Молекулярно-клеточные аспекты действия ионизирующего излучения и кадмия в малых дозах на млекопитающих

Изменения концентрации мононенасыщенных и насыщенных жирных кислот носили нелинейный характер при увеличении их содержания в общей фракции липидов. На 1-е сут после облучения уровень пальмитолеиновой кислоты был снижен на 28% (р<0,05). В последующие сроки (2-20-е сут) величина показателя возрастала и составила от исходных данных на 3-и (394%), 5-е (343,3%), 7-е (148,7%) и 20-е (142%) сут (р<0,05). К концу опыта (25-е и 30-е сут) содержание пальмитолеиновой кислоты было ниже исходных данных на 30,7% и 46%, соответственно (р<0,05). Напротив, концентрация стеариновой кислоты после воздействия возрастала в течение всего периода наблюдения. Аналогичные изменения были выявлены при определении содержания олеиновой кислоты.

Динамика индекса насыщенности липидов (отношение насыщенных жирных кислот к ненасыщенным) имела нелинейный характер. Повторное облучение овец приводило к повышению индекса насыщенности липидов в начальные сроки исследования (157% от исходных данных на 3-и сут). В дальнейшем регистрировали снижение значений показателя, хотя уровень его был выше исходных данных.

Однократное острое воздействие в сублетальной дозе (2 Гр) характеризовалось уменьшением количества линолевой кислоты в течение всего периода исследования. На 1-е, 3-и и 25-е сут величина этого показателя составила 47,2%, 29,5% и 31,8% от исходных данных, соответственно (p<0,05). В то же время динамика концентрации линоленовой кислоты имела фазовый характер. Достоверное увеличение значений показателя регистрировали на 10-е (238%), 15-е (137,7%) и 20-е (231,7%) сут, а уменьшение - на 1-е (69,7%) и 25-е (25,9%) сут после воздействия. Определение концентрации арахидоновой кислоты выявило нелинейный характер изменений. После облучения наблюдали как снижение, так и повышение величины этого показателя. Максимальное уменьшение регистрировали на 3-и сут (65,9%, p<0,05), а увеличение - на 10-е сут (174%).

Процентное содержание мононенасыщенных и насыщенных кислот было повышено при некотором снижении их уровня ниже исходных на 10-е, 20-е и 30-е сут (олеиновая) и на 2-е сут (стеариновая).

Изменения индекса насыщенности липидов носили фазовый характер. На 1-е и 3-и сут после воздействия отмечали повышение относительного содержания насыщенных кислот на 16% и 53%, соответственно. В последующие сроки исследования регистрировали некоторое уменьшение, а к концу опыта - увеличение значений данного показателя.

При облучении овец в летальной дозе (6 Гр) на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр на 1-7-е сут регистрировали достоверное снижение концентрации линолевой кислоты на 63,4-49,7% относительно исходных данных. К исходу 10-х и 20-х сут концентрация линолевой кислоты была увеличена и составила 105,3% и 109,2%, соответственно (р<0,05). Оценка процентного соотношения линоленовой и арахидоновой кислот в плазме крови выявила следующие особенности. Уменьшение концентрации линоленовой кислоты наблюдали сразу после облучения. Минимальные значения показателя отмечали на 1-е сут исследования (18% от исходных данных, р<0,05). В последующие сроки регистрировали повышение концентрации линоленовой кислоты, хотя уровень её с 2-х по 7-е сут был достоверно ниже исходных данных. К концу опыта (30-е сут) содержание линоленовой кислоты было выше исходных величин на 140% (р<0,05). Динамика концентрации арахидоновой кислоты имела фазовый характер. Так, на 2-е сут наблюдения значения показатели были ниже исходных на 24% (р<0,05). В дальнейшем отмечали менее выраженный характер изменений.

Напротив, содержание мононенасыщенных и насыщенных кислот возрастало. Концентрация пальмитолеиновой кислоты в течение первых 7-и сут была выше исходных данных. Максимальное повышение уровня этого показателя отмечали на 1-е сут (430%, р<0,05). В последующие сроки изменения пальмитолеиновой кислоты носили менее выраженный характер и имели значения близкие к контролю. Процентное содержание стеариновой кислоты было повышено в течение всего периода исследования. Достоверные различия значений регистрировали на 1-е, 2-е, 3-и, 5-е, 7-е и 15-е сут. Концентрация олеиновой кислоты возрастала в течение первых 15-и сут. Максимальное увеличение значений показателя наблюдали на 1-е сут после воздействия (125%, р<0,05). Отношение насыщенных жирных кислот к ненасыщенным возрастало в первые 7 сут после облучения. Максимальное повышение индекса насыщенности липидов отмечали на 2-е сут исследования (142%). В последующие сроки наблюдали постепенное снижение значений показателя.

Однократное облучение овец в дозе 6 Гр также приводило к изменению процентного соотношения жирных кислот. Так, количество линолевой кислоты было достоверно ниже исходных данных в течение всего периода исследования. Аналогичные изменения регистрировали при определении содержания линоленовой кислоты, хотя они были менее выражены. В то же время динамика концентрации арахидоной кислоты имела фазовый характер. Повышение её уровня отмечали на 7-е сут, что составило 276,5% от исходных значений (р<0,05). На 15-е, 20-е и 25-е сут величина этого показателя была достоверно ниже исходных данных и составила 41%, 74% и 7%, соответственно.

Концентрация мононенасыщенных и насыщенных кислот в плазме крови облученных овец, напротив, возрастала. Так, количество пальмитолеиновой кислоты было достоверно увеличено в течение первых 20-и сут (157,8-241%). Содержание стеариновой кислоты было повышено во все сроки исследования. Максимальные значения показателя наблюдали на 25-е сут (146,3%, р<0,05). Динамика концентрации олеиновой кислоты носила фазовый характер. В зависимости от срока исследования регистрировали как повышение, так и снижение её величины.

