Всасывание продуктов гидролиза белков и углеводов: механизмы и регуляция

Размещено на http://www.allbest.ru/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П. ПАВЛОВА

На правах рукописи

Всасывание продуктов гидролиза белков и углеводов: механизмы и регуляция

03.00.13 - физиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Громова Людмила Викторовна

Санкт-Петербург 2008

Работа выполнена в Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург.

НАУЧНЫЙ КОНСУЛЬТАНТ доктор биологических наук, Андрей Андреевич Груздков (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург)

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ

доктор медицинских наук, профессор Владимир Иванович Овсянников (НИИ экспериментальной медицины РАМН, Санкт-Петербург)

доктор биологических наук, профессор Марина Николаевна Маслова (Институт эволюционной физиологии им.И.М. Сеченова РАН, Санкт-Петербург).

доктор биологических наук, Сергей Тимофеевич Метельский (ГУ НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН, Москва)

ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ Санкт-Петербургский государственный университет

Защита диссертации состоится « » ________________ 2008 года в ____ часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д 002.020.01) при Институте физиологии им. И.П. Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П. Павлова РАН.

Автореферат разослан « » ______________2008 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Н.Э. Ордян

гидролиз белок всасывание

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Исследование всасывания, т.е. переноса низкомолекулярных веществ, содержащихся в пище или образующихся в результате полостного и мембранного гидролиза пищевых биополимеров, из желудочно-кишечного тракта во внутреннюю среду организма, является одним из актуальных направлений физиологии пищеварения и питания.

Современные представления о функционировании пищеварительного аппарата (в том числе - в отношении всасывания пищевых веществ) сформировались во многом под влиянием открытия А.М. Уголевым в конце 50-х годов мембранного пищеварения. Локализация мембранного гидролиза пищевых веществ и всасывания образующихся продуктов на одной и той же поверхности - апикальной мембране энтероцитов - является одним из факторов, обеспечивающих тесную интеграцию этих процессов и высокую эффективность работы пищеварительно-транспортного конвейера.

В значительном прогрессе, достигнутом в исследовании механизмов всасывания пищевых веществ и его адаптации, важную роль сыграли различные аналитические (редуцированные) модели: от эвертированных препаратов тонкой кишки (обзоры: Уголев, 1972; 1985; Kimmich, 1981; Karasov, Diamond, 1987; Foulkes, 1996; Barthe et al., 1999; Тимофеева и др., 2000; Метельский, 2007) до везикул изолированных мембран щеточной каймы энтероцитов и клонированных мембранных транспортеров (Уголев, 1985; Уголев, Иезуитова, 1991; Hopfer, 1987; Cheeseman, Tsang, 1996; Kushak, Winter, 2005; Drozdowki, Thomson, 2006a; Wright et al, 2007).

На основе опытов с эвертированными препаратами тонкой кишки была разработана основная модель переноса глюкозы через энтероцит, предполагающая вход глюкозы через апикальную мембрану в клетки с участием натрий-зависимого вторичного активного транспорта и выход глюкозы из них через базолатеральную мембрану с участием облегченной диффузии (Crane et al., 1961), которая в дальнейшем получила развитие в отношении всасывания аминокислот и дипептидов (обзоры: Hopfer, 1987; Тимофеева и др., 2000; Kushak, Winter, 2005). Позднее были получены новые данные в пользу указанной модели благодаря выделению и клонированию апикального натрий-зависимого транспортера глюкозы SGLT1 и базолатерального транспортера облегченной диффузии глюкозы GLUT2 (обзоры: Hopfer, 1986; Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Kushak, Winter, 2005; Wright et al, 2007).

Вместе с тем в последние годы были предприняты попытки ревизии общепринятого представления о вторичном активном транспорте как основном механизме переноса глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов в тонкой кишке млекопитающих. Выдвинуты две новые гипотезы: о преимущественно парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды (Pappenheimer 1987, 2001) и об облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который включается в апикальную мембрану энтероцитов при высоких углеводных нагрузках (Kellett, Helliwell, 2000; Kellett, 2001).

