Репарация миокарда крыс в онтогенезе

Изучение репарации миокарда крыс после повреждения, нанесенного в пренатальном онтогенезе. Оценка пролиферации кардиомиоцитов левого желудочка после повреждения. Исследование происхождения клеток Аничкова и их участия в репарации миокарда крыс.

Рубрика Биология и естествознание
Вид автореферат
Язык русский
Дата добавления 24.12.2017
Размер файла 463,0 K

Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже

Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.

Размещено на http://www.allbest.ru/

РЕПАРАЦИЯ МИОКАРДА КРЫС В ОНТОГЕНЕЗЕ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

БОЛЬШАКОВА Галина Борисовна

Москва 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте морфологии человека РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Бабаева Анна Георгиевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук Болтовская Марина Николаевна

доктор медицинских наук, профессор Буравков Сергей Валентинович

доктор медицинских наук, профессор Черняев Андрей Львович

Ведущее учреждение: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «___» ________________2009 года в ____часов на заседании диссертационного совета (Д 001.004.01) Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН по адресу: 117418 Москва, ул.Цюрупы, д.3

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института морфологии человека РАМН

Автореферат разослан «____»________________ 2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета Л.П.Михайлова

доктор медицинских наук

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Развитие и регенерация миокарда представляют интерес для представителей различных специальностей, включая цитологов, гистологов, анатомов, физиологов, молекулярных биологов, поскольку изучение процессов пролиферации и гибели клеток сердца, дистрофических и фиброзных изменений миокарда актуально для решения проблем восстановительных процессов в медицине и биологии (Epstein J.A, Buck C.A.; Rothenberg B.M., Korn A., 2005), в том числе и в быстро развивающейся фетальной кардиохирургии (Huhta J. et al., 2004; Pavlovic M. et al., 2008).

Восстановление органов в пренатальном периоде сравнительно мало изучено. Между тем изучение механизмов, обеспечивающих полноценное заживление ран, поможет подойти к решению проблемы безрубцового заживления в клинике и обосновать патогенетическое лечение фиброзно-пролиферативных процессов, в частности при сердечно-сосудистых заболеваниях, являющихся ведущей причиной заболеваемости и смертности (Colwell et al., 2003; Wynn T., 2007).

Несмотря на то, что регенерация миокарда изучается уже более ста лет, до настоящего времени нет данных, дающих полное представление о соотношении в регенерационном процессе пролиферации кардиомиоцитов и замещении очага повреждения рубцовой тканью. Динамика и исход репаративных процессов в миокарде обусловлены изменениями соотношений основных компонентов очага некроза: собственно некротизированной ткани, воспалительного инфильтрата, рубцующейся ткани и новообразованных кардиомиоцитов. Мышечный и соединительнотканный компоненты миокарда в зависимости от возраста животного вносят разный вклад в его репарацию. Так, при повреждении сердца 1--30-суточных крыс было установлено, что чем старше животное, тем меньше митотическая активность кардиомиоцитов вблизи области повреждения и интенсивнее реакция соединительной ткани -- инфильтрация, образование рубца. У взрослых млекопитающих повреждение заживает рубцом, новообразование мышечной ткани практически отсутствует (Большакова Г.Б., 1980). Таким образом, возможность вызвать активную пролиферацию кардиомиоцитов выше в пренатальном периоде, когда они еще не утратили способности к пролиферации, и их пролиферативный пул еще велик: в компактном миокарде желудочков 15-дневного плода крысы он составляет 70--80% (Румянцев П.П., 1982).

Сведения о репарации миокарда плодов млекопитающих немногочисленны. И. И. Малышев (1986) свидетельствовал о возможности заполнения дефекта миокарда 20--24-суточных плодов кроликов новообразованной мышечной тканью. Данные о существовании очагов некроза и/или рубцевания миокарда у плодов и недоношенных детей (Валькович Э.И. и др., 1986; Kamath M.V. et al., 1986), частота возникновения которых достигает 43% среди мертворожденных недоношенных и умерших в течение первого месяца жизни детей (De Sa D.J., 1979) и 25% у недоношенных детей, страдающих от эпизодов гипоксии (Kamath M.V. et al., 1986), вынуждают к осторожности в суждении о регенерационной способности миокарда. Сердца поздних плодов крыс в органной культуре также не были способны к полноценному заживлению (Blewett C.J. et al., 1997). В целом можно утверждать, что полные доказательные данные о регенерационной способности миокарда в эмбриональном периоде отсутствуют.

Для более обоснованных суждений о репаративной способности миокарда и понимания динамических взаимодействий клеток сердца необходимо использование воспроизводимой экспериментальной модели с соблюдением стандартных условий повреждения и с объективной количественной оценкой изменений. Высокие технологии и последние достижения компьютерной техники дают возможность дать репрезентативную, статистически обоснованную характеристику морфологических процессов, сопровождающих повреждение и последующую регенерацию.

Цель исследования - охарактеризовать морфогенез восстановления миокарда, поврежденного в пренатальном онтогенезе, и оценить вклад в репарацию его мышечного и соединительнотканного компонентов.

Задачи: репарация миокард крыса повреждение

1. Изучить репарацию миокарда крыс после повреждения, нанесенного в пренатальном онтогенезе.

2. Разработать воспроизводимую модель повреждения сердца в фетальном периоде и методические основы исследования регенерационных процессов миокарда.

3. Провести исследование основных морфологических компонентов области повреждения и выявить особенности их взаимосвязей, определяющие исход репарации на разных этапах онтогенеза.

4. Дать характеристику немышечных клеток сердца в пренатальном периоде на модели травматического повреждения миокарда.

5. Оценить пролиферацию кардиомиоцитов левого желудочка после повреждения (травма сердца у плодов и взрослых крыс).

6. Исследовать происхождение клеток Аничкова и их участие в репарации миокарда.

7. Оценить степень зрелости миокардиального рубца после фетальной травмы.

Научная новизна

Разработана оригинальная воспроизводимая модель механической травмы левого желудочка сердца, наносимой в пренатальном онтогенезе, при которой область повреждения локализуется в верхней трети левого желудочка и занимает около 20% объема миокарда.