Оценка индекса насыщенности липидов выявила увеличение значений показателя в течение всего периода наблюдения. На 1-е сут доля насыщенных кислот была повышена и составила 136%. В дальнейшем значения показателя были выше исходных в 1,39-2,84 раза.

Следовательно, однократное и повторное облучение овец в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах после пролонгированного воздействия в малых дозах модифицировало процентное соотношение основных жирных кислот в плазме крови. У повторно облученных животных изменения носили менее выраженный характер. Наблюдали сглаживание процесса перераспределения жирных кислот в общей фракции липидов. Индекс насыщенности липидов был на уровне близком к показателям нормы на всем протяжении исследования. У однократно облученных овец динамика индекса насыщенности липидов носила нелинейный характер, что было обусловлено как приростом суммарного количества насыщенных, так и снижением содержания ненасыщенных жирных кислот. Отмечали повышение концентрации пальмитолеиновой и стеариновой кислот при одновременном снижении уровня линолевой и линоленовой. Динамика количества арахидоновой кислоты имела фазовый характер, причем амплитуда колебаний её при дозе ионизирующего излучения 6 Гр была наибольшей. Изменения содержания линолевой кислоты при облучении в дозе 2 Гр носили фазовый характер, а с увеличением дозы воздействия регистрировали достоверное уменьшение значений показателя во все сроки исследования.

Процесс свободнорадикального ПОЛ регулируется биоантиоксидантами, к числу которых относят б-токоферол и ретинол. Определение концентрации жирорастворимых витаминов в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию г-излучения в сублетальной и летальной дозах однократно и повторно после пролонгированного облучения в малых дозах обнаружило следующие особенности. Так, у овец облученных в дозе 2 Гр на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,5 Гр в течение всего периода наблюдения не регистрировали существенных изменений концентрации б-токоферола (рис. 7). В то же время однократное облучение овец в дозе 2 Гр повышало уровень б-токоферола в плазме крови. Достоверные различия значений отмечали на 1-е (257%), 5-10-е (245-210%) и 30-е (186%) сут.

Облучение овец в летальной дозе на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр приводило к уменьшению концентрации б-токоферола в плазме крови (рис. 7). Напротив, однократное острое облучение увеличивало уровень б-токоферола в плазме крови. Максимальные значения показателя регистрировали на 2-е (274%, р<0,05), 5-10-е (253-194%, р<0,05) и 30-е (170%, р<0,05) сут исследования.

Содержание ретинола в плазме крови овец, подвергнутых острому воздействию г-излучения в дозе 2 Гр на фоне пролонгированного облучения в дозе 0,5 Гр, было ниже исходных данных в течение первых 10-и сут (рис. 8). В дальнейшем уровень этого показате ля возрастал до исходных значений. Однократное острое воздействие г-излучения в сублетальной дозе (2 Гр) также снижало концентрацию ретинола. Так, на 1-е сут исследования уменьшение составило 68% (р<0,05), а на 5-7-е сут - 64-40% (р<0,05). В дальнейшем значения показателя возрастали, хотя и были ниже исходных данных.

Рис. 7. Концентрация б-токоферола в плазме крови однократно и повторно облученных овец

Рис. 8. Концентрация ретинола в плазме крови однократно и повторно облученных овец

Облучение овец в летальной дозе (6 Гр) на фоне пролонгированного воздействия в дозе 0,1 Гр приводило к снижению концентрации ретинола в течение всего срока исследования. В то же время однократное острое воздействие г-излучения в дозе 6 Гр обнаружило нелинейный характер изменений значений показателя. Содержание ретинола на 2-е сут было уменьшено на 83,7% (р<0,05), а на 5-7-е сут - на 59,6-85,1% (р<0,05).

Оценка клинических показателей выявила наиболее короткий латентный период и выраженные симптомы лучевой болезни у овец, однократно облученных в летальной дозе. Через 3 час после воздействия наступала вялость, а на 7-е сут отмечали понос. К концу исследования наблюдали депрессию и эпиляцию. В зависимости от периода болезни регистрировали нарушение частоты пульса и температуры тела. К 25-м сут пали две овцы, а на 30-е сут - остальные. У животных, облученных в сублетальной и летальной дозах после пролонгированного воздействия в малых дозах, клинические симптомы были несколько сглажены. Причем при повторном облучении в летальной дозе не наблюдали гибели овец.

Таким образом, при остром воздействии г-излучения в сублетальной (2 Гр) и летальной (6 Гр) дозах через девять мес после пролонгированного облучения овец в малых дозах отсутствовала выраженная активация процесса свободнорадикального ПОЛ. В плазме крови животных отмечали снижение интенсивности СХЛ, тенденцию к повышению концентрации МДА и слабое изменение содержания ДК и ТК, уровней б-токоферола, ретинола. Однократное облучение овец в дозах 2 и 6 Гр инициировало процесс свободнорадикального ПОЛ в плазме крови. При развитии лучевой патологии наблюдали увеличение интенсивности СХЛ и концентрации МДА, ДК и ТК. Изменения интенсивности СХЛ и содержания ТК носили более выраженный характер. Активация процесса свободнорадикального ПОЛ приводила к изменению процентного соотношения жирных кислот в плазме крови и характеризовалась как приростом суммарного количества насыщенных, так и снижением содержания ненасыщенных жирных кислот. Очевидно, что облучение овец сопровождается окислением ненасыщенных жирных кислот, в частности линолевой кислоты и её метаболитов. Дефицит линолевой кислоты можно объяснить фазовым изменением арахидоновой кислоты, так как она является предшественником последней, а та, в свою очередь, - простагландинов и лейкотриенов. Следствием активации процесса свободнорадикального ПОЛ явилось изменение концентрации б-токоферола и ретинола, которое наступало до клинического проявления лучевой болезни. Следовательно, обнаруженные изменения интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ после однократного воздействия г-излучения в сублетальной и летальной дозах можно рассматривать как один из патогенетических факторов лучевой болезни.

