использования этих гормонов в более ранние сроки развития. Кроме того, со времени работ В.И. Владимирова (1975) в литературе не обсуждались вопросы, касающиеся специфики раннего онтогенеза, как особого, критического периода, определяющего физиологические свойства осетровых рыб, в том числе, сопряженность гормональных и сенсорных влияний с функциональными показателями на последующих стадиях развития.

Выбор в качестве объекта исследования русского осетра диктовался следующими обстоятельствами: ценностью объекта, имеющего высокую промысловую и товарную привлекательность; доступностью его, как объекта исследования, выращиваемого в сравнительно больших, по сравнению с другими видами, объемах на индустриальных хозяйствах.

Цель и основные задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение приспособительных реакций личинок осетровых рыб, лежащих в основе их жизнестойкости (изменение показателей роста, показателей крови, поведения) на основе комплексного физиолого-биохимического анализа результатов гормонального и сенсорного воздействий. В связи с этим, были поставлены следующие задачи:

1. В индустриальных условиях на потомствах осетровых рыб различного качества (с различной оплодотворяемостью икры, выживаемостью эмбрионов и личинок, характером морфологического развития, скоростью последующего роста) изучить уровни и динамику тиреоидных гормонов; на экспериментальных моделях изучить влияние тиреоидных гормонов и кортизола на изменение показателей выживаемости, массы, красной и белой крови.

2. В экспериментах на разновозрастных группах осетра оценить вклад предличиночного этапа развития в модификацию поведения молоди в поле «знакомого» химического сигнала (импринтинг химического сигнала среды). Изучить характер поведения молоди в поле химического сигнала после воздействия на личинок специфических (тиреоидные гормоны, тиомочевина) и неспецифических (токсические вещества) факторов, влияющих на содержание в организме тиреоидных гормонов.

3. На основе полученных данных сформулировать рабочую гипотезу о значении тиреоидных гормонов на организменном уровне как адаптогенов, определяющих стратегию выживания личинок осетра в критический, переходный период смены условий питания и обитания.

4. Провести испытания новых средств коррекции функционального состояния и повышения жизнестойкости личинок осетра в условиях аквакультуры.

Экспериментальные исследования выполняли в рамках плановых НИР отдела генетико-биохимического мониторинга АзНИИРХ и по гранту РФФИ №00-04-96008.

Научная новизна. Впервые показано, что у осетровых рыб на ранних стадиях развития нормальный морфогенез обеспечивается колебаниями тканевых концентраций тиреоидных гормонов с наиболее высокими величинами в оплодотворенной яйцеклетке, в период выклева и перехода на активное питание. Установлено, что в потомствах высокого и низкого качества различия в содержании отдельных фракций гормонов проявляются именно в эти периоды. Впервые получены свидетельства активизации щитовидной железы и интерреналовой ткани у предличинок осетра на основании биохимических показателей, а также установлена сопряженность изменений гормонального фона с показателями роста и жизнестойкости, которые удалось оценить с количественной стороны в опытах с применением гормональных воздействий.

Впервые показано, что в раннем онтогенезе у осетра формируется адаптация поведенческого уровня - запечатление химического фона среды, приуроченная к периоду созревания периферического отдела обонятельного анализатора, до того, как система в целом, получит окончательное развитие. Произведено сравнение данной адаптации с импринтингом у других животных. Показано, что у осетра верхняя граница чувствительного периода зависит от уровня тиреоидных гормонов.

Теоретическое и практическое значение работы. Теоретическое значение работы состоит в углублении представлений о критическом периоде в раннем онтогенезе осетра, рассмотрение его как этапа, в который гормональные и сенсорные воздействия определяют уровень приспособительных изменений, необходимых для успешного выживания молоди. Установление границ этого периода позволило разработать подходы, направленные на нейтрализацию негативных процессов при выращивании осетровых рыб.

Способность осетра к адаптивному изменению поведения, аналогичному импринтингу у высших животных, открывает возможность для дальнейшего изучения влияния раннего опыта на пищевое поведение рыб, а также на формирование приспособительных механизмов популяционного уровня, в том числе, миграционного (хомингового) поведения. С практической точки зрения возможность химического фона среды обитания личинок изменять поведение молоди, выращиваемой в индустриальных условиях, позволяет совершенствовать технологию кормления, в частности, повышением привлекательности искусственного корма за счет ранней адаптации. Отсутствие или пониженная способность к сохранению и воспроизведению изученного адаптивного навыка у потомства при неблагоприятных условиях выращивания несет информацию о скрытых необратимых нарушениях ведущей анализаторной системы личинок рыб. Это позволяет использовать критерий импринтинга для оценки качества выращиваемой в индустриальных условиях молоди осетра и при разработке корректирующих технологий, в том числе, гормональных воздействий.

На основании исследований создана и защищена патентом методика оптимизации процесса подращивания личинок осетровых рыб методом кратковременных воздействий с применением тиреоидных гормонов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. У осетра от оплодотворенной яйцеклетки до питающейся личинки тканевое содержание тиреоидных гормонов характеризуется волнообразными колебаниями. У потомств с наименьшим количеством уродств развития и более высоким темпом роста в период активного питания на стадии оплодотворенной яйцеклетки и на этапе смешанного питания установлены достоверно более высокие показатели тироксина.

2. Период, от которого зависит модификация поведения осетра в поле химического стимула, совпадает с предличиночным этапом развития. Поведенческая реакция имеет признаки импринтинга и чувствительна к тиреоидным гормонам, специфическим и неспецифическим токсическим воздействиям.

3. Созревание гормонозависимых функциональных механизмов приурочено к концу предличиночного развития и маркируется наибольшими показателями тироксина, кортизола и циклического аденозинмонофосфата.