Обе гипотезы основаны главным образом на результатах опытов in vitro или острых опытов in vivo на анестезированных животных. Вместе с тем при использовании разработанной А.М. Уголевым и Б.З. Зариповым (1979) методики хронических опытов было показано, что в отсутствие наркоза и операционной травмы гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке протекают с более высокой скоростью, а степень их сопряжения значительно выше, чем в случае широко применявшихся методов in vivo и in vitro. Существенные различия между острыми и хроническими опытами in vivo обнаружены в отношении реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на некоторые экспериментальные воздействия (введение уабаина и/или удаление ионов натрия) (Уголев и др., 1984; 1986; 1987), а также в отношении проницаемости преэпителиального («неперемешиваемого») слоя тонкой кишки, значительно более высокой в хронических опытах (Груздков, Громова, 1995; Levitt et al., 1996). Все это диктовало необходимость проверки указанных новых гипотез в условиях хронического опыта как наиболее близких к физиологическим.

Остается дискуссионным вопрос о соотношении транспорта продуктов расщепления белков через апикальную мембрану энтероцита в виде аминокислот, образующихся при мембранном гидролизе пептидов, и в виде малых пептидов (ди- и трипептиды), подвергающихся затем внутриклеточному гидролизу (обзоры: Grimble, Silk, 1989; Уголев и др., 1990; Тимофеева, 1993; Тимофеева и др., 2000; Adibi, 2003; Thwaites, Anderson, 2007). Следует отметить, что кинетические параметры транспорта аминокислот и олигопептидов до настоящего времени практически не исследовались в опытах in vivo в отсутствие наркоза и операционной травмы. Вместе с тем указанные факторы могут существенно изменять относительный вклад «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывание продуктов гидролиза белков.

В последние десятилетия установлены основные факторы, влияющие на протекание гидролитических и транспортных процессов в тонкой кишке (пищевые субстраты, желчь, панкреатический секрет, гормоны), среди которых ведущая роль отводится субстратному регулированию (Karasov, Diamond, 1987; Уголев и др., 1991; Levin, 1994; Ferraris, Diamond, 1997; Ferraris, 2001; Drozdowski, Thomson, 2006b; Wright et al, 2007). Но до настоящего времени нет ясности в отношении роли желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов (обзоры: Karasov, Diamond, 1983; 1987; Уголев и др., 1991б). В литературе имеются сведения, главным образом, о совместном действии желчи и панкреатического секрета. Представлялось важным выявить влияние каждого из них в отдельности на всасывательную способность тонкой кишки, в частности, в отношении всасывания продуктов гидролиза углеводов.

До сих пор при исследовании субстратной регуляции всасывания нутриентов в тонкой кишке практически не использовалась методика хронических экспериментов. Вместе с тем ее применение для этой цели имеет ряд важных преимуществ перед существующими методами, а именно: 1) проведение многократных опытов на одной и той же группе животных; 2) контроль уровня и специфичности локальной субстратной нагрузки на тонкую кишку и возможность выявления реакции на эту нагрузку со стороны соответствующих мембранных гидролитических и транспортных систем; 3) возможность исследования роли эндогенных (в основном, гормональных) факторов, сопутствующих изменению функционального состояния организма, на гидролитические и транспортные характеристики тонкой кишки.

Представлялось целесообразным использовать указанные преимущества хронических опытов для выявления особенностей регуляции всасывания нутриентов в изолированном участке тонкой кишки под влиянием регулярной субстратной нагрузки различной специфичности, а также системных факторов, сопутствующих полному голоданию, белковой депривации и наркозу.

Все вышеизложенное определило постановку цели и задач исследования.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Исследование механизмов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов в тонкой кишке и его адаптивной регуляции при действии различных люминальных и эндогенных факторов.