Сравнительный анализ исследованных показателей при однократном и повторном облучении овец демонстрирует, что пролонгированное воздействие г-излучения в дозах 0,1 и 0,5 Гр модифицирует реакцию организма при последующем облучении в сублетальной и летальной дозах. Полученные результаты подтверждают роль процесса свободнорадикаль-ного ПОЛ в индукции АО и указывают на возможность его проявления через девять мес. после предварительного облучения в малых дозах.

3. Однократное и хроническое воздействия кадмия в малых дозах на крыс

3.1 Хроническое воздействие кадмия в малых дозах на крыс

Хроническое воздействие кадмия в малых дозах моделировали поступлением раствора Cd(NO₃)₂ в организм крыс взамен питьевой воды. Концентрации металла составляли 0,05 и 0,1 мг/л, что соответствовало среднесуточным дозам 3 и 6 мкг/кг. Оценка количества лейкоцитов в периферической крови крыс выявила достоверное уменьшение его значений в течение первых 60-и сут исследования у животных, получавших раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л. На 90-е сут значения показателя возрастали и превышали уровень контроля (р0,05). С увеличением концентрации металла в питьевой воде (0,1 мг/л) достоверное снижение количества лейкоцитов регистрировали на 30-е сут. В дальнейшем величина показателя возрастала до контрольных значений.

Определение количества эритроцитов в периферической крови обнаружило следующие особенности. У животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, наблюдали рост значений показателя. Напротив, увеличение уровня кадмия в питьевой воде приводило к снижению количества эритроцитов в течение первых 60-и сут и повышению на 90-е сут исследования (p<0,05).

Оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ выявила разнонаправленный характер изменений концентрации МДА в тимоцитах, в плазме и эритроцитах периферической крови. Хроническое поступление нитрата кадмия в организм крыс в концентрации 0,1 мг/л повышало содержание МДА в плазме крови (рис. 9). Достоверные различия значений наблюдали на 60-е сут исследования. С уменьшением уровня металла в питьевой воде (0,05 мг/л) регистрировали тенденцию к снижению величины показателя. Следует отметить, что на 60-е и 90-е сут исследования различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны.

В эритроцитах периферической крови содержание МДА было повышено на 30-е сут исследования (рис. 9). Достоверные различия значений наблюдали у животных, которые получали питьевую воду с кадмием в концентрации 0,05 мг/л. На 60-е сут значения показателя у подопытных крыс были ниже контроля. На 90-е сут в зависимости от уровня металла в питьевой воде регистрировали разнонаправленный характер изменений: при концентрации кадмия в питьевой воде 0,05 мг/л отмечали увеличение, а при 0,1 мг/л - умень- шение содержания МДА.

В тимоцитах подопытных животных концентрация МДА была ниже контроля в течение первых 60-и сут исследования и достоверно возрастала на 90-е сут (рис. 9).

Разнонаправленный характер изменений содержания МДА в тимоцитах, в плазме и эритроцитах периферической крови, вероятно, зависит от уровня биоантиоксидантов и кадмия, а также синтеза металлотионеинов (МТ) в клетках. В частности, накопление кадмия в эритроцитах и тимоцитах крыс при хроническом воздействии получило подтверждение при исследовании скорости входа и выхода радионуклида ¹⁰⁹Cd. Скорость входа является результирующей потоков поступления и АТФ-зависимого удаления ионов Cd²⁺ из клеток.

Рис. 9. Содержание МДА в тимоцитах, плазме и эритроцитах крови крыс при хроническом поступлении кадмия с питьевой водой

Примечание: здесь и далее

*- достоверно относительно контроля при p<0,05;

+ - достоверные различия между опытными группами при p<0,05

В то же время скорость выхода фактически является критерием активности ион-транспортирующих АТФаз. Исследования показали, что скорость входа радионуклида ¹⁰⁹Cd в эритроциты крыс, подвергнутых хроническому воздействию кадмия, повышается (рис. 10), а в тимоциты - снижается на 30-е сут и увеличивается на 90-е сут исследования (рис. 11). Следовательно, обнаруженные изменения скорости входа радионуклида ¹⁰⁹Cd в клетки носят нелинейный характер и с увеличением концентрации металла в питьевой воде смещаются в более ранние сроки наблюдения.

Рис. 10. Скорость входа (А) и выхода (Б) ¹⁰⁹Cd в эритроцитах крыс при хроническом поступлении кадмия с питьевой водой

Рис. 11. Скорость входа (А) и выхода (Б) ¹⁰⁹Cd в тимоцитах крыс при хроническом поступлении кадмия с питьевой водой

Предполагается, что это обусловлено нарушением проницаемости плазматической мембраны и/или модификацией активности ион-транспортирующих АТФаз. Подтверждение этого предположения было получено при определении скорости выхода радионуклида ¹⁰⁹Cd из клеток.

Так, в эритроцитах скорость выхода радионуклида была повышена в течение первых 60-и сут и снижена на 90-е сут исследования. Аналогичные изменения отмечали и в тимоци- тах. Учитывая тот факт, что удаление ионов Cd²⁺ из клеток является АТФ-зависимым, то увеличение скорости выхода радионуклида ¹⁰⁹Cd свидетельствует об активации ион-транспортирующих АТФаз, а уменьшение на 90-е сут - об истощении энергетических ресурсов клетки.

