диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Новизна исследования. Показана взаимосвязь между структурными особенностями клеточной поверхности Blastocystis hominis и их вирулентностью. Литическое действие на клетки B.hominis различной вирулентности оказывали ферменты, обладающие протеазной, хитиназной, глюканазной, липазной и целлюлазной активностями. Отмечена закономерность изменения скорости лизиса при действии липазы на все три группы штаммов бластоцист - с усилением вирулентности замедляется скорость лизиса. Целлюлазы способны лизировать клетки только высоко- и умеренновирулентных B.hominis. Это может свидетельствовать в пользу того, что при укреплении клеточной оболочки целлюлозой усиливаются вирулентные свойства бластоцист, а клетки умеренно- и авирулентных вариантов B.hominis имеют области незащищенной мембраны вследствие частичного или полного отсутствия защитной целлюлозной оболочки.

В опытах in vivo установлена диссоциация эшерихий по показателю вирулентности. У штаммов E.coli, выделенных в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами значения показателя вирулентности (LD₅₀/lg) были выше, чем с умеренновирулентными и авирулентными.

Впервые исследована динамика численности популяций B.hominis и E.coli при совместном культивировании. Показано, что в результате межмикробного взаимодействия выявлено устойчивое совместное существование популяций эшерихий и бластоцист, с сохранением высокой численности микросимбионтов.

Показано взаимодействие вирулентных и авирулентных E.coli с цистами B.hominis при действии дестабилизирующих факторов, таких как антибактериальные препараты.

Впервые установлено, что в условиях микросимбиоценоза с B.hominis, происходит увеличение частоты встречаемости генетических детерминант факторов патогенности, обеспечивающих адгезию и токсинообразование среди выделенных фенотипических групп E.coli, а также селекция клонов с сочетаниями генов, не встречавшихся у штаммов, изученных до сокультивирования и в монокультурах.

Дана оценка изменения патогенного потенциала микросимбионтов в протозойно-бактериальных ассоциациях после совместной инкубации. Показано, что неферментирующие и гемолитические эшерихии в тандеме с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами обоюдно усиливали вирулентность, напротив, кишечные палочки с нормальной ферментативной активностью угнетали активность факторов патогенности бластоцист. В сообществах E.coli с нормальной ферментативной активностью и авирулентных бластоцист отмечен индифферентный характер взаимодействия.

Основные положения и выводы диссертационной работы включены в лекционные курсы и практические занятия для студентов биологических и медицинских специальностей по темам: «Микробная экология», «Особенности этиопатогенеза эндогенных инфекций», «Инфекционный и постинфекционный иммунитет»; в практику клинической и бактериологической лабораторий ГУЗ Городской клинической больницы №1 г. Ульяновска при диагностике и оценке микробиоценоза кишечника, при определении чувствительности микробов к антибиотикам.

Положения, выносимые на защиту

1. Обоснован симбиотический подход к оценке динамики патогенного потенциала микросимбионтов в ассоциации E.coli-B.hominis, позволяющий выявить некоторые условия селекции вирулентных эшерихий в кишечном биотопе.

2. Молекулярно-генетический анализ при изучении ассоциативных симбиотических взаимодействий способствует выявлению основных направлений взаимоадаптации микроорганизмов в изменяющихся условиях симбиоценоза.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на: Российской научно-практической конференции “Актуальные вопросы педиатрии и детской хирургии” (Ульяновск, 2000); VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням "Проблема инфекции в клинической медицине" (Санкт-Петербург, 2002); Юбилейной научной конференции, посвящённой 80 - летию кафедры микробиологии Военной медицинской академии и 300 летию основания Санкт - Петербурга “Современная микробиология в клинической медицине и эпидемиологии (Санкт - Петербург, 2003); II Международной научно - практическая конференция. "Медицинская Экология" (Пенза, 2003); Международной конференции, посвященной 125-летию К.И. Скрябина и 60-летию основания Лаборатории гельминтологии АН СССР - Института паразитологии РАН «Основные достижения и перспективы развития паразитологии» (Москва, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные вопросы здоровья и среды обитания современного человека» (Ульяновск, 2005); Falk Symposium № 142 (Birmengem, 2005); Международной конференции «Профилактика, диагностика и лечение инфекционных болезней, общих для людей и животных» (Ульяновск, 2006); I конференции молодых ученых медико-биологической секции Поволжской ассоциации государственных университетов (Ульяновск, 2007); Всероссийской конференции с международным участием «Медико-физиологические проблемы экологии человека» (Ульяновск, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 45 работ, из них 12 статей в рецензируемых научных журналах; изданы 4 практических пособия и 3 монографии; получены 3 патента на изобретение.