4. Физиологический эффект тиреоидных гормонов на критическом этапе перехода от смешанного к активному питанию складывается из нескольких составляющих: изменение уровня биорегуляторов (тироксина, трийодтиронина, кортизола, циклического аденозинмонофосфата), морфологических (показателей роста, смертности, перераспределение клеточного состава крови) и поведенческих (запечатление химического фона среды) параметров.

Апробация работы. Основные результаты по теме диссертации были заслушаны и обсуждены на отчетных сессиях Ученого Совета АзНИИРХ (Ростов-на-Дону, 1993, 1996, 2001-2006), X Всесоюзном совещании, посвященном памяти академика Л.А. Орбели (Ленинград, 1990), II Международном симпозиуме по осетровым рыбам (Москва-Кострома, 1993), заседаниях Всероссийского общества физиологов, гистологов и эмбриологов (СПб, 1994, 2000, 2002), Международном симпозиуме «Ресурсосберегающие технологии в аквакультуре» (Адлер, 1999), Всероссийской научной конференции Администрации Краснодарского Края (р2000юг, Сочи; р2001юг, Небуг), Международной конференции «Проблемы сохранения экосистем и рационального использования биоресурсов Азово-Черноморского бассейна» (Ростов-на-Дону, 2001 г.), Международных конференциях «Нейроэндокринология 2000», «Нейроэндокринология 2003» (СПБ, 2000, 2003), Международной конференции «Физиология и биохимия водных организмов» (Петрозаводск, 2004).

Структура и объем диссертационной работы. Текст диссертации содержит 224 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, трех разделов собственных экспериментальных данных, общего заключения, выводов. Список цитированной литературы включает 217 отечественных и 236 зарубежных работ. Работа иллюстрирована 35 рисунками, 19 таблицами.

В сборе и обработке материала, а также в постановке экспериментов принимали участие сотрудники АзНИИРХ, которым соискатель выражает свою искреннюю признательность. Особую благодарность соискатель приносит руководству АзНИИРХ и в особенности, д. б. н. Э. В. Макарову за постоянную поддержку в выполнении этой работы. Автор бесконечно благодарен научным консультантам за разработку плана исследований, ценные советы и рекомендации.

Содержание работы

Организация и методы исследования

Опытный материал. Сбор материала и основные экспериментальные исследования по теме диссертации проводили с 1989 по 2004гг. Исследования проводили на трех представителях осетровых рыб: русском осетре Acipenser gueldenstaedtii Brandt (разделы 1-3); севрюге Acipenser stellatus Pall.(подраздел 1.1) и гибриде белуга х стерлядь (бестер) Huso huso х Acipenser ruthenus (подраздел 2.4). Материал для исследований получали из морских уловов (самки осетра, 13 экз.) (кровь, генеративная ткань) и на рыбоводных заводах в устье р. Дон «Взморье» и «Рогожкино» (самки осетра, 38 экз.; самки севрюги, 6 экз.) (кровь, генеративная ткань, эмбрионы, личинки). Материал для сравнительного анализа (эмбрионы, личинки, молодь), инкубировали и подращивали в одни и те же сроки. Общее количество личинок и молоди, использованных при наблюдениях и экспериментальных исследованиях, в том числе исследованиях поведения, составило 8474 экз.

Биологический анализ. Морфологические исследования проводили в заводских и лабораторных условиях на фиксированных в 4%-м растворе формальдегида объектов с помощью бинокулярного микроскопа МБС-1 по общепринятым в ихтиологии методикам (Детлаф и др., 1981).

Гематологический анализ. Форменные элементы белой и красной крови в окрашенном мазке с подсчетом лейкоцитарного состава и интенсивности эритропоэза оценивали, согласно принятым в ихтиологических исследованиях критериям (Головина, 1975; Житенева и др., 1989). При изучении гранулоцитов учитывали сдвиги ядер, показатели, отражающие процент незрелых клеток. При подсчете эритроцитов оценивали процентный состав незрелых форм и патологически измененных клеток.

Гистологический анализ. Проводили методом световой микроскопии (микроскоп «Olympus», Япония) окрашенных смесью Маллори парафиновых срезов образцов тканей желудка после фиксации и обезвоживания (Волкова, Елецкий, 1971). Цитометрическое исследование проводили с помощью окуляр-микрометра.

Биохимический анализ. Для определения содержания тиреоидных гормонов и кортизола в тканях использовали методы экстракции гормонов растворителями. Экстракцию производили этанолом или серным эфиром из замороженных при -40 - -60⁰С проб, содержащих 5-15 произвольно выбранных живых экземпляров (яйцеклеток, эмбрионов и личинок) в 3-5 повторностях, с последующим центрифугированием, высушиванием экстракта и разведением, согласно методикам Kobuke et. al. (1987) и de Jesus et al. (1990). При определении циклического нуклеотида (cAMP) с целью предотвращения его распада гомогенаты готовили с добавлением ЭДТА. Показатели оценивали радиоиммунологическим методом наборами фирмы IMMUNOTECH, Франция и частично, наборами производства Республики Беларусь.

Процент сухого вещества в тканях личинок определяли весовым методом, уровень белка - по методу Лоури (Методич. руководство..., 2005).

Методы гормонального воздействия. Воздействие на личинок производили в хроническом и краткосрочном режиме. В хронических экспериментах предличинок обрабатывали 40 нМ тироксином или 5 нМ трийодтиронином в сочетании с ингибитором функции щитовидной железы (тиомочевиной, 0,035%). Краткосрочное воздействие производили согласно модифицированному методу Kim, Brown (1997), погружая рыб на 1 час в воду с тироксином (Т4) или трийодтиронином (Т3) в комплексе с кортизолом или обработку только кортизолом или Т3: Т4 (1,5 мг/л) + кортизол (1,0 мг/л), на стадии 38, 41, 44 и в возрасте 3 дня после начала питания; Т4 (1,5 мг/л), Т4 (1,5 мг/л)+кортизол (30 мг/л), на стадии 44; Т3 (1,5 мг/л) + кортизол (1,0 мг/л), на стадии 38, 41, 44; Т3 (0,15 мг/л), на стадии 44; кортизол (1,30,100 мг/л) на стадии 44. Использовали препараты левотироксина натрия или левотрийодтиронина натрия, производство Berlin Chemie, Германия; гидрокортизона ацетата, производство Россия. Контролем служили особи той же возрастной группы и взятые из той же партии, что и опытные.