На основе количественного морфологического исследования миокарда крыс, поврежденного в различные сроки пренатального онтогенеза, впервые показано, что у плодов способность к восстановлению миокарда ниже, чем у взрослых животных.

Оценка динамики изменений основных компонентов области повреждения в фетальном миокарде показала, что ее характерной особенностью является длительное сохранение некротизированной ткани и расширение области повреждения за счет пересокращенных кардиомиоцитов перинекротической области.

С помощью электронно-микроскопического и иммуногистохимического методов впервые описана динамика изменений немышечных клеток сердца плода крыс в норме и после повреждения. На протяжении нормального пренатального онтогенеза немышечные клетки представлены в основном эндотелиоцитами. После травмы, нанесенной плодам крыс, воспалительная реакция слабо выражена и представлена малодифференцированными клетками. Вплоть до 10 суток после операции происходит увеличение доли фибробластов. Макрофагальная инфильтрация, усиливающаяся на 5-е сутки после операции и идущая на убыль к 10-м суткам, вновь возрастает на 30-е сутки.

Исследование пролиферации кардиомиоцитов левого желудочка сердца плодов показало, что возрастание индекса патологических митозов (метафаз и анафаз) и увеличение процентной доли метафаз соответствует прогрессирующему снижению пролиферативной способности кардиомиоцитов. Травма миокарда, нанесенная в фетальный период, стимулирует митотическую активность только желудочковых кардиомиоцитов, отдаленных от места повреждения, и только на десятые сутки после ее нанесения. Судя по снижению индекса патологических митозов и уменьшению доли метафаз в этой группе, стимуляция является истинной. Тем не менее пролиферация кардиомиоцитов не вносит существенного вклада в репарацию миокарда плодов.

С помощью методов авторадиографии установлено, что конфигурацию хроматина, характерную для клеток Аничкова, через 20 часов после митоза могут приобретать ядра различных типов клеток, независимо от их тканевой принадлежности и участия в процессах репарации.

Выявлено, что эндотелиоциты сердца плода принимают участие в элиминации поврежденной ткани, отграничивая погибшие клетки.

Соединительная ткань рубца после фетальной травмы состоит из более тонких, чем у взрослых, и менее упорядоченно расположенных коллагеновых волокон, что свидетельствует о его меньшей зрелости.

Научно-практическая значимость

Результаты проведенного исследования теоретически обосновывают возможность разработки новых методов стимуляции кардиомиоцитов, а также модуляции развития соединительной ткани и фиброзирования в миокарде в норме и при патологии.

Данные о возрастных закономерностях репарации миокарда следует учитывать при обосновании хирургических операций на сердце в том или ином возрасте.

Экспериментальный материал, полученный при проведении данного исследования, может быть использован в процессе преподавания в вузах медицинского и биологического профиля по специальностям гистология, эмбриология, анатомия и патологическая анатомия.

Оригинальная модель повреждения сердца в пренатальном возрасте может быть использована в научно-исследовательских разработках.

Основные положения, выносимые на защиту

Способность сердца плода крыс к репарации слабее, чем у взрослых особей.

Для заживления повреждения, нанесенного в пренатальном периоде, характерно длительное персистирование некротических масс и расширение области повреждения за счет перинекротических пересокращенных кардиомиоцитов.

Немышечные клетки сердца плода крыс представлены в основном эндотелиоцитами. Воспалительный инфильтрат миокарда в пренатальном онтогенезе состоит из малодифференцированных клеток, не способных к полному удалению некротизированной ткани и развитию полноценной воспалительной реакции.

После травмы миокарда, нанесенной в пренатальном периоде, митотическая активность кардиомиоцитов левого желудочка превышает контрольные показатели только на десятые сутки после ее нанесения вдали от места повреждения.

Высокая пролиферативная способность фетальных кардиомиоцитов не способна обеспечить полноценное восстановление миокарда, поврежденного в пренатальном периоде.

Характерная для клеток Аничкова конфигурация хроматина появляется в ядрах клеток различной тканевой принадлежности через 20 часов после митоза.

После повреждения фетального миокарда рубец, в отличие от рубца взрослых животных, представлен более тонкими и менее упорядоченными коллагеновыми волокнами, характеризующими незрелость новообразованной соединительной ткани.

Внедрение

Результаты исследования по репарации фетального миокарда используются при чтении лекций и проведении практических занятий на кафедре клеточной биологии и гистологии биологического факультета Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова и кафедре гистологии, цитологии и эмбриологии Московского государственного медико-стоматологического университета.

Степень личного вклада автора в результаты исследования

Автор непосредственно участвовал в проведении всех экспериментальных исследований, самостоятельно проводил сбор, обработку и анализ полученного экспериментального материала, самостоятельно сформулировал основные положения диссертации.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы доложены и обсуждены на конференции «Актуальные вопросы современной гистопатологии» (г. Москва, 1980), на III Всесоюзной конференции по патологии клетки (г. Москва, 1982), на VII Всесоюзной конференции по регенерации и клеточному делению. (г. Москва, 1985), на конференции «Актуальные вопросы современной гистопатологии» (г. Москва, 1986), на IV зональной межвузовской конференции по регенерации органов и тканей животных и ее стимуляции (Ереван, 1986), на конференции «Актуальные вопросы современной гистопатологии» (г. Москва, 1987), на конференции «Актуальные вопросы современной гистопатологии» (г. Москва, 1988), на конференции «Ультраструктурные основы патологии органов и тканей» (г. Тбилиси, 1989), на конференции «Актуальные вопросы современной гистопатологии» (г.Москва, 1990), на конференции «Актуальные проблемы общей и частной патологии» (г. Москва, 1999), на конференциях «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии» (г. Москва, 2004, 2006, 2008), на межлабораторной конференции НИИМЧ РАМН (июнь, 2009).

Публикации
Основные положения диссертации отражены в 23 публикациях, из них - в 1 монографии и 7 статьях в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, общей характеристики материала и методов исследования, главы собственных исследований и их обсуждения, состоящей из 12 подразделов, заключения, выводов и списка литературы.
Объем диссертации составляет 312 страниц машинописного текста и включает 36 таблиц и 51 рисунок. Список литературы включает 309 источников, из которых 105 отечественных и 204 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Всего в работе были использованы 341 плод белых нелинейных крыс в возрасте 16, 17, 18, 19 и 21 суток внутриутробного развития, 54 новорожденных животных, 47 крысят в возрасте 5-8 суток и 52 взрослых самца. Плоды получали у самок с датированной беременностью.

Методы исследования

Методика повреждения миокарда и ее воспроизводимость были предварительно отработаны на 200 плодах и новорожденных животных. Оперирование и вывод животных из эксперимента осуществляли под эфирным наркозом. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977 г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ГУ НИИ морфологии человека РАМН (протокол № 4 от 12.03.2007).

Для получения стандартного повреждения миокарда плодов крысе вскрывали брюшную полость. Не разрезая матку, делали прокол сердца хирургической прямой иглой диаметром 0,7 мм и разрывали миокард. Новорожденным животным также наносили травму миокарда иглой большего размера, не повреждая грудную клетку. Группы сравнения составили интактные одновозрастные и взрослые животные. Взрослым крысам массой 300--350 г вскрывали грудную клетку и несколько раз надрезали сердце скальпелем, предварительно отработав методику повреждения так, чтобы получить травму такого относительного объема, как и в первой группе (около 20%).

Животных усыпляли эфиром на 1,2, 3, 4, 5, 7, 10, 30-е сутки после операции. Далее проводили обычную гистологическую обработку сердца. Продольные срезы сердца делали на 12 -- 15 уровнях. При резке блок располагали так, чтобы на срез попадало все сердце в продольном сечении, т.е. хорошо были видны оба предсердия с ушками и оба желудочка. Парафиновые срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином с докраской эозином и пикрофуксином, по Маллори, железным гематоксилином по Гейденгайну, молибденовым гематоксилином Гельда с докраской пикрофуксином. Для дифференцирования мышечных и соединительнотканных клеток ставили ШИК-реакцию с предварительной обработкой срезов амилазой.

С целью объективизации оценки размеров повреждения, а также состава области повреждения проводили морфометрический анализ (Автандилов Г.Г. и др., 1981). Препарат исследовали с помощью окулярной квадратной тест-решетки с 289 точками при суммарном увеличении 27,75Х. На 10 срезах каждого сердца просчитывали число узлов решетки, попавших в область повреждения и на весь срез, затем высчитывали суммарную и средние площади области повреждения, некротизированной и рубцовой ткани в квадратных миллиметрах, а также относительный объем области повреждения. Область повреждения исследовали методом «полей» с помощью сетки из 4 узлов, свободно передвигаемой по всей области на нескольких срезах (100 тест-точек на сердце) при общем увеличении светового микроскопа 1350X. Выделяли основные элементы учета, отражающие морфологические изменения в посттравматический период: некротизированная ткань, клетки, мигрирующие в область повреждения, просвет кровеносных сосудов, коллагеновые волокна (окрашенные пикросириусом или пикрофуксином в ярко-красный цвет), кардиомиоциты вокруг очага повреждения. Затем определяли объемную плотность каждого из элементов.

Для проведения электронно-микроскопического исследования брали кусочки поврежденной ткани объемом 1 мм3 из верхней трети левого желудочка на 3, 5, 10, 30-е сутки после травмы сердца плодов, а также миокард из той же области у интактных 21-суточных плодов, 5-суточных крысят и 25-суточных крыс (2--3 животных на срок). Кусочки фиксировали 1--2 ч в 2,5%-ном глутаровом альдегиде, затем дофиксировали в 1%-ном OsO4, дегидратировали и заливали в эпон-аралдитную смесь. Срезы получали на ультратоме LKB, окрашивали по Рейнольдсу и просматривали под электронным микроскопом JEM-100 В. Клеточный состав области повреждения определяли на электронограммах неповторяющихся срезов при конечном увеличении 6000X. Во избежание ошибок, связанных с подсчетом фрагментов клеток, учитывали только срезы, содержащие ядро. Результаты выражали в процентах.

Для иммуногистохимического исследования были ичпользованы сердца плодов крыс, оперированных в возрасте 16 суток, на сроках 2 и 5 суток после операции (по 2 сердца); у взрослых животных - через 2 и 5 суток после операции (по 2 сердца); у интактного 21-суточного плода (2 сердца).

Материал фиксировали в 10% забуференном формалине, заливали в парафин, готовили серийные срезы толщиной 4 мкм на предметных стеклах Menzel-Glaser® Polysine™, которые затем депарафинировали по стандартной схеме. Исследование проводили непрямым иммунопероксидазным методом. Использовали следующие первичные антитела (Abcam): для идентификации макрофагов - CD-68 (крысиные, клон ED-1, разведение 1:100); для оценки пролиферативного пула - Ki-67 (кроличьи, разведение 1:100); для определения эндотелиоцитов - CD-31 (крысиные, клон SC-1506, разведение 1:50). С целью демаскирования антигенов стекла со срезами нагревали в течение 30 минут на водяной бане в 0,01 М в цитратном буфере (рН 6,0). Активность эндогенной пероксидазы блокировали 3% раствором перекиси водорода, неспецифическую адсорбцию первичных антител - 30-минутной инкубацией с нормальной телячьей сывороткой. Инкубацию с первичными антителами проводили при комнатной температуре в течение 40мин. После каждый процедуры срезы промывали в Трис-HCl буфере - 0,05 М (рН 7,6). Для визуализации реакции использовали систему детекции UltraVision TL-015-HD (LabVision), срезы докрашивали гематоксилином Караччи. Контроль иммуноокрашивания осуществляли исключением вторичных антител.

Митотическую активность кардиомиоцитов оценивали, подсчитывали митозы в компактном миокарде левого желудочка: в кардиомиоцитах вокруг области повреждения и в отдалении от нее (у контроля в интактном миокарде), причем учитывали фазу митоза. Отдельно подсчитывали патологические метафазы и анафазы - рассеивание хромосом, их склеивание, трехгрупповая и полая метафазы, отставание хромосом в метакинезе, хромосомные и хроматидные мосты, асимметричные митозы (Алов И.А., 1972).

