Гетерогенность тромбоцитов человека и животных. Связь морфологических особенностей с функциональным состоянием

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

ГЕТЕРОГЕННОСТЬ ТРОМБОЦИТОВ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ. СВЯЗЬ МОРФОЛОГИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ С ФУНКЦИОНАЛЬНЫМ СОСТОЯНИЕМ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

БУРЯЧКОВСКАЯ Людмила Ивановна

Москва - 2007 г.

Работа выполнена в Отделе клеточной биологии Института экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Научные консультанты: доктор медицинских наук, академик РАН Евгений Иванович Чазов

доктор медицинских наук, профессор Алексей Владимирович Мазуров

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, академик РАМН Аслан Амирханович Кубатиев ГУ НИИ общей патологии и патофизиологии РАМН

доктор медицинских наук, профессор Владимир Александрович Макаров ГУ Гематологический научный центр РАМН

доктор биологических наук Юрий Аскольдович Романов ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий»

Ведущая организация - Московский Государственный Университет им. М.В.Ломоносова, биологический факультет.

Защита диссертации состоится 23 января 2008 г. в 13.30 час. на заседании диссертационного совета Д 208.073.01в РКНПК «Росмедтехнологий» по адресу: 121552, г. Москва, ул. З-я Черепковская, д. 15-А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РКНПК «Росмедтехнологий»

Автореферат разослан 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук, профессор В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Согласно современным представлениям тромбоциты играют ведущую роль в образовании тромба. Кроме того, они участвуют в иммунных процессах и воспалении, защите организма-хозяина от вирусов и бактерий, в транспорте веществ, регуляции сосудистого тонуса, росте раковых клеток, их метастазировании и уничтожении, в ангиогенезе и ремоделировании сосудов. Такая полифункциональность связана со способностью тромбоцитов к активации, которая в свою очередь, зависит от их морфо-функционального состояния.

Неоднородность пула циркулирующих в крови тромбоцитов была обнаружена еще в начале прошлого века. Различия отмечены в количестве, морфологии, возрасте, объеме, плотности, функциональной активности, содержании белков, гликогена, ферментов и рецепторов, что позволило говорить о гетерогенности пула тромбоцитов (Karpatkin, Khan, 1978).

Интактные тромбоциты имеют характерную форму диска. При активации происходит быстрое, занимающее менее секунды, изменение формы из дисковидной в сферическую. На разных этапах этого процесса могут появляться переходные формы, которые долгое время рассматривались в качестве одной из причин гетерогенности тромбоцитарного пула, а их выявление использовалось для определения риска тромботических осложнений у больных (Corash, 1990). Кроме того, были обнаружены и другие по форме тромбоциты, которые R. Allen (1979) относил к атипичным или артефактным. Но в дальнейшем появились неопровержимые данные, что такие формы появляются в результате их рождения мегакариоцитами (Gladwin, Martin, 1990; Hartwig, Italiano, 2003; Kozaki, 2005).

Возможны следующие пути появления тромбоцитов из мегакариоцитов: 1) разделение цитоплазмы мегакариоцитов демаркационными мембранами и быстрый «взрывной» выброс тромбоцитов, 2) образование эндоплазматических пузырей, содержащих пластинки, и их отделение от материнской клетки, 3) инвагинация мембраны с отделением тромбоцитов в виде бус, 4) образование из цитоплазмы псевдоподий, которые проникают в синусы костного мозга и отшнуровываются, в результате чего рождаются незрелые формы тромбоцитов, названные протромбоцитами. В дальнейшем, уже в кровотоке, они разделяются, образуя тромбоциты дисковидной формы.

Важную роль в продукции разных тромбоцитов играет степень полиплоидизации ядра мегакариоцитов (Ravid et al, 2002). С ней связан уровень содержания в тромбоцитах специфичных для них белков. Транскрипционные факторы, поэтины, цитокины, молекулы адгезии и катехоламины являются определяющими для созревания и полиплоидизации мегакариоцитов (Slayton et. al., 2005).

В настоящее время выделяют три формы тромбоцитов, появление которых в кровотоке зависит от состояния мегакариоцитов и в первую очередь от их плоидности. Это дисковидные тромбоциты, удлиненные биполярные протромбоциты (менее зрелые формы, рожденные клетками с низкой плоидностью) и большие сферические («ретикулярные») тромбоциты с высоким содержанием мРНК, происходящие из мегакариоцитов с высокой плоидностью. Кроме этих трех, выделяют четвертую субпопуляцию - сферические тромбоциты размером 1-2 мкм с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий. За исключением редких патологий их появление в крови не связано с мегакариоцитопоэзом, а происходит в результате активации и изменения дисковидной формы кровяных пластинок.

Большинство исследований функциональных свойств тромбоцитов проводится на дисковидных и их производных - сферических формах. Что касается протромбоцитов и больших сферических («ретикулярных») форм, они остаются мало изученными, данные о них в основном имеют описательный характер, а сведения об их функциональных свойствах, способности к активации и роли в различных процессах единичны и противоречивы.

Цель и задачи исследования. Основной целью данного исследования было выяснение взаимосвязи между морфологической гетерогенностью тромбоцитов, их функциональными свойствами и участием различных субпопуляций в гемостазе и тромбозе.

К задачам исследования были отнесены:

1. выявление и характеристика различных субпопуляций тромбоцитов, циркулирующих в крови человека и животных в норме;

2. отработка экспериментальных моделей, в которых в крови увеличивается количество протромбоцитов и появляются большие сферические («ретикулярные») тромбоциты;

3. подбор условий и изучение механизмов появления разных субпопуляций тромбоцитов в крови;

4. изучение функциональной активности отдельных субпопуляций кровяных пластинок - в особенности протромбоцитов и больших сферических тромбоцитов;

5. поиск факторов, влияющих на появление протромбоцитов и больших тромбоцитов in vitro;

6. исследование морфофункциональных особенностей тромбоцитов у больных при различных патологиях и вклад в развитие тромбозов и геморрагий;

7. изучение влияния различных фармакологических препаратов на содержание в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

Иными словами, основным направлением работы был поиск ответа на вопросы: существует ли взаимосвязь между морфологией тромбоцитов, приобретенной ими в ходе мегакариоцитопоэза, и функциональной активностью пластинок, а также, какие факторы внешней среды могут оказаться решающими в появлении в кровотоке различных субпопуляций?

Научная новизна. Практически все основные результаты работы получены впервые. Для исследования особенностей морфологии и функций тромбоцитов была использована модель метаболического стресса у крыс. Это позволило выявить условия повышения количества протромбоцитов в крови и провести исследование редко встречающихся в норме форм тромбоцитов. До нашей работы такую модель для исследования морфофункциональной гетерогенности тромбоцитов никто не применял.

Разработанный нами метод смыва неактивных тромбоцитов с адгезивных поверхностей дал возможность выделить высоко-гомогенную фракцию протромбоцитов, что помогло получить доказательства их функциональной инертности.

Впервые получены экспериментальные данные о форме и структуре протромбоцитов, не способных к агрегатообразованию. Количественное определение таких клеток у больных повышает возможности более адекватной оценки риска возникновения у них геморрагических осложнений.

Впервые обнаружено, что длительно поддерживающееся высокое содержание катехоламинов в крови приводит к продукции протромбоцитов. Наиболее значительное количество функционально инертных протромбоцитов обнаружено у больных феохромоцитомой и пациентов с инфекционными заболеваниями на стадии гипокоагуляции.

Показано, что циркулирующие мегакариоциты из донорской крови, способны к тромбоцитопоэзу в условиях хранения тромбомассы in vitro. Появление молодых тромбоцитов влияет на сохранение функциональной активности хранящейся тромбомассы и способствует продлению срока пригодности ее для переливания.

Экспериментально подтверждено, что протромбоциты секвестируются в селезенку и возвращаются в кровоток под действием катехоламинов.

Установлено, что присутствие в крови больших сферических тромбоцитов повышает агрегационную способность всего пула. Существует тесная взаимосвязь между количеством этих клеток в пуле и спонтанной агрегацией. В больших сферических тромбоцитах не обнаружена типичная для тромбоцитов грануляция и выявлена сильно развитая сеть канальцев, заполненных аморфным материалом.

Для более адекватной оценки появления в крови больших тромбоцитов нами впервые применен разработанный в лаборатории оригинальный метод определения среднего объема тромбоцитов по тромбоцитокриту. Метод оказался нетрудоемким и высокоэффективным, отличается более высокой точностью и воспроизводимостью по сравнению с использованием гематологических анализаторов.

Большие «ретикулярные» тромбоциты отсутствуют в крови здоровых добровольцев. У всех больных с верифицированным атеросклерозом, независимо от места его локализации, в крови выявлены большие тромбоциты.

Риск тромботических осложнений тесно связан с увеличением количества больших тромбоцитов, обладающих повышенной активностью. Отмечено, что при развитии ДВС-синдрома присутствие в крови (до 10 %) больших сферических форм соответствует фазе тромбозов, а увеличение количества биполярных протромбоцитов (до 50 %) - фазе геморрагий.

Научно-практическая значимость работы. Полученные экспериментальные данные позволяют расширить сложившиеся представления о циркулирующих в крови тромбоцитах в норме и при патологических состояниях.

За период выполнения исследования разработаны методы выделения и количественной оценки протромбоцитов и больших «ретикулярных» тромбоцитов. Получены данные о количестве протромбоцитов в норме у человека и животных и о его повышении при различных сердечно-сосудистых патологиях. Показано, что количество биполярных протромбоцитов резко возрастает в условиях гиперкатехоламинемии. Обнаружено, что при феохромоцитоме на их долю приходится от 17% до 49% от общего числа тромбоцитов, и это может служить диагностическим критерием. Получено авторское свидетельство «Метод диагностики феохромоцитомы». Этот метод используется в клинической практике. Отмечено, что увеличение количества протромбоцитов в крови соответствует фазе геморрагии. В отличие от этого, риск тромботических осложнений возрастает с появлением в крови больших «ретикулярных» тромбоцитов. Они обладают повышенной активностью, способны спонтанно агрегировать. Ингибиторы циклооксигеназы не оказывают влияния ни на количество, ни на функциональные свойства этих клеток. Результаты этой работы могут оказаться полезными для разработки новых методов диагностики тромботических осложнений и в поиске способов их лечения.

Апробация работы. Апробация диссертации состоялась 19 июня 2007 г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии РКНПК «Росмедтехнологий». Результаты исследования были представлены в виде устных и стендовых сообщений на российских и международных конгрессах и симпозиумах: Пленум правления ВНОГ (Рига, СССР, 1986 г.); Всесоюзная Конференция «Актуальные проблемы гемостаза в клинической практике» (Москва, 1987 г.); 1^th Congress International Soсiety for Pathophysiology (Москва, 1991 г.); Всесоюзная Конференция по тромбозу и гемостазу (Полтава, 1992); Всесоюзный съезд гематологов (Львов, 1993);., VII, XI , XII, XIII, XV European Meeting on Hypertension (Милан, Италия, 1995 г., 1999 г., 2001 г., 2003 г., 2005 г.); Всероссийская конференция «Тромбозы и геморрагии, ДВС-синдром. Проблемы лечения» (Москва, 1997 г., 2003 г., Ярославль, 2005 г.); XI и XIV International Symposium on Atherosclerosis (Париж, Франция, 1997 г., Рим, Италия, 2006 г.); 31th Annual Scientific Meeting of European Society for Clinical Investigation (Киль, Германия, 1997 г.); I и III Украинская научная конференция «Микроциркуляция и ее возрастные изменения» (Киев, Украина, 1999 г., 2002 г.); XVII, XVIII, XIX, XXI Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis (Вашингтон. США, 1999 г., Париж, Франция, 2001 г., Бирмингем, Англия, 2003 г., Женева, Швейцария, 2007.); 18^th Scientific Meeting of the International Society of Hypertension (Чикаго, США, 2000 г.); The 5^th UK Meeting on platelets and the 9^th и 10^th Erfurt Conference on Platelets (Ноттингем, Англия, 2002 г.. Эрфурт, Германия, 2004 г.); 42nd American Society for Cell Biology Annual Meeting (Сан-Франциско, США, 2002 г.); I II и III Всероссийская научная конференция “Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии” (Москва, 2003 г., 2005 г., 2007 г.); 14 Международный симпозиум Дунайской лиги по борьбе с тромбозами, нарушениями гемостаза и патологии сосудистой стенки (С-Петербург, 2004 г.); Российский национальный конгресс кардиологов (Томск, 2004 г.); Симпозиум «Человек и лекарство» (Москва, 2005 г.); 1 съезд физиологов СНГ (Сочи, 2005 г.); World Congress of Cardiology (Барселона, Испания, 2006 г,); Всероссийская конференция «Тромбозы в клинической практике: факторы риска, диагностика, терапия» (С.-Петербург, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 55 печатных работ: 28 в отечественных и 27 в международных изданиях.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, 6-ти глав, посвященных собственным результатам и их обсуждению, а также заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 210 страницах, содержит 38 рисунков и 8 таблиц. Список литературы включает 381 источник.

Материалы и методы исследования

Проводились исследования крови 54 специально отобранных здоровых добровольцев, 24 случайно обратившихся в донорский пункт с целью коммерческой сдачи крови добровольца, состояние здоровья которых не контролировалось, 38 профессиональных доноров, 29 больных бронхиальной астмой, 15 больных с артериальной гипертонией кризового течения, 18 больных феохромоцитомой, 18 больных с различными воспалительными заболеваниями (пневмония, пиелонефрит, абсцессы разной локализации), 14 - с генерализованными формами менингококковой инфекции, 52 больных ИБС с атеросклерозом коронарных сосудов, 11 больных с атеросклерозом брахиоцефальных артерий. Отдельные эксперименты выполнены на 126 самцах крыс линии Wistar весом 250-300 г, 23 белых лабораторных мышах весом 25-30 г, 54 кроликах породы Шиншилла весом 2,5-3,5 кг, 7 сусликах весом 120-130 г. Часть экспериментов проводили на предварительно подвергнутых двусторонней демедуляции надпочечников крысах. Кровь брали самотеком из вены или шприцем из сердца, в некоторых экспериментах на крысах и мышах - через имплантированный в брюшную аорту катетер. Метаболический стресс создавали с помощью болюсного введения 500 мг/кг 2-дезокси-Д-глюкозы (2ДГ). Концентрацию эндогенных катехоламинов в плазме определяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимическим детектированием.

Выделение и хранение концентрата тромбоцитов осуществляли в отделении переливания крови ФГУ РКНПК в контейнерах Fenwal PL-1240. Тромбомассу от 38 доноров получали двумя способами: «в осадке» и из лейкоцитарной пленки методом «Buffy Coat». Забор образцов для исследования осуществляли непосредственно после помещения тромбомассы в мешки для хранения (0 точка), на 1, 3 и 5 сутки хранения. Одновременно с этим проводился анализ контроля стерильности. Исследование морфологии. Для оценки формы тромбоцитов 50 мкл цельной крови непосредственно при взятии или 10 мкл ОТП фиксировали в 2,5% глутаровом альдегиде (1:30), помещали на поликарбонатные мембраны и подготавливпали препараты для исследования. Подсчет разных форм тромбоцитов проводили в сканирующем электронном микроскопе (СЭМ) «PHILLIPS PSEM 550х». Количество пластинок каждой формы выражали в % по отношению к общему числу клеток в образце. При подсчете выделяли 4 типа тромбоцитов: дисковидные (Д) размером 2-4 мкм; сферические (С₁) размером 1-2 мкм, с гладкой поверхностью или различным числом псевдоподий; большие сферические (С₂) размером 4-5 мкм, с выраженными инвагинациями плазматической мембраны, часто называемые в литературе «ретикулярными тромбоцитами»; вытянутые биполярные протромбоциты (ПТ) длиной 2-20 мкм и диаметром 0,5-0,7 мкм, одинаковые по всей длине или сужающиеся к концам наподобие веретена. Для исследования внутриклеточных структур тромбоцитов 2 мл крови с антикоагулянтом префиксировали в 1% глутаровом альдегиде, отделяли ОТП и проводили более жесткую фиксацию 2,5% глутаровым альдегидом. Импрегнацию осуществляли 0,1% раствором четырехокиси осмия. Срезы контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца, просматривали на трансмиссионном электронном микроскопе (ТЭМ) “JEOL” - 200 CH. Исследование функций тромбоцитов. Агрегацию исследовали с помощью лазерного двухканального анализатора агрегации НПФ «БИОЛА» модели 230LA. Способность к образованию агрегатов малого размера (от 3 до 100 клеток) оценивали по спонтанной и индуцированной 0,1 и 0,5 мкмоль АДФ агрегации. Образование агрегатов среднего и большого размера (свыше 100 клеток) оценивали по индуцированной 1,0 и 5,0 мкмоль АДФ агрегации.

Адгезию оценивали с помощью СЭМ. 50 мкл ОТП наносили на адгезивную поверхность, инкубировали 5 мин. при комнатной t в закрытом бюксе, снимали неприкрепленные клетки с поверхности и фиксировали 2,5% глутаровым альдегидом. Параллельно исследовали тромбоциты, прикрепившиеся к поверхности и оставшиеся в суспензии, которые характеризовали как не способные к адгезии. Подсчет разных форм проводили на 25 полях сканирования, передвигая столик по диагонали, при увеличении 2500х или на 50 полях при увеличении 5000х. Для определения количества тромбоцитов (в %), способных к адгезии, использовали формулу:

А=N_аx100/N_a+N_n,

где: A - количество тромбоцитов определенной формы, способных к адгезии; N_а - общее число подсчитанных клеток, прикрепленных к поверхности; N_n - общее число подсчитанных клеток, оставшихся в суспензии.

Способность к эндо-экзоцитозу регистрировали с помощью флюориметрии методом АО-теста. Флюоресцентный зонд акридиновый оранжевый (АО) избирательно поглощается и запасается в основном внутри гранул и по его накоплению и освобождению можно судить о функциональном состоянии тромбоцитов.

Средний объем тромбоцитов (СОТ) оценивали по тромбоцитокриту. В кювету переменного диаметра добавляли 1 мл ОТП с 0,1 моль ЭДТА и центрифугировали 20 мин при 2000 g. Высоту столбика осевших клеток измеряли по линейке бинокуляра и пересчитывали по формуле DxH/N^-3, где D - диаметр капилляра, H - высота столбика осевших клеток, получившегося после центрифугирования, N - количество клеток в мм³ ОТП. Объем тромбоцитов выражается в фл. Параллельно для контроля проводили измерение СОТ на гемоанализаторе "Hemascreen 5".

Статистическую обработку и оценку корреляций с помощью критерия Спирмана осуществляли с помощью компьютерной программы Statistica 6.0. Определение различий проводили с использованием параметрического критерия Стьюдента и непараметрического критерия Манна-Уитни. На рисунках и в таблицах приводятся отклонения от среднего значения, соответствующие стандартной ошибке или стандартному отклонению.

Результаты исследования и обсуждение

субпопуляция тромбоцит человек животное

Особенности морфологии и функций тромбоцитов человека и животных

В крови относительно здоровых лиц тромбоциты морфологически достаточно однородны. Однако в разных группах людей, наиболее часто используемых в качестве контрольных, могут наблюдаться отличия.

В цитратной крови специально отобранных здоровых добровольцев, чье состояние оценивается по отсутствию хронических заболеваний, жалоб на здоровье и обращений к врачу в течение последнего года, 85 - 98 % (в среднем 94±5,2%) тромбоцитов имеют форму дисков. С₁ формы немногочисленны и в среднем составляют 6,3±0,7%. Обнаружено также от 1 до 4% (2,4±0,3%) ПТ небольшой длины (до 6 мкм). Более длинные ПТ, делящиеся или с перетяжками отсутствуют. Больших сферических тромбоцитов, относящихся к субпопуляции С₂, нет (рис. 1).

Рисунок 1. Содержание тромбоцитов разной формы в цельной крови (темные столбики) и в ОТП (светлые столбики) отобранных здоровых добровольцев (1),профессиональных доноров (2) случайных добровольцев (3). * - р<0,05; ** - p<0,01.

Для тромбоцитов отобранных здоровых добровольцев характерно отсутствие способности спонтанно агрегировать. В ответ на добавление 0,1 мкмоль АДФ агрегация составляет 1,7±0,1 отн ед, а в ответ на 5 мкмоль АДФ - 47,8±3,7 %. СОТ соответствует 8,6±0,6 фл и не превышает 10 фл. Реакция освобождения, оцениваемая по АО-тесту, достигает 19,2±1,9 усл ед, но не выходит за предел 22 усл ед.

У профессиональных доноров содержание Д форм снижено, а С₁ форм повышено, что может быть связано с активацией, вызванной кровопотерей и перестройкой организма в результате длительного донорства. Содержание ПТ увеличено почти в 2 раза и колеблется от 3 до 7% (в среднем 4,8±0,8%, р<0,05) по сравнению с ЗД. В основном они имеют веретенообразную или биполярную конфигурацию, но в отдельных случаях присутствовали единичные ПТ до 20 мкм длиной с перетяжками на концах. С₂ не обнаружены. Спонтанная агрегация отсутствовала. АДФ-индуцированная агрегация (18,6±2,0%), СОТ (8,2±0,9 фл) и реакция освобождения (18,6±2,0 усл ед) незначительно отличались от сходных показателей у ЗД.

У большинства случайных добровольцев, обратившихся в донорский пункт с целью сдачи крови на коммерческой основе, состояние здоровья не контролировалось, и поэтому среди них могли оказаться лица с различными заболеваниями. По сравнению со здоровыми добровольцами, у этого контингента исследованных повышено содержание С₁ и снижено количество Д форм, хотя это не столь выражено, как у доноров. В то же время, у отдельных случайных добровольцев отличий от здоровых добровольцев не наблюдалось. В среднем содержание ПТ также не отличалось, но у некоторых представителей этой группы выявлены С₂ формы (рис. 1). Несмотря на то, что их количество ни у одного случайного добровольца не превышало 1%, у них наблюдается спонтанная агрегация (1,5±0,1 отн ед), повышенные 0,1 мкмоль АДФ-индуцированная агрегация (2,1±0,3 отн ед) и реакция освобождения (20,3±2,9 усл ед), хотя СОТ не менялся. Встречающиеся в ряде работ данные о присутствии С₂ форм в крови здоровых лиц может быть связано с недостаточно строгим отбором людей для включения в группу нормы.

По сравнению с цельной кровью, в ОТП увеличивается количество С₁ и уменьшается число Д форм в результате активации, вызванной процедурой выделения тромбоцитов. В то же время производимые при выделении действия не влияют на состояние С₂ и ПТ, количество которых в ОТП и цельной крови одинаково.

Анализ проведенных исследований в различных группах относительно здоровых лиц позволил нам выбрать группу отобранных здоровых добровольцев в качестве контроля для исследования морфо-функциональных особенностей тромбоцитов. Можно говорить о минимальной гетерогенности тромбоцитов у этой группы лиц, чей пул представлен преимущественно Д формами, минимальным количеством ПТ и отсутствием С₂ форм, что ограничивает возможность исследовать эти субпопуляции.

В поиске возможности использования лабораторных животных для изучения функциональных свойств тромбоцитов различных субпопуляций, мы исследовали кровь бодрствующих крыс, кроликов, мышей и сусликов. У всех видов животных в цельной крови основная часть пула тромбоцитов представлена Д формами, которые различаются по размеру и структуре. У крыс Д формы более уплощенные и крупнее, чем у других животных. У кроликов, мышей и сусликов тромбоциты субпопуляции Д более выпуклые, но без признаков активации. Максимальное количество Д форм обнаружено в крови крыс и кроликов, в то время как у мышей и сусликов их количество меньше, но одновременно с этим повышено число С₁ с гладкой поверхностью и без выраженных псевдоподий, что говорит о минимальной активации.

Таблица 1. Морфо-функциональные особенности тромбоцитов у различных видов лабораторных животных. Агрегация в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ.

Ни у одного из видов интактных животных не обнаружены С₂ тромбоциты. В то же время у крыс почти в 5 раз увеличено число циркулирующих ПТ. У остальных животных их содержание сходно с наблюдаемым у ЗД. Такая морфологическая гетерогенность пула тромбоцитов крысы отличает ее от других видов лабораторных животных.

Межвидовые различия касаются и функциональной активности кровяных пластинок. Спонтанная агрегация отсутствовала у всех видов животных. АДФ-индуцированная агрегация была самой высокой у кроликов, а наиболее низкой у крыс. Сходные различия касаются и способности к экзоцитозу: тромбоциты крыс наименее активны по этому параметру (табл. 1).

Выявленные особенности морфологии и функции тромбоцитов у крыс могут быть связаны с тем, что эти животные наиболее восприимчивы к эмоциональному стрессу, а иммобилизация, которой они подвергались для взятия крови, приравнивается у них к такому состоянию. Это позволило нам предположить, что стрессорные воздействия различной природы могут влиять на изменение пула тромбоцитов, и в частности на появление ПТ.

2. Роль катехоламинов в регуляции тромбоцитарного пула крыс

Одним из компонентов стресс-реакции в организме рассматриваются катехоламины. Принципиальная трудность, связанная с исследованием причин и взаимосвязи между стрессорной ситуацией и ответом, заключается в количественной оценке вызывающего стресс стимула. В этой связи удобной моделью активации симпато-адреналовой системы является метаболический стресс, вызванный введением 2ДГ.

Рисунок 2. Изменение концентрации адреналина и норадреналина в крови на фоне метаболического стресса, развившегося в ответ на болюсное введение через вживленный катетер бодрствующим крысам 2ДГ. Первая доза составляла 125 мг/кг, вторую дозу (375 мг/кг) вводили через 15 мин. * - p<0,05; ** - p<0,01.

Исходно концентрация адреналина и норадреналина в плазме крови составляли 0,158±0,052 нг/мл и 0,393±0,065 нг/мл соответственно. Через 15 мин после введения крысе первой дозы 2ДГ (125 мг/кг) уровень адреналина возрастал почти в 12 раз. Максимальный его прирост (в 41 раз) наблюдался через 15 мин после введения второй дозы, равной 375 мг/кг, и далее менялся незначительно в течение двух часов. Общий выброс норадреналина после первой дозы увеличивался в 1,4 раза, а после второй дозы - в 2,7 раза, в дальнейшем сохраняясь повышенным в 2,5 раза (рис. 2).

Уже через 15 мин после введения первой дозы 2ДГ количество тромбоцитов в крови возрастает на 31% (рис. 3).

Рисунок 3. Количество тромбоцитов в крови крыс до и через 15 мин после введения первой и 120 мин после введения второй доз 2ДГ. * - p<0,05.

Реально в физиологическом состоянии треть тромбоцитов секвестрируется в селезенку. Под действием высоких концентраций катехоламинов они могут достаточно быстро покидать это депо, что и может быть причиной повышения их количества в крови. Через 2 часа наблюдалось увеличение количества тромбоцитов еще на 8%. и одновременно имело место появление более длинных и находящихся на разных стадиях деления ПТ.

Это может быть связано со стимуляцией стресс-поэза и запуском продукции тромбоцитов из мегакариоцитов, находящихся на ранних стадиях созревания. Такой поворот событий вполне реален, если учитывать, что стадия полиплоидизации и созревания может занимать менее 90 мин после поступления стимула.

Рисунок 4. Содержание ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса в зависимости от времени взятия проб после введения 2ДГ. * - p<0,05 по отношению к первоначальным показателям до введения 2ДГ (0 точка);^ - p<0,05 по отношению к показателям на 15^й мин, соответствующей введению первой дозы 2ДГ.

В то же время через 15 минут после введения 2ДГ содержание ПТ возрастает почти в 5 раз (p<0,01) (рис.4). Трудно себе представить, что за такой короткий срок такое повышение может произойти за счет рождения из мегакариоцитов. Это подтверждает высказанное ранее предположение о выбросе запасного пула из селезенки, так как известно, что именно молодые клетки задерживаются в ней, где и происходит их дальнейшее созревание.

Полученные данные позволили выбрать для проведения дальнейших исследований ПТ временной интервал в 120 мин после введения 2ДГ, за который в крови появляется достаточно большое количество ПТ разного происхождения, но животные еще не погибают.

На рис. 5 (А, Б) представлены отдельные ПТ, на дистальных концах которых происходит формирование Д форм (В), остающиеся еще соединенными с основной структурой. Обнаружены ПТ различной длины (от 2 мкм до 20 мкм), находящиеся на разных стадиях деления. Большинство биполярных ПТ имели длину 2-4 мкм и закругленные или вытянутые сужающиеся концы. Именно такие более короткие формы появлялись в первые 15 мин. после введения 2ДГ, что свидетельствует о том, что именно они находились в селезенке. Можно предположить, что в таком виде ПТ остаются после последнего отделения Д форм и задерживаются в селезенке для «дозревания». Через 2 часа в крови появляются более длинные, делящиеся ПТ.

Рисунок 5. А, Б, В - различные формы ПТ в крови крыс в условиях метаболического стресса, СЭМ, увеличение х2500 - 7000. 1 бар - 2мкм. Г, Д, Е - внутренняя структура ПТ, ТЭМ, Г, Д, - увеличение х40000, Е - увеличение 10000, стрелками отмечены места формирования Д тромбоцитов.

Ультраструктура ПТ значительно отличается от структуры Д форм (рис. 5 Г, Д). На дистальных концах ПТ концентрируются пучки микротрубочек, которые отличаются плотной упаковкой и способствуют удержанию вытянутой биполярной формы. У Д форм микротрубочки располагаются по внутреннему периметру мембраны: при активации они рассеиваются хаотически по цитоплазме и вследствие этого происходит изменение формы и переход из Д в С₁ формы. В делящихся ПТ микротрубочки более выражены в сформировавшемся, но еще не отделившемся участке, который в дальнейшем даст начало Д форме (Е). Понятно, что именно такое расположение микротрубочек способствует как поддержанию формы и формированию перетяжек на концах ПТ, так и отделению новых Д тромбоцитов.

Кроме разницы в форме, важнейшим отличием является величина плотных гранул и их количество в ПТ. Для биполярных, размером до 4 мкм ПТ характерно почти двукратное снижение количества гранул (р<0,05) и увеличение их размера (p<0,001). В более длинных делящихся ПТ плотные гранулы были единичными, а в отдельных клетках отсутствовали.

Мы предположили, что такие различия в морфологической картине могут влиять на функциональную активность тромбоцитов. Создавая метаболический стресс, т.е. условия, когда значительно повышается выброс в кровоток ПТ, у нас появилась возможность исследования функциональной активности этих форм и оценки вклада данной субпопуляции в общее состояние всего пула.

Агрегационная способность тромбоцитов крыс по сравнению с человеком снижена. У здоровых животных, находящихся в бодрствующем состоянии, агрегация тромбоцитов в крови, взятой через катетер, находится в пределах 18 - 42 % (рис. 6). В крови таких животных циркулирует от 4,2 до 7,3 % ПТ, а основную часть (83±9,1 %) составляют Д формы. Спонтанная агрегация отсутствует. В условиях метаболического стресса спонтанная агрегация тромбоцитов у крыс также отсутствовала, а индуцированная 5 мкмоль АДФ была снижена и ни у одного животного не достигала нижней границы нормы (рис.6). Возможно, что именно присутствие значительного количества ПТ вызывает такую агрегационную картину всей популяции пластинок.

Рисунок 6. Агрегация тромбоцитов интактных крыс (контроль) и через 2 часа после введения 2ДГ. Жирными горизонтальными линиями отмечены пределы показателей у здоровых животных. Индуктор агрегации - 5 мкмоль АДФ.

Для проверки этой гипотезы были исследованы образцы ОТП после исследования процесса агрегации. Кюветы для агрегатометрии после ее измерения оставляли на столе на 5 мин для того, чтобы образованные агрегаты осели на дно, а затем отбирали надосадок и определяли в нем содержание тромбоцитов разной формы. Подсчитывали также общее количество клеток в ОТП и супернатанте, чтобы выяснить, сколько тромбоцитов не способны к образованию агрегатов.

У контрольных крыс 32,8±2,7% тромбоцитов не участвуют в образовании агрегатов и остаются в суспензии. Среди одиночных тромбоцитов находится 39,3±4,7% Д форм, 44,0±3,9% С₁ форм и 16,1±1,8% ПТ. Увеличение числа С₁ форм связано с активацией тромбоцитов Д формы под действием АДФ, но в основном это были мелкие, с гладкой поверхностью, по-видимому старые или рефрактерные пластинки. Увеличение содержания ПТ в суспензии (р<0,001) свидетельствует о том, что они не участвуют в образовании агрегатов и их число по отношению к другим формам растет. Более ярко это проявляется при метаболическом стрессе. Вне агрегатов остается 23,8±2,7% Д форм, 21,4±3,1% С₁ форм и 55.2% ПТ. Значительное количество ПТ, не включившихся в состав агрегатов, остается в неизмененном виде. Такое увеличение числа ПТ в надосадке по сравнению с ОТП (р<0,001) связано с тем, что часть Д и С₁ форм уходит в агрегаты, а все ПТ остаются в нем, и их содержание по отношению к другим формам возрастает. Такая картина подтверждает неспособность ПТ взаимодействовать друг с другом и тромбоцитами других субпопуляций и позволяет сделать вывод об их функциональной инертности в отношении агрегации.

Таблица 2. Содержание различных по морфологии тромбоцитов у крыс, находящихся в условиях метаболического стресса среди адгезированных и не способных к адгезии клеток.

Адгезивные свойства ПТ также изменены. Около трети тромбоцитов крыс, пребывающих в метаболическом стрессе адгезируют к фольге и стеклу, а к подложкам, покрытым коллагеном IV типа еще меньше. Остальные, неприкрепившиеся, легко смываются с поверхностей. К поверхностям адгезировали активные формы, а неактивные оставались в смывах. Практически все ПТ оказывались среди последних, что говорит об их неспособности выполнять функцию адгезии (табл. 2).

Исследование адгезивных свойств тромбоцитов, не способных к агрегации (см. раздел на стр. 18) показало, что только 7,3±1,5% из них способны к адгезии. Но ПТ и в этом эксперименте оставались инертными. Сходная картина получена при исследовании агрегации тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии. В ответ на 5 мкмоль АДФ ни в одном образце агрегация не наблюдалась. Поскольку более 50% пула составляли инертные ПТ, именно они могут снижать агрегационный ответ всего пула. Спонтанная агрегация также отсутствовала.

Реакция освобождения (экзоцитоз). Тромбоциты контрольных крыс способны захватывать флуоресцентный маркер и накапливать его внутри гранул (эндоцитоз). В ответ на стимул они почти полностью высвобождают его в окружающую среду, удерживая лишь незначительное количество, рассеянное в цитоплазме. Через 2 часа после введения 2ДГ, на фоне повышения в крови содержания ПТ, способность к эндоцитозу возрастает на 28% (p<0,05), а освобождение метки снижается на треть (p<0,01). Флуоресцентная микроскопия показала, что метка остается внутри гранул, вызывая ярко-красное свечение. У тромбоцитов, оставшихся в смыве после адгезии, на фоне повышенного на 33% эндоцитоза, освобождение метки снижается в 2,5 раза (p<0,01). Это может быть связано с тем, что в ПТ как в молодых клетках, внутриклеточные гранулы содержат только небольшое количество веществ и часто даже не визуализируются, так как могут находиться в «слипшемся» состоянии. Этим определяется их повышенный потенциал к эндоцитозу. В то же время, резкое снижение экзоцитоза может зависеть как от потребности клеток в насыщении гранул, так и от нарушения в них такой физиологической функции как реакция освобождения.

Взаимодействие ПТ с лейкоцитами. Для проверки способности ПТ образовывать лейкоцитарно-тромбоцитарные агрегаты, мы добавляли суспензию отмытых аутологичных лейкоцитов (1:50) к образцам тромбоцитов из смыва после адгезии, в которых сконцентрированы ПТ. После инкубации этой смеси в течение 15 мин при 37⁰С и перемешивании (1200 об/мин) с помощью СЭМ было обнаружено образование гетероклеточных агрегатов. При подсчете тромбоцитов до и после этих манипуляций выяснилось, что их количество в свободном состоянии снизилось на 7,4±1,1%, и это произошло за счет уменьшения числа Д форм. ПТ оставались в суспензии и не участвовали во взаимодействии с лейкоцитами. Это свидетельствует об их инертности и по отношению участия в воспалительных реакциях.

Анализ полученных данных о неспособности ПТ к адгезии и агрегации, взаимодействию с лейкоцитами, а также сниженной реакции освобождения позволил сделать вывод об их инертности.

Демедулляция надпочечников у крыс приводила к тому, что уровень адреналина в плазме крови животных не превосходил предел его хромотографического определения (0,02 нг/мл) ни до, ни после введения 2ДГ. Базальная концентрация норадреналина в плазме демедуллированных крыс оказалась выше, чем у крыс с интактными надпочечниками. После введения полной дозы 2ДГ она повышалась в 2,5 раза, что было сходным с показателями у интактных крыс.

У демедуллированных крыс в крови обнаружено не более 4% ПТ (2,9±0,6%), что было ниже этого показателя у тех же животных до операции. Агрегационная активность тромбоцитов не отличалась от показателей у интактных животных. После введения 2ДГ количество ПТ не изменялось, но большинство тромбоцитов имели С₁ форму. Агрегация тромбоцитов в ответ на АДФ у большинства животных превышалась, что может быть связано с умеренным возрастанием (в 2-3 раза) уровня норадреналина, который оказывает активирующее действие на пластинки.

Адреноблокаторы празозин, тропафен и пропраналол предотвращали повышение в крови ПТ, происходящее на фоне стрессорного воздействия, что можно объяснить блокадой выброса запасного пула тромбоцитов селезенкой. Агрегация тромбоцитов на фоне блокады б и в-адренорецепторов повышалась, хотя есть различия в ее степени. В первую очередь это связано с отсутствием в общем пуле инертных, неспособных к агрегации ПТ.

Эксперименты по демедулляции надпочечников и действию адреноблокаторов указывают на то, что изменения морфологии и функциональных свойств тромбоцитов обусловлено не непосредственным введением 2ДГ, а именно стрессорной реакцией.

3. Образование ПТ в условиях in vitro

В патологических условиях (например, при курении, стрессе и особенно кардиогенном шоке) в крови повышается уровень катехоламинов, которые могут существенно содействовать внутрисосудистой агрегации тромбоцитов. Возможно, именно выброс значительного количества инертных ПТ в циркуляцию является защитной реакцией организма против развития массированного тромбоза на фоне гиперкатехоламинемии. Хотя нельзя было исключить и более прямого пути, связанного с непосредственным влиянием высоких концентраций катехоламинов на трансформацию тромбоцитов разных субпопуляций, присутствующих в кровотоке, в биполярные формы ПТ. В наших экспериментах in vitro адреналин, серотонин и гистамин в концентрациях 10^-8 - 10^-7 моль индуцируют агрегацию тромбоцитов, а в более высоких (выше 10^-5 моль) - являются дезагрегантами. Инкубация ОТП с катехоламинами в концентрации 10^-7 моль не приводила к появлению ПТ в суспензии. Повышение концентрации веществ до 10^-4 моль принципиально не меняло картину, что свидетельствует об отсутствии прямого влияния катехоламинов на трансформацию тромбоцитов в формы, характерные для ПТ.

Ионы Са² играют важную роль в поддержании формы тромбоцитов. По нашим данным, при использовании ЭДТА в качестве антикоагулянта в крови, отсутствуют ПТ. Это позволило предположить, что связывание двухвалентных катионов, происходящее на фоне добавление ЭДТА к ОТП с высоким содержанием ПТ, может приводить к потере их формы.

Рисунок 7. Влияние хелатирования, вызванного добавлением 1 мкмоль ЭДТА, на содержание тромбоцитов разных субпопуляций в крови крыс, пребывающих в состоянии метаболического стресса. * - p<0,05; ** - p<0,001.

После инкубации с ЭДТА тромбоцитов крыс с метаболическим стрессом, ПТ теряли свою биполярную форму и их количество уменьшалось, содержание С₁ форм повышалось, а количество Д форм снижалось (рис. 7). Микроскопический анализ выявил, что среди сферических тромбоцитов попадаются более крупные, с гладкой поверхностью или с длинными псевдоподиями, т.е. формы, которых не было до добавления ЭДТА. Вероятно, они появляются в результате преобразования ПТ, которые первоначально присутствовали в ОТП. Изменение их формы может влиять на показатели СОТ, исследование которого проводят на фоне ЭДТА.

ИЛ-2 и ИЛ-6, влияющие на созревание и пролиферативную активность мегакариоцитов и стимулирующие рождение ПТ, после инкубации с ОТП в течение 3 мин при 37⁰ С не влияют на форму и агрегационную активность тромбоцитов in vitro. Известно, что ИЛ-2 стимулирует иммунную реактивность лимфоцитов, а также синтез и экспрессию ИЛ-1 и ФНО-б. Добавление к ОТП предварительно инкубированных с ИЛ-2 аутологичных лимфоцитов приводило к активации тромбоцитов и увеличению количества С₁ форм на фоне снижения Д форм, что может быть связано с взаимодействием с лейкоцитами. Но интерлейкины, ни непосредственно сами, ни опосредованно через лейкоциты, не вызывают образования ПТ.

4. Состояние тромбоцитов в условиях хранения тромбомассы

Для выяснения возможности трансформации тромбоцитов при длительном нахождении в условиях in vitro (5 дней), исследовали концентраты тромбомассы, полученные с помощью разных методов - традиционным «в осадке» и с использованием процедуры получения из лейкоцитарной пленки, так называемым «buffy coat».

В течение хранения количество тромбоцитов в тромбомассе менялось. В «buffy coat» уже в первые сутки хранения количество тромбоцитов повышалось в среднем на 7,1%, незначительно падало к 3 суткам и затем понижалось на 5-е сутки (рис. 8 А). В контейнерах с «осадком» через сутки количество пластинок сохранялось, на 3 сутки повышалось на 9,7%, после чего снижалось к 5 дню. На первые сутки хранения в «buffy coat» увеличивается количеств ПТ, среди которых есть тромбоциты длиной до 10 мкм. В дальнейшем их число снижалось и к 5 дню достигало первоначального уровня. В «осадке» сходное, но более выраженное повышение начиналось на 3 сутки и продолжало расти и к 5 дню (рис. 8 Б). С₂ формы отсутствовали во всех исследованных пробах.

Спонтанная агрегация во всех исследованных образцах отсутствовала. АДФ-индуцированная (5 мкмоль) агрегация в начале хранения была достоверно выше (р<0,01), чем в донорской крови (рис. 8 В). Однако в дальнейшем она снижалась в зависимости от срока хранения. Это может быть связано как с деградацией тромбоцитов, так и с повышением количества функционально инертных ПТ, хотя до 3-х суток агрегация сохранялась в пределах нормальных величин.

Рисунок 8. Динамика изменения количества тромбоцитов в тромбомассе, полученной разными методами, при хранении в течение 5 суток (А); содержание ПТ в общем пуле (Б); агрегация тромбоцитов в ответ на добавление 5 мкмоль АДФ (В). * - p<0,05; ** - p<0,001 по сравнению с показателями в 1^й час хранения.

СОТ в образцах «buffy coat» через сутки хранения повышался (р<0,05), а затем постепенно снижался и к 5-му дню был меньше, чем в первый час хранения. Повышение СОТ объясняется скорее всего тем, что под действием ЭДТА ПТ изменяют форму и увеличиваются в объеме, и именно присутствие в контейнерах ПТ ведет к повышению СОТ на 1-3 сутки хранения. Появление на 5 сутки мелких тромбоцитов приводит к снижению СОТ.

Повышение общего количества тромбоцитов и увеличение числа ПТ в контейнерах при 5-ти дневном хранении in vitro и сохраняющейся контролируемой стерильности можно объяснить присутствием в них циркулирующих мегакариоцитов, которые нам удалось выявить при микроскопии (рис. 9). По разным данным в венозной крови здоровых лиц присутствует от 1 до 20 мегакариоцитов на 1,5 мл. С учетом того, что один мегакариоцит может продуцировать от 10³ до 6х10⁴ тромбоцитов, достаточно попадания в контейнер нескольких мегакариоцитов, чтобы значительно повысить количество тромбоцитов. Мощным регулятором тромбоцитопоэза в данных условиях могут служить цитокины, которые вырабатываются лейкоцитами, находящимися в тромбомассе. Есть данные, что содержание интерлейкинов зависит от величины контаминации лейкоцитами (Wadhwa et.al., 1996). Это относится в первую очередь к ИЛ-1, ИЛ-6 и TGF-в, уровень которых постепенно возрастает к 5-му дню хранения. В то же время содержание ИЛ-8 повышается уже в первые сутки.

То, что ни в одном из образцов не обнаружено С₂ форм, подтверждает мнение о невозможности трансформации в эти формы тромбоцитов других субпопуляций. Мы предполагаем, что С₂ тромбоциты вырабатываются только клетками костного мозга и не образуются из циркулирующих мегакариоцитов, которые по литературным данным имеют пониженную плоидность.

Рисунок 9. Мегакариоцит из контейнера с тромбомассой на 3-и сутки хранения. 1 Бар соответствует 5 мкм.

В то же время быстрое появление ПТ в условиях in vitro позволяет предположить, что и в организме человека in vivo они могут образовываться не только в костном мозге, но и из циркулирующих мегакариоцитов.

5. Гетерогенность тромбоцитов человека c различными патологиями

У больных атопической бронхиальной астмой, которая часто сопровождается воспалительной реакцией, отмечены повышенная активность тромбоцитов и накопление на их поверхности IgE и IgG. С целью снижения содержания этих иммуноглобулинов, играющих важную роль в патогенезе заболевания, у больных проводили процедуру тромбоцитофереза, удаляя из организма до 60% (в среднем оставалось 102,4±9,7 тыс/мм³) тромбоцитов. Количество тромбоцитов восстанавливалось до первоначального уровня через сутки (до - 295,7±31, после - 316,6±27 тыс/мм³).

До проведения процедуры тромбоциты были активированы, в пуле присутствовали С₂ формы, содержание которых кореллировало с уровнем спонтанной агрегации (r=0.448. р>0,05). После процедуры тромбоцитофереза, на фоне достоверного повышения количества Д и снижения содержания С₁ форм, исчезали С₂ тромбоциты и почти в 6 раз увеличивалось число ПТ (табл. 3).

Таблица 3. Содержание тромбоцитов разной формы и их агрегация у больных бронхиальной астмой до и после тромбоцитофереза. * - p<0,05; ** - p<0,001 - по сравнению с данными до процедуры.

Такая картина свидетельствует о стимуляции мегакариоцитопоэза и включении пути быстрой выработки тромбоцитов для пополнения утерянного пула. Агрегационный ответ снижался, спонтанная агрегация исчезала у всех больных, а индуцированная была даже ниже нормальных величин у большей части больных. Это может быть связано с повышением количества неактивнях, функционально инертных ПТ.

Феохромоцитома (ФХЦ). Учитывая ранее установленный факт, что избыточная концентрация катехоламинов изменяет состав пула и функциональное состояние тромбоцитов у крыс, логично было предположить, что у больных ФХЦ возможна сходная картина. Экскреция адреналина, норадреналина и ВМК с суточной мочой у больных ФХЦ в десятки раз выше, чем у здоровых лиц и больных АГ с подозрением на ФХЦ, которая после детального обследования была отвергнута.

Таблица 4. Соотношение различных форм тромбоцитов и экскреция катехоламинов.

Содержание ПТ у больных ФХЦ также на порядок больше, чем у здоровых и больных АГ (p<0,001). Длина их может колебаться от 3 мкм до 10 мкм, а толщина - от 0,4 мкм до 1 мкм. Клетки субпопуляции С₂ не обнаружены (табл. 4). Общее число тромбоцитов в периферической крови во всех случаях было сходным. Агрегация тромбоцитов, индуцированная 2 мкмоль АДФ, у больных ФХЦ достоверно снижена по сравнению со здоровыми, хотя для больных АГ характерно даже некоторое ее повышение. После операции удаления ФХЦ уровень экскреции катехоламинов и содержание ПТ нормализуются, что существенно отличает их от значений до хирургического вмешательства. Изменения количества Д и С₁ форм недостоверны. После удаления опухоли агрегационный ответ также восстанавливается. Спонтанная агрегация наблюдалась у всех больных после операции, что может быть вызвано воспалительным процессом, сопровождающим вмешательство, и у 3 из 15 пациентов с АГ.

Присутствие в пуле тромбоцитов значительного количества инертных ПТ снижает его общую функциональную активность. Этим можно объяснить невысокую агрегационную способность тромбоцитов у больных ФХЦ, что в свою очередь может служить причиной геморрагических осложнений. Так, у одного из 18 больных ФХЦ (случай злокачественной АГ) во время операции удаления опухоли возникло массивное интраоперационное кровотечение. В основе кровотечения лежало нарушение тромбоцитарного звена гемостаза с развитием ДВС-синдрома, в связи с чем больная умерла на третьи сутки после операции, несмотря на повторные переливания донорской крови. Сходные осложнения отмечены и другими авторами.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что количество тромбоцитов биполярной формы значительно повышается только у больных с ФХЦ. Содержание их в крови, превышающее 17%. может служить диагностическим тестом ФХЦ (Авторское свидетельство № 1446527), что особенно важно в случаях с "нехарактерной" клинической симптоматикой и должно нацеливать на дальнейший поиск в плане топической диагностики ФХЦ.

Воспаление. Тот факт, что интерлейкины регулируют мегакариоцитопоэз, и в то же время их уровень повышается при воспалительных процессах разной природы, позволил нам предположить, что это может повлиять на появление в крови разных субпопуляций тромбоцитов.

У больных пневмонией, острым пиелонефритом, с гнойными абсцессами, содержание С-реактивного белка в крови было повышено (>5мг/дл). Известно, что его повышение сопровождается увеличением уровня цитокинов, и в первую очередь ФНО-б. На этом фоне в 3-4 раза увеличивалось содержание ПТ (p<0,001) и появилось до 4% С₂ форм (p<0,001). Спонтанная агрегация регистрировалась у всех больных. Выявлена корреляция между спонтанной агрегацией и содержанием С₂ форм (r=0,596, p=0,02). АДФ-индуцированная агрегация у большинства больных оставалась в пределах нормальных величин. Еще более выраженной была картина у больных менингитом и менингококкцемией, при которых уровень цитокинов может быть повышен в сотни раз. При генерализованных формах менингококковых инфекций у больных развивается тромбогеморрагический синдром, для различных фаз которого характерны либо тромбозы, либо геморрагические явления.