По мере накопления в клетках ионы Cd²⁺ могут оказывать негативное влияние на структурно-функциональное состояние молекулы ДНК. Оценка интенсивности синтеза ДНК в тимоцитах выявила повышение значений показателя в течение первых 60-и сут и снижение - на 90-е сут исследования (рис. 12). Предполагается, что обнаруженные изменения зависят от внутриклеточной концентрации ионов Cd²⁺: низкие уровни металла активируют синтез ДНК, а высокие, напротив, - ингибируют. Не исключается и негативное влияние конечных продуктов процесса свободнорадикального ПОЛ, так как на 90-е сут исследования концентрация МДА в тимоцитах была увеличена.

ф

Рис. 12. Синтез ДНК в тимоцитах крыс при хроническом поступлении кадмия с питьевой водой

Таким образом, хроническое поступление нитрата кадмия с питьевой водой в организм крыс в концентрациях 0,05 и 0,1 мг/л в течение 90 сут приводило к изменению количества клеток в периферической крови. Модификация количества лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови носила фазовый характер и отражала общую реакцию системы кроветворения. В тимоцитах, плазме и эритроцитах периферической крови крыс отмечали изменение концентрации МДА. Синтез ДНК в тимоцитах была повышен в течение первых 60-и сут исследования и снижен на 90-е сут. Кроме того, регистрировали рост интенсивности внутриклеточного накопления кадмия по скорости входа и выхода радионуклида ¹⁰⁹Cd.

3.2 Биологические эффекты кадмия при хроническом воздействии в антенатальный и постнатальный периоды развития крыс

3.2.1 Ответная реакция организма крыс (поколение F₁), подвергнутых хроническому воздействию нитрата кадмия в антенатальный и постнатальный периоды развития

Определение содержания лейкоцитов в периферической крови подопытных животных выявило разнонаправленный характер изменений значений показателя в зависимости от уровня кадмия в питьевой воде. У крыс, которые получали раствор металла в концентрации 0,05 мг/л, на 120-е сут исследования отмечали повышение количества лейкоцитов на 37% (р0,05). В дальнейшем на 210-е и 365-е сут наблюдали уменьшение величины показателя до контрольных значений. С увеличением концентрации кадмия в питьевой воде (0,1 мг/л), напротив, регистрировали достоверное снижение количества клеток на 120-е сут. В последующие сроки значения показателя возрастали до уровня контроля.

Оценка количества эритроцитов у подопытных животных обнаружила фазовый характер изменений. У крыс, получавших раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, на 120-е и 210-е сут исследования наблюдали повышение значений показателя с последующим снижением на 365-е сут (р0,05). С увеличением уровня металла в питьевой воде рост количества клеток регистрировали на 210-е и 365-е сут исследования (р0,05).

Поступивший в организм млекопитающих кадмий накапливается в тканях органов и индуцирует синтез МТ, которые выполняют функции детоксификации и действуют как ловушка для свободных радикалов [Котеров А.Н. и Филиппович И.В., 1995; Klaassen C.D. et al., 2009]. Определение содержания МТ в тканях печени крыс, подвергнутых хроническому воздействию кадмия, выявило следующие особенности (рис. 13). При концентрации металла в питьевой воде 0,05 мг/л повышение значений показателя регистрировали на 210-е сут (р0,05), а при 0,1 мг/л - на 120-е сут (р0,05). Следует отметить, что различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е сут.

В почках изменения уровня МТ носили слабо выраженный характер (рис. 13). Увеличение значений показателя регистрировали на 365-е сут у крыс, которые получали питьевую воду с кадмием в концентрации 0,1 мг/л (р0,05). В этот период различия значений между показателями животных опытных групп также были достоверны.

В тканях селезенки содержание МТ возрастало в течение всего срока исследования (рис. 13). Достоверные различия значений отмечали на 365-е сут у животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,1 мг/л.

Вероятно, обнаруженные изменения зависят от метаболизма кадмия и его концентрации в органе. Синтез МТ в организме животных сопровождается мобилизацией биологи-чески активных веществ (глюкортикоиды, глутатион, интерлейкины, белки теплового шока), которые могут оказывать влияние на интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ. Следует отметить, что в инактивации свободных радикалов тиоловые группы в составе МТ обладают высокой реакционной способностью: причем цистеин в составе МТ более эффективен, чем в составе глутатиона.

Рис. 13. Содержание МТ в печени, почках и селезенке крыс (поколение F₁), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Примечание: здесь и далее

^*- достоверно относительно контроля при p<0,05;

⁺ - достоверные различия между опытными группами при p<0,05

Оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ выявила увеличение концентрации МДА в плазме крови крыс в начальные сроки исследования (рис. 14). У животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, достоверные различия значений наблюдали на 120-е и 210-е сут. В дальнейшем отмечали уменьшение его уровня до контрольных значений. С увеличением содержания кадмия в питьевой воде повы шение величины показателя регистрировали на 120-е сут (р0,05). В последующие сроки исследования концентрация МДА была практически на уровне контроля. Следует отметить, что различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 210-е сут.

Рис. 14. Содержание МДА в плазме и эритроцитах крови крыс (поколение F₁), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

В эритроцитах периферической крови крыс, подвергнутых хроническому воздейст-вию кадмия, наблюдали фазовый характер изменений содержания МДА (рис. 14). У живот- ных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, на 120-е сут отмечали снижение значений показателя (р0,05), а на 210-е и 365-е сут - увеличение (р0,05). С повышением уровня металла в питьевой воде на 120-е и 365-е сут регистрировали уменьшение величины показателя, а на 210-е сут - увеличение (р0,05). Достоверные раз-личия значений между показателями животных опытных групп наблюдали на 210-е и 365-е сут исследования.

Следствием модификации интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ является изменение состава и свойств липидов мембран клеток, что отражается на их функциональных характеристиках, в частности на проницаемости плазматической мембраны для ионов Са²⁺.