Воздействие токсическими веществами на личинок проводили в лабораторных условиях в хроническом режиме. Хлорорганический пестицид линдан (гексахлоран) использовали в сублетальных концентрациях: 0,05, 0,1 и 0,5 мг/л; водную вытяжку из нефти на уровне хронического и сублетального воздействий - 1 и 5 мг/л. Препараты вносили в аквариумы за сутки до опыта, а концентрации веществ поддерживали на постоянном уровне в течение эксперимента.

Изучение поведения. Опыты по изучению параметров двигательной активности молоди осетра, адаптированной к химическому модельному сигналу включали подготовительный и тестовый период. На подготовительном этапе производили выбор оптимальных параметров химической стимуляции применительно к данному виду рыб с определением порога химической чувствительности условно-рефлекторным методом. В качестве модельного сигнала использовали: 4-[2-(5-нитро-1Н-имидазол-1-ил)этил] морфолин. Адаптацию личинок к морфолину проводили в проточных бассейнах на рыбоводном предприятии «Рогожкино или в непроточных емкостях в лабораторных условиях. Результаты оценивали после перерыва (3-9 недель) в экспериментальной камере методом визуального группового тестирования (Касумян, Пономарев, 1986). Реакцию рыб регистрировали на фоновом, стимульном и, в ряде случаев, постстимульном интервалах на протяжении 3-4 мин. с интервалом 15 с. Показатели реагирования каждой группы рыб суммировали по вертикали для всего массива данных по каждому интервалу отсчета и определенному виду стимула. Общую интенсивность реакции определяли как отношение средних значений на стимульных и постстимульных интервалах к среднему значению фона и выражали в процентах.

Статистическую обработку полученных данных проводили с применением стандартных статистических методов: t-критерия Стъюдента, непараметрического критерия (л) Колмогорова-Смирнова; корреляционного анализа - вычислением порядкового коэффициента (R) Спирмена; пакетов программ Statistics for Windows и Microsoft Excel.

Результаты экспериментальных исследований

1. Закономерности изменения некоторых гормональных показателей и структурно-функциональные параметры осетра на начальных этапах развития

1.1 Изменение показателей тиреоидных гормонов у самок осетровых рыб в генеративной ткани на различных стадиях созревания и в период эмбрионального развития

В литературе рассмотрение многообразных физиологических функций тиреоидных гормонов в онтогенезе осетровых рыб, обычно, отнесено к периоду, связанному с активностью щитовидной железы (Яковлева, 1952, 1964, 2000; Яковлева, Кузик, 2005; Лагунова, 1977; Баранникова, 1975; Баранникова и др., 1981). Но тиреоидные гормоны имеются у рыб уже на стадии яйцеклетки и эмбриона (Kobuke et al., 1987; Brown et al., 1987; Tagawa et al., 1990). Была поставлена задача установить, содержат ли яйца осетровых рыб тиреоидные гормоны и несут ли они какую-либо функциональную нагрузку до начала работы щитовидной железы.

В генеративной ткани на стадии протоплазматического роста содержание Т4 составляло 5,46 ± 0,98 нг/г. и таким образом, может быть сравнимо с уровнем тироксина в мышечной ткани (5,8 нг/ г). В период трофоплазматического роста показатели в гонадах увеличивались, причем, от III-IV к IV стадии в яйцеклетки поступало более половины от общего количества гормона, а у самок с гонадами в IV стадии (находящихся в состоянии нерестовой миграции), содержание тироксина оказалось на уровне 18,4 ± 2,8 нг/г. Тканевые концентрации тиреоидных гормонов в яйцеклетках IV cтадии зрелости у осетра сопоставимы с таковыми у севрюги: Т4-18,4 нг/г (осетр) и 19,1 нг/г (севрюга); Т3, соответственно - 2,1 нг/ и 3,7 нг/г.

В крови осетров уровень тироксина максимален, когда яйцеклетки находятся в процессе трофоплазматического роста (26,5±3,3 нг/мл). При достижении IV стадии зрелости гонад в крови самок осетра регистрировались весьма низкие показатели тироксина - 8,2 ± 0,9 нг/мл.

При переходе ооцитов осетра из IV в V стадию наблюдается рост концентрации Т4, что показало сравнение показателей гормонов в яйцеклетках у двух групп самок с гонадами IV стадия зрелости, а также после овуляции яйцеклеток (V стадия зрелости): в первой группе - от 18,7± 3,4 нг/г до 31,1±6,0, во второй - от 15,4 ±2,4 нг/г до 20,7±4,8 нг/г.

«Расходование» тиреоидных гормонов в период эмбриогенеза у осетровых рыб становится очевидным при сравнении «нормального» и «партеногенетически» характера развития яиц (данные на севрюге). В атипично развивающихся яйцах содержание тиреоидных гормонов не менялось на протяжении более чем 40 часов с периода закладки икры в аппараты; в нормально развивающихся зародышах к 29-30 стадиям развития показатели Т4 снизились более чем в 4 раза, а Т3 в 1,5 раза.

Установлено, что в эмбриогенезе у осетровых (осетр) происходит снижение индивидуальной изменчивости по исследуемым показателям: на стадии оплодотворенной яйцеклетки варьирование показателей относительно высокое - (CV) от 51.5% (Т4) и 53,6% (Т3), но уменьшается до 28,0% (Т4) и 37,1% (Т3) на стадии выклева. Дальнейшие исследования были направлены на то, чтобы установить, в какой степени различия в уровнях гормонов у зародышей связаны с их жизнеспособностью и как эти различия могут повлиять на выживаемость, рост и адаптационные возможности выклюнувшихся личинок.

1.2 Некоторые характеристики развития предличинок осетра при различном содержании в организме тиреоидных гормонов

В двух сериях экспериментов (I и II) изучали динамику тиреоидных гормонов в потомствах осетра с различной степенью оплодотворяемости икры, а также рассмотрели некоторые морфологические показатели развития в зависимости от исходного качества материала. В икре с высокой оплодотворяемостью (соответственно, 89-80%) средние величины Т4 составили 0,22 нг и 0,34 нг на яйцеклетку. При оплодотворяемости яйцеклеток 55-30% - 0,15нг и 0,17 нг (p0,05). Уровни Т3 составили 0,017 нг и 0,025 нг, (оплодотворяемость 89 и 80%); 0,012 нг и 0,018 нг, (оплодотворяемость 55 и 30%) (р 0,05). Таким образом яйцеклетки высокого качества в среднем содержали в 1,46-2 раза больше Т4.

В эмбриогенезе в обоих случаях значения показателей Т4 и Т3 были минимальными к периоду появления пульсации сердца (стадии 29-30); к этому периоду обе фракции гормона снизились в два раза и более. Почти во все сроки эмбриогенеза наблюдался параллелизм в изменениях уровней Т4 и Т3. Он нарушался к концу эмбриогенеза, что, возможно, результат активации дейодирующих ферментов в связи с изменением уровня метаболизма. При этом зародыши из потомств низкого качества на стадии выклева имели в 1,36 раза большие показатели Т3 (Рис. 1).

На личиночном этапе развития начало подъема Т4 совпадало с периодом развития жаберного дыхания и роста потребности в кислороде (ст. 40). Наиболее высокие показатели Т4 (но не Т3) оказались в конце периода смешанного питания, непосредственно перед переходом на активное питание (ст. 43-44). В эти сроки обе партии различались по показателям Т4: в потомствах высокого качества они были до 2,6 раза выше.

Отклонение в содержании гормонов на переломных стадиях у «некачественного» потомства коррелировало с нарушениями морфологического развития: увеличением, в сравнении с нормой, доли аномальных зародышей (с 14% до 54%), смертности за эмбриональный (с 21% до 73%) и постэмбриональный (с 15% до 40%) периоды. «Слабые» личинки развивались с отставанием на одни сутки, а после начала питания характеризовались значительной смертностью (50%) и отставанием по массе тела более чем в два раза. Смертность была связана с большим числом морфологических дефектов, обнаруженных, в основном, в пищеварительной системе.

На основании полученных данных сделано предположение, что более высокие уровни тиреоидных гормонов на «переломных» стадиях развития: оплодотворения (Т4 и Т3), и перехода на активное питание (Т4) могут быть позитивными показателями, влияющими на ход развития в последующий период. Дальнейшие этапы работы связаны с поиском дополнительных морфофункциональных коррелятов гормональных изменений.

Рис. 1. Динамика тиреоидных гормонов у осетра в период раннего развития. Слева - эксперимент I, справа - эксперимент II. (**) - время выклева и начала питания

1.2.1 Оценка изменений содержания тиреоидных гормонов в тканях предличинок осетра при воздействии некоторых токсических веществ антропогенного происхождения

Снижение качества потомства при индустриальном выращивании осетровых рыб происходит не только вследствие нарушений биотехнических норм при получении икры, но и в том числе, при антропогенном загрязнении водной среды. В хроническом эксперименте на предличинках осетра оценено влияние нефтяного и пестицидного загрязнений на динамику тиреоидных гормонов.

Эффект воздействия линдана (0,05 и 0,5 мг/л) и нефти (0,5 и 5 мг/л) зависел от дозы и выражался в фазовых сдвигах динамики тироксина (приемущественно, на более ранние стадии развития), при максимальных дозах вызвавших в завершающий период предличиночного развития уменьшение абсолютных величин Т4 до 35 % (линдан) и до 39% (нефть) и отклонение от нормы Т3/Т4.

1.3 Изменение уровней тканевого кортизола у осетра на ранних этапах личиночного развития

У низших позвоночных глюкокортикоиды представляют собой один из основных регуляторов промежуточного метаболизма и нормальных физиологических параметров. Доказано, что у личинок костистых рыб морфогенетический эффект тиреоидных гормонов на определенных, переломных стадиях реализуется с участием кортизола (de Jesus, Hirano, 1992). При метаморфозе рыб и амфибий в крови (Kikuyama et al., 1986; Hurdry, 1993) и в целом организме (de Jesus, et al., 1991; de Jesus, Hirano, 1992) содержание глюкокортикоидов увеличивается параллельно росту тиреоидных гормонов. У осетровых рыб интерреналовая ткань, продуцирующая кортизол, активизируется в первые дни развития (Бараникова, 1974, 1975).

У предличинок осетра обнаружено волнообразное изменение общетканевых показателей кортизола: на выклеве cодержание гормона невелико - 0,27 ± 0,08 нг. Показатели увеличились более чем в 5 раз и достигали своего максимума (1,62 ± 0,15 нг/экз) во второй половине срока (стадии 43-44), что соответствовало 8-му дню от выклева. При стрессорном воздействии (обработка тиомочевиной) максимальные показатели кортизола увеличивались более чем в полтора раза со смещением максимума на более ранние сроки (стадии 40-41). Величины кортизола возвращались к норме, если личинок обрабатывали одновременно ингибитором и Т3.

Таким образом, результаты подтвердили данные гистоморфологии о раннем проявлении функциональной активности интерреналовой ткани и ее способности реагировать на внешние воздействия, что предполагает участие центральных механизмов в этот период (Баранникова, 1974). Показано, что до начала активности интерреналовой ткани у личинок имеется гормональный «резерв», источником которого служит кортизол яйцеклеток. Особенностью тканевой динамики кортизола у предличинок осетра является ее волнообразный характер и соответствие динамике тироксина.

1.4 Оценка некоторых морфологических дефектов развития предличинок осетра в условиях пониженного и повышенного содержания тиреоидных гормонов в организме

Задача состояла оценить частоту появления дефектов морфологического развития у питающихся личинок осетра при изменении содержания тиреоидных гормонов в тканях на этапе желточного питания- при хронической обработке от выклева до перехода на активное питание тиомочевиной, либо тиомочевиной и одной из форм тиреодных гормонов: Т4 или Т3. В условиях гипотиреоза (снижение Т4 до 31%) в 100% случаев наблюдалось замедление резорбции желтка; при этом аномалии развития пищеварительной системы, в том числе, недоразвитие спиральной кишки или ее укорочение могло составлять до 30% случаев. Дефекты перегородки обонятельной капсулы наблюдались также у 30% рыб, а у 10% рыб имела место деформация туловища. Указанные дефекты отсутствовали, если рыб обрабатывали тиомочевиной на фоне поддерживающих концентраций тиреоидных гормонов, вызвавших их двукратное увеличение в тканях. В этом случае скорость развития не отличалась от контрольной, но обнаруживались дефекты развития покровных тканей, в том числе, нарушение пигментации - свидетельство нарушения функционирования меланофоров (17%), а также формирования плавников (30%). Обработка гормонами вызвала гипертрофию слизистого и мышечного слоев желудка. В целом, опыты показали, что при воздействии тиреоидными гормонами на фоне подавления функции щитовидной железы тиомочевиной не удается полностью воспроизвести пререстройки, характерные для нормального морфогенеза. Это согласуется с результатами биохимического анализа, которые свидетельствуют, что процессы нормального развития осетровых рыб на начальной стадии онтогенеза обеспечиваются меняющейся концентрацией тироксина в организме. Полученные в совокупности данные позволили изменить направление дальнейших экспериментов и проводить их в режиме, когда исключалось равное по интенсивности гормональное воздействие во все сроки развития предличинок осетра.

2. Поиски корректирующих методов воздействия на личинок осетровых рыб с целью улучшения показателей жизнестойкости

2.1 Динамика циклического аденозинмонофосфата у предличинок осетра и его изменение при гормональной стимуляции

Увеличение концентрации циклического аденозинмонофосфата (cAMP), как и других «вторичных мессенджеров», является импульсом для изменений в ответ на действие гормонов. В наших исследованиях определение содержания гормонов у личинок осетра технически было возможно только в целом организме, включая эндокринные железы. Поэтому показатель cAMP использовали для доказательств того, что гормоны в этот период поступают в общую циркуляцию организма и принимают участие в метаболических процессах, а также для уточнения временных границ периода их функционального действия. Изучали динамику содержания cAMP в предличиночный период, а также изменение cAMP после однократной обработки личинок тиреоидными гормонами и кортизолом. Результаты анализа содержания cAMP показали, что от 38 к 44 стадии у предличинок наблюдалось десятикратное увеличение показателя cAMP, который снижался к 9-10-м дням развития (Рис. 2).

Рис. 2. Динамика суммарной тканевой концентрации сAMP у личинок осетра

Обнаружена зависимость направленности эффекта гормонального воздействия от возраста (стадии морфологического развития). Если у двухдневных личинок (ст. 38) Т4 вызывал немедленное и стойкое снижение концентрации cAMP (на 38% и на 22% в начале и конце суточного периода), то на стадии 44 в ответ на обработку Т4 наблюдалось слабое увеличение cAMP (почти на 10%). Реакция усиливалась (p< 0,05) если производили обработку предличинок одновременно Т4 и кортизолом (увеличение на 6% и 32%). Таким образом, у осетра изменение уровней сAMP может быть расценено как функциональный ответ организма на запрограммированное изменение тканевых концентраций гормонов.

2.2 Количественная оценка некоторых морфофизиологических показателей у осетра после кратковременного гормонального воздействия

С учетом полученных наблюдений и экспериментальных данных мы считали оправданным проведение модельных экспериментов, при которых воздействие на личинок осетра было кратковременным. Личинок осетра обрабатывали гормонами на различных стадиях и в сроки, совпадающие высокими и низкими фоновыми уровнями тироксина и кортизола.

2.2.1 Изменения морфологических показателей личинок осетра после гормональной обработки

Через сутки после гормональной обработки содержание Т4, Т3 и кортизола в теле у обработанных гормонами личинок не отличались от контрольных вариантов.

Анализ молоди, произведенный через 22 дня после воздействия, показал, что комплекс, содержащий тиреоидные гормоны и кортизол, вызвал наиболее существенные увеличение показателей массы, если воздействие производили на ст. 44 - увеличение на 59% (Т4) и 61% (Т3). После обработки на ст. 38 показатель массы уменьшался соответственно на 49% и 47%. У молоди, которую обрабатывали через трое суток после начала активного питания, не наблюдалось изменений в массе. Почти во всех случаях показатели смертности молоди изменялись в противоположном направлении: наименьшая после обработки личинок на ст. 44 - на 38% (Т4) и 50% (Т3), а наибольшая - в группах, обработанных таким же образом на ст. 38 - увеличение на 120% (Т4) и 160% (Т3).

Кортизол в концентрации 1 мг/л (дозировка, использованная в гормональном комплексе с тиреоидными гормонами) самостоятельно не влиял на рост и выживаемость, а в концентрации 100 мг/л приводил к снижению массы на 18% и увеличению смертности на 33%.

Гистологический анализ выявил у молоди осетра после воздействия тиреоидными гормонами на стадии 44 гипертрофию энтероцитов в пилорическом отделе желудка - от 23,10 ± 0,89 мкм до 39,63 ± 0,68 мкм; при этом не наблюдалось гипертрофии мышечного слоя.

2.2.2 Показатели тиреоидных гормонов и кортизола в тканях у молоди осетра после гормонального воздействия на стадии 44

Стимуляция тироксином привела к снижению концентраций «общего» и «свободного» Т4, с одновременной тенденцией к увеличению «общего» количества Т3. В противоположность этому, у рыб, обработанных фармакологическими дозами кортизола, не произошло изменений «общего» Т4. Между массой тела рыб и соотношением «общих» значений Т3/Т4 установлена положительная связь: R=0,69; р=0,012.

У личинок, обработанных Т4 или гормональным комплексом в тканях резко снизилось содержание кортизола, которое составило 13-10% от контрольного уровня.

2.2.3 Изменение показателей крови у молоди осетра в результате гормонального воздействия

Показатели клеток красной и белой крови, реагируя изменением соотношения между отдельными формами клеток и интенсивностью лимфо-, грануло- и эритропоэза, адекватно отражают функциональное состояние рыб (Микряков и др., 2001). Повышение доли лимфоцитов и моноцитов при относительном снижении гранулоцитов - нейтрофилов и эозинофилов - свидетельствует о высоком иммунном статусе, смещение баланса показателей белой крови в сторону гранулоцитов, является отражением неблагоприятных изменений в организме. Гормональная обработка с применением тиреоидных гормонов еще не питающихся личинок, а также на начальном этапе активного питания приблизила лейкоцитарный состав и показатели красной крови у молоди к так называемой «норме» - набору гематологических показателей, отражающему наиболее благополучное физиологическое состояние растущей бассейновой молоди осетра (Гершанович и др, 1987; Житенева и др., 1997). Так, у молоди осетра, прошедшей гормональную обработку на 44 стадии к концу эксперимента произошел сдвиг в лейкоцитарном составе крови в сторону увеличения доли лимфоцитов от 28,9 ± 7,7% в контроле до 59,5 ± 4,7% после обработки комплексом и уменьшения доли эозинофилов до 11,0 ± 4,1% причем, изменения увеличивались с возрастом. В это же время у контрольных рыб к концу эксперимента проявилась значительная эозинофилия (45,0 ± 10,9%), обусловленная аллергизацией организма и вызванная длительным пребыванием рыб в замкнутом пространстве аквариума.

Анемия, как проявление патологии клеток красной крови, часто наблюдается при ухудшении условий выращивания рыб и является результатом снижения процесса генерации молодых клеток, а также следствием гемолиза - разрушения мембран эритроцитов. Последнее, в частности, происходит при снижении активности антиоксидантной системы и смещения равновесия в сторону свободнорадикальных процессов, а также при введении аллергенов. В наших опытах интенсивность эритропоэза усиливалась и приближалась к «норме» для данного возраста (20,3 ± 0,3%) только после обработки комплексом (на 44 стадии и через три дня после начала выращивания) и зависела от стимуляции тироксином.

Перераспределение соотношения клеток крови может быть связано с изменениями на нескольких уровнях организации, одним из которых может быть влияние на их созревание. Косвенным показателем ускорения процессов дифференцировки в наших опытах является смещение соотношения гранулоцитов у обработанных гормонами рыб в сторону более зрелых форм (Рис. 3).

Рис. 3. Соотношение палочкоядерных (а) и сегментоядерных (б) гранулярных лейкоцитов крови молоди осетра после гормональной обработки предличинок на 44 стадии

В целом, результаты эксперимента показали, что на предличиночном этапе развития организм рыб реагирует на изменение содержания в организме тиреоидных гормонов и кортизола изменениями морфофункциональных показателей. В завершающий период развития повышение тиреоидных гормонов вызывают длительные изменения в гормональном балансе организма и стимуляцию роста. Обнаружен противоположный эффект действующих доз тиреоидных гормонов и кортизола на рост рыб, смертность, и однонаправленный эффект на систему клеточной защиты организма.

2.3 Реакция клеток крови пораженных сапролегниозом личинок осетра на кратковременное гормональное воздействие

Эксперимент включал контрольную и опытные группы рыб, на которых воздействовали: Т4 (1,5 мг/л), Т4 (1,5 мг/л)+кортизол (30 мг/л) или кортизол (100 мг/л) на ст. 44. У контрольных личинок осетра поражение сапролегниозом зафиксировано на 14-е сутки и идентифицировано по наличию зооспорангиев и гифов гриба, которые попали в образцы при взятии крови и были выявлены при микроскопическом исследовании мазка. В эритроцитах зараженных рыб обнаружены семь видов патологий, в том числе, обусловленных сопутствующей инфекцией (Головин, Головина, 2000). В то же время лейкоцитарный состав крови находился в пределах нормы, что согласуется с литературными данными об отсутствии реакции на патогенный фактор при грибковых инфекциях рыб (Нейш, Хьюз, 1984). Во всех случаях применения гормонального воздействия внешних признаков заражения не обнаружено. Обработка Т4 стимулировала нейтрофилию, что вызвано миграцией гранулоцитов к участкам повреждения тканей в период воспаления и некроза и является важным фактором активизации защитных реакций организма, направленных на ликвидацию поврежденных клеток. В отличие от необработанных рыб, из семи видов патологий эритроцитов отсутствовали шесть: снизилось относительное число патологически измененных эритроцитов и видов патологий. После гормонального воздействия одновременно Т4 и кортизолом рыбы находились на более продвинутой стадии борьбы с заболеванием и характеризовались полным отсутствием патологически измененных клеток. Лейкоцитарная формула соответствовала норме. Результаты опытов подтвердили адекватность применяемых на стадии активного питания методов гормонального воздействия для улучшения функционального состояния рыб и показали, что тиреоидные гормоны и кортизол на критическом этапе перехода к активному питанию повышают устойчивость организма к неблагоприятным факторам среды.

2.4 Содержание тиреоидных гормонов у беспозвоночных, являющихся кормовыми организмами для осетровых рыб

У представителей из отряда Cladocera дафнии (Daphnia), отряда Coрероda циклопов (Cyclops), сем. Сhironomidae личинки хирономуса, (Chyronomus) и кл. Oligohaeta олигохет (Tubifex) тканевые уровни Т4 колебались от 17,3 ± 0,2 нг/г (олигохеты) до 73± 0,4 нг/г (личинки хирономид), Т3 - от 0,33±0,05 нг/г (циклопы) до 1,41±0,2 нг/г (личинки хирономид). Проведенный параллельно анализ гормонов у осетра (ст. 44) подтвердил, что показатели сопоставимы с величинами гормонов у личинок осетра на стадии активного питания: 19,5± 0,4 (Т4) и 0,8±0,01 (Т3).

У личинок бестера, потреблявших личинок хирономид и дафний, соотношение форм тиреоидных гормонов (Т3/Т4) оказалось на 60 % выше, чем в случае кормления комбикормом и синхронизировано с показателем массы: потребление личинками живого корма только в течение трех дней с момента перехода на активное питание привело к различиям в массе тела личинок в 20%. Таким образом, личинки осетровых рыб на начальном этапе питания могут пополнять свой гормональный «пул» за счет тиреоидных гормонов, содержащихся в планктонных и бентосных организмах.

гормональный сенсорный тиреоидный предличинка осетр

3. Количественная оценка опыт-зависимых изменений поведенческой реакции молоди при восприятии химических сигналов сред

ы на ранних этапах жизненного цикла

У животных различной систематической принадлежности проблема функциональной пластичности поведения тесно связана с такими понятиями как ранний онтогенез, критический период и импринтинг. У водных позвоночных (рыб и амфибий), поведение которых в значительной степени контролируется химическими сигналами, от ольфакторного импринтинга, возникающего при переходе к ювенильной фазе (смолтификация, метаморфоз) зависит пищевое, коммуникативное, и нерестовое (хоминговое) поведение (Бастаков, 1992, Waldman, 1981; Hasler, Scholz, 1983).

У осетровых рыб прежде не рассматривались вопросы пластичности поведенческих функций, отнесенных к раннему периоду онтогенеза.

3.1 Изменение характера поведения молоди осетра в зависимости от предварительной адаптации в поле химического модельного стимула (морфолина)

Качественное и количественное выражение реакции молоди на химический сигнал зависело от сроков и длительности предварительной адаптации этому сигналу, а также от его интенсивности. При минимальном сроке адаптации (с 1 по 4-й дни после выклева) реакция составляла 93% от фона (p <0,05) (избегательная реакция), что аналогично неадаптированному контролю (81%). Сдвиг реакции в сторону привлечения, по сравнению с фоном, обнаружен у личинок, адаптированных с 6-го по 10-й дни (134%), а также при увеличении срока адаптации до 10 и 18 дней, начиная от выклева - соответственно 151% и 224% (p < 0,001). Интенсивность реакции на концентрацию 10^-9 М была выше, чем на 10^-8 М. Различия в интенсивности поведенческого ответа на разные концентрации сигнала наиболее значительны (на 86%) при самой продолжительной адаптации к химическому сигналу (p < 0,001). Результат адаптации к химическому сигналу после 25-го дня развития, независимо от срока выдерживания личинок при тестировании был оценен как привыкание: поведение молоди на стимульном 104% (8 дней) и 105% (30 дней) и фоновом (100%) интервалах не различалось (Рис. 4).

Реакция предпочтения химического фона рыб, зависит как от внешних, так и гормональных влияний (Hasler,Scholz, 1983; Nevitt, Dittman, 1994). Это обусловило направление дальнейших исследований, в которых поведение, зависимое от предварительной адаптации к химическому сигналу, изучали при специфическом и неспецифическом воздействии химических агентов, вызывающих изменение уровня тиреоидных гормонов в период адаптации.

Рис. 4. Динамика двигательной реакции молоди осетра в поле химического стимула (морфолин, 10^{-8 -} М 10^-9 М) после адаптации личинок к стимулу в различные сроки раннего онтогенеза.

3.2 Оценка запечатления химического стимула личинками осетра с различным тиреоидным статусом

Уровни гормонов у личинок осетра изменяли, воздействуя тиомочевиной или тиомочевиной и тиреоидными гормонами (Т3) в течение 14-ти дней в чувствительный (1-14 дни) или нечувствительный (20-35 дни) периоды. В результате воздействия ингибитора тироксин снизился по сравнению с контролем, в среднем, на 22% (25,4-18,6%), трийодтиронин - на 75% (86,4-63,1%). Добавление в воду Т3 привело к увеличению тканевого содержания Т3 на стадии активного питания на 200 и 220%.

Вызванное «гипотиреоидное» состояние в чувствительный период в значительной степени снизило положительную реакцию (120%). Если же в период адаптации личинок к химическому фону гормональный фон повышали с помощью Т3, то в этом случае по интенсивности реакция была аналогична реакции контрольных рыб и достоверно (p < 0,001) отличалась от реакции «гипотиреоидных» рыб (181%).

Реакция рыб зависела от уровня тиреоидных гормонов не только на предличином этапе развития, но и в более поздний период. Повышение гормонального фона у старшевозрастных личинок (с 20-го по 35-й дни) при их адаптации к химическому фону среды приводила при тестировании к предпочтению этого фона. Интенсивность реакции составила 161% (p < 0,001).

3.3 Влияние линдана и водорастворимых фракций нефти на поведенческую реакцию молоди осетра, связанные с «химическим опытом» в ходе личиночного развития

Воздействие линданом в концентрациях (0,1 мг/л и 0,5 мг/л) и нефтью (5 мг/л) в чувствительный для запоминания химических стимулов период приводило к тому, что рыбы демонстрировали индифферентную реакцию. В случае воздействия любого из токсикантов в нечувствительный период положительная реакция сохранялась, хотя ее интенсивность была меньше контрольной. После воздействия линданом интенсивность реакции составила 123%, что существенно отличалось от поведения после воздействия в чувствительный период (p < 0,001); после воздействия нефти - 120% (p <0,05). Таким образом, тестирование молоди, обработанной токсикантами в различном возрасте, показало необратимость повреждающего воздействия линдана и нефти в предличиночный период развития в сравнении с более поздним периодом.

Заключение

1. Впервые биохимическими методами показано наличие материнских тиреоидных гормонов у осетровых рыб (осетра и севрюги) в генеративной, эмбриональной и личиночной ткани. Не исключено, что уровни и соотношение форм гормонов в ооцитах должны отражать экологию вида (Tagawa et al., 1990; Mellinger, 1994), что подтверждают наши данные: соотношение форм гормона, при котором содержание Т4 превышает Т3, характерно для пресноводных видов с относительно невысокой скоростью развития, в том числе, для осетра и севрюги. Эти виды не различались по абсолютным величинам гормонов в яйцеклетках в расчете на единицу массы, что, вероятно, обусловлено общностью условий обитания, диктующих определенный уровень метаболизма. Можно ожидать, что у данных видов осетровых, но из других популяций, гормональные характеристики будут несколько иными.

2. Анализ показателей тиреоидных гормонов в генеративной ткани, эмбрионах и личинках в сопоставлении с морфологическими и физиологическими данными позволил с количественной стороны оценить их функциональное значение в эмбриогенезе. Нами установлено, что поступление Т4 в генеративную ткань самок осетра активизируется на III стадии зрелости и не прекращается в завершающий период созревания, ведущий к овуляции (V стадия). Снижение варьирования показателей по мере продвижения стадий эмбрионального развития свидетельствует о «стабилизации» эндокринного фона, обеспечивающего нормальное развитие зародышей лишь в определенном, более узком диапазоне величин и «отбраковку» уклонений. Уточнить сроки включения материнских тиреоидных гормонов в метаболизм зародыша удалось при сравнении динамики гормональных показателей в потомствах с высокой и низкой степенью оплодотворяемости икры (осетр), а также при аномальном развитии (севрюга). Расходование гормонального «запаса» начинается не позднее периода закладки нервных валиков, что подтверждено позднейшими исследованиями на рыбах с привлечением молекулярно-генетических методов (Liu, Chan, 2002). Рост показателей тиреоидных гормонов у эмбрионов на стадии выклева и выклюнувшихся особей предполагает возможность внефолликулярного синтеза тиреоидных гормонов в конце эмбрионального периода. Вторая фаза повышения Т4, наблюдаемая у личинок осетра при завершении периода желточного питания, очевидно, зависит от фолликулярного синтеза, поскольку совпадает по времени с первыми признаками активности щитовидной железы предличинок по гистологическим критериям [3, 8, 11,12, 18, 19,20].

3. В условиях хронического воздействия на предличинок осетра токсикантов, принадлежащим к различным классам - пестицида линдана и нефти - выявлена одинаковая по характеру реакция организма: фазовое смещение максимума Т4 со стадий 43-44 на 39-40 стадии, как свидетельство преждевременной активизации щитовидной железы. В поздние сроки развития предличинок снижение концентрации Т4 и перераспределение соотношения Т3/Т4, видимо, отражает нарушение функционирования различных звеньев тиреоидной оси, связанных с производством, конверсией и включением гормонов в метаболизм. Изучение динамики гормона стресса кортизола в тканях личинок осетра не только позволило уточнить биохимическими методами сроки активизации интерреналовой ткани, отнесенных к первым дням развития (Баранникова, 1974; 1975), но и показало согласованный характер изменений тироксина и кортизола в предличиночный период с одновременным максимумом, что свойственно «критическим периодам» метаморфоза рыб. Эти данные, а также увеличение амплитуды и изменение фазы волны кортизола (смещение на более ранние сроки развития) при специфическом хроническом воздействии, вызывающем дефицит тиреоидных гормонов (тиомочевина), появление фазового сдвига на эти же сроки Т4 в условиях хронического воздействия других стрессорных агентов - антропогенных поллютантов, предполагает взаимодействие тиреоидной и глюкокортикоидной осей у осетра уже в предличиночный период [12, 20, 21].

4. У потомств различного качества отклонения от «нормы» в уровнях гормонов на стадии оплодотворения (Т4 и Т3 до 50%), выклева (Т3 до 50%) и перехода на активное питание (Т4 до 67%) сопровождались торможением развития и морфологическими нарушениями, а после начала питания увеличением смертности и снижением начального роста. Эксперименты, в ходе которых производилось воздействие гормонами в хроническом и краткосрочном режиме, подтвердили выявленную в ходе наблюдений связь морфофизиологических и гормональных параметров развития, а также позволили оценить степень пластичности функциональных показателей в зависимости от содержания тиреоидных гормонов и кортизола. Удалось показать, что одним из самых явно выраженных фенотипических последствий увеличения содержания в организме тиреоидных гормонов в конце периода желточного питания является увеличение роста массы тела. При этом гормональное воздействие у молоди вызвало перераспределение гормонов в сторону Т3 и снижение в более чем в 10 раз фоновых значений кортизола. Направленность изменений после обработки гормонами соответствует эндокринному статусу ювенильных рыб с высоким темпом роста (Gomez, et al., 1997; McCormick, 1999) [3-6, 8, 15-17, 23, 24].

...