Конструирование лекарственных препаратов на основе корпускулярных носителей и изучение механизмов их взаимодействия с клетками ретикулоэндотелиальной системы животных

Рис. 14 Накопление диминазена в лимфоцитах

Рис. 15 Накопление диминазена в эритроцитах

Таким образом, при применении мицеллярной лекарственной формы проникновение действующего вещества в клетки крови увеличивается примерно вдвое по сравнению с традиционно применяемой лекарственной формой диминазена.

С учетом приведенных выше данных, нам представляется резонным вопрос о том, как происходит проникновение препарата во внутреннюю среду клеток - посредством диффузии или активного переноса? В связи с этим мы провели ряд экспериментов, в которых определяли накопление водорастворимой, мицеллярной и липосомальной форм диминазена в живых и убитых антибиотиком А23187 перитонеальных макрофагах (рис. 16, 17).

Рис. 16 Накопление диминазена в живых и убитых перитонеальных макрофагах при использование водного раствора диминазена

Рис. 17 Накопление диминазена в живых и убитых перитонеальных макрофагах при использовании мицеллярного раствора диминазена

В результате проведенных исследований было установлено, что:

при культивировании клеток в присутствии мицеллярного диминазена препарат накапливался в макрофагах до концентрации 2.07±0.16 мкг/мл. Однако при обработке клеток антибиотиком А23187 (за 30 мин до введения препарата) накопление диминазена было менее интенсивное и составило 0.97±0.09 мкг/мл;

при культивировании клеток в присутствии водного раствора диминазена препарат накапливался в макрофагах до концентрации 0.7±0.027 мкг/мл. Обработка клеток антибиотиком А23187 не вызвала изменения в концентрации накопившегося препарата, которая составила 0.91±0.06 мкг/мл;

липосомальный препарат диминазена внутри перитонеальных макрофагов не накапливался, что, скорее всего, связано с агрегацией липосом при культивировании.

В опытах с животными было отмечено, что диминазен из липосомной формы склонен накапливаться в макрофагах и в меньшей степени - в печени и почках. Накопление его в селезенке, сыворотке крови и в легких было относительно низким. При этом диминазен из мицеллярной формы значительно накапливался в печени и перитонеальных макрофагах. Заметное его количество обнаруживается и в почках. Диминазен же водной формы присутствовал, главным образом, в почках, концентрировался в печени, относительно мало накапливаясь в селезенке.

Резюмируя приведенные выше данные можно отметить, что мицеллы (как и КЗ) могут использоваться в качестве эффективных носителей для лекарственных веществ и антигенов. При этом мицелла обладает более пластичным строением, а наличие поверхностно активного вещества улучшает способность коньюгированного с ней антигена проникать в мишени через мембраны клеток. Однако мицеллу сложно назвать полноценной наночастицей из-за статистического характера структуры мицеллообразующих систем. Что, судя по всему, не оказывает существенного влияние на биологические свойства данных комплексов.

Опираясь на эти исследования, мы провели разработку инъекционной мицеллярной лекарственной формы на основе диминазена и мицеллярной гелевой формы на основе ивермектина для наружного применения.

3.7. Разработка инъекционной лекарственной формы на основе диминазена и изучение ее фармакологических свойств

В ветеринарии препараты диминазена встречаются в форме порошков, которые растворяют в воде перед применением. Это связано с их низкой стабильности в водной среде (Karvonen et al., 1985; Campbell et al., 2004). В связи с тем, что диминазен ацетурат имеет в водном растворе крайне низкую стабильность, мы получили гидрофобную соль диминазена, чтобы в дальнейшем разработать на ее основе стабильный мицеллярный инъекционный препарат.

Была разработана методика получения диминазена ди- и моно - бензоата из диминазена ацетурата и бензоата натрия. По мере проведения реакции в реакционной смеси могут образовываться две соли диминазена - диминазен дибензоат и диминазен монобензоат (рис. 18, 19).

Dm(Az)2 + 2BzNa Dm(Bz)2 + 2AzNa

Рис. 18 Структурная формула и реакция получения диминазена дибензоата

Dm(Az)2 + BzNa > DmBz + Na(Az)2

Рис. 19 Структурная формула и реакция получения диминазена монобензоата

У полученных нами солей диминазена была измерена температура плавления и проверена их растворимость в органических растворителях. У диминазена монобензоата температура плавления оказалась ниже, чем у диминазена ацетурата, и составляет 2081°С. Так как диминазен дибензоат содержит в своем составе две молекулы бензойной кислоты, это повышает его температуру плавления, и она составляет 2281°С.

Одним из основных требований, предъявляемых к активному веществу, входящему в состав инъекционного лекарственного препарата, является его способность растворяться в фармакопейных органических растворителях. Поэтому следующим этапом нашей работы была проверка полученных нами солей на их способность растворятся в фармацевтических растворителях.

Наилучшая растворимость у диминазена монобензоата наблюдается в пропиленгликоле и составляет 6.22%. В остальных растворителях он растворяется хуже и его растворимость составляет в метаноле 1.9%, в этаноле 1.72%, в диметилацетамиде 3.14%. У диминазена дибензоата мы наблюдали лучшую растворимость, и она составила в метаноле 3.06%, в этаноле 3.34%, в диметилацетамиде 5.3%, а в пропиленгликоле 5.44%.

Принимая во внимание эти данные, мы провели конструирование инъекционной лекарственной формы на основе диминазена как активного вещества. В качестве растворителя нами был выбран диметилацетамид, так как он обладает небольшой токсичностью и сравнительно низкой себестоимостью.

Сначала мы провели конструирование лекарственной формы диминазена на водноорганической основе. В табл. 5 приведена рецептура данной композиции.

Таблица 5 Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

Однако полученный нами раствор показал низкую стабильность - диминазен выпал в осадок. Поэтому для повышения стабилизации лекарственной формы в препарат был внесен колидон 12PF в 7% концентрации. Однако данный раствор так же не обладал высокой стабильностью. Поэтому мы поставили перед собой задачу изучить возможность заключения диминазена в мицеллярную систему.

В табл. 6 приведена рецептура мицеллярной композиции диминазена с применением неионогенного поверхностно активного вещества Твин-80 в качестве мицеллообразующего агента. Приготовление лекарственной формы осуществляли в следующей последовательности. Готовили навеску органического растворителя, диметилацетамида, после чего растворяли в ней диминазен при постоянном перемешивании. К полученному раствору добавляли солюбилизатор Твин-80 и бензиловый спирт в качестве консерванта. Композицию перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли при постоянном перемешивании стабилизатор Колидон 12PF и феназон, предварительно растворенные в необходимом объеме воды. Готовый препарат фильтровали. В данной рецептуре приводятся оптимальные концентрации мицеллообразующего агента в препарате, повышение и понижение данного компонента в лекарственной форме приводит к снижению стабильности препарата.

Таблица 6 Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

Получив предварительную лекарственную форму диминазена, мы проверили ее терапевтическую активность на ограниченном поголовье при различных паразитарных заболеваниях.

Опыты по предварительному изучению антипаразитарной эффективности препарата Неозидин М (7% раствор, рабочее название «Диминазен 70») при бабезиозе крупного рогатого скота провели в апреле-мае 2002 г. на базе ААПЗ «Губский» Мостовского района Краснодарского края. В первом опыте на 20 коровах, спонтанно инвазированных B. bigemina, провели изучение эффективности новой лекарственной формы диминазена при его одно- и двукратном введении в стандартных дозировках - 1 мл на 20 кг массы тела животного (3.5 мг/кг по действующему веществу (д.в.)). В результате исследований установлено, что более 95% животных (19 из 20) выздоровело уже после его однократного введения и 5% остальных животных (1 корова) после повторной инъекции с интервалом в 24 ч после первой.

У животных после первой инъекции резко падала температура тела (до уровня физиологической нормы), появлялся аппетит, жвачка, резко улучшалось общее состояние. Случаев вынужденного убоя животных зарегистрировано не было. Побочных явлений и осложнений при применении Неозидина М не отмечали. Во второй серии опыта на 30 спонтанно инвазированных животных молодняка крупного рогатого скота провели сравнительное изучение эффективности Неозидина М и порошковых препаратов на основе диминазена: Неозидин и Беренил. В результате эксперимента установлены сходные данные от применения препаратов Неозидин и Беренил (табл. 7). При лечении животных сконструированной нами новой мицеллярной лекарственной формой диминазена (даже без дополнительного применения жаропонижающих средств) были отмечены наиболее хорошие результаты. Препарат в 100% случаев применяли однократно. Побочного действия препарата на организм животных не отмечали.

Таким образом, эффективность Неозидина М при бабезиозе крупного рогатого скота, вызванном B. bigemina несколько выше таковой у базовых препаратов, а дозу 3.5 мг/кг массы тела животного можно считать терапевтической.

Таблица 7 Сравнительная эффективность разных препаратов на основе диминазена

В связи с тем, что в предварительных экспериментах Неозидин М показал более высокую эффективность по сравнению с водными растворами порошкообразных лекарственных форм диминазена, мы провели титрацию терапевтической дозы сконструированной нами новой лекарственной формы диминазена.

Испытания по титрации терапевтических доз Неозидин М (в виде 7% лекарственной формы диминазена) провели в период летней вспышки (июнь-июль 2003 г.) бабезиоза, вызванного В. bigemina, на базе районной ветеринарной лечебницы Левокумского района Ставропольского края, стационарно неблагополучного по кровепаразитарным болезням. Всего в исследованиях было задействовано 30 голов крупного рогатого скота, спонтанно инвазированных В. bigemina. Диагноз на пироплазмоз ставили комплексно: учитывали эпизоотологические, клинические данные, данные ксенодиагностики и результаты лабораторного исследования мазков периферической крови. Неозидин М вводили однократно внутримышечно по следующей схеме: животным первой группы (n = 10) в стандартной для всех препаратов диминазена дозе 1.0 мл/20 кг массы тела (3.5 мг на 1 кг по д.в.); коровам второй группы (n = 15) - в дозе 1 мл/30 кг массы тела (2.5 мг на 1 кг по д.в.). Еще 5 головам коров третьей группы применили препарат в дозе 1 мл/40 кг массы тела (1.75 мг на 1 кг по д.в.). При необходимости инъекции повторяли с интервалом 24 ч.

Во всех случаях параллельно проводили симптоматическое лечение: внутривенно борглюконат кальция с глюкозой, подкожно кофеин бензоат натрия, вещества стимулирующие работу преджелудков. Эффективность терапии учитывали по исчезновению клинических признаков заболевания и результатам лабораторных исследований (отсутствие бабезий в мазках из периферической крови). Кроме того, проводили общие гематологические исследования как до, так и через 3 и 10 дней после начала лечения.

В результате исследований установлена 100%-ная эффективность двух из исследованных доз Неозидина М (2.5 и 3.5 мг/кг) при пироплазмозе крупного рогатого скота (табл. 8). У животных после инъекции наблюдали следующее: резко падала температура тела (до уровня физиологической нормы), появлялся аппетит, жвачка, резко улучшалось общее состояние. Возбудителя заболевания в мазках периферической крови не обнаруживали уже через 1-2 дня после начала лечения. Полное выздоровление животных наступало через 3±0.3 дня.

При применении дозы 1.75 мг/кг массы тела по д.в. во всех случаях приходилось проводить двукратную инъекцию препарата, а одному животному (в связи с ухудшением общего состояния) пришлось применять третий раз, уже в дозе 3.5 мг/кг массы тела. Побочного действия препарата на организм животных не отмечали, осложнений не выявляли.

Таблица 8 Данные по титрации терапевтических доз 7% мицеллярного раствора Неозидин М

Аналогичные результаты были получены для бабезиоза, вызванного В. divergens.

Таким образом, какой-либо разницы в антипаразитарной активности разных доз применения Неозидина М не зарегистрировано, и дозу 2.5 мг/кг массы тела животного по д.в. можно считать терапевтической при бабезиозе крупного рогатого скота.

Проведя наши исследования, мы пришли к выводу о возможности сокращения количества активнодействующего вещества в основной рецептуре препарата. Поэтому в дальнейшем была проведена ее доработка.

В табл. 9 приведена рецептура лекарственной формы диминазена, содержащей сниженное количество активнодействующего вещества. Приготовление лекарственной формы осуществляли в следующей последовательности. Готовили навеску органического растворителя, диметилацетамида, после чего растворяли в ней диминазен при постоянном перемешивании. К полученному раствору добавляли солюбилизатор Твин-80 и бензиловый спирт в качестве консерванта. Композицию перемешивали до полного растворения. К полученному раствору добавляли при постоянном перемешивании стабилизатор Колидон 12PF и феназон, предварительно растворенные в необходимом объеме воды. Готовый препарат фильтровали.

Таблица 9 Фармацевтическая композиция инъекционной лекарственной формы на основе диминазена

В данной рецептуре приводятся оптимальные концентрации активнодействующего вещества в препарате. Понижение данного компонента в лекарственной форме приводит к снижению эффективности препарата. В дальнейшем нами были проведены работы по изучению физико-химических и фармакологических свойств разработанного нами препарата.

Для любого фармакологического вещества необходимо определение его токсикологических характеристик, а также распределения и метаболизма в организме животных. Без знания этих параметров и степени влияния вещества на организм животного невозможна дальнейшая работа по изучению его терапевтической эффективности.

В связи с тем, что Неозидин М представляет собой новую лекарственную форму, нами, кроме определения острой токсичности на лабораторных животных (белые мыши), было проведено изучение его субхронической токсичности на разных видах продуктивных животных (собаки, телята и ягнята) и хронической токсичности на лабораторных животных (крысы).

Изучение параметров острой токсичности Неозидина М в форме 7% мицеллярного раствора проводили на основании «Методических рекомендаций по изучению общетоксического действия фармакологических веществ», утвержденных Минздравом РФ 29 декабря 1997 г. Острая токсичность определялась на белых мышах методом пробит-анализа, предложенного Литчфилдом и Уилкоксоном в модификации З. Рота с определением ЛД0, ЛД16, ЛД50, ЛД84 и ЛД100. Для опыта было взято 30 нелинейных белых мышей (самцы, масса 19-21 г). Исходный раствор препарата вводили внутрибрюшинно в различных дозах - от 1.43 до 2.49 мл/кг массы тела или 100-175 мг/кг по а.д.в. (диминазену). Каждую из 5-ти доз препарата вводили однократно группе из 6 животных (растворитель - дистиллированная вода).

Наблюдение за общим состоянием животных, состоянием шерстного покрова, подвижностью и чувствительностью к внешним раздражителям проводили до и в течение 5 дней после введения препарата. Клинические признаки токсического действия: резкое снижение двигательной активности, атаксия, тремор, угнетение дыхания. Гибель животных наступала в течение нескольких первых часов после введения препарата. ЛД50 для новой лекарственной формы диминазена (7% мицеллярный раствор) при его внутрибрюшинном введении и ее стандартная ошибка составили 142±7 мг/кг веса мыши, что в 39 раз превышает терапевтическую дозу.

Таким образом, на основании существующих правил по степени острой токсичности Неозидин М относится к группе малоопасных веществ (4 класс опасности согласно ГОСТ 121.007-76).

Затем мы определяли хроническую токсичность Неозидина М. Для чего препарат вводили внутрибрюшинно крысам-самцам трех групп с первоначальной массой тела 110-120 г. Неозидин М применяли в форме раствора с Твин-80 в течение 4 месяцев в различных дозах. Крысам первой группы вводили рабочий раствор (в пересчете на Неозидин М) в дозе 0.08 мл/кг/день (1/250 от ЛД50 - 0.6 мг/кг/день по диминазену); 2-ой группы - 0.0016 мл/кг/день (1/500 от ЛД50 - 0.3 мг/кг/день по диминазену), 3-ей группы - 0.00016 мл/кг/день (1/5000 от ЛД50 - 0.03 мг/кг/день по диминазену). В контрольную группу включали крыс-самцов такого же возраста и массы. Контрольные животные ежедневно получали равный объем стерильного физиологического раствора. В течение всего опыта вели наблюдение за состоянием и поведением животных, динамикой роста массы тела, регулярно проводили исследования по оценке функционального состояния печени, почек и изучали влияние препарата на гематологические показатели. Статистическую обработку полученных данных проводили по Стьюденту-Фишеру.

Результаты исследований показали, что в течение опыта (125 суток) не отмечалось гибели животных ни в одной из подопытных групп по причине действия препарата. Неозидин М во всех испытанных дозах не оказал отрицательного влияния на внешний вид, физиологическое состояние и поведение крыс.

Изучение местно-раздражающего действия Неозидина М проводили на базе СПК «Белокаменский» Старополтавского района Волгоградской области. Препарат вводили в/м в дозе 1 мл на 20 кг массы тела животного. Препарат вводили 10 телятам, 2 группы по 5 голов на каждую пропись (в виде 7 и 5% растворов), инъецировали препарат в область крупа. Ягнятам вводили с внутренней стороны бедра, 2 группы по 5 голов на каждую пропись. В результате проведенных исследований показано, что Неозидин М не обладает местно-раздражающим действием, а припухлость в месте инъекции объясняется большим количеством вводимого раствора.

На сегодняшний день известно, что многие препараты не только в обычных (терапевтических) дозировках, но и в минимальных дозах вызывают различные аллергические реакции организма. Определение сенсибилизирующих (аллергизирующих) свойств Неозидина М проводили на морских свинках по целому ряду методик: в реакции непрямой дегрануляции тучных клеток по методу Фрадкина, в иммунологических тестах для выявления реакции клеток крови на аллерген in vitro: реакция специфической агломерации лейкоцитов (РСАЛ) и реакция специфического лизиса лейкоцитов (РСЛЛ). Из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что Неозидин М практически не обладает сенсибилизирующим действием.

Иммунотоксичность Неозидина М определяли по характеру влияния препарата на Т- и В-клеточные звенья иммунной системы организма животных. Оценку Т-клеточного звена иммунитета проводили по выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) и аутологичным розеткообразующим клеткам (ауто-РОК). Было показано, что Неозидин М не оказывает выраженного отрицательного действия на Т-клеточное звено иммунитета. Оценку В-клеточного звена иммунной системы проводили путем определения антителообразующих клеток (АОК), кинетики В-лимфоцитов и титров гемагглютининов в сыворотке крови мышей. Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что Неозидин М, введенный интрамускулярно однократно, незначительно снижает иммунный ответ в течение 5-ти дней после его применения.

Для определения титров гемагглютининов животных обеих групп внутрибрюшинно иммунизировали 10%-ной суспензией ЭБ. На 7-й день все мыши были убиты и у них были определены титры общих антител и антител классов M и G (табл. 10). Из данных таблицы следует, что титры общих антител (АТ) у подопытных животных несколько ниже, чем таковой у контрольных, а разница в их содержании статистически недостоверна.

Таблица 10 Результаты исследования титров антител

Примечание: разница показателей относительно контроля статистически недостоверна (Р 0.05).

Таким образом, Неозидин М практически не угнетает Т- и В- клеточное звено иммунитета и обладаем сравнительно мягким иммуносупрессивным действием.

Исследование фармакокинетических параметров препарата Неозидин М проводили на телятах черно-пестрой породы (6 голов) подобранных по принципу «аналогов» (вес, питание, содержание). Возраст 3-4 мес, средний вес - 13212 кг. Животные были здоровыми (определялась температура тела, пульс, величина зрачка, внешний вид и поведение). Животных разбили на 2 группы по 3 головы. Первой группе вводили 5% Неозидин М. Второй группе вводили беренил в виде 7% водного раствора. Препараты вводили однократно, внутримышечно в максимальной дозе, согласно инструкциям по применению (1 мл на 20 кг живой массы).

На рис. 20 показана динамика концентрации диминазена в плазме крови телят после введения Неозидина М и беренила. При применении беренила отмечается резкое повышение концентрации (4.3±0.4 мкг/мл) диминазена в плазме крови в течение первых двух часов и его последующее снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения.

При применении Неозидина М постепенное повышение концентрации диминазена до 1.1±0.1 мкг/мл в плазме наблюдалось в течение четырех часов с момента введения. Затем отмечено его постепенное снижение, которое выходит на плато через 72 ч и составляет 0.06±0.01 мкг/мл. После этого концентрация диминазена в плазме медленно снижается, и он обнаруживается вплоть до 192 ч после введения.

Рис. 20 Динамика концентрации диминазена в плазме телят

Более низкая концентрация диминазена в плазме крови после применения Неозидина М объясняется более высокой степенью ее накопления в клетках крови по сравнению с водными растворами аналогов.

Анализ проб молока, полученного от животных после однократной внутримышечной инъекции Неозидина М, показал отсутствие диминазена в молоке в определимых концентрациях во всех пробах. На основании полученных результатов можно утверждать, что молоко от коров, обработанных Неозидином М, можно употреблять без ограничений.

В современной литературе имеется большое количество данных по применению и эффективности препаратов на основе диминазена. Но все эти работы посвящены порошку диминазена, растворяемому в воде перед инъекцией (Mdachi et al., 1995; Jacobson et al., 1996; Tuntasuvan et al., 2003). Однако работа с препаратом диминазена ацетурата связана с рядом трудностей. Во-первых, сам препарат выпускается в больших фасовках и поэтому перед применением приходится готовить навески, что снижает стерильность используемого вещества. Во-вторых, в растворенном виде препарат хранится не более 1-2 дней при +4°С, что повышает стоимость лечения. Поэтому при проведении широких производственных испытаний мы стали акцентировать внимание на эффективности и безопасности разработанного нами препарата.

В связи с тем, что в экспериментах по титрации терапевтических доз Неозидина М было установлено, что при двух наиболее распространенных бабезиозах крупного рогатого скота, вызываемым B. bigemina и B. divergens, терапевтической дозой сконструированной нами новой лекарственной формы диминазена является 2.5 мг д.в./кг массы тела животного, и с целью снижения себестоимости лекарственного средства в дальнейшем широкие испытания пироплазмицидной эффективности проводили только с 5% вариантом препарата. Новую лекарственную форму диминазена всем животным водили в дозе 1 мл на 20 кг массы тела или 2.5 мг/кг по диминазену (активно действующему веществу).

Работу по изучению эффективности препарата при бабезиозах крупного рогатого скота проводили в разных регионах России. Всего в процессе работы было задействовано 754 головы крупного рогатого скота разных половозрастных групп (быки-производители, коровы, молодняк старше года) и пород (черно-пестрая, симментальская, красно-пестрая, калмыцкая, айрширская, герефорд), спонтанно инвазированных бабезиозом в различной степени интенсивности. В результате проведенных исследований установлена 97-100% эффективность однократного применения 5% лекарственной формы мицеллярного Неозидина М при всех бабезиозах крупного рогатого скота (табл. 11).

При двукратном же применении препарата в тяжелых запущенных случаях препарат проявлял 100% активность против B. bigemina, B. bovis и B. divergens. Какой-либо разницы в эффективности препарата в зависимости от половозрастных групп или породы крупного рогатого скота нами не выявлено.

Таким образом, наши предварительные исследования полностью подтвердились результатами широких испытаний, проведенных на значительном поголовье крупного рогатого скота в разных природно-климатических и социально-экономических зонах России. Аналогичные результаты были получены при бабезиозах овец и лошадей.

Таблица 11 Результаты широких испытаний активности 5% формы Неозидина М при бабезиозах крупного рогатого скота

Все вышеперечисленное позволяет отнести сконструированную нами лекарственную форму диминазена к высокоперспективным препаратам, который заслуживает дальнейшего широкого внедрения в ветеринарную паразитологическую практику.

В заключение данного раздела можно отметить, что перевод соли диминазена из гидрофильного в гидрофобное состояние позволил получить его воднодисперсную форму, обладающую лучшими фармакодинамическими свойствами. Способность поверхностно-активного вещества улучшать проникновение лекарства в эритроциты приводит к повышению терапевтической эффективности самой лекарственной формы. Тогда как снижение дозы вводимого препарата приводит к уменьшению его токсического эффекта. Наш опыт позволяет также предположить возможность конструирования более широкого спектра ветеринарных препаратов на основе водных дисперсий ПАВ.

3.8. Разработка ветеринарного препарата наружного применения на основе мицеллярно-гелевой формы ивермектина

Препараты наружного применения широко используются в ветеринарии и медицине. Поэтому нами также решалась задача разработки эффективной лекарственной системы для борьбы с наружными паразитами животных на основе мицеллярно-гелевой системы. В качестве активного противопаразитарного вещества нами был взят ивермектин - препарат, обладающий высокой противопаразитарной активностью, но слабой растворимостью.

Для определения степени влияния различных формообразующих вспомогательных компонентов, входящих в состав гелевой формы (лутрол, кремофор, глицерин), на ее физико-химические свойства были проведены оценки вязкости различных рецептур гелевых систем. На основании полученных данных нами была проведена разработка и оптимизация лекарственной формы препарата Ивермек-гель.

Препарат «Ивермек-гель» представляет собой опалесцирующий прозрачный гель желтоватого цвета. Номенклатура сырья для приготовления 10 г препарата указаны в табл. 12.

Таблица 12 Номенклатура и квалификация сырья

Изучение влияния препарата «Ивермек-гель» на организм собак провели на базе питомника «Военный завод № 9» г. Энгельса Саратовской области. В опытах было задействовано 6 собак, подобранных по принципу аналогов: 3-м животным ежедневно в течение 14 дней препарат наносили на выстриженные участи кожи (S = 10 см3) в дозе 1.0 см3 на животное, 3-м другим собакам - в течение того же срока и в той же дозе на внутреннюю поверхность ушной раковины. Контролем служили 3 клинически здоровых животных, которым ничего не вводили. Подопытные животные подвергались тщательному клиническому осмотру с определением общего состояния организма, упитанности, состояния видимых слизистых оболочек. Для определения влияния препарата «Ивермек-гель» на гематологические и биохимические показатели, у собак из подкожной вены голени отбирали кровь как до, так и через 5, 10 и 20 суток после начала применения препарата. Из гематологических показателей определяли количество эритроцитов, лейкоцитов и выводили лейкоцитарную формулу.

Для изучения гепатотоксического действия препарата определяли ферменты переаминирования, а именно АсАТ и АлАТ. Кроме того, определяли содержание в крови общего белка.

Результаты исследований показывают, что гематологическая картина после субхронического применения препарата у подопытных собак существенно не изменялась. Что касается ферментов переаминирования, то у животных отмечалось некоторое увеличение активности АсАТ и незначительные колебания активности АлАТ как через 5, 10 и 20 суток после дачи препарата «Ивермек-гель». Однако разница между этими значениями была статистически недостоверна, что дает основание констатировать отсутствие гепатотоксического действия у препарата. Содержание общего белка находилось в пределах физиологической нормы, а снижение его уровня с 59±0.6 г/л до 58±0.4 г/л (на 5 день) было статистически недостоверным (табл. 13, 14).

Таким образом, ежедневное применение препарата «Ивермек-гель» в течение 14 дней не оказывает влияние на гомеостаз организма и препарат не обладает токсическим воздействием.

Определение сенсибилизирующих (аллергизирующих) свойств препарата «Ивермек-гель» проводили на кроликах и морских свинках по целому ряду методик (см. выше). Из результатов проведенных исследований можно сделать вывод, что препарат «Ивермек-гель» не обладает сенсибилизирующим действием.

Таблица 13 Влияние препарата «Ивермек-гель» на гематологические биохимические показатели собак (P>0.05)

Таблица 14 Показатели крови подопытных и контрольных собак

Испытание местно-раздражающих свойств препарата «Ивермек-гель» проводили на 4 собаках (возраст 2 года, вес 15 кг). Трем собакам на кожу наносили препарат в дозе 1 см3 на животное, четвертая служила контролем, ей наносился физиологический раствор в тех же дозах. Перед применением участки кожи предварительно выстригались ножницами и выбривались, площадь участка 10 см2. После 7 ежедневных аппликаций препарат в той же дозе однократно наносили на другой участок кожи, расположенный с противоположной стороны, который также предварительно выстригался и выбривался. Животных осматривали после каждого нанесения через 0.5, 3 и 5 ч. В результате осмотра собак установили, что аллергических реакций на нанесение препарата в виде покраснения, припухлости и зуда не наблюдали ни через 30 мин, ни через 3 и 5 ч после каждого нанесения. После этого тем же животным препарат вводили в ухо в дозе 1 мл, видимых изменений со стороны ушных раковин у подопытных и контрольных животных не отмечали.

Таким образом, по полученным результатам проведенных исследований на собаках препарат «Ивермек-гель» не обладает местно-раздражающими свойствами.

Затем мы проводили анализ остаточных количеств ивермектина в сыворотке крови и его фармакокинетики при наружном применении собакам, кошкам и кроликам.

Исследования проводили на базе вивария СГАУ им. Н.И. Вавилова и питомника собак Военного завода № 9 г. Энгельса.

При нанесении препарата на кожу нами были получены следующие результаты (табл. 15, 16), пик концентрации в плазме составил 1.3 нг/мл, период полураспада препарата (Т1/2) - 2.7 ч; площадь под кривой концентрация/время (AUC) - 13.2.

При внутриушном введении пик концентрации в плазме - 1.3 нг/мл; Т1/2 - 2.4 ч; площадь под кривой концентрация/время - 4.02.

Таблица 15 Фармакокинетика ивермектина после внутриушного и накожного применения препарата «Ивермек-гель»

Таблица 16 Фармакологические параметры выделения ивермектина из плазмы собак при внутриушном и накожном применении препарата «Ивермек-гель»

Сходные результаты были получены при изучении фармакокинетики ивермектина на кроликах и кошках.

Эксперименты по определению остаточных количеств ивермектина после применения препарата «Ивермек-гель» проводили на кроликах породы шиншилла 6 месячного возраста, подобранных по принципу «аналогов» (вес, питание, содержание). Средний вес животных - 2,60,2 кг, количество - 16 голов. Животные были здоровыми (определялась температура тела, пульс, величина зрачка, внешний вид и поведение), препаратами ивермектина не обрабатывались. Перед началом эксперимента проводили капрологический анализ на наличие яиц и личинок гельминтов (заражение гельминтозами не обнаружено) и обследование на акарозы (клещей не обнаружено). Ивермек-гель вводили внутрь ушной раковины в дозе 2,0 мл на животное, дважды с интервалом 3 дня. Для исследования отбирали образцы печени, мышц и жировой ткани в количестве 50-70 г после забоя каждого животного. Пробы замораживали до -10-18 С и транспортировали в лабораторию.

Определение остаточных количеств ивермектина проводили для каждого животного в отдельности, в табл. 17 показаны усредненные данные. Показаны средние значения количества ивермектина и стандартное отклонение.

Таблица 17 Средние значения количества ивермектина в тканях и органах кроликов

Из таблицы видно, что ко 2-му дню (через 36 ч) ивермектин полностью элиминируется из мышечных тканей и ушной раковины кроликов (место введения), к этому сроку в печени обнаруживаются только следы (на грани чувствительности метода). Полностью из организма кроликов он элиминируется через 2 суток после применения препарата. Таким образом, сроки предубойной выдержки препарата у кроликов составляют 3 суток после последнего применения препарата «Ивермек-гель».

В результате проведенных исследований установлена 100%-ная эффективность применения препарата «Ивермек-гель» против Psoroptes cuniculi у кроликов разных пород и половозрастных групп при его одно- или двукратном нанесении на пораженные участки ушных раковин в дозе 0,5-2 мл с интервалом 5-7 дней. Живых клещей в соскобах кожи с внутренней поверхности ушной раковины не обнаружили уже после первого применения препарата (100% выздоровление).

Сходные результаты получены при применении растворов синтетических пиретроидов (неостомазан или бутокс). При применении терпентинного масла эффективность была ниже на 16%. Кроме того, срок выздоровления животных при применении препарата «Ивермек-гель» по сравнению с другими препаратами и способами лечения сокращался в среднем на 4.5-12 дней.

Таким образом, препарат «Ивермек-гель» является эффективным средством при псороптозе кроликов, проявляющих высокую акарицидную активность против P. cuniculi. Не менее эффективным оказалось применение разработанного препарата против клещей родов Otodectes, Sarcoptes, Demodex, Notoedres.

Заключение и выводы

На протяжении последних лет биология и медицина существенно обогатились рядом новых достижений, связанных с применением наноматериалов. Однако многие вопросы данного направления до сих пор являются недостаточно проработанными. Так, при ярко выраженных плюсах применения наноносителей, конъюгированных с различными веществами, остается во многом открытым вопрос о механизмах взаимодействия данных комплексов с различными функциональными системами организма.

В данной работе мы рассмотрели ряд проблем, связанных с конструированием терапевтических средств на основе корпускулярных носителей и изучением их взаимодействий с иммунокомпетентными клетками для их использования в терапевтических и профилактических целях. Мы полагаем также, что эти данные могут способствовать развитию представлений о молекулярных и клеточных механизмах иммуномодулирующего действия наночастиц в составе их комплексов с антигенами.

В том числе, было проведено изучение взаимодействия низкомолекулярных веществ, ассоциированных с КЗ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы. Было установлено, что иммунизация лабораторных животных данными комплексами приводит к образованию поликлональных антител на низкомолекулярные вещества (ивермектин, диминазен и кленбутерол). При изучении взаимодействия комплексов низкомолекулярных веществ и КЗ с перитонеальными клетками нам удалось определить локализацию данных веществ в цитоплазматическом пространстве, а так же установить участие КЗ в более интенсивном накоплении низкомолекулярных веществ в клетках.

С помощью метода иммунозолотого дот-анализа и полученных нами поликлональных антител мы исследовали биодинамику низкомолекулярных веществ (диминазена и ивермектина) в биологических жидкостях животных, и провели сравнение данного метода с высокоэффективной жидкостной хроматографией. Последнее показало сопоставимость чувствительности определения антигенов обоими методами при существенно большей простоте иммуноанализа.

Проведенное нами изучение взаимодействия высокомолекулярных веществ, ассоциированных с КЗ, с клетками ретикулоэндотелиальной системы показало, что данный антиген проникает в перитонеальные клетки животных и повышает их митохондриальное дыхание. Введение самого КЗ в популяцию перитонеальных клеток также приводило к повышению их ферментативной активности. Получив эти результаты, мы предположили, что золото обладает адъювантными свойствами. Для подтверждения этого предположения были проведены эксперименты с введением данного препарата в организм лабораторных животных. В ходе этих исследований мы установили, что комплекс КЗ с антигеном не только усиливает активность фагоцитирующих клеток, но и повышает титр антител к вводимому антигену, что косвенно может указывать на стимуляцию КЗ клеток лимфоидного ряда.

Аналогичные результаты мы получили и при использовании в качестве корпускулярных носителей мицелл, полученных при помощи неионогенных поверхностно активных веществ. В этой части работы мы исходили из того, что внесение в данную систему высокомолекулярных и низкомолекулярных веществ должно обеспечивать получение препаратов, обладающих более высокой терапевтической эффективностью за счет повышения биодоступности активного вещества.

Мы установили, что поверхностно активные вещества проникают через мембрану перитонеальных клеток и накапливаются в их цитоплазме. При этом активные вещества вместе с мицеллообразующим агентом также проникают и накапливаются во внутриклеточном пространстве.

Кроме низкомолекулярных веществ, мы рассмотрели и действие высокомолекулярных соединений, заключенных в мицеллы. Установлено, что введение высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного повышает активность как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета. Что может указывать на адъювантные свойства данного комплекса.

В качестве одного из низкомолекулярных активных веществ нами использовался диминазен. Это соединение (относящееся к группе ароматических диамидинов) известно как один из самых распространенных препаратов, применяемых в ветеринарии для борьбы с кровопаразитарными заболеваниями. Было показано, что разработанная нами новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М) обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной формой, что позволило нам снизить дозу применяемого препарата и тем самым уменьшить его токсичность.

На завершающем этапе нашей работы было установлено, что внесение мицеллярной системы в лутрольную основу может привести к формированию геля, содержащего в качестве активного вещества ивермектин и обладающего уникальными свойствами. Препарат, приготовленный на этой основе, показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

Полученные в настоящей работе результаты были нацелены как на пополнение фундаментальных знаний в областях биохимии и фармакологии, так и на их практическое использование. В этой связи отметим, что в настоящее время в нашей стране выпускается большое количество различных ветеринарных препаратов. Но в большинстве своем - это аналоги зарубежных разработок. Поэтому предложенные нами новые лекарственные формы на основе наноструктур можно рассматривать как развитие эффективных подходов к улучшению свойств уже имеющихся биологически активных веществ. Мы выражаем надежду, что это может послужить стимулом к разработке целой группы новых сравнительно недорогих лекарственных препаратов в ветеринарной медицине.

Исходя из результатов работы, можно сформулировать следующие выводы:

Установлено, что иммунизация лабораторных животных конъюгатами ивермектина, диминазена и кленбутерола с золотыми наночастицами приводит к образованию поликлональных антител на данные низкомолекулярные вещества, обеспечивающих их применение для определения ивермектина и диминазена в биологических жидкостях животных с чувствительностью, сопоставимой с результатами метода ВЭЖХ.

Показано, что при взаимодействии с перитонеальными клетками коньюгатов низкомолекулярных веществ с золотыми наночастицами данные вещества локализуются в цитоплазматическом пространстве. При этом в присутствии коллоидного золота накопление низкомолекулярных веществ в клетках происходит более интенсивно.

Обнаружено, что при взаимодействии с клетками ретикулоэндотелиальной системы высокомолекулярных веществ, конъюгированных с золотыми наночастицами, данные антигены проникают в перитонеальные клетки и усиливают их митохондриальное дыхание. При этом введение самого коллоидного золота в популяцию перитонеальных клеток также приводит к повышению их ферментативной активности. Введение комплекса наночастиц золота с антигеном в организм подопытного животного не только повышает активность фагоцитирующих клеток, но и увеличивает титр антител, полученных к вводимому антигену.

При использовании в качестве корпускулярных носителей низко- и высокомолекулярных антигенов мицелл, полученных с использованием неионогенных ПАВ, отмечено проникновение антигенов через мембрану перитонеальных клеток и накопление в цитоплазме.

При введении мицеллярного комплекса высокомолекулярного вещества в организм лабораторного животного установлено повышение активности как неспецифических, так и специфических факторов иммунитета, что указывает на адъювантные свойства также и данного комплекса.

Разработана новая мицеллярная инъекционная лекарственная форма на основе диминазена (Неозидин М). Установлено, что она является стабильной и обладает более высокой терапевтической эффективностью по сравнению с исходной лекарственной формой, что позволяет снизить дозу применяемого препарата и уменьшить его токсичность.

Сконструирована новая мицеллярно-гелевая лекарственная форма для наружного применения на основе ивермектина (Ивермек-гель), оказавшаяся стабильной и обладающей высокой терапевтической эффективностью. Приготовленный на ее основе препарат показал хорошие терапевтические свойства при лечении ряда паразитарных заболеваний.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Даугалиева Э.Х., Сидоркин В.А., Семенов С.В., Жемеричкин Д.А., Староверов С.А. Сенсибилизирующие свойства препарата “Ивермек” // Ветеринария. - 2000. - № 11. - С. 26-28.

2. Даугалиева Э.Х., Сидоркин В.А., Семенов С.А., Жемеричкин Д.А., Староверов С.А. Влияние ивермека на показатели иммунного ответа у животных // Ветеринария. - 2000. - № 12. - С. 29-31.

3. Дыкман Л.А., Сумарока М.В., Зайцева И.С., Богатырев В.А., Староверов С.А. Использование частиц коллоидного золота в качестве носителя при получении антител in vivo // Межд. науч. конф. “Биотехнология на рубеже двух тысячелетий”. - Саранск, 2001. - С. 19-21.

4. Дыкман Л.А., Семенов С.В., Староверов С.А., Щербаков А.А., Ермилов Д.Н. Применение метода дот-иммуноанализа и конъюгато...