Оценка проницаемости плазматической мембраны тимоцитов для ионов Са²⁺ у крыс, подвергнутых хроническому воздействию кадмия, выявила снижение интенсивности внутриклеточного накопления радионуклида ⁴⁵Са²⁺ на 120-е сут (рис. 15). В последующие сроки исследования значения показателя возрастали. Достоверные различия значений отмечали на 210-е сут. В то же время пассивная проницаемость плазматической мембраны была ниже уровня контроля практически во все сроки наблюдения (рис. 15). В зависимости от концентрации металла в питьевой воде уменьшение значений этого показателя регистрировали на 120-е или 210-е сут (р0,05).

Ионы Cd²⁺ подавляют транспорт ионов Са²⁺ через плазматическую мембрану, поэтому пассивная проницаемость плазматической мембраны тимоцитов для ионов Са²⁺ у животных опытных групп была ниже контрольных значений. Аналогичные изменения интенсивности внутриклеточного накопления ионов Са²⁺ отмечали на 120-е сут исследования. Очевидно, что это обусловлено снижением пассивной проницаемости плазматической мембраны и активацией системы АТФ-зависимого удаления ионов Са²⁺. Последующее увеличение значе- ний этого показателя, вероятно, связано с нарушением структурно-функционального состояния плазматической мембраны, ингибированием активности АТФаз и ростом внутри клеточной концентрации ионов Cd²⁺, которые замещают ионы Са²⁺ в клеточных структурах.

Рис. 15. Интенсивность внутриклеточного накопления (А) и пассивная проницаемость плазматической мембраны (Б) для ионов Са²⁺ в тимоцитах крыс (поколение F₁), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Хроническое воздействие кадмия в антенатальный и постнатальный периоды развития крыс (поколение F₁) оказывало влияние на функциональное состояние молекулы ДНК. Оценка синтеза ДНК в тимоцитах выявила достоверное повышение значений показателя на 120-е сут исследования у животных опытных групп (рис. 16). На 210-е и 365-е сут регистрировали снижение интенсивности этого показателя (р0,05). Достоверные различия значений между показателями животных опытных групп наблюдали на 210-е сут.

Рис. 16. Синтез ДНК в тимоцитах крыс (поколение F₁), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Таким образом, хроническое воздействие кадмия в антенатальный и постнатальный периоды развития крыс (поколение F₁) характеризуется изменением: количества лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови, содержания МТ в тканях органов (печени, почек, селезенки), концентрации МДА в плазме и эритроцитах периферической крови, проницаемости плазматической мембраны для ионов Са²⁺ и уровня синтеза ДНК в тимоцитах. Обнаруженные на 120-е сут исследования изменения носят компенсаторно-приспособительный характер и свидетельствуют о формировании адаптивно-защитных реакций организма. Дальнейшее поступление нитрата кадмия с питьевой водой приводит к развитию негативных реакций в тимоцитах крыс.

3.2.2 Ответная реакция организма крыс (поколение F₂), подвергнутых хроническому воздействию нитрата кадмия в антенатальный и постнатальный периоды развития

Исследование количества лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови подопытных крыс выявило следующие особенности: содержание лейкоцитов в периферической крови в течение всего периода наблюдения было ниже контрольных значений и физиологической нормы. Лейкопения была более выражена у животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,1 мг/л (p<0,05). Достоверные различия значений между показателями животных опытных групп отмечали на 120-е и 365-е сут исследования.

Определение содержания эритроцитов в периферической крови крыс, подвергнутых хроническому воздействию нитрата кадмия, обнаружило разнонаправленный характер изме-нений на 120-е сут. При концентрации металла в питьевой воде 0,05 мг/л наблюдали повышение (p<0,05), а при 0,1 мг/л - тенденцию к снижению. В последующие сроки исследования содержание эритроцитов в периферической крови подопытных животных было на уровне контроля. Различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е сут.

Оценка содержания МТ в органах крыс (поколение F₂) выявила нелинейный характер изменений (рис. 17). В тканях печени отмечали повышение синтеза МТ на 120-е сут с последующим уменьшением ниже контрольных значений на 210-е и 365-е сут исследования. Наиболее выраженный характер изменений наблюдали у животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,1 мг/л (p<0,05). Различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е сут.

В почках регистрировали аналогичную динамику значений показателя, однако эти изменения носили менее выраженный характер (рис. 17). Достоверные различия значений между показателями животных опытных групп отмечали на 210-е сут исследования. Анализ концентрации МТ в селезенке выявил нелинейный характер изменений (рис. 17). На 120-е и 210-е сут наблюдали увеличение значений показателя с последующим уменьшением на 365-е сут. Различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е и 210-е сут исследования.

Исследование интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ обнаружило изменение содержания МДА в плазме и эритроцитах периферической крови (рис. 18). В плазме крови подопытных животных на 120-е сут регистрировали увеличение концентрации МДА с последующим уменьшением на 365-е сут исследования (p<0,05). Различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е и 365-е сут. В эритроцитах периферической крови на 120-е сут содержание МДА, напротив, было снижено (рис. 18). В дальнейшем (210-е сут) в зависимости от концентрации кадмия в питьевой воде регистрировали разнонаправленный характер изменений. К концу эксперимента (365-е сут) значения показателя в клетках животных контрольной и опытных групп практически были на одинаковом уровне. Вероятно, изменения интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ зависят от концентрации кадмия, МТ и биоантиоксидантов в тканях организма.