Для этого поставлены следующие ЗАДАЧИ:

1. Выявить относительную роль различных механизмов транспорта (парацеллюлярный перенос, облегченная диффузия с участием GLUT2, вторичный активный транспорт с участием SGLT1) во всасывании глюкозы в тонкой кишке.

2. Разработать математический подход и использовать его для оценки по данным, полученным в хронических опытах, «истинных» (с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) кинетических параметров мембранного гидролиза мальтозы и дипептидов, а также всасывания глюкозы, аминокислот и дипептидов.

3. Определить соотношение «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании дипептидов.

4. Оценить влияние различных по специфичности субстратных нагрузок на структурные и функциональные характеристики тонкой кишки.

5. Оценить роль желчи и панкреатического секрета в регуляции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.

6. Изучить влияние наркоза на гидролитические и транспортные процессы в тонкой кишке.

7. Исследовать влияние полного голодания и белковой депривации на гидролитические и транспортные функции тонкой кишки.

НОВИЗНА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ. Впервые показано, что высокие скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке крыс в диапазоне больших концентраций мальтозы имеют место в отсутствие всасывания воды (в случае гипоосмотических инфузатов) и даже на фоне секреции воды (в случае гиперосмотических инфузатов); эти результаты свидетельствуют о том, что парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.

Впервые показано, что флоретин (ингибитор GLUT2), введенный с мукозной стороны кишки, в условиях хронического опыта не только ингибирует всасывание глюкозы (или галактозы), но и способен неспецифически тормозить всасывание глицина. В опытах in vitro обнаружено, что он снижает выход глюкозы из энтероцитов в эвертированных мешках тонкой кишки и ингибирует активность пищеварительных ферментов в гомогенатах слизистой оболочки. Эти результаты позволяют заключить, что используемый рядом зарубежных исследователей подход, предусматривающий применение флоретина с мукозной стороны in vivo, дает завышенную оценку вклада облегченной диффузии и заниженную оценку вклада вторичного активного транспорта с участием транспортера SGLT1 во всасывание глюкозы.

С применением разработанного математического подхода впервые по данным о кинетике гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы в тонкой кишке в хронических опытах получена оценка проницаемости преэпителиального слоя и, с ее учетом, определены значения «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы. Это позволило впервые установить, что значительно бульшие скорости всасывания глюкозы в хронических опытах, по сравнению с острыми опытами in vivo, обусловлены не только лучшей проницаемостью преэпителиального барьера тонкой кишки, но и более высоким значением константы максимальной скорости активного транспорта глюкозы.

Впервые с применением разработанного математического подхода определены в условиях хронического опыта значения «истинных» кинетических констант мембранного гидролиза и всасывания дипептидов (глицилглицин и глицил-L-лейцин) и составляющих их аминокислот (глицин и лейцин), что позволило количественно оценить относительную роль «аминокислотной» и «пептидной» составляющих во всасывании каждого из этих дипептидов в широком диапазоне их концентраций.

В опытах с перевязкой желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов впервые показано повышение активного транспорта свободной глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов. После перевязки панкреатического протока у кроликов отсутствовали заметные изменения в активном транспорте глюкозы, образующейся при мембранном гидролизе крахмала. Повышение активного транспорта глюкозы в указанных отделах тонкой кишки обеспечивает сохранение высокой эффективности работы пищеварительно-всасывательного конвейера в отношении углеводных полимеров при снижении темпов полостного пищеварения вследствие недостаточности панкреатических ферментов.