Для характеристики пролиферации в каждой группе определяли следующие параметры: митотический индекс (МИ), выраженный в промилле (‰), соотношение между фазами митоза, а также процентное отношение патологических метафаз к общему количеству метафаз.

Клеточную кинетику миокарда и, в частности, клеток Аничкова изучали с помощью методов авторадиографии (Епифанова О.И., 1969; Епифанова О.И. и соавт., 1977). 44 крысятам в возрасте 7-8 сут внутрибрюшинно вводили 3Н-тимидин удельной активности 1,3 Ки/ммолъ 1530 ТБк/моль в дозе 0,5 мкКи на 1г массы и через 2, 4, 6, 9, 12, 18, 24, 30, 36, 42, 48 часов животных декапитировали. Сердца подвергали обычной гистологической обработке. Депарафинированные срезы толщиной 5-7 мкм покрывали эмульсией типа "М", после 6-недельной экспозиции проявляли амидоловым проявителем и окрашивали гематоксилином. Так как, согласно данным литературы (Kunz J., 1979), параметры митотических циклов кардиомиоцитов и клеток соединительной ткани одинаковы, при подсчетах клетки не разделяли на мышечные и соединительнотканные. Подсчитывали зерна серебра над мечеными ядрами клеток Аничкова, а также над ядрами клеток, делящихся впервые после введения тимидина (спустя 9 ч после инъекции), учитывая отдельно стадии митоза до кариокинеза и после него (профаза-метафаза и анафаза-телофаза). На каждом сроке исследования определяли количество меченых митозов и количество меченых клеток Аничкова в процентах на 100--200 клеток. Ввиду самоабсорбции излучения препаратом подсчеты проводили в верхнем слое среза.

Количество ДНК в ядрах клеток Аничкова определяли цитофотометрически на диссоциированных клетках (Коган М.Е. и др., 1976), окрашенных по Фельгену. Измерение оптической плотности ядер проводили на сканирующем микроспектрофотометре 5ЕМ-3 фирмы «Opton» (ФРГ). Диплоидным контролем служили лимфоциты на мазках крови тех же животных.

Динамику изменения содержания коллагена исследовали в миокарде 16-суточных плодов и взрослых через 7, 8, 10, 16, 30 и 40 суток после операции на срезах толщиной 4 мкм, окрашенных пикросириусом красным, позволяющим наиболее точно визуализировать коллаген, поскольку в поляризованном свете цвет коллагеновых волокон зависит от толщины фибрилл, а именно: фибриллы более высокой морфологической зрелости выявляются в спектре от оранжевого до светло- красного, а более тонкие фибриллы- зеленые (Junqueira L. C. U.et al., 1987).

На случайно выбранных срезах в области рубца делали 10 цифровых снимков при объективе х40 в поляризованном свете, используя камеру AxioCam HRc микроскопа Axioplan 2 (Carl Zeiss, Германия), и обрабатывали их с помощью пакета «Анализ» программы Adobe Photoshop CS3 Extended (Adobe Systems, Inc.). Инструментом «Волшебная палочка» выделяли окрашенные в красный или зеленый цвет коллагеновые волокна и определяли количество размер выделенной площади в условных единицах (пикселях). Долю коллагеновых волокон вычисляли как отношение площади коллагена к их общей площади поля зрения и представляли в процентном отношении.

Для исследования ориентации фибрилл были выбраны группы 16-суточных плодов и взрослых крыс на 7, 10 и 30 сутки после механической травмы сердца Исследовали срезы от 5 сердец в каждой группе, окрашенные пикросириусом красным. Чтобы измерить ориентацию пучка волокон, измеряли угол ориентации пучка коллагеновых волокон по отношению к оси раневого канала. На каждую группу делали 170 измерений. Данные по ориентации наносили на круговую гистограмму и анализировали, используя статистику угловых измерений (Мардиа К., 1978). С помощью программы StatistiXL version 1.8. определяли круговое среднее направление, круговую дисперсию, круговое стандартное отклонение, средний результирующий вектор (длина результирующего вектора / количество наблюдений).

В группах определяли среднее арифметическое и стандартное отклонение по формуле для долей. Границы 95%-ных доверительных интервалов для долей рассчитывали с помощью -критерия (Урбах В.Ю., 1975; Юнкеров В.И., Григорьев С.Г., 2002). Сравнение двух выборочных долей проводили с помощью z-критерия, который является более мощным, чем критерий хи-квадрат и точный критерий Фишера (Williams J.L. et al.,1997).

Поскольку в большинстве групп признаки не имели нормального распределения, при сравнении средних групповых количественных признаков параметрических и непараметрических данных применяли соответственно критерий Стьюдента и критерий Манна-Уитни. Сравнение средних значений количественных признаков в нескольких группах проводили с помощью критерия Стьюдента с поправкой Бонферрони и критерия Данна. Оценка интенсивности корреляционной связи проводилась с помощью коэффициента корреляции Спирмена.

С целью визуализации корреляций между признаками, выявления структуры данных и нахождения как можно меньшего числа скрытых общих факторов, точно описывающих наблюдаемые связи между составляющими область повреждения миокарда использовали компонентный и факторный анализ. Выделение факторов было проведено с использованием метода главных компонент, метод вращения - Варимакс нормализованный (Калинина В.Н., Соловьев В.И., 2003). Сравнение соотношений фаз митозов проводили с помощью критерия хи-квадрат. Данные были проанализированы с помощью программ Statistica 6.0 (StatSoft, Inc.), Microsoft® Excel 2003 и Sigma Stat 3.5 (Systat Software, Inc.). При статистическом анализе результатов был выбран 5%-ный уровень значимости.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ОБСУЖДЕНИЕ

Доказательства воспроизводимости

Для данной экспериментальной модели необходимо было доказать воспроизводимость как метода повреждения миокарда, так и определения: 1) размера повреждения, 2) состава очага повреждения, 3) результатов измерений.

Через сутки после травмы относительный объем повреждения составил у 16-суточных плодов 21,5±4,8% (среднее ± стандартное отклонение), у взрослых животных -- 18,6±2,1%. Различия оказались недостоверными (p = 0,410). Относительный объем некротизированной ткани по отношению к всему сердцу у плодов на этом сроке (11,7±2,3%) также не различался в обеих группах (11,3±3,1% у взрослых) при p = 0,792. Полученные данные указывают на стандартизованный метод травмирования миокарда и хорошую воспроизводимость определения размера повреждения.

Воспроизводимость определения состава очага повреждения в пределах одной группы выявляли, разбив группу «оперированные 16-суточные плоды через 5 сут после травмы» (n = 8) на две подгруппы и сравнивая относительный объем различных элементов области повреждения с помощью критерия 2. Полученная величина 2 = 7,18 при p = 0,127 свидетельствует о постоянстве состава области повреждения при данном способе травмирования и его определения.

Для оценки воспроизводимости результатов измерений препараты группы «плоды через 7 сут после травмы» (n = 7) просчитывали дважды и проводили попарное сравнение результатов с помощью критерия 2. Различия были недостоверными (2 = 2,07 при p = 0,724).

Таким образом, разработанная модель травмы миокарда обеспечивает получение воспроизводимых результатов, позволяющих судить об изменении площади и относительного объема области повреждения и составляющих ее элементов в процессе репарации и сравнивать ход заживления в сердце плодов и взрослых животных.

Сравнительные морфологические особенности области повреждения у плодов и взрослых на разных сроках после травмы

У взрослых животных происходит типичная репарация повреждения миокарда, при которой сменяются фазы альтерации, реактивного воспаления и рубцевания ткани. В обширном очаге коагуляционного некроза на 2-е сутки появляются полинуклеары, которые из-за нарушения кровообращения образуют лейкоцитарный вал.

В краевой зоне повреждения уже на вторые сутки после повреждения появляются очаги патологической контракции (коагуляционный миоцитолиз). Макрофаги уничтожают поврежденную ткань, остающиеся сарколеммные футляры образуют «альвеолярную» структуру. Инфильтрат представлен мононуклеарами типа лимфоцитов. Такого рода картина типична для коагуляционного миоцитолизиса (Turillazzi E. et al., 2005; Yi S.H. et al., 2008).

На 4-е сутки в области повреждения появляются макрофаги с желто-бурой зернистостью, быстро уничтожающие некротические массы. Резорбция макрофагами некротизированной ткани заканчивалась в течение недели. Мышечные волокна, претерпевшие некроз, уже на 4-5 сутки замещаются соединительной тканью. На 4-е сутки появляются волокна коллагена, к 7 сутками образуется плотный рубец.

В поврежденном миокарде плодов вплоть до рождения обнаруживали обширные поля гибели клеток.

На 3-е и 5-е сутки после травмы гибнущие кардиомиоциты образовывали значительные скопления, что свидетельствует о замедленном или нарушенном фагоцитозе. В эту область мигрировали фибробласты, синтезирующие коллаген. На ранних сроках после операции (3-5 суток) нами были замечены маргинация хроматина кардиомиоцитов, лизис миофибрилл, вакуолизация эндоплазматического ретикулума, разрушение крист митохондрий, образование аутофагосом, сегментарные контрактуры.

Мы наблюдали коагуляционный некроз лишь с 5 суток после операции. Для него характерны разрывы мембран кардиомиоцитов, контрактуры миофибрилл, аморфный осадок в митохондриях. С 5 суток на периферии повреждения можно также наблюдать кардиомиоциты со множественными вакуолями, являющимися характерными признаками миоцитолизиса

В сердце плода крайне слабо выражена воспалительная реакция, что, несомненно, связано с замедленной резорбцией некротических масс. Полностью отсутствовала лейкоцитарная и гранулоцитарная инфильтрация.

Начиная с 5-х суток после травмы в сердце наблюдали дополнительные очаги некроза и рубцевания в субэндокарде, окруженные сверхсокращенными кардиомиоцитами.

После рождения в поврежденном миокарде плодов наблюдаются те же изменения, что и у взрослых животных. На 10-е сутки в поврежденном миокарде нередко сохранен раневой канал и сформирован рыхлый рубец, окруженный кардиомиоцитами с контрактурными повреждениями, следствием которых нередко является миоцитолизис, что позволяет сделать предположение о расширении области некроза.

На 30-е сутки после травмы ни в одном сердце не наблюдали заполнения дефекта мышечной тканью. В области повреждения сохранялся раневой канал, присутствует некротизированная ткань, активно функционируют макрофаги, т.е. репаративные процессы были десинхронизированы, что, вероятно, является следствием нарушения межтканевых взаимодействий в эмбриогенезе, когда механизмы регуляции воспаления и репарации еще несовершенны.

Динамика морфометрических характеристик миокарда в разных группах

С течением времени состав области повреждения претерпевает изменения, динамика которых определяется возрастом, в котором была нанесена травма.

На 1-е сутки после травмы по объемной плотности некроза относительно области повреждения можно выделить две подгруппы, в пределах которых она достоверно не различается - 16-суточных, 17-суточных, 18-суточных и взрослых крыс (52-61 %) и 19-суточных, 21-суточных и новорожденных крыс (69-74%). Вплоть до 4-х суток у всех животных этот показатель колеблется в указанном диапазоне, за исключением кратковременного резкого снижения до 34,6 ± 2,1 % у 21-суточных крыс на 3-е постоперационные сутки.

Наиболее резкие различия наблюдали между группами взрослых крыс и 16-суточных плодов (Рис. 1). Так, на 5-е сутки у взрослых крыс объемная плотность некроза резко уменьшается до 9,75 ± 1,5 %, снижаясь к 30-м суткам до 0, у 16-суточных плодов к 10-м суткам она снижается до 41,1 ± 1,6 %, а к 30-м суткам возрастает до 67,7 ± 1,9 %. В группе новорожденных крыс этот показатель занимает промежуточное положение, колеблясь от 5 до 10 суток между 39 и 49 %.

Абсолютная площадь некротизированной ткани у 16-суточных плодов возрастает от 0,4 ± 0,1 кв.мм на 1-е сутки до 2,1 ± 0,1 кв.мм на 30-е сутки, абсолютная площадь области повреждения на 30-е сутки операции (3,1 ± 0,1 кв.мм ) достигает величины площади среза всего сердца плода через 1 сут после операции (3,82 ± 0,14 кв.мм, р=0,1).

Накопление коллагена в области повреждения начинается у взрослых животных на 4-е сутки после травмы (7,4 ± 1,2%). Его объемная плотность резко возрастает, составляя на 5-е сутки 44,8 ± 2,5%, на остальных сроках колеблясь в пределах 60-65%. У 16-суточных плодов объемная плотность коллагена постепенно нарастает от 1,5 ± 0,4% на 5-е сутки до 16,1 ± 1,5% на 30-е сутки после операции.

В группе новорожденных крыс этот показатель так же, как и предыдущий, занимает промежуточное положение, колеблясь на сроках от 5 до 10 суток между 13 и 26 %. По исследованным показателям эта группа статистически значимо отличается от групп оперированных взрослых животных и 16-суточных плодов. По-видимому, функциональное созревание систем, обеспечивающих образование полноценного рубца, происходит в постнатальном периоде (Colwell A.S. et al., 2005; Mescher A.L., Neff A.W., 2005).Относительный объем области повреждения к 4-м cyткам уменьшался до 3,0±0,3 %, а к 30-м сут до 1,0+0,1 %.

Рис. 1 Динамика изменения состава области повреждения в сердце 16-суточных плодов и взрослых крыс

В сердце 16-суточных плодов абсолютная площадь повреждения в первую неделю после травмы достоверно не изменяется (на 5-е сутки p= 0,058, на 7-е сутки p= 0,051), а затем увеличивается за счет расширения области некроза, которая составляет на 1-е сутки 0,44 ± 0,05 кв.мм, а на 30-е 2,12 ± 0,11 кв.мм, то есть увеличивается почти в пять раз. На 30-е сутки после травмы доля некротизированной ткани в сердцах плодов, травмированных на 16-сутки (67,7 ± 1,9%), статистически значимо не отличается от таковой у взрослых на 1-е сутки после травмы (61,0 ± 1,8), несмотря на существенную разницу в размерах сердец животных обеих групп, оцениваемую по площади продольных срезов (p = 0,072).

Объемная плотность клеток, мигрирующих в область повреждения, составляет во всех в период с 1 по 10 сутки от 15 до 39%, однако следует иметь в виду, что здесь мы имеем дело не только с количественными различиями, но и природой мигрирующих клеток. Так, у взрослых животных это типичный воспалительный инфильтрат, а у 16-суточных плодов - базофильные веретеновидные клетки, идентификация которых может быть выполнена методами электронной микроскопии и иммуногистохимии.

Объемная плотность сосудов достоверно не различается у 16-суточных плодов, новорожденных и взрослых и постепенно снижается примерно от 16% до 6%, кроме 4-х суток, когда в группе взрослых спад происходит раньше, чем в остальных группах.

Корреляционный анализ позволил выявить связи между составляющими области повреждения, специфические для различных возрастных групп.

У оперированных взрослых животных корреляция между абсолютной площадью некротизированной ткани и площадью области повреждения отрицательна (r = -0,62). С увеличением срока после операции в этой группе положительно коррелирует доля коллагеновых волокон (коэффициент корреляции r = 0,91) и отрицательно - доля некротизированной ткани (r = -0,84). Между долями некротизированной ткани и коллагеновых волокон коэффициент корреляции составляет -0,87. Эти данные свидетельствуют о быстром замещении поврежденной ткани рубцом.

У 16-суточных плодов, напротив, выявлена сильная положительная корреляционная связь между абсолютной площадью некротизированной ткани и площадью области повреждения (r = 0,98). Следовательно, после травмы, нанесенной 16-суточным плодам, область повреждения расширяется за счет увеличения количества некротизированной ткани. Корреляция между сроком после операции и долей коллагеновых волокон также сильная и достоверно не отличается от таковой во взрослой группе (r = 0,91, p = 0,4), корреляция с долей некроза слабее (r = -0,36) и достоверно меньше, чем у взрослых ( p = 0,002). О том, что замещение некротизированной ткани рубцом происходит медленнее, свидетельствует и более слабая корреляционная связь между долями некротизированной ткани и коллагеновых волокон (r = -0,45), также статистически значимо отличающаяся от предыдущей группы ( p = 0,002).

Клеточный состав соединительной ткани нормального и поврежденного миокарда

Функционирование сердца определяется динамическим взаимодействием клеток различных типов и межклеточного вещества, существенно различающихся на разных этапах кардиогенеза.

Клеточный состав области повреждения взрослого сердца резко изменяется в течение первой недели после травмы миокарда. Доля лимфоцитов наиболее велика на 2-е сутки (4,4±0,9%), затем она резко уменьшается. Доля сегментоядерных лейкоцитов достоверно возрастает на 4-е сутки после операции до 45,4±2,2% и уменьшается на 7-е сутки до 2,4±0,7%, доля макрофагов убывает с 4 по 7-е сутки с 39,2±2,2% до 18,2±1,7%, доля юных фибробластов постоянно нарастает от 4-х к 7-м суткам, достигая 70,0±2,0%, зрелые фибробласты появляются на 4-е сутки после операции, и их доля возрастает на 7-е сутки до 5,2±1,0%. Таким образом, в поврежденном взрослом сердце можно наблюдать картину типичного реактивного воспаления.

Клеточные элементы пренатального миокарда не отличаются разнообразием и вплоть до рождения представлены почти исключительно кардиомиоцитами и эндотелиоцитами.

В интактном миокарде 21-суточных плодов крыс количество кардиомиоцитов составляет 66,7 ± 1,8% от общего числа клеток, 5-суточных крысят - 53,0 ± 2,3% (различия достоверны при p < 0,001), 25-дневных крысы - 50,2 ± 3,2% (различия с предыдущим сроком недостоверны), стало быть, количество немышечных клеток достигает на этих сроках соответственно 33,3 ± 1,8%, 47,0 ±2,3% и 49,8±3,2%. В постнатальном периоде в составе немышечных клеток статистически значимо возрастают доли эндотелиоцитов, фибробластов, макрофагов и перицитов. В течение первого месяца после рождения клеточный состав миокарда остается постоянным. По сравнению с интактным одновозрастным контролем на 5-е сутки после операции достоверно возрастает доля фибробластов и макрофагов и, вероятно, вследствие этого уменьшается доля эндотелиоцитов. На 10-е сутки доля фибробластов продолжает возрастать, достигая 20,1±2,8 %. Через 30 суток после операции обращает на себя внимание значительное увеличение доли макрофагов (p < 0,001) в области повреждения (Рис. 2).

После травмы вплоть до 10 суток после операции происходит усиленное по сравнению с контролем увеличение доли фибробластов. Макрофагальная инфильтрация, усиливающаяся на 5-е сутки после операции и идущая на убыль к 10-м суткам, вновь возрастает на 30-е сутки, что может свидетельствовать о хронизации воспаления.

Заживление как пренатальном, так и в постнатальном онтогенезе в большой мере определяется характером воспалительного процесса (Redd

Рис. 2 Динамика клеточного состава воспалительного инфильтрата в поврежденном сердце 16-суточного плода. Cерые участки - доля эндотелиоцитов, светлые - макрофагов, заштрихованные - фибробластов, черные - перицитов

По оси ординат - возраст / срок после операции в сутках и исследуемая зона сердца. f - фетальный период, post - постнатальный период, int - интактные.

M.E. et al., 2004; Stramer B.M. et al., 2007), следовательно, нарушение нормального процесса репарации обусловлено изменением характера межклеточных взаимодействий в травмированном пренатальном миокарде. В частности, фетальные кардиальные фибробласты в норме взаимодействуют с кардиомиоцитами, регулируя их пролиферацию (Ieda M. et al., 2009), в свою очередь, их пролиферация и синтез коллагена регулируется эндотелиальными клетками (Kuruvilla L. et al., 2007). Фибробласты, появившиеся в поврежденном плодном миокарде, могли принадлежать к другой клеточной популяции, тогда как по данным литературы, фибробласты разных популяций различаются по способности к репарации и взаимодействию с другими клетками сердца (Sorrell J.M., Caplan A.I., 2004; Wang H.J. et al., 2004).

О роли эндотелиоцитов в элиминации погибших клеток

В интактном сердце плода крысы присутствовали зоны физиологической гибели клеток, которые морфологически не отличались от поврежденного миокарда. В данном случае элиминация погибших клеток несомненно происходила, хотя макрофаги в сердце на этом сроке отсутствовали. После травмы миокарда тяжи эндотелиальных клеток, иммуногистохимически определенных как CD-31-положительные и CD-68-отрицательные, нередко разрастались вокруг поврежденных клеток: кардиомиоцитов и зндотелиоцитов. Подобное же обрастание поврежденных эндотелиоцитов было замечено и на 30-е сутки после операции, т. е. у взрослых животных.

По данным литературы, в пренатальном периоде фагоцитоз нередко осуществляется мезенхимальными клетками, на которых отсутствуют рецепторы макрофагов (Wood W. et al., 2000; Komohara Y. et al., 2005). Врастание эндотелия эндокарда в миокард и изоляция групп миоцитов являются частыми событиями кардиогенеза, сопутствующими разделению тканей, и определяющими течение таких процессов, как формирование вторичного межпредсердного отверстия, разрыв дорсального мезокардия, развитие сухожильных хорд. (Markwald R.R., Bernanke D.H., 1981; Morse D.E., 1981; Noble Ch.W. et al., 1983). Вероятно, вследствие присоединения разрастаний эндотелия к циркуляции фрагменты погибших клеток, неоднократно описанные в просвете капилляров (Вихерт А.М. и др., 1984; Кияк Ю.Г., 1985), могут элиминироваться из миокарда. В постнатальном онтогенезе также существует неспецифический фагоцитоз, осуществляемый различными типами клеток, в том числе и эндотелиоцитами, которые связываются с погибшими клетками с помощью лектинов (Gregory C.D., Devitt A., 2004).

Таким образом, эндотелий плода принимает участие в удалении погибших клеток, изолируя их и способствуя удалению с кровотоком. В поврежденном сердце плода эндотелий полностью не обеспечивает элиминацию погибших клеток, однако в ходе нормального развития сердца таким способом, вероятно, достигается удаление клеток при их физиологической гибели, что является процессом, «дублирующим» макрофагальный фагоцитоз (Wood W. et al., 2000).

Количественная и качественная оценка пролиферации компактного миокарда левого желудочка в норме и повреждения сердца у 16-суточных плодов крыс

На всех исследованных сроках нормального пренатального развития кардиомиоциты статистически значимо не различались по уровню пролиферативной активности. После рождения митотический индекс уменьшается (Рис. 3). Это согласуется с ранее полученными данными (РумянцевП.П., Соколовская И.Л., 1965; Большакова Г.Б., 1980; Soonpaa M.H., Field L.J., 1998; Ahuja P. et al., 2007) об угасании пролиферации кардиомиоцитов, наиболее ярко выраженном после рождения.

Рис. 3 Митотическая активность кардиомиоцитов после травмы левого желудочка, нанесенной в возрасте 16 суток пренатального развития

Серые столбики - кардиомиоциты вокруг очага повреждения, светлые - вдали от очага повреждения, заштрихованные - кардиомиоциты интактного одновозрастного контроля.

По оси абсцисс - возраст / срок после операции, по оси ординат - митотический индекс в промилле. f - фетальный период, post - постнатальный период.

Полоски погрешностей - доверительные интервалы.

Рис. 4 Процентное соотношение фаз митозов в после травмы миокарда

По оси ординат - возраст / срок после операции в сутках и исследуемая зона сердца.

Черные части столбиков - процент профаз, серые - метафаз, светлые - анафаз, пестрые - телофаз.

В период постнатального онтогенеза сердечной мышцы относительная продолжительность фаз митоза ядер кардиомиоцитов варьирует, отражая индивидуальные изменения характера митотической активности. Тем не менее с возрастом не было выявлено статистически значимой тенденции к увеличению количества метафаз и уменьшению количества анафаз и телофаз, что является показателем стабильном времени прохождения митоза кардиомиоцитами на данном этапе развития (Рис. 4).

Однако характер митотической активности все же не остается неизменным. На прогрессирующую дезорганизацию митотического аппарата, сопровождающую угасание пролиферации, указывает возрастное увеличение количества патологических метафаз и анафаз. На пятые сутки после операции они составляют около 70% от всех анафаз и телофаз. (Рис. 5).

На первые сутки после травмы наблюдается резкое торможение

Рис. 5 Доля патологических метафаз и анафаз кардиомиоцитов на различных сроках после травмы левого желудочка

Серые столбики - кардиомиоциты вокруг очага повреждения, светлые - вдали от очага повреждения, заштрихованные - кардиомиоциты интактного одновозрастного контроля.

По оси абсцисс - возраст / срок после операции в сутках, по оси ординат - доля патологических митозов в процентах.

митотической активности всех желудочковых кардиомиоцитов. Аналогичное подавление пролиферации происходило также во всех отделах сердца крысят, поврежденного на разных сроках постнатального развития (Большакова Г.Б., 1980). На третьи сутки оно сменяется достоверным увеличением пролиферации, достигающим контрольных показателей. На пятые сутки митотический индекс в околораневой области статистически значимо меньше показателей отдаленного миокарда и контроля, которые все еще не различаются между собой.

После рождения митотическая активность во всех исследуемых областях поврежденного сердца достоверно снижается. На седьмые сутки после операции (вторые сутки после рождения) митотические индексы в околораневой и отдаленных областях не различаются между собой и не отличаются от контрольных показателей, и только на десятые сутки после операции (пятые сутки после рождения) митотический индекс в области, отдаленной от места повреждения, статистически значимо превышает таковой в перинекротической области и в интактном миокарде (Рис. 3).

Таким образом, травма миокарда, нанесенная в фетальный период, стимулирует митотическую активность только желудочковых кардиомиоцитов, отдаленных от места повреждения, и только на десятые сутки после ее нанесения. Следует отметить, что вследствие постоянного расширения области некроза в перинекротическую область вовлекаются все новые клетки, так что речь идет о стимуляции пролиферации постнатальных кардиомиоцитов.

На первые сутки после травмы происходит резкое увеличение доли профаз и метафаз по сравнению с контролем, свидетельствующее о возобновлении пролиферации после ее временного угнетения, вызванного послеоперационным стрессом (Рис.4). На третьи сутки доля профаз как в перитравматической, так и в отдаленной области миокарда превышает контрольные значения, возможно, являясь признаком дальнейшего усиления пролиферации. На пятые, седьмые и десятые сутки после травмы увеличивается доля метафаз, что может свидетельствовать об удлинении времени их прохождения и нарастающем торможении пролиферации, характерном для постнатальных кардиомиоцитов крыс.

Таким образом, митозы, возникающие после повреждения сердца 16-суточных плодов, по соотношению фаз не отличаются от таковых в контрольных группах. Отсутствуют различия с контролем и по величине индекса патологических метафаз и телофаз и их доли (Рис.5 ), что, возможно, обусловлено большой вариабельностью этих показателей. Лишь на 10 сутки в области, отдаленной от повреждения, доля патологических митозов статистически значимо снижена по сравнению с контролем, что свидетельствует о частичной нормализации протекания митозов.

Ядра Аничкова как маркер постмитотических клеток

Клетки Аничкова, или "миоциты Аничкова", обращают на себя внимание необычным расположением сконденсированного хроматина, похожего на гусеницу при продольном срезе ядра или на глаз совы при поперечном срезе. Их ультраструктура свидетельствует о нормальном состоянии органелл (Pienaar J.G., Price H.M., 1967), описано включение в ядра 3Н-тимидиновой метки (Румянцев П.П., 1982).

Поскольку эти клетки часто находили в очагах повреждения миокарда, возникла мысль об их участии в регенерации в роли «миоцитов» (Anitschkow, 1928), впоследствии признанная несостоятельной.

Вообще говоря, клеток Аничкова как отдельного типа не существует, так как характерные ядра встречаются в различных клетках различных органов (Wood T.A. et al., 1975; Kobayashi T.K. et al., 1992). Они скорее отражают функциональное состояние клетки, поэтому правильнее было бы употреблять термин "ядра Аничкова".

По нашим наблюдениям над нормальным и поврежденным миокардом крыс, появление клеток Аничкова тесно связано с очагами пролиферации клеток сердца, точнее, областями, где повышенная митотическая активность, отмеченная в течение нескольких дней, снижается. Например, в процессе нормального постнатального онтогенеза сердца крыс скопления клеток Аничкова можно обнаружить на 3-й сутки жизни в компактном миокарде обоих желудочков, на 5--8-е сутки в трабекулярном миокарде, на 21--28-е сутки в субэпикардиальной зоне левого желудочка, т. е. в тех зонах сердца, где, по ранее полученным нами данным (Большакова Г.Б., 1980), происходит снижение митотического индекса кардиомиоцитов.

Опыты со включением 3Н-тимидиновой метки в миокарде интактных 7-8-суточных крысят показали, что полученная нами кривая меченых митозов с максимумом приблизительно на 10-й час после введения 3Н-тимидина в основном совпала с приведенными в работе (Kunz J., 1979) кривыми, сходными для мышечных и соединительнотканных клеток, что дало нам возможность не учитывать тканевую принадлежность клеток Аничкова. Количество меченых клеток Аничкова нарастает медленно и достигает максимума через 30 ч после введения меченого тимидина, следовательно, во время включения изотопа будущие клетки Аничкова внешне не отличаются от прочих клеток сердца (Рис. 6).

Рис. 6 Кривые меченых митозов (черные кружки) и меченых клеток Аничкова (белые кружки). По оси абсцисс - время после введения тимидина (в ч), по оси ординат - количество меченых клеток (в %)

Интенсивность мечения клеток Аничкова (количество зерен серебра над ядром 4,0±0,1) сходно с таковой у клеток, впервые после введения тимидина прошедших митоз, т. е. анафаз и телофаз через 9 ч после инъекции изотопа. Более точным доказательством того, что предшественники клеток

...

Подобные документы

Работы в архивах красиво оформлены согласно требованиям ВУЗов и содержат рисунки, диаграммы, формулы и т.д.
PPT, PPTX и PDF-файлы представлены только в архивах.
Рекомендуем скачать работу.