Рис. 17. Содержание МТ в печени, почках и селезенке крыс (поколение F₂), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Рис. 18. Содержание МДА в плазме и эритроцитах крови крыс (поколение F₂), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Модификация интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ оказывает влияние на функциональные характеристики клеток, в частности на поддержание Са-гомеостаза. Интенсивность внутриклеточного накопления ионов Са²⁺ в тимоцитах крыс, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, возрастала в течение всего периода исследования (рис. 19). Достоверные различия значений регистрировали на 365-е сут. Возможно, обнаруженные изменения были обусловлены увеличением пассивной проницаемости плазматической мембраны для ионов Са²⁺ на 210-е и 365-е сут. У животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,1 мг/л на 120-е сут отмечали снижение интенсивности внутриклеточного накопления ионов Са²⁺, а на 210-е сут - повышение (p<0,05). В дальнейшем регистрировали уменьшение величины показателя до контрольных значений. В то же время пассивная проницаемость плазматической мембраны для ионов Са²⁺ практически была на уровне контроля. Отсутствие изменений пассивной проницаемости плазматической мембраны связано с тем, что ионы Cd²⁺ подавляют тран- спорт ионов Ca²⁺ через плазматическую мембрану. Предполагается, что обнаруженные изменения обусловлены структурно-функциональным состоянием плазматической мембраны клеток и ингибированием активности ион-транспортирующих АТФаз, и зависят от концентрации кадмия в питьевой воде и продолжительности его поступления в организм крыс.

Рис. 19. Интенсивность внутриклеточного накопления (А) и пассивная проницаемость плазматической мембраны (Б) для ионов Са²⁺ в тимоцитах крыс (поколение F₂), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Длительное хроническое воздействие нитрата кадмия на организм крыс (поколение F₂) может вызывать повреждение ДНК [Coogan T.P. et al., 1992; Hansen K. and Stern R.M., 1984]. Оценка интенсивности синтеза ДНК в тимоцитах выявила следующие особенности (рис. 20). У животных, которые получали раствор нитрата кадмия в концентрации 0,05 мг/л, на 120-е сут отмечали активацию синтеза ДНК с последующим снижением на 210-е сут исследования (p<0,05). В дальнейшем (365-е сут) величина данного показателя возрастала. Аналогичную динамику интенсивности синтеза ДНК наблюдали при увеличении концентрации кадмия в питьевой воде. Различия значений между показателями животных опытных групп были достоверны на 120-е сут исследования.

Рис. 20. Синтез ДНК в тимоцитах крыс (поколение F₂), подвергнутых хроническому воздействию кадмия

Таким образом, ответная реакция организма крыс (поколение F₂), которые в антенатальный и постнатальный периоды развития были подвергнуты хроническому воздействию нитрата кадмия, характеризуется изменением: количества лейкоцитов и эритроцитов в периферической крови, содержания МТ в тканях органов (печени, почек, селезенки), концентрации МДА в плазме и эритроцитах периферической крови, проницаемости плазматической мембраны для ионов Са²⁺ и уровня синтеза ДНК в тимоцитах. Полученные результаты свидетельствуют о развитии негативных реакций на клеточном уровне и в системе органов кроветворения.

3.3 Содержание малонового диальдегида и проницаемость плазматической мембраны тимоцитов крыс для ионов Са ²⁺ при внутрибрюшинном введении кадмия

Внутрибрюшинное введение нитрата кадмия в дозе 0,5 мг/кг выявило тенденцию к повышению интенсивности внутриклеточного накопления ионов Са²⁺ практически во все сроки наблюдения. В то же время изменения пассивной проницаемости плазматической мембраны носили фазовый характер (табл. 6). На 1-е сут исследования отмечали достоверное уменьшение значений показателя с последующим увеличением до уровня контроля на 5-е сут. В дальнейшем регистрировали тенденцию к снижению пассивной проницаемости мембраны для ионов Са²⁺ относительно контрольных значений.

Оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ в тимоцитах обнару-жила тенденцию к уменьшению концентрации МДА в начальные сроки исследования (рис. 21). Очевидно, что стабилизация уровня МДА обусловлена модификацией активности биоантиоксидантов. Более того, в организме млекопитающих ионы Cd²⁺ индуцируют синтез МТ, которые их связывают и действуют как ловушка для свободных радикалов.

Показано, что увеличение токсической нагрузки кадмия на млекопитающих (2,5 мг/кг) приводит к повышению интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ при одновременном снижении уровня супероксиддисмутазы, глутатиона и активности глутатион-трансферазы [Karmakar R. et al., 1998; Hussain T. et al., 1987]. Сравнительный анализ ответной реакции организма млекопитающих позволяет говорить о различиях при воздействии металла в больших и малых дозах.

Таблица 6. Проницаемость плазматической мембраны тимоцитов крыс для ионов Са²⁺ при внутрибрюшинном введении кадмия, фмоль/(клеток * мин)

Примечание: ^* - достоверно относительно контроля при p<0,05

Рис. 21. Содержание МДА в тимоцитах крыс при внутрибрюшинном введении кадмия

Таким образом, при внутрибрюшинном введении нитрата кадмия крысам в дозе 0,5 мг/кг в тимоцитах наблюдаются стабилизация уровня МДА и тенденция к повышению интенсивности внутриклеточного накопления ионов Са²⁺ при одновременном снижении пассивной проницаемости плазматической мембраны.

4. Воздействие техногенных факторов на сельскохозяйственных животных при ведении животноводства в экологически неблагополучных регионах

4.1 Содержание малонового диальдегида и проницаемость плазматической мембраны для ионов Са²⁺ в эритроцитах периферической крови коров при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях

В отдаленный период (через 10 лет) после аварии на Чернобыльской АЭС проводили обследование состояния здоровья коров в условиях хозяйств “Новая жизнь”, “Боевик”, “Волна революции” Новозыбковского района Брянской области. У клинически здоровых животных оценивали проницаемость плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ и содержание МДА.

Определение концентрации МДА в эритроцитах периферической крови коров выявило следующие особенности. Наибольшее содержание МДА в клетках отмечали у животных хозяйства “Боевик” (0,268 отн. ед.). В хозяйствах “Новая жизнь” и “Волна революции” значение показателя в эритроцитах периферической крови коров было несколько ниже и составило 0,245 и 0,255 отн. ед., соответственно. Инкубирование клеток в изотонической и гипертонической средах в течение 30 мин при t-37⁰ С повышало уровень МДА. Наиболее выраженный характер изменений при дополнительном стресс-воздействии регистрировали в эритроцитах периферической крови коров из хозяйства “Волна революции”. Следует отметить, что увеличение содержания МДА в эритроцитах животных свидетельствует об активации интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ.

Оценка пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ обнаружила достоверное увеличение величины показателя у коров из хозяйства “Боевик” (табл. 7). Инкубирование эритроцитов в гипертонической среде в течение 30 мин при t-37⁰ С повышало пассивную проницаемость плазматической мембраны. Максимальные значения показателя наблюдали у животных из хозяйства “Волна революции”. Следовательно, обследование коров при ведении животноводства на радиоактивно загрязненных территориях выявило увеличение пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ и концентрации МДА. Инкубирование эритроцитов в гипертонической среде обнаружило изменения в мембране, которые проявляются при дополнительном стресс-воздействии и характеризуются изменением функционального состояния клеток.

Таблица 7. Пассивная проницаемость плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ при длительном содержании коров на радиоактивно загрязненных территориях, фмоль/(клеток * мин)

Примечание: ^* - достоверно относительно контроля при p<0,05;

⁺ - достоверно относительно хозяйства “Новая жизнь” при p<0,05

Причиной обнаруженных нарушений, вероятно, являются изменения в структуре клеток-предшественников костномозгового кроветворения. Следствием этого может быть снижение неспецифического иммунитета, в частности фагоцитарной активности нейтрофи-лов. Так, активация нейтрофилов характеризуется резким усилением образования суперок-сид анион радикала; ей предшествует увеличение концентрации ионов Са²⁺ в цитоплазме за счет поступления из внеклеточной среды и внутриклеточных пулов [Shaafi R.I. and Molski T.F., 1990], поэтому увеличение проницаемости плазматической мембраны клеток при отклонении осмолярности среды от физиологических условий изотоничности может быть причиной модификации механизма активации клеток, приводящей в итоге к уменьшению образования супероксид анион радикала и угнетению фагоцитарной активности. Эти предположения согласуются с данными по снижению фагоцитарной активности нейтрофилов периферической крови животных при длительном содержании на радиоактивно загрязненных территориях [Сыпин В.Д. и Егоров В.Г., 1998].

Ключевая роль системы Са²⁺-гомеостаза и процесса свободнорадикального ПОЛ показана в патогенезе различных заболеваний [Акоев И.Г. и Мотлох Н.Н., 1984]. В связи с этим нарушение проницаемости плазматической мембраны клеток для ионов Са²⁺ и активацию процесса свободнорадикального ПОЛ можно рассматривать в качестве дополнительного фактора риска развития патологии сельскохозяйственных животных.

4.2 Содержание малонового диальдегида в эритроцитах периферической крови супоросных свиноматок

Исследование интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ у супоросных свиноматок хозяйства “Тарутино” выявило, что в эритроцитах периферической крови содержание МДА перед опоросом увеличивается на 60%. После опороса содержание МДА в эритроцитах периферической крови было снижено (рис. 22). Аналогичные данные получены на стельных коровах. В последние месяцы стельности процесс свободнорадикального ПОЛ в плазме крови активируется, а после отела - ингибируется. У стельных коров с низким содержанием витаминов в крови до отела отмечается послеродовая патология (задержание последа), а также изменение клеточного и гуморального иммунитета [Мяльдзин А.Р., 1990; Гугушвили Н.Н., 2003].

Следовательно, увеличение интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ до и снижение после опороса являются физиологическим процессом и характеризуют период супоросности.

Рис. 22. Содержание МДА в эритроцитах супоросных свиноматок, Примечание: ^* - достоверно относительно исходных данных при p<0,05

Вакцинация сельскохозяйственных животных также приводит к повышению интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ [Шахов А.Г., 2004]. Иммунизация свиноматок в период супоросности может усилить интенсивность процесса свободнорадикального ПОЛ и привести к срыву защитно-компенсаторного потенциала орга- низма и развитию пре- и постнатальной патологии потомства. Учитывая то, что эффективным способом защиты организма от токсичных продуктов ПОЛ является использование антиоксидантов, вакцинацию супоросных свиноматок против паратифа и лептоспироза проводили на фоне применения витаминных препаратов (тривит, элеовит).

Оценка интенсивности процесса свободнорадикального ПОЛ у свиноматок выявила достоверное снижение содержания МДА в эритроцитах периферической крови на 85-е сут супоросности и после опороса (табл. 8). Очевидно, что ингибирование процесса свободнорадикального ПОЛ обусловлено применением витаминных препаратов.

Исследование пассивной проницаемости плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ обнаружило тенденцию к уменьшению значений показателя на 85-е сут супоросности и после опороса (табл. 8). Возможно, это связано не только со стабилизацией структуры мембраны, но и снижением концентрации кальция в плазме крови. Как видно из таблицы 8, содержание кальция в плазме крови свиноматок на 85-е сут супоросности и после опороса было ниже исходных данных (p<0,05).

Таблица 8. Молекулярно-клеточные показатели супоросных свиноматок

Примечание: ^*- достоверно относительно 55 суток супоросности, p<0,05

Определение синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови супоросных свиноматок выявило снижение его интенсивности на 85-е сут супоросности (p<0,05). После опороса значения этого показателя были на уровне исходных данных (табл. 8). Вероятно, что ингибирование синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови супоросных свиноматок связано с вакцинацией животных.

Таким образом, содержание МДА в эритроцитах периферической крови свиноматок в последние месяцы супоросности увеличивается, а после опороса - уменьшается. Применение витаминных препаратов перед вакцинацией супоросных свиноматок снижает проницаемость плазматической мембраны эритроцитов для ионов Са²⁺ и концентрацию МДА. Кроме того, отмечаются ингибирование синтеза ДНК в лимфоцитах периферической крови и уменьшение уровня кальция в плазме крови.

4.3 Методология оценки воздействия техногенных факторов на сельскохозяйственных животных при ведении животноводства в экологически неблагополучных регионах

Для оценки воздействия техногенных факторов на сельскохозяйственных животных изучают экологическую ситуацию и состояние их здоровья на разных уровнях биологической организации: молекулярно-клеточном, органном, организменном и популяционном.

На основе данных мониторинга окружающей среды определяют факторы, масштабы, характер и интенсивность воздействия. Учитывают следующие факторы: физические, химические и биологические. В свою очередь физические факторы подразделяют на ионизирующие и неионизирующие излучения, а химические - на пестициды и тяжелые металлы. По масштабам загрязнения выделяют локальные, региональные и глобальные уровни; по характеру воздействия - острое и хроническое; по интенсивности - низкие и высокие уровни.

В большинстве случаев экологическая ситуация характеризуется одновременным воздействием этих факторов и невысоким уровнем экспозиции радиоактивных и токсичных веществ. При анализе данных мониторинга основное внимание обращают на содержание в воде и кормах радиоактивных и химических веществ, продолжительность их поступления в организм животных. В условиях сочетанного техногенного воздействия в относительно малых дозах, когда имеющаяся симптоматика неспецифична и полиморфна, важным источником информации является оценка физиологического состояния сельскохозяйствен-ных животных.

Хронический характер воздействия и невысокий уровень экспозиции действующих агентов не вызывают специфических изменений в организме, однако оказывают влияние на процессы внутриклеточного метаболизма. Длительное хроническое воздействие, в конечном итоге, приводит к истощению резервных возможностей организма и изменению гомеостаза на разных уровнях биологической организации. Наиболее ранние изменения наблюдают на молекулярно-клеточном уровне и определяют по структурно-функциональному состоянию ДНК (ядерной и митохондриальной), митохондрий и плазматической мембраны. Следует отметить, что на этом уровне грань между деструктивными и адаптационными процессами является весьма условной и регистрируемые изменения в большинстве случаев носят обратимый характер.

Нарушения кроветворения, функциональной активности детоксикационной и выдели-тельной систем свидетельствуют об изменении гомеостаза на уровне органов. Поэтому обра-щают внимание на показатели белоксинтезирующей, мочевинообразующей и антитокси-ческой функций, на активность ферментов - щелочной фосфатазы, лактатдегидрогеназы, г-глутамилтрансферазы, на интенсивность пролиферации клеток и содержание токсичных элементов в органах.

Изменения гомеостаза на уровне целостного организма регистрируют клиническими, биохимическими и иммунологическими методами и определяют по количеству и качеству получаемой продукции. Необходимо отметить, что качество продукции включает не только соответствие санитарно-гигиеническим требованиям по содержанию токсичных элементов, но и пищевую и питательную ценность.

На уровне популяции воздействие техногенных факторов оценивают по характеристике стада, показателю заболеваемости, продуктивности. Особое внимание обращают на сопутствующие факторы (технологии кормления и содержания животных в стойловый и пастбищный периоды, качество кормов, полноценность рациона по микро- и макроэлементам, эндемичность региона по ряду элементов, в частности по йоду и селену, проведение селекционной работы и ветеринарно-санитарных мероприятий).

Характеристика стада включает количество животных, возраст, живую массу, процент яловости, абортов, выбраковки, антенатальной и постнатальной смертности. Длительное поступление токсичных элементов в организм сельскохозяйственных животных сказывается на структуре их поголовья (стада). Большой процент яловости и абортов свидетельствует о нарушении воспроизводительной функции животных и подтверждается акушерско-гинекологическими заболеваниями (эндометриты, маститы). Более того, рождение слабого и нежизнеспособного потомства влияет на уровень антенатальной и постнатальной смертности [Адаптация агросферы…, 2006].

Показатель заболеваемости - это соотношение различных заболеваний, регистрируемых на конкретной территории за определенный промежуток времени. Распространение и течение инфекционных заболеваний зависят от наследственной предрасположенности и иммунитета сельскохозяйственных животных. В то же время снижение иммунитета может быть обусловлено экологическими факторами, поэтому проводят сравнительный анализ инфекционных и незаразных заболеваний до и после воздействия техногенных факторов.

Таким образом, при ведении животноводства на техногенно загрязненных террито-риях воздействие факторов физической, химической и биологической природы на сельскохо-зяйственных животных необходимо оценивать на разных уровнях биологической организа-ции (молекулярно-клеточном, органном, организменном, популяционном) с учетом метабо-лизма и механизма действующего агента, величины и мощности дозы (концентрации) и длительности воздействия. На физиологическое состояние продуктивных животных оказывают влияние и сопутствующие факторы (технологии кормления и содержания животных в стойловый и пастбищный периоды, качество кормов, полноценность рациона по микро- и макроэлементам, проведение селекционной работы и ветеринарно-санитарных мероприятий, супоросность (стельность)). Изменения гомеостаза на молекулярно-клеточном уровне выявляются, как правило, до появления морфологических, физиологических и популяционных отклонений от нормы, поэтому обнаружение нарушений на начальных уровнях биологической организации позволит определить степень и тяжесть воздействия, обеспечит более рациональное использование сельскохозяйственных животных и снизит экономический ущерб от потери продуктов животноводства.