Впервые исследована динамика развития адаптивных изменений гидролиза и всасывания различных субстратов в изолированном участке тонкой кишки крыс в хронических опытах при белковой депривации животных в течение двух недель. Обнаружены разнонаправленные изменения всасывания глюкозы, глицина и глицилглицина на разных сроках безбелкового рациона. Несмотря на то, что в некоторые сроки эти показатели снижаются, их уровень остается довольно высоким, что играет жизненно важную роль при возобновлении кормления.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ И ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ

Результаты данной работы вносят существенный вклад в развитие современных представлений о механизмах транспорта глюкозы, аминокислот и дипептидов в тонкой кишке млекопитающих в физиологических условиях. Полученные результаты показывают, что парацеллюлярный перенос на потоке воды, рассматривавшийся некоторыми исследователями как основной механизм всасывания глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках, в этих условиях не играет заметной роли. Наши данные свидетельствуют о том, что основным механизмом всасывания глюкозы является ее активный транспорт, опосредованный SGLT1, тогда как роль облегченной диффузии с участием GLUT2 становится существенной лишь при высоких углеводных нагрузках. Согласно результатам нашей работы, относительный вклад «пептидной» и «аминокислотной» составляющих во всасывание дипептидов в физиологических условиях определяется соотношением кинетических параметров мембранного гидролиза и мембранного транспорта конкретного дипептида.

Представленные результаты способствуют более глубокому пониманию путей и механизмов адаптивной регуляции всасывания нутриентов при действии различных люминальных и эндогенных факторов. Раскрыты особенности влияния наркоза и операционной травмы, присущих острым опытам in vivo, на всасывание нутриентов. Показано, что наркоз влияет на проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и на величину максимальной скорости активного транспорта глюкозы. Данные о реакции гидролитических и транспортных систем тонкой кишки на полное голодание и безбелковое питание предполагают участие эндогенных факторов, сопутствующих этим состояниям, в регуляции процессов всасывания продуктов гидролиза белков и углеводов. Показано сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ в условиях полного голодания или содержания крыс на высокоуглеводном безбелковом рационе, что, по-видимому, играет важную роль в обеспечении эффективного всасывания эндогенных субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасывания основных компонентов пищи при возобновлении питания. Проанализированы особенности изменения активного транспорта глюкозы в тонкой кишке после перевязки желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов. Полученные данные позволяют полагать, что повышение активного транспорта глюкозы в дистальных отделах тонкой кишки у крыс и в ее проксимальных отделах у кроликов направлено на сохранение эффективного всасывания глюкозы, образующейся при гидролизе углеводных полимеров, в условиях снижения темпов полостного пищеварения вследствие исключения желчи и панкреатического секрета.

Результаты экспериментального исследования различных механизмов всасывания глюкозы, а также механизмов гидролиза и всасывания дипептидов и аминокислот, могут иметь значение для совершенствования методов энтерального и парентерального питания, а также для оценки механизмов действия лекарственных веществ олигопептидной природы.

Результаты исследования субстратной регуляции всасывания в изолированном участке тонкой кишки крыс в условиях хронического опыта способствуют пониманию механизмов адаптивных перестроек тонкой кишки после хирургических вмешательств и могут быть полезны при разработке диетического питания в постоперационном периоде.

Данные о реакции всасывания свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе углеводов различной степени полимерности, на исключение желчи или панкреатического секрета расширяют представления о механизмах адаптивных перестроек тонкой кишки при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической -амилазы) и могут быть полезны для разработки лечебных диет при указанной патологии.

Исследование изменений функциональных характеристик изолированного участка тонкой кишки в хронических опытах, а также изменений функциональных характеристик препаратов тонкой кишки в опытах in vitro на фоне полного голодания или безбелкового питания, имеет практическое значение для разработки лечебных диет, обеспечивающих оптимальный рефидинг - переход от состояния голодания (лечебного или вынужденного) к нормальному питанию.

Математические подходы, позволяющие оценить проницаемость преэпителиального слоя тонкой кишки и, с ее учетом, «истинные» кинетические константы мембранного гидролиза и всасывания субстратов, могут найти применение при анализе результатов перфузионных исследований in vivo на животных и на человеке.

Данные, полученные в работе, могут быть использованы в курсах лекций по физиологии и биохимии.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Парацеллюлярный перенос на потоке воды не играет существенной роли во всасывании глюкозы в тонкой кишке при высоких углеводных нагрузках.

2. Транспорт глюкозы, опосредованный котранспортером натрия и глюкозы SGLT1, является основным механизмом всасывания этого моносахарида в тонкой кишке, тогда как облегченная диффузии с участием GLUT2 играет заметную роль лишь при высоких углеводных нагрузках.

3. Высокие скорости всасывания глюкозы в тонкой кишке в физиологических условиях обеспечиваются главным образом благодаря большой мощности системы вторичного активного транспорта глюкозы и высокой проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки.

4. Сохранение высокой эффективности функционироваания пищеварительно-всасывательного конвейера тонкой кишки в отношении углеводов при недостаточности полостного пищеварения (в частности, при недостаточности панкреатической -амилазы) обеспечивается за счет повышения способности кишечного эпителия к активному транспорту глюкозы.

5. Сохранение или повышение способности тонкой кишки к всасыванию основных пищевых веществ (глюкоза, аминокислоты, дипептиды) в условиях полного голодания или безбелкового питания может обеспечиваться действием эндогенных (гормональных) факторов и способствовать эффективному всасыванию этих субстратов, поступающих в тонкую кишку в составе пищеварительных соков и слущиваемого эпителия, а также всасыванию основных компонентов пищи при возобновлении питания.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИОННОГО МАТЕРИАЛА. Материалы работы доложены на II международной конференции «Средства математического моделирования» (Санкт-Петербург, 1999); I-V Всероссийских конференциях с международным участием «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 1999, 2001, 2003, 2005, 2007 гг.); IV, VI, VIII Международных конгрессах «Парентеральное и энтеральное питание» (Москва, 2000, 2002, 2004 гг.); ХIХ Съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004); XXXV Международном конгрессе физиологических наук (San Diego, USA); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005); Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные проблемы пищеварения и питания» (Санкт-Петербург, 2006); Международном симпозиуме «XXI Meeting European Intestinal Transport Group. March 3-6, 2007. Oberwiesenthal, Germany).

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликованы 52 работы, включая 27 статей в рецензируемых научных журналах, определенных ВАК РФ.

СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация изложена на 283 страницах, содержит 35 рисунков и 8 таблиц.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Эксперименты in vitro выполнены на 82 взрослых крысах (Вистар, самцы, масса тела 150Ї200 г) и на 18 взрослых кроликах (масса тела 2Ї3 кг). В хронических опытах in vivo использовано 65 крыс (Вистар, самцы, масса тела 150Ї200 г), на каждой из которых проведено около 15 опытов.

Содержание животных и все экспериментальные манипуляции осуществляли соблюдая «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных».

Методы исследования

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ПОДХОДЫ

Методы in vitro. При исследовании всасывания пищевых субстратов использовалась методика эвертированных мешков или отрезков тонкой кишки в нашей модификации (Громова, и др., 1992; Тимофеева и др., 1994). Инкубация препаратов проводилась при 37С в растворах глюкозы, мальтозы, глицина и глицилглицина в течение 20 - 60 мин в присутствии кислорода (оксигенация) или азота (аноксия). После инкубации в случае эвертированных отрезков определяли концентрацию субстрата в ткани препарата, а в случае эвертированных мешков - концентрацию субстрата в ткани и в серозной жидкости препарата. Определяли также объем серозной жидкости и вес препарата (без серозной жидкости). Аккумуляцию глюкозы в ткани и в серозной жидкости эвертированных мешков оценивали по количеству глюкозы в этих объектах в расчете на длину препарата и на 1 г влажного веса ткани препарата кишки. Об уровне активного транспорта субстрата судили по разнице в аккумуляции субстрата в условиях оксигенации и аноксии.

Активности мальтазы (НФ 3.2.1.20), б-амилазы (НФ 3.2.1.1), щелочной фосфатазы (НФ 3.1.3.1), аминопептидазы М (НФ 3.4.11.2) и глицил-L-лейциндипептидазы (НