Штаммы Vibrio cholerae с измененной экспрессией генов вирулентности

Далее, для дальнейшего подтверждения участия гена toxR в изменении уровня биосинтеза ТСР в плазмидных штаммах в эксперименты был взят штамм V. cholerae RV31, имеющий делецию в гене toxR. Введение в клетки этого штамма плазмиды рСТ105::mini-kan и последующее определение у полученных трансконьюгантов продукции ТСР и OmpU показало отсутствие у них указанных белков. Эти данные указывают на справедливость нашего утверждения относительно усиления транскрипции гена toxR в штаммах, содержащих рекомбинантную плазмиду и имеющих полноценный ген toxR.

Таким образом, у возбудителя холеры классического биовара обнаружен новый механизм регуляции генной активности, основанный на влиянии плазмидного генома, содержащего клонированные гены двух профагов вирулентности на экспрессию хромосомных генов. Показано, что в присутствии рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan в токсигенных штаммах V. cholerae классического биовара повышается экспрессия хромосомных генов tcpA-F и ompU, кодирующих соответственно биосинтез ТСР и ОmpU, в результате усиления активности регуляторного гена toxR.

Возникает вопрос о том, какие гены клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды могут изменять экспрессию хромосомного гена toxR? Одно из возможных предположений состояло в том, что в таких событиях может играть большую роль второй профаг - RS1, входящий в состав клонированного фрагмента рекомбинантной плазмиды. Внесение в клетки классических вибрионов ДНК профага RS1 в составе рекомбинантной плазмиды могло привести к индукции в чужом хозяине экспрессии гетерологичного гена toxR. Данные, позволившие подтвердить это предположение, были получены в экспериментах при использовании другой рекомбинантной плазмиды рСТ27 (Тсr), являющейся также производной pBR322, но лишенной в отличие от плазмиды рСТ105 умеренного фага RS1, и несущей делецию протяженностью 250 п.н. в гене ctxA. Оказалось, что введение указанной плазмиды в клетки штаммов V. cholerae 569В и Дакка 35 не приводит к изменению у трансконьюгантов продукции ТСР. Более того, у полученных штаммов V. cholerae Дакка 35 (рСТ27) и 569В (рСТ27) было выявлено отсутствие по сравнению с исходными штаммами каких-либо изменений в биосинтезе белков OmpU и OmpT. Повысилась лишь в 2-3 раза продукция В-субъединицы СТ за счет наличия в клетках дополнительных структурных генов ctxB (таблица 3). Таким образом, эти эксперименты, во-первых, подтвердили данные других авторов (Fando et al., 1997; Provenzano et al., 2001; Wibbenmeyer et al., 2002) об отсутствии влияния плазмиды pBR322 на активность гена toxR, во-вторых, свидетельствуют о том, что отсутствие описанных выше различий в продукции ТСР и белков внешней мембраны (OmpU и OmpТ) между исходными и содержащими плазмиду штаммами V. cholerae Дакка 35 (рСТ27) и 569В (рСТ27) может быть обусловлена тем, что рекомбинантная плазмида рСТ27 лишена профага RS1. Из этих данных следует, что этот профаг, возможно, несет ответственность за повышение экспрессии гена toxR. В качестве одного из первых претендентов на участие в этом событии следует рассматривать ген rstC, локализованный в составе RS1. Однако для окончательного заключения о роли гена-антирепрессора rstC в изменении экспрессии хромосомных генов, необходимы дальнейшие исследования.

Итак, нами обнаружено, что введение в клетки возбудителя холеры классического биовара плазмидного генома с клонированными генами двух профагов может включаться дополнительный механизм регуляции хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы вирулентности и иммуногенности. Перспективность продолжения работы в этом направлении определяется не только получением новых фундаментальных знаний о регуляции экспрессии различных генов патогенности возбудителя холеры, но и ее непосредственной практической ценностью. Во-первых, на основании полученных данных показана возможность использования принципиально нового подхода для создания штаммов холерного вибриона с высоким уровнем продукции одновременно трех важнейших белков - СТ, ТСР и белка OmpU. Во-вторых, созданные штаммы с гиперпродукцией протективных антигенов могут быть использованы для совершенствования выпускаемой в России химической холерной вакцины «холероген-анатоксин+О антиген», а также для выделения очищенных антигенов, необходимых для конструирования диагностических тест - систем.

5. Сравнительный протеомный анализ исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae классического биовара.

Вполне очевидно, что при введении плазмиды рСТ105::mini-kan, наряду с повышенной активностью регуляторного гена toxR, может происходить изменение экспрессии и других хромосомных генов, кодирующих белки с различной функцией. Так, в 2003 г J. Bina et al. показали, что белок ToxR оказывает значительное влияние на метаболизм клетки. При мутации в toxR происходит изменение экспрессии 154 генов, из которых 60 индуцируется, а 94 репрессируется. Обнаружено изменение экспрессии генов, кодирующих белки внешней мембраны, участвующие в транспортных и энергетических процессах, метаболизме железа, подвижности, а также с неустановленной функцией. Эти данные позволяют полагать, что в клетках сконструированных нами штаммах, содержащих плазмиду рСТ105::mini-kan, также может изменяться экспрессия ряда хромосомных генов. В этой связи был проведен сравнительный анализ протеомов исходного штамма V. cholerae 569В и его производного V. cholerae 2415 (рСТ105::mini-kan) TcrKmr. При сопоставлении протеомных профилей сравниваемых штаммов было выявлено 783 белка и обнаружено изменение содержания 61 белка (рисунок 7).

Обозначения: 209 - белок MshL; 444 - белок OmpT; 495 - белок цитоплазматической мембраны FtsZ; 583 и 585 - С4-дикарбоксилат связывающий периплазматический белок; 369 - триптофаназа; 401 - ацетаткиназа; 650 и 694 - А субъединица холерного токсина.

Рисунок 7 - Протеинограмма исходного штамма V. cholerae 569В (А) и его производного V. cholerae 2415 TcrKmr, содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan, (Б) с идентифицированными белками.

Большинство из них, так или иначе, связано с метаболизмом клетки (триптофаназа), ее энергетическим обменом (ацетат киназа), а также транспортными (С4-дикарбоксилат-связывающий белок) и секреторными (MshL, OmpT) функциями (таблица 4).

Наибольший интерес вызывает существенное повышение (в 11,9-19,8 раз) в клетках штамма V. cholerae 2415 TcrKmr белка патогенности - А субъединицы холерного токсина (таблица 4). По данным иммуноферментного анализа уровень продукции секретируемого СТ, в состав которого входит А субъединица, в штамме V. cholerae 2415 TcrKmr увеличился лишь 4,3 раза (таблица 3). Одно из возможных объяснений различий между секретируемой и связанной с клеткой А субъединицей может состоять в отсутствии перестройки в работе системы секреции II типа, через которую происходит транспорт СТ из клетки, при введении плазмиды рСТ105::mini-kan.

Таблица 4 - Идентифицированные белки в изогенных штаммах V. cholerae 569B и 2415 (рСТ105::mini-kan).

Полученные нами при протеомном анализе результаты согласуются с данными J. Bina et al. (2003), относительно изменения продукции ацетаткиназы, транспортных и белков внешней мембраны при изменении активности toxR, и подтверждают выявленную нами роль глобального регуляторного белка ToxR в изменении экспрессии хромосомных генов в штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду.

Таким образом, присутствие плазмиды рСТ105::mini-kan, содержащей клонированные гены профагов CTX и RS1, в высокотоксигенном штамме V. cholerae 569В в результате повышения активности toxR привело не только к увеличению продукции факторов патогенности СТ и ТСР, но и значительно изменило метаболизм клетки, что выразилось в изменении содержания более 60 белков, участвующих в энергетическом обмене, делении клеток, транспорте, а также входящих в состав внешней мембраны.

5. Создание экспериментальной многокомпонентной иммуноферментной диагностической тест-системы.

Сконструированные штаммы V. cholerae 2414 [Дакка 35 (pCT105::mini-kan)] и 2415 [569В (pCT105::mini-kan)] с высоким уровнем продукции одновременно трех протективных антигенов холерного вибриона - СТ, ТСР и OmpU могут быть использованы в производстве диагностических и вакцинных препаратов. Однако, в условиях производства необходима селекция клонов, сохранивших рекомбинантную плазмиду pCT105::mini-kan, что требует добавление антибиотиков в среду выращивания. Такие условия культивирования нежелательны при изготовлении вакцинных препаратов. В этой связи, на первом этапе работы были получены бесплазмидные штаммы V. cholerae продуценты протективных антигенов. При выращивании штаммов V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) и 2415 (pCT105::mini-kan) при температуре 4 оС (благоприятные условия для элиминации плазмиды) с частотой 14-16 % были получены KmsTcs клоны. Утрата плазмиды в 98 % сопровождалась потерей гиперпродукции СТ и ТСР. Вместе с тем среди изученных бесплазмидных клонов было обнаружено по два клона (или 2 %), у которых потеря автономной плазмиды не сопровождалась понижением продукции ТСР и СТ (фенотип KmsTcs Тох++ТСР++). Более того, бесплазмидные Тох++ТСР++ клоны не отличались от содержащих плазмиду штаммов по уровню биосинтеза белка OmpU, что указывает на сохранение эффективной экспрессии в них регуляторного гена toxR. Для дальнейшего изучения этого явления было отобрано по одному KmsTcs Тох++ТСР++ клону, обозначенными как V. cholerae КМ206 (производный штамма 2414 (pCT105::mini-kan) Тох++ТСР++) и V. cholerae КМ207 (производный штамма 2415 (pCT105::mini-kan) Тох++ТСР++) (таблица 3). Такой фенотип штаммов, лишенных указанной плазмиды, дает основание предполагать, что усиление транскрипции гена toxR могло произойти в результате внедрения профага RS1 или утратившей все маркеры резистентности плазмиды рСТ105 с клонированным опероном ctxAB в хромосому. Однако опыты по блот-гибридизации хромосомной ДНК бесплазмидных штаммов с СТ- и RS1-зондами показали отсутствие в их бактериальном геноме профага RS1 и дополнительных копий оперона ctxAB (рисунок 6, дорожки 2 и 6). Мы пока не располагаем сведениями, объясняющими повышенный уровень экспрессии глобального гена toxR, который сохранился после утраты плазмиды. Тем не менее, полученные бесплазмидные штаммы, с высоким уровнем продукции трех протективных антигенов, являются весьма перспективными для применения их в производстве. Кроме того, при сравнительном анализе продукции ряда протективных антигенов сконструированными штаммами в сравнении с производственными штаммами V. cholerae 569В серовара Инаба и М-41 серовара Огава, используемыми для изготовления вакцины «холероген-анатоксин+О-антиген» (ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб», г. Саратов), было обнаружено что полученные нами штаммы сероваров Инаба и Огава отличаются от производственных штаммов повышенной продукцией не только СТ, ТСР, белка OmpU, но и ферментов протеазы и фосфолипазы, а также О1 антигена указанных сероваров, которые также участвуют в образовании защитных антител при холере (таблица 5).

Таблица 5 - Сравнительный анализ продукции протективных антигенов сконструированными и производственными штаммами V. cholerae 569В и М-41

Эти данные позволяют считать, что сконструированные штаммы, имеющие высокий уровень продукции 6-ти протективных антигенов по сравнению с производственными штаммами, могут найти применение для приготовления более эффективной химической холерной вакцины.

Далее в условиях малообъемного культивирования было установлено, что для получения значительного количества СТ, ТСР и О1 антигена сероваров Инаба и Огава культивирование сконструированных штаммов-продуцентов необходимо проводить не более 12 ч в бульоне Хоттингера (рН 8,0) и казеиновом бульоне (рН 7,6) без добавления пептона и глюкозы.

На следующем этапе была разработана модифицированная методика выделения препарата, содержащего токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона, и получены антисыворотки. Для выделения ТСР использовали трис-HCl-буфер (рН 7,0), описанный у D. Sun et al. (1990). Модификации касались способа отделения ТСР от поверхности клеток. Для этих целей использовали не шприц с толстой иглой (Sun et al., 1990), а обработку культуры в течение 2 мин на вортексе «Bio Vortex V1» (Россия) при орбитальном движении центрифужных пробирок с максимальной скоростью (2500 об/мин). Содержание белка в полученных белковых препаратах (БП) составляло 240-300 мкг/мл. По данным белкового электрофореза в БП, кроме ТСР, содержался белок внешней мембраны OmpU. Присутствие ТСР в полученных препаратах было подтверждено электронно-микроскопически и методом иммуноблоттинга с анти-ТСР сывороткой, предоставленной R. K. Taylor (США). Поликлональные антисыворотки получали иммунизацией животных (кролики) бактериями штамма V. cholerae 2414 (pCT105::mini-kan) TcrKmr и БП, выделенным из штамма V. cholerae КМ206 TcsKms. В результате отработанной методики иммунизации животных получены поликлональные кроличьи антисыворотки, содержащие в высоком титре специфические антитела к ТСР, которые могут быть использованы для выяснения экспрессии генов tcp в природных штаммах холерного вибриона с помощью иммуноблоттинга и электронно-микроскопически (рисунок 8). Наличие антисывороток, содержащих антитела к ТСР холерного вибриона, позволило приступить к созданию многокомпонентной экспериментальной иммуноферментной диагностической тест-системы, необходимой для изучения экспрессии основных генов вирулентности в штаммах V. cholerae, выделяемых из различных объектов внешней среды при выяснении их эпидзначимости.

Примечания: Стрелками отмечены пучки токсин-корегулируемых пилей адгезии. Инструментальное увеличение 17 000.

Рисунок 8 - Иммуноэлектронная микрофотография бактерий исходного штамма V. cholerae Дакка 35 (А) и его производного V. cholerae 2414 TcrKmr, содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan, (Б) при использовании коньюгата иммуноглобулинов, приготовленных из антисыворотки к ТСР, и коллоидного золота.

В настоящее время разработан ряд отечественных иммуноферментных тест-систем на основе использования поли- и моноклональных антител для контроля синтеза лишь отдельных антигенов (О антигена или В-субъединицы СТ) (Федорова с соавт, 2000; Алексеева с соавт., 2002; Сырова с соавт., 2003; Чемисова с соавт., 2003; Шеклакова с соавт., 2005). Однако при проведении мониторинговых исследованиях предпочтительны многокомпонентные тест-системы, позволяющие определять экспрессию диагностически значимых генов и генов вирулентности.

Для решения поставленной задачи использовали четыре очищенных ключевых антигена холерного вибриона (ТСР, СТ, О1 антиген Огава и Инаба) и четыре поликлональные антисыворотки к ним. В качестве метода анализа был выбран дот-иммуноанализ (ДИА), позволяющий проводить исследования значительного количества образцов (Beutin et al., 1984). Тест-система обладала высокой чувствительностью, так как определяла ТСР при концентрации бактерий 3,0х106 м.кл./мл., экспрессируемые СТ и О1 антиген соответственно в концентрации 0,3 и 0,14-0,16 мкг/мл, и специфичностью, поскольку выявляла антигены только в штаммах V. cholerae соответствующей серогруппы и серовара.

На следующем этапе был проведен анализ 18 штаммов V. cholerae, выделенных на территории России и других стран от больных и из внешней среды, и эпидемическая значимость которых подтверждена ранее при использовании ПЦР. Все клинические штаммы, содержащие структурные гены О1 антигена серовара Инаба или Огава, ТСР и СТ, продуцировали контролируемые ими факторы вирулентности и иммуногенности (таблица 6).

Таблица 6 - Определение серовара, продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии, холерного токсина в природных штаммах V. cholerae с помощью многокомпонентной диагностической тест-системы.

Вместе с тем было выявлено три штамма (М-999, М-998, С-197), у которых отсутствовал ген tcpA, но результаты ДИА были положительными (таблица 6). Согласно литературным данным у tcpA- холерных вибрионов могут присутствовать пили, подобные ТСР (Fullner, Mekalanos, 1999). Можно полагать, что данные штаммы синтезируют новый тип пилей, имеющих сходную с ТСР последовательность белка. Эти данные расширяют наши представления о дополнительных факторах патогенности холерного вибриона и указывают на возможность использования созданной тест-системы при анализе атипичных штаммов V. cholerae, все чаще вызывающих вспышки или спорадические случаи холеры.

На следующем этапе сконструированную тест-систему использовали для анализа двух производственных серий холерной химической бивалентной вакцины «холероген-анатоксин+О антиген». Ранее было установлено, что эта вакцина содержит О1 антиген сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицу в составе инактивированного СТ (Джапаридзе с соавт., 1991). Присутствие указанных антигенов в вакцине обеспечивает формирование антибактериального и антитоксического иммунитета. В тоже время из-за отсутствия антисыворотки к ТСР не было сведений о наличии этого антигена в указанной вакцине. Полученные нами данные подтвердили присутствие в составе вакцины О1 антигена сероваров Инаба и Огава, а также В-субъединицы СТ. Однако проверяемая вакцина не содержала ТСР.

Итак, диагностическая ценность предлагаемой тест-системы заключается в следующем. Во-первых, обнаружение продукции О антигена позволяет судить о выделении штамма холерного вибриона О1 серогруппы. Во-вторых, на основе изучения экспрессии СТ и ТСР возможна оценка вирулентности выделенных штаммов. В-третьих, созданная тест-система может быть использована при анализе атипичных штаммов V. cholerae, способных вызывать вспышки и спорадические случаи холеры.

В заключении подведены итоги работы и определены перспективы дальнейших исследований. Отмечено, что новые сведения, о существовании в популяции ряда штаммов возбудителя холеры двух типов клонов, различающихся уровнем экспрессии одновременно нескольких генов вирулентности и персистенции, а также выяснение роли отдельных факторов внешней среды в переключении активности этих генов, может внести существенный вклад в понимание природы адаптационной изменчивости V. cholerae, поскольку является одним из перспективных направлений дальнейших исследований по проблеме холера и позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации.

Не менее важны приоритетные данные о влиянии рекомбинантной плазмиды pCT105::mini-kan, несущей клонированные гены двух профагов вирулентности СТХ и RS1, на экспрессию хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, а также контролирующих процессы метаболизма, энергетического обмена, транспорта, цитокинезиса и продукцию белков внешней мембраны, путем изменения активности глобального регуляторного гена toxR. Полученные результаты свидетельствуют о существовании ранее неизвестного механизма координированного изменения активности различных генов и указывают на перспективы продолжения исследований, направленных на получение новых фундаментальных знаний о роли чужеродного генетического материала в изменении экспрессии резидентных генов возбудителя холеры.

Наряду с фундаментальным аспектом, работа имеет и важное практическое значение. Сконструированные бесплазмидные и содержащие плазмиду рСТ105::mini-kan штаммы V. cholerae классического биовара с повышенной продукцией ряда факторов патогенности и иммуногенности холерного вибриона (холерный токсин, токсин-корегулируемые пили адгезии, белок внешней мембраны, ферменты патогенности, О1 антиген) могут быть использованы в производстве более эффективных холерных профилактических и диагностических препаратов. Созданная многокомпонентная иммуноферментная диагностическая тест-система будет востребована при проведении мониторинговых исследований и уточнения эпидемической значимости штаммов холерного вибриона.

ВЫВОДЫ

1. При комплексном фенотипическом анализе 146 клинических штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров обнаружены штаммы, гетерогенность популяции которых определяется присутствием двух типов клонов, различающихся по морфологии колоний (мутные и прозрачные), продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, гемолизина, а также подвижности. Впервые установлено, что экспрессия генов, контролирующих указанные фенотипические свойства, имеет координированный характер.

2. Морфология колоний штаммов V. cholerae классического и эльтор биоваров определяется биосинтезом экзополисахарида. Впервые обнаружено, что классические и эльтор вибрионы, продуцирующие экзополисахарид, различаются по характеру координированной экспрессии генов холерного токсина (сtxAB), растворимой гемагглютинин/протеазы (hapА) и подвижности (mot). У эльтор вибрионов повышение экспрессии генов экзополисахарида (vps) сопровождается увеличением активности генов сtxAB, но снижением экспрессии генов hapА и mot. У классических вибрионов существует обратная связь между экспрессией указанных генов.

3. Впервые показано, что в состав экзополисахарида V. cholerae классического биовара входят рамноза, глюкоза, галактоза и гексозамин. Выявлена адаптивная функция экзополисахарида, заключающаяся в повышении устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стрессов.

4. Проведенный сравнительный анализ протеомов двух фенотипически разных вариантов V. cholerae Дакка 35 классического биовара выявил присутствие 841 белка. В клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ репрессируется синтез 26 белков и индуцируется синтез 31. Для клеток EPS+Тох++Нар+Mot+ характерна обратная картина. Индукция в клетках EPS++Тох+Нар++Mot++ ряда мембранных и цитоплазматических белков с защитной функцией указывает на их повышенную резистентность к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды.

5. Сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности является щелочная реакция среды (рН 9,0). Переключение активности этих генов приводит к изменению вирулентности популяции и её устойчивости к действию неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Введение рекомбинантной плазмиды рСТ105::mini-kan с клонированными генами профагов вирулентности СТХ и RS1 в клетки высокотоксигенных штаммов V. cholerae классического биовара приводит к выраженному изменению экспрессии хромосомных генов, кодирующих ключевые факторы патогенности и иммуногенности, - токсин-корегулируемые пили адгезии и белок OmpU. Изменение экспрессии хромосомных генов обусловлено повышенной активностью глобального регуляторного гена toxR.

7. При сравнительном анализе протеомов исходного и содержащего плазмиду рСТ105::mini-kan штаммов V. cholerae впервые выявлены различия в их белковых профилях. В штамме, содержащем рекомбинантную плазмиду, обнаружено 33 гена с пониженной и 28 генов с повышенной экспрессией, кодирующих белки, являющиеся важными факторами вирулентности и иммуногенности, а также участвующими в энергетическом обмене, процессах метаболизма, транспорте, цитокинезисе и входящих в состав внешней мембраны.

8. Сконструированы содержащие плазмиду и бесплазмидные штаммы V. cholerae классического биовара с высоким уровнем продукции одновременно трех ключевых протективных антигенов - холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и О1 антигена, ответственных за формирование при холере антитоксического, антиколонизирующего и антибактериального иммунитета. Определены оптимальные условия их культивирования (фаза роста, температура, состав и рН среды, время выращивания) для получения протективных антигенов при малообъемном культивировании в производственных условиях.

9. На основе сконструированных штаммов создана экспериментальная многокомпонентная иммунодиагностическая тест-система, включающая набор из 4-х очищенных протективных антигенов (холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, О1 антигена сероваров Инаба и Огава) и 4-х поликлональных антисывороток к ним. Экспериментально доказана специфичность, эффективность и диагностическая ценность тест-системы при определении экспрессии основных генов патогенности и иммуногенности у природных штаммов V. cholerae с различной эпидемической значимостью.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Заднова С. П. Сравнительный анализ факторов патогенности у токсигенных и нетоксигенных клонов штаммов Vibrio cholerae Дакка35 Огава / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 1999. - Вып. 79. - С. 153-159.

2. Чеховская Г. В. Новый высокотоксигенный штамм Vibrio cholerae Дакка35: морфология, продукция холерного токсина и белковый спектр / Г. В. Чеховская, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, Ю. В. Лазовский, Н. И. Смирнова // Centre for Control and Research of natural infectious diseases. Scientific Journal. - Ulaanbaatar, 1999. - N 7. - P. 282-283.

3. Konnov N. P. Comparative microscopy study of Vibrio cholera flagella / N. P. Konnov, V. B. Baibyrin, S. P. Zadnova, Y. P. Volkov // International Symposium. Biomedical Optic, Spie Proceedings. - San Jose, USA, 1999. - Vol. 3607. - P - 25. - S. 30-31.

4. Топорков А. В. Штаммы холерного вибриона с повышенной продукцией токсин-корегулируемых пилей адгезии: выявление и фенотипический анализ / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2000. - Вып. 80. - С .88-93.

5. Топорков А. В. ToxR-регулируемые гены и их экспрессия в штаммах Vibrio cholerae О1 (рСТ105::mini-kan) / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Г. А. Ерошенко, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Информация проблемной комиссии (46.04) межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации (46.00). - Ростов-на-Дону, 2000. - Вып. 13. - С. 59-61.

6. Смирнова Н. И. Молекулярно- генетические особенности штаммов Vibrio cholerae classica, вызвавших эпидемию азиатской холеры в России в 1942 году / Н. И. Смирнова, Н. Б. Челдышова, С. П. Заднова, В. В. Кутырев // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. - 2001. - № 4. - С. 12-16.

7. Заднова С. П. Получение и фенотипический анализ штаммов холерного вибриона с повышенной продукцией основных протективных антигенов / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2001. - № 2. - C. 3-6.

8. Заднова С. П. Получение и изучение антител против токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона О1 серогруппы / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2001. - Вып. 1(81). - С. 131-136.

9. Заднова С. П. Изучение продукции токсин-корегулируемых пилей адгезии у штаммов холерного вибриона классического биовара / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Карантинные и зоонозные инфекции в Казахстане. Сб. тез. Международной научно-практической конференции. - Алматы, 2001. - Вып. 3. - С. 143-147.

10. Заднова С. П. Продукция токсин-корегулируемых пилей адгезии природными штаммами холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Материалы проблемной комиссии межведомственного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2001. - Вып. 14. - С. 36-38.

11. Заднова С. П. Конструирование штаммов-суперпродуцентов токсин-корегулируемых пилей адгезии - основного фактора колонизации холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Б. Челдышова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Биотехнология. - 2002. - № 2. - С. 3-11.

12. Коннов Н. П. Изучение токсин-корегулируемых пилей адгезии холерного вибриона методом иммуноэлектронной микроскопии / Н. П. Коннов, С. П. Заднова, О. В. Новикова, А. В. Топорков, Н. И. Смирнова // ЭМ'2002. Тез. докл. ХIХ Российской конференции по электронной микроскопии. - Черноголовка, 2002. - C. 229.

13. Заднова С. П. Получение и использование антител на токсин-корегулируемые пили адгезии холерного вибриона / С. П. Заднова, А. В. Топорков, О. В. Новикова, Н. И. Смирнова // Биотехнология. - 2003. - № 1. - C. 79-84.

14. Топорков А. В. Генетический контроль регуляции экспрессии основных генов патогенности у возбудителя холеры / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2003. - Вып. 85. - С. 113-121.

15. Заднова С. П. Изучение роста штаммов холерного вибриона - продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение белка токсин-корегулируемых пилей адгезии / С. П. Заднова, С. А. Еремин, Н. Г. Авдеева, О. А. Волох // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 236-238.

16. Заднова С. П. И. Колониальные вариации штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Т. Л. Захарова, Н. П. Коннов, Н. И. Смирнова // Холера. Материалы Российской научно-практической конференции. - Ростов-на-Дону, 2003. - С. 140-143.

17. Smirnova N. I. Molecular-genetic peculiarities of classical biotype Vibrio cholerae, the etiological agent of the last outbreak Asiatic cholera in Russia / N. I. Smirnova, N. B. Cheldyshova, S. P. Zadnova, V. V. Kutyrev // Microb. Pathog. - 2004. - Vol. 36, N 3. - Р. 131-136.

18. Заднова С. П. Изучение динамики роста штаммов Vibrio cholerae-продуцентов протективных антигенов в условиях глубинного культивирования и выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии / С. П. Заднова, С. А. Еремин, Н. Г. Авдеева, О. А. Волох // Биотехнология. - 2004. - № 3. - С. 43-48.

19. Заднова С. П. Фенотипический анализ штамма Vibrio сholerae Дакка 35 Огава, имеющего гетерогенную популяцию / С. П. Заднова, А. В. Топорков, Н. Д. Исаев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2004. - № 3. - С. 86-88.

20. Заднова С. П. Функциональная роль ToxR-регулируемых белков Vibrio cholerae / С. П. Заднова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. - Вып. 1(87). - С. 9-13.

21. Заднова С. П. Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 О1 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. П. Коннов, Т. Л. Захарова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2004. - Вып. 1(87). - С. 42-45.

22. Заднова С. П. Сравнительное изучение белкового состава у токсигенных и нетоксигенных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка35 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Молекулярная медицина и биобезопасность. Сб. тез. I Международной конференции. - М., 2004. - С. 80-81.

23. Заднова С. П. Вариабельность биохимических и генетических свойств штамма Vibrio cholerae Дакка 35 / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Генетика в ХХI веке: современное состояние и перспективы развития. Сб. тез. III съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров России. - М., 2004. - Т.1. - С. 381.

24. Топорков А. В. Повышение продукции основных протективных антигенов Vibrio cholerae О1 с помощью рекомбинантной плазмиды с клонированными генами холерного токсина / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины. Сб. тез. III конференции молодых ученых с международным участием. - М., 2004. - С. 160-161.

25. Смирнова Н. И. Влияние рекомбинантной плазмиды, несущей клонированные гены холерных профагов СТХ и RS1, на экспрессию генов вирулентности и иммуногенности у возбудителя холеры / Н. И. Смирнова, С. П. Заднова, А. В. Топорков // Молекул. генетика, микробиол. и вирусол. - 2005. - № 3. - С. 3-8.

26. Топорков А. В. Сравнительный анализ продукции протективных антигенов у рекомбинантных и производственных штаммов Vibrio cholerae классического биовара / А. В. Топорков, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2005. - № 1. - С. 53-57.

27. Исаев Н. Д. Популяционная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара: координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств / Н. Д. Исаев, Ю. В. Лозовский, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2005. - Вып. 1(89). - С. 43-46.

28. Заднова С. П. Механизмы секреции грамотрицательных бактерий / С. П. Заднова, Ю. В. Лозовский // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2005. - Вып. 2(90). - С. 11-16.

29. Смирнова Н. И. Конструирование штаммов-продуцентов основных протективных антигенов холерного вибриона с помощью изменения экспрессии глобального регуляторного гена toxR / Н. И. Смирнова, С. П. Заднова, А. В. Топорков, В. В. Кутырев // Биотехнология: состояние и перспективы развития. Материалы III Международного конгресса. - М., 2005. - Ч.1. - С. 82.

30. Кузнецов О. С. Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae Дакка 35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии / О. С. Кузнецов, С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова, Н. П. Коннов // ХIV Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. Тез. докл. - Черноголовка, 2005. - C. 261.

31. Заднова С. П. Экзополисахаридный слой холерных вибрионов классического биовара: обнаружение, биохимический анализ и функциональная значимость / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2005. - Вып. 18. - С. 92-94.

32. Smirnova N. I. Construction of strains producing the main protective antigens of Vibrio cholerae based on altered expression of the global regulatory gene toxR / N. I. Smirnova, S. P. Zadnova, A. V. Toporkov, V. V. Kutyrev // New Research on Biotechnology and Medicine / Edit. A.M. Egorov, G.E. Zaikov. New York, 2006. - P. 177-188.

33. Заднова С. П. Протеомный анализ двух изогенных вариантов Vibrio cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, К. Б. Кутейкин-Тепляков, О. В. Тихонова, И. Ю. Торопыгин, А. И. Арчаков, Н. И. Смирнова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. - 2006. - № 3. - С. 11-16.

34. Исаев Н. Д. Влияние условий среды на координированное переключение генов патогенности и персистенции у холерного вибриона / Н. Д. Исаев, С. П. Заднова, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2006. - Вып. 19. - С. 69-71.

35. Заднова С. П. Выделение токсин-корегулируемых пилей адгезии и белка внешней мембраны OmpU из штамма холерного вибриона классического биовара / С. П. Заднова, С. А. Еремин, О. А. Волох, Н. И. Смирнова // Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении в решениях Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств - участников Содружества Независимых Государств. Материалы VII Межгосударственной научно-практической конференции. - Оболенск, 2006. - С. 105-106.

36. Заднова С. П. Изучение продукции основных факторов патогенности и иммуногенности различными штаммами Vibrio cholerae при их культивировании в производственных условиях / С. П. Заднова, О. А. Волох, И. М. Крепостнова, Е. Ю. Щелканова, Л. Ф. Ливанова, Т. Л. Захарова, И. А. Шепелев, С. А. Еремин, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2007. - Вып. 1(95) - С. 51-55.

37. Zadnova S. P. Studying Vibrio cholerae isogenic variants of classical biovar by means of proteomic analysis / S. P. Zadnova, N. D. Isayev, N. I. Smirnova // Эрдэм Шинжилгээний Бутээл (Natural infectious and emerging and reemerging diseases). Scientific Journal. - Улаанбаатар, 2007. - № 15. - С. 253-258.

38. Заднова С. П. Изменение свойств штаммов холерного вибриона классического биовара под действием факторов внешней среды и мобильных генетических элементов / С. П. Заднова, Н. Д. Исаев, Ю. В. Лозовский, Н. И. Смирнова // Холера и патогенные для человека вибрионы. Сборник материалов проблемной комиссии Координационного научного совета по санитарно-эпидемиологической охране территории Российской Федерации. - Ростов-на-Дону, 2007. - Вып. 20. - С. 102-105.

39. Захарова Т. Л. Создание многокомпонентной диагностической иммуноферментной тест-системы для оценки экспрессии основных генов вирулентности у холерных вибрионов / Т. Л. Захарова, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, И. М. Крепостнова, М. Н. Киреев, Н. И. Смирнова // Биотехнология. - 2008. - № 1. - С. 88-96.

40. Волох О. А. Изучение физиологических процессов, происходящих в популяции штаммов холерного вибриона продуцентов протективных антигенов, в процессе производственного культивирования / О. А. Волох, И. А. Шепелёв, С. П. Заднова, И. М. Крепостнова, С. А. Еремин // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2008. - Вып. 1(95). - С. 52-55.

41. Захарова Т. Л. Конструирование рекомбинантных штаммов для одновременного получения нескольких очищенных основных протективных антигенов холерного вибриона / Т. Л. Захарова, С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, М. Н. Киреев, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2009. - Вып. 2(100). - C. 68-71.

42. Заднова С. П. Выявление в природных популяциях холерного вибриона клонов с различной экспрессией факторов вирулентности и персистенции и их фенотипический анализ / С. П. Заднова, Л. Ф. Ливанова, Ю. В. Лозовский, Н. И. Смирнова // Пробл. особо опасных инф. - Саратов, 2009. - Вып. 3(101). - (принята в печать).

Патенты Российской Федерации на изобретения.

43. Штамм бактерий Vibrio cholerae 2414 классического биовара серовара Огава - продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат RU 2169187 C1 / Смирнова Н. И., Заднова С. П., Топорков А. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2169187 C1; заявл. 26.04.2000; опубл. 20.06.2001, Бюл. № 17. - 6 с.

44. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM200-продуцент холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии: пат. RU 2193598 C1 / Смирнова Н. И., Заднова С. П., Топорков А. В., Челдышова Н. Б.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2193598, заявл. 26.07.2001, опубл. 27.11.2002. Бюл. № 33. - 6 с.

45. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM206 классического биовара серовара Огава - продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222594 C1 / Топорков А. В., Заднова С. П., Смирнова Н. И., Кутырев В. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222594, заявл. 15.07.2002, опубл. 27.01.2004, Бюл. № 3. - 8 с.

46. Штамм бактерий Vibrio cholerae KM207 классического биовара серовара Инаба - продуцент протективных антигенов: пат. RU 2222595 C1 / Заднова С. П., Топорков А. В., Смирнова Н. И., Кутырев В. В.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2222595, заявл. 15.07.2002; опубл. 27.01.2004, Бюл. № 3. - 10 с.

47. Способ выделения белков токсин-корегулируемых пилей адгезии и OmpU холерного вибриона классического биовара: пат. RU 2324740 C2 / Заднова С. П., Еремин С. А., Авдеева Н. Г., Волох О. А., Самохвалова Ю. И., Смирнова Н. И.; заявитель и патентообладатель ФГУЗ РосНИПЧИ «Микроб». - № 2324740; заявл. 11.07.2006; опубл. 20.05.2008, Бюл. № 14. - 7 с.: ил.

Размещено на Allbest.ru