Объем и структура диссертации. Текст диссертации изложен на страницах машинописи, содержит введение, 5 глав, заключение, выводы, практические рекомендации, указатель литературы, включающий в себя 102 отечественных и 391 иностранных источников. Иллюстрации представлены 35 таблицами, 57 рисунками.

Основные разделы работы выполнены по плану НИР Института медицины, экологии и физической культуры Ульяновского государственного университета «Биология простейших Blastocystis hominis и их влияние на макроорганизм» (№гос. регистрации 01.200.2211659).

Содержание работы

Материалы и методы исследования.

Исследования микробного пейзажа кишечника проводили в период с 2002 по 2007 года на базе бактериологической лаборатории городской клинической больницы №1 г. Ульяновска (табл. 1).

Таблица 1. Количество штаммов E.coli, изолированных из протозойно-бактериальных ассоциаций толстой кишки человека

В работе использовали штаммы E.coli, выделенные из фекалий 307 пациентов в возрасте от 20 до 75 лет, находившихся на лечении в условиях дневного гастроэнтерологического стационара Городской поликлиники № 5 г. Ульяновска.

Контрольную группу составили 150 практически здоровых лиц репрезентативных по полу и возрасту, из которых 134 (89,3 %) - неинфицированных данными простейшими.

При изучении микробиоценозов кишечника согласно Приказу № 535 от 22.04.85 МЗ РСФСР «Об унификации микробиологических методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждениях», определяли как частоту высеваемости отдельных видов, так и их количественные показатели в пересчете на 1 г фекалий (Сорокин, Федорова, 1990; Крылов, Козлович, Решетнева, 1994).

В качестве контрольных также использовали эталонные штаммы E.coli, содержащие гены, детерминирующие синтез факторов патогенности (табл. 2).

Таблица 2. Эталонные штаммы E.coli

Молекулярно-генетические исследования с применением полимеразно-цепной реакции (Маккреди, Чимера, 1999) проводили на базе клинико-диагностической лаборатории Государственного учреждения здравоохранения Ульяновской областной клинической больницы №1 (ГУЗ УОКБ).

Для постановки полимеразно-цепной реакции выделение бактериальной ДНК проводили по методу Boom et al. (1988) c использованием гуанидинтиоцианата (GuSCN). Подбор праймеров и температуры отжига осуществляли при использовании пакета программ «Lasergene» (США). Праймеры синтезированы в НПФ «ДНК-технология» (Россия). Для получения достаточного количества копий искомого характеристического фрагмента ДНК амплификация включает 20-40 циклов. Регистрацию результатов ПЦР осуществляли путем электрофоретического разделения продуктов амплификации на окрашенном бромистым этидием агарозном геле (Маккреди, Чимера, 1999). Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей проводили с помощью компьютерной программы Vector NTI Suite (США).

Определение факторов патогенности таких как: гемолитическая, липолитическая, ДНК-азная, протеолитическая, лецитоветилазная проводили с использованием общепринятых методик (Биргер, 1982).

Колициногенная активность изучалась методом отсроченного антагонизма. В качестве тест-культуры использовали музейный штамм E.coli К-12 ГИСК №240367 (плотность 10 ед. по оптическому стандарту мутности ГИСК Л.А. Тарасевича).

Чувствительность бактерий определяли к следующим антимикробным препаратам: ампициллину, стрептомицину, цефазолину, гентамицину. Для выявления степени антибактериальной активности определяли минимальную подавляющую концентрацию химиопрепарата (Навашин, Чучалин, Белоусов, 1998).

Для получения аксеничных культур B.hominis использовали среду Suresh (Suresh, Ng, 1993), в анаэробных условиях.

Изучение действия гидролитических ферментов с известной субстратной специфичностью на клетки изолятов бластоцист проводили по методу Степной О.А. и соавт. (2003) на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г.Пущино (ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН). В работе использовали следующие гомогенные, очищенные ферменты: протеазу Lysobacter sp. XL 1(7Е/мг) (10), липазу панкреатическую (EC 3.1.1.74; Sigma; 250 Е/мг), пектиназу (EC 3.1.1.73), целлюлазу (EC 3.2.1.4), в-глюкуронидазу (EC 3.1.6.2; Worthington biochemical corporation; 30 Е/мг, 5 Е/мг, 0,03 Е/мг соответственно), эндоглюканазу Aspergillus terreus 5 Е/ мг (EC 3.2.1.155; любезно предоставлена Рязановой Л.П. ИБФМ им Г.К. Скрябина РАН), хитиназу Serratia marcescens ((EC 3.2.1.14; Sigma; 0,01Е/мг).

Культивирование с целью изучения взаимного влияния микробов-симбионтов в протозойно-бактериальной ассоциации проводили с использованием разработанной питательной среды (приоритетная справка №2008114890 от 5.10.2008) с определением количества взаимодействующих микробов и индекса обилия (ИО) (Степанских, 2000).

С целью изучения взаимодействия E.coli с цистами B.hominis на 21-е сутки совместного культивирования контрольные и опытные посевы подвергали действию антибактериальных препаратов ампициллина, стрептомицина, гентамицина и цефазолина в концентрации 60,6; 47,3; 39,2 и 10,4 мкг/мл, с последующим высевом для проведения качественной и количественной оценки микробов и их свойств.

Степень вирулентности микробов (LD₅₀/lg) определяли внутрибрюшинной и кератоконъюнктивальной пробами с использованием белых мышей и морских свинок.

Полученные данные обработаны для медико-биологических работ критериями параметрической и непараметрической статистики. Для параметров указывалась точность оценки. В работе использовался 95% и 99% доверительный интервал.

При сравнении двух связанных групп использовался парный одновыборочный t-критерий; при сравнении двух независимых групп применялся непарный двухвыборочный t-критерий Стыодента. Непараметрические (качественные) данные двух независимых групп сравнивались с помощью критерия хи-квадрат Пирсона, а также подвергались корреляционному анализу по методу Спирмена.

Статистическую обработку результатов исследований выполняли на персональном ЭВМ типа IBM «Pentium III», графическая обработка материалов выполнена с помощью пакета прикладных программ Exel-2000. Для статистической обработки материала, применена компьютерная программа StatSoft Statistica 6.O. (Лакин, 1990; Зайцев, 2003).

Результаты исследования

Известно, что вирулентность микроорганизмов в значительной мере определяется строением клеточной стенки (Бухарин и др., 2004). Ранее показано, что вирулентность микросимбионтов B.hominis значительно варьирует (Потатуркина-Нестерова, Ю.Ю.Красноперова, Чебан, Ильина, 2000; Красноперова, Глебова, Лазарев, Курзин, 2007), тем не менее, не изученной остается взаимосвязь степени вирулентности бластоцист и особенностей структуры клеточной стенки возбудителя.

Основываясь на известных в литературе немногочисленных и фрагментарных данных относительно строения клеточной поверхности B.hominis мы предположили, что клетки простейших могут либо вовсе не иметь клеточных покровов, либо иметь покровы, включающие хитин (как например у корненожек, солнечников, биченосцев и инфузорий), целлюлозу, пектин (сходство с растительной клеткой). В случае если клетки бластоцист не имеют клеточной оболочки, они должны быть чувствительными к действию липаз или протеаз. Можно также предположить участие в организации клеточных покровов полисахаридов, распространенных у животных и бактерий - гиалуроновых или тейхуроновых кислот (Наумова, Шашков, 1997), и полимеров, характерных для клеточных стенок грибов - глюкана, структурных белков (Калебина, Кулаев, 2001; Klis, 1994; Kapteyn, Van Den Ende, Klis, 1999).

Поэтому для проверки действия на клетки B. hominis были выбраны следующие ферменты: липаза, протеаза, пектиназа, целлюлаза, глюкуронидаза, глюканаза, хитиназа. В ходе эксперимента определяли количество жизнеспособных клеток бластоцист разной вирулентности после воздействия на них ферментов.

Результаты исследования показали различия в гидролитической активности и скорости проявления положительных эффектов изучаемых ферментов в зависимости от выраженности вирулентных свойств бластоцист. Литическое действие на клетки авирулентных, умеренно- и высоковирулентных B.hominis оказывали ферменты, обладающие протеазной (с=0,95; с=0,91; с=0,86 соответственно), хитиназной (с=0,83; с=0,72; с=0,72 соответственно), липазной (с=0,9; с=0,89; с=0,88 соответственно) и глюканазной активностями (с=0,79; с=0,73; с=0,71 соответственно). Под действием данных ферментов происходило значительное снижение популяционной численности бластоцист, уменьшение размеров клеток B.hominis с 15 мкм до 7 мкм, сжатие и затемнение цитоплазмы. Нами показаны отличия в скорости лизиса при действии липазы и целлюлазы на все три группы штаммов бластоцист. С увеличением вирулентности простейших замедлялась скорость проявления положительного действия при действии липазы от 1 до 4 часов, при воздействии целлюлазы отмечался прямо противоположный эффект (рис. 1).

Рисунок 1 - Скорость проявления положительного литического действия на клетки бластоцист липазы и целлюлазы

Это может свидетельствовать в пользу того, что вирулентность микроорганизма усиливается вследствие укрепления клеточной оболочки бластоцист целлюлозой и другими полимерами, что придает микробу конкурентные преимущества в условиях кишечного биотопа и может служить лигандами при взаимодействии с пили бактерий. Клетки умеренно- и авирулентных вариантов B.hominis имеют области незащищенной липидсодержащей мембраны вследствие частичного или полного отсутствия защитной целлюлозной оболочки.

Исследованиями, проведенными нами ранее (2003, 2004), были выявлены микроэкологические нарушения микробного сообщества толстой кишки при бластоцистной инвазии. Тем не менее, остается не изученной взаимосвязь устойчивости популяций микросимбиоценоза кишечника в сопоставлении с вирулентностью бластоцист

Данные, подтвержденные линейным регрессионным анализом, показали, при увеличении вирулентности изолированных бластоцист отмечается снижение высеваемости бактерий рода Bifidobacterium и Lactobacillus со значений lg 9,3±0,4 и 8,6±0,3 КОЕ/г до lg 6,1±0,3, 4,3±0,3 КОЕ/г соответственно (р?0,001). Коэффициенты корреляции составили r=-0,9 и r=-0,8 соответственно.

Противоположную направленность имела зависимость, демонстрирующая обсемененность кишечника микробами родов Enterococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida. При изменении вирулентности паразитов от LD₅₀/lg 0 до 5,3±0,2 статистически достоверно изменялась обсемененность кишечника микробами родов Enterococcus, Clostridium, Staphylococcus и Candida со значений lg 3,1±0,3, 6,3±0,2, 3,9±0,4 и 2,5±0,3 КОЕ/г до lg 8,1±0,3, 9,2±0,1, 6,2±0,3 и 5,7±0,2 КОЕ/г соответственно (р?0,001). Коэффициенты корреляции составили r=0,7, r=0,9, r=0,8 и r=0,8 соответственно.

Полученные результаты по бактериям родов Proteus и Klebsiella имели сходную направленность, но носили менее выраженный характер. Так, при усилении вирулентности бластоцист статистически достоверно увеличивалось количество Proteus и Klebsiella с lg 3,1±0,3, 2,8±0,4 КОЕ/г до lg 5,1±0,1, 5,2±0,2 КОЕ/г соответственно (р0,05). Коэффициенты корреляции составили r=0,5 и r=0,7 соответственно.

Исследования также выявили, что вегетирование в кишечном биотопе вирулентных Blastocystis hominis, сопровождалось не только резким уменьшением общего содержания микросимбионтов Escherichia coli с нормальной ферментативной активностью, но и появлением большого количества штаммов, обладающих гемолитической и лактозонегативной активностями.

Изменение численности различных фенотипических групп бактерий E.coli под влиянием бластоцист проходило в следующих направлениях. Количество лактозонегативных и гемолитических форм эшерихий увеличилось с 0 до lg 3,8±0,3, 5,4±0,1 КОЕ/г соответственно (р?0,001). Коэффициент корреляции составил r=0,8 и r=0,9 соответственно. Угол наклона линии тренда демонстрирует обратную связь изменения численности бактерий с нормальной ферментативной активностью от вирулентности простейших, где r=-0,9 (рис. 2).

Рисунок 2 - Характеристика связи вирулентности B.hominis с количеством E.coli

Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямой взаимосвязи глубины качественных и количественных изменений внутри микробных ассоциаций кишечника от вирулентности изолятов B.hominis, в частности вегетирование умеренно- и высоковирулентных бластоцист сопровождается увеличением содержания E.coli с широким набором факторов патогенности.

Изменение биологических свойств условно-патогенных энтеробактерии, в частности усиление вирулентности, рассматривают в качестве одной из причин изменения этиологической структуры патологических состояний инфекционного генеза (Бондаренко, 2001). Тем не менее, исследования гетерогенности эшерихий в протозойно-бактериальных ассоциациях толстой кишки по показателю вирулентности, с последующим количественным выражением, не проводилось.

Исследования изменения вирулентности эшерихий, как механизма адаптации к ассоциативному симбиотическому взаимодействию с простейшими B.hominis, выявили увеличение данного показателя у штаммов в сообществе с высоковирулентными бластоцистами по сравнению с умеренновирулентными, который составил LD₅₀/lg 3,7 и 3,1 ед соответственно (рис. 3).

Рисунок 3 - Показатель вирулентности микросимбионтов E.coli в протозойно-бактериальных ассоциациях толстой кишки

Показатель LD₅₀/lg для неферментирующих изолятов E.coli, выделенных совместно с высоковирулентными бластоцистами составил 2,8, с умеренновирулентными - 1,9, с авирулентными - 1,1 ед.

Выявленная неоднородность по указанному признаку является отражением направленности межмикробных взаимодействий E.coli с B.hominis в условиях ассоциативного симбиоценоза толстой кишки. Аспекты взаимодействия бактерий и простейших требуют дальнейшего изучения на генетическом уровне.

В последние десятилетия простейшие рассматриваются как возможные хозяева возбудителей ряда инфекционных заболеваний (Коренберг, 2005). Все имеющиеся данные описывают изучение взаимодействия бактерий и простейших - обитателей почв и водоемов. Известно, что организм человека также представляет собой экологическую нишу для разнообразных микроорганизмов, заселяющих его биотопы (Нетрусов и др., 2004). Однако до сих пор, не изученными остаются формы и аспекты отношений, складывающихся между простейшими B.hominis и другими микросимбионтами как внутри макроорганизма, так и в экспериментах in vitro.

В связи с этим дальнейшим этапом нашей работы явилось проведение совместного культивирования различных фенотипических групп бактерий E.coli и простейших B.hominis.

Показано, что при сокультивировании гемолитических форм эшерихий с высоко- (рис. 4) и умеренновирулентными (рис. 5) бластоцистами через 24 часа взаимодействия численность бактерий достигла максимальных значений.

В эти сроки численность бактериальных популяций составляла 1,8х10⁸±1,4 и 1,9х10⁷±1,1 КОЕ/мл соответственно (в контрольных посевах количества бактерий находились на уровне 1,5х10⁷±2,4 и 6,7х10⁷±2,4, р>0,05). Динамика численности высоко- и умеренновирулентных бластоцист также носила положительный характер.

Рисунок 4 - Динамика численности гемолитических E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с высоковирулентными B.hominis при совместном культивировании

Рисунок 5 - Динамика численности гемолитических E.coli в рамках ассоциативного симбиоза с умеренновирулентными B.hominis при совместном культивировании

В последующее время наблюдений плотность популяций E.coli неуклонно снижалась, что, по-видимому, связано с активным антагонистическим действием высоко- и умеренновирулентных простейших B.hominis, и достигла минимума на 12-е и 15-е сутки соответственно. При ассоциативном симбиотическом взаимодействии с высоковирулентными бластоцистами уровень гемолитических эшерихий в это время составил 1,3х10³±2,2 КОЕ/мл, с умеренновирулентными - 1,5х10²±1,4 КОЕ/мл (в монокультурах данные показатели равнялись 1,9х10²±1,6 и 6,2х10³±1,6 КОЕ/мл соответственно, р>0,05).

Напротив, именно в эти сроки отмечена максимальная численность высоко- и умеренновирулентных простейших B.hominis, которая соответствовала 4,8х10⁶±1,9 и 9,3х10⁵±1,5 КОЕ/мл соответственно (в зоне контрольных высевов данные показатели составили 4,2х10⁴±2,4 и 4,2х10⁴±0,3 КОЕ/мл соответственно, р<0,05). КОЕ/мл. К 21 суткам численность E.coli возросла до значений 2,2х10⁴±2,3 при взаимодействии с высоковирулентными B.hominis и до 3,9х10³±1,5 КОЕ/мл при взаимодействии с умеренновирулентными бластоцистами (в контроле плотность популяции E.coli составляла 8,4±0,2 и 1,8±0,1 КОЕ/мл соответственно, р?0,001). Количество высоко- и умеренновирулентных клеток бластоцист напротив снизилось и составило 6,7х10³±1,3 и 1,7х10³±0,9 КОЕ/мл соответственно (в контроле плотность популяции бластоцист составила 4,2х10⁴±1,5 и 3,2х10⁴±1,5 КОЕ/мл соответственно, р?0,001). Повышение численности гемолитических кишечных палочек, по-видимому, связано с активизацией защитных механизмов, направленных на нейтрализацию антагонистической активности бластоцист. Это проявлялось, во-первых, в неуклонном уменьшении числа бактерий, чувствительных к проявлениям антагонизма, во-вторых, стимулированием усиления вирулентности бактерий, приводящей к деструкции простейших.

При ассоциативных взаимоотношениях лактозонегативных эшерихий с высоко-, умеренно- и авирулентными бластоцистами все популяции продолжали существовать, сохраняя определенные количественные соотношения на протяжении всего опыта (21 сутки). Периоды увеличения численности эшерихий одновременно сопровождались снижением плотности популяции B.hominis и наоборот. Это позволяет предположить, что при антагонистических взаимодействиях внутри микросимбиоценоза активизировались механизмы взаимоадаптации. Появление более вирулентных и устойчивых клонов бактерий стимулировало формирование и более вирулентных простейших.

При анализе динамики авирулентных E.coli с высоко-, умеренно- и авирулентными B.hominis, можно сделать вывод о том, что отсутствие вирулентности приводит к быстрому уничтожению не устойчивых к антагонистической активности эшерихий в ассоциациях с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами - на 6-е и 15-е сутки соответственно. При сокультивировании авирулентных простейших бластоцист и E.coli с нормальной ферментативной активностью отмечен обоюдосдерживающий рост обеих культур до конца эксперимента (21-е сутки) - с доминированием популяции эшерихий (2,7х10³±2,7 против 1,8х10²±0,8 КОЕ/мл).

Способность многих патогенных и условно-патогенных бактерий сохранять свою жизнеспособность внутри свободноживущих простейших доказана многими авторами (Литвин, 2003; Пушкарева, Величко, Каминская, 2005; Пушкарева, 2006). Конкретные экологические факторы и механизмы устойчивого сохранения обитателей кишечного биотопа, обладающих потенциальной патогенностью в условиях, когда их активная жизнедеятельность и размножение затруднены или невозможны, практически не изучены.

С целью создания условий, неблагоприятных для существования кишечных палочек адекватных антибактериальной терапии, во все пробирки с протозойно-бактериальными ассоциациями и монокультурами добавляли антибактериальные препараты ампициллин, стрептомицин, гентамицин и цефазолин в концентрациях 60,6; 47,3; 39,2 и 10,4 мкг/мл соответственно. Через 18 часов воздействия антибиотиков на посевы культур, кишечные палочки бактериологически не выявлялись (в контрольных посевах вегетативных форм также не было обнаружено). Количество бластоцист при этом существенно не менялось.

При переносе образцов с цистами из контрольных и опытных пробирок, на модифицированную среду Suresh (приоритетная справка №№2008114890 от 5.10.2008) уже через 6 часов был зарегистрирован рост как вирулентных, так и авирулентных бактерий E.coli в количестве от 0,5х10²±0,9 до 0,9х10²±1,3 КОЕ/см² и вегетативных форм простейших на уровне 0,1х10²±0,4 - 1,3х10²±2,5 КОЕ/см² .

Исследование материала из контрольных посевов не выявило роста бактерий кишечной палочки ни в одном случае. Полученные результаты демонстрируют взаимодействие не только вирулентных, но и авирулентных E.coli с цистами простейших B.hominis, способствующее длительному выживанию бактерий при действии стрессорных факторов, а именно антибактериальных препаратов. Данные результаты могут способствовать пониманию процессов передачи инфекций, а также развития рецидивных состояний патологий микробного генеза после проведения активной химиотерапии.

Усиление вирулентности среди гетерогенных популяций потенциально патогенных энтеробактерий в настоящее время является важным объектом исследований различных отраслей биологической и медицинской наук. Наиболее существенными для изменения патогенности условно-патогенных энтеробактерий, ввиду «скачкообразного» характера и кардинальности происходящих превращений микроорганизма, рассматривают генетические рекомбинации, которые определяют геномную пластичность микробов, реализуемую через несколько конкретных механизмов связанных, в частности с «островами» и «островками» патогенности (Brunder, Karch, 2000).

Используя набор праймеров, амплифицирующих фрагменты генов рaрС, рарН, sfаА, sfaG, fimА, stx1, stx2, eaeA, cnf-1 и hlyB и ehx было протестировано 417 фенотипически различных штаммов E.coli, выделенных при ассоциативных симбиотических взаимодействиях с B.hominis различной степени вирулентности, а также после их совместного культивирования и 134 штамма эшерихий выделенных из консорциумов, где бластоцисты не являлись участниками микробного сообщества.

Тестирование микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с авирулентными бластоцистами, показали, что чаще всего, независимо от периода исследования и изучаемой фенотипической группы бактерий, искомые ампликоны выявлялись при использовании праймеров к рaрС, рарН и sfаА генам. Частота встречаемости данных апмликонов у авирулентных кишечных палочек составила 33,3, 12,1 и 12,1 % соответственно (в монокультурах и до сокультивирования данные показатели составили - 6,1, 0, 0 % и 12,1, 6,1, 6,1 % соответственно, р<0,05). В данной фенотипической группе не были выявлены ампликоны, специфичные sfaG и fimA генам.

В группе лактозонегативных эшерихий частота встречаемости генетических детерминант фимбрий P и S типа была выше по сравнению с нормальными эшерихиями. Так, фрагменты рaрС, рарН и sfаА генов после 24 часов совместного культивирования тестировались с частотой 25,0, 16,7, 16,7 % соответственно. Кроме того положительные результаты были получены с парами праймеров, амплифицирующих фрагменты генов sfaG и fimА с частотой 2,8 и 8,3 % соответственно. По истечению 21-х суток образование искомых ампликонов специфичных рaрС гену составило 38,9 %, рарН - 30,5 %, sfаА - 30,5 %, sfaG - 8,3 %, fimА - 13,9 %, что соответствовало появлению более вирулентных клонов и увеличению численности неферментирующих бактерий. До сокультивирования распространенность изучаемых нуклеотидных последовательностей была следующей: рaрС - 13,9 %, рарН - 5,6 %, sfаА - 5,6 %, sfaG - 0 %, fimА - 8,3 % (в монокультурах 5,6, 0, 0, 0, 0 соответственно, р?0,001).

Далее была изучена частота встречаемости нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих синтез фимбрий P, S и 1 типа у микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с умеренновирулентными бластоцистами. В общем пуле исследуемых штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью, отмечено увеличение частоты образования искомых ампликонов, специфичных изучаемым генам - через 24 часа совместного культивирования, что соответствовало увеличению численности популяции бактерий, вследствие усиления их защитных механизмов от антагонистической активности бластоцист. В группах лактозонегативных и гемолитических E.coli также выявлено увеличение частоты встречаемости генетических детерминант фимбрий P, S и 1 типа, по сравнению с исследованиями штаммов до сокультивирования и в монокультурах, на 15-е и 21-е сутки соответственно (р?0,001), как усиление механизмов защиты.

Далее была проведена оценка частоты образования искомых ампликонов у микросимбионтов E.coli, выделенных из ассоциации с высоковирулентными бластоцистами. Результаты тестирования штаммов эшерихий с нормальной ферментативной активностью показали достоверно более широкую распространенность нуклеотидных последовательностей генов рaрС, рарН, sfаА, sfaG, fimА через 24-е часа проведения эксперимента по сравнению данными, полученными до сокультивирования и в монокультурах (р?0,001).

Исследование неферментирующих штаммов кишечных палочек, показало, что достоверно чаще других после сокультивирования тестировались генетические детерминанты, обеспечивающие синтез фимбрий P и S типа (рaрС - 78,3, рарН - 42,0, sfаА - 42,0 % , р?0,001). До совместного культивирования и в монокультурах показатели встречаемости всех пар праймеров были значительно ниже. Идентичная тенденция изменений распространенности изучаемых генетических детерминант отмечена и в популяции гемолитических эшерихий. Следует отметить, что показатели изменений были значительно выраженнее.

В общем пуле контрольных штаммов положительные сигналы были получены только с фрагментами гена рaрС - у 9 культур (6,9 %).

Проведенные тестирования показали, что после сокультивирования бактерий с вирулентными бластоцистами чаще всего искомые ампликоны выявлялись с использованием праймеров к рaрС, рарН и sfаА генам. С наименьшей частотой обнаруживались фрагменты sfaG и fimA генов. Следует также отметить, что возрастание количества положительных сигналов со всеми изучаемыми фрагментами генов совпадало с периодами увеличения плотности популяций всех фенотипических групп бактерий E.coli и появлением в среде разрушенных клеток B.hominis.

Из 417 протестированных штаммов с праймерами к eaeA гену, положительный сигнал был получен только с 82 культурами, что составляет 19,7 % (табл. 3).

Таблица 3. Частота встречаемости нуклеотидных последовательностей eaeA гена в различных фенотипических группах бактерий кишечной палочки

Примечание: * - Р<0,05; ** - Р?0,001.

Распространенность нуклеотидной последовательности eaeA гена в различных фенотипических группах бактерий кишечной палочки, как правило, возрастала после совместного культивирования с B.hominis в те же сроки, что и при обнаружении генетических детерминант фимбрий P, S и 1 типа.

Отмечен так же статистически достоверный рост встречаемости искомого ампликона при увеличении вирулентности микросимбионтов бластоцист (р?0,001). В общем пуле контрольных штаммов положительные сигналы были получены у 2 культур (1,5 %).

Не вызывает сомнения, что в патогенезе любого заболевания одна из важных ролей принадлежит факторам патогенности, оказывающим прямое и косвенное токсическое воздействие. Это связано с высокой биологической активностью токсинов и их способностью вызывать функциональные и структурные повреждения клетки-хозяина. В связи с этим была поставлена задача - изучить распространенность нуклеотидных последовательностей генов токсинообразования: цитотоксического некротизирующего фактора 1 типа (cnf-1), энтерогемолизина (ehx), б-гемолизина (hlyB), шигаподобных токсинов 1 и 2 типов (stx1 и stx2).

Используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности cnf1 гена, были получены ампликоны размером 406 пн. В исследуемых группах отмечена зависимость роста числа положительных сигналов с праймерами, специфичными к cnf1 гену от вирулентности ассоциантов B.hominis (r=0,87), как до сокультивирования, так и после (р?0,001). По нашему мнению, это свидетельствует о резкой мобилизации защитных механизмов, проявляющихся в увеличении числа особей, содержащих в своем генотипе фрагменты cnf1 гена и его фенотипической экспрессии.

С целью подтверждения полученных результатов мы также изучили распространенность нуклеотидных последовательностей гена, детерминирующего выработку энтерогемолизина (ehx). Наши исследования выявили, что частота встречаемости фрагментов ehx гена во всех изучаемых фенотипических группах возрастала после совместного культивирования бактерий E.coli с простейшими B.hominis, однако распространенность нуклеотидных последовательностей была в целом ниже, по сравнению с таковой cnf1 гена. Так, среди неферментирующих кишечных палочек в консорциуме с авирулентными бластоцистами данный показатель увеличился в 2 раза; нормальных, неферментирующих и гемолитических эшерихий в ассоциации с умеренновирулентными бластоцистами - в 1,3, 1,4, 1,5, раза соответственно; нормальных, неферментирующих и гемолитических эшерихий в ассоциации с высоковирулентными бластоцистами - в 1,2, 1,4, 1,6 раза соответственно. В группе контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 %.

Далее используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности hlyB гена, контролирующего синтез б-гемолизина, были получены ампликоны размером 542 пн, при тестировании штаммов эшерихий различных фенотипических групп. Показано, что максимальные значения встречаемости фрагментов данного гена выявлены в группах гемолитических эшерихий в ассоциации с умеренно- и высоковирулентными простейшими бластоцистами, как до так и после совместного культивирования. Значения распространенности специфичных данному гену ампликонов составили 33,3 и 34,6 % - до сокультивирования и 44,4 и 52,3 % - после. Среди штаммов других фенотипических групп E.coli не выявлено изменений данного показателя (в контроле - 1,5 %).

Используя праймеры, амплифицирующие нуклеотидные последовательности stx1 гена, были получены ампликоны, частота встречаемости которых варьировала в различных фенотипических группах эшерихий. В группе бактерий с нормальной ферментативной активностью и лактозонегативных в ассоциации с авирулентными простейшими B.hominis распределение фрагментов изучаемого гена оказалось равно 0 % как до, так и после совместной инкубации. В общем пуле эшерихий с нормальной ферментативной активностью при взаимодействии с высоко- и умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение встречаемости фрагмента stx1 гена с 6,9 до 10,3 % и с 3,2 до 9,4 % соответственно, (р<0,05). Среди неферментирующих E.coli в консорциуме с умеренновирулентными бластоцистами отмечено статистически достоверное увеличение частоты обнаружения нуклеотидных последовательностей stx1 гена после сокультивирования с 4,6 % до 11,6 % соответственно (р<0,05). В группе неферментирующих эшерихий в консорциуме с высоковирулентными бластоцистами отмечен также статистически достоверный рост частоты обнаружения искомых ампликонов после сокультивирования с 7,2 % до 13,0 % соответственно (р?0,001). Среди гемолитических штаммов кишечных палочек в консорциуме с умеренно- и высоковирулентными B.hominis увеличение данного показателя не имело достоверного характера, (р>0,05). В общем пуле контрольных штаммов данный показатель не превышал 0,7 % (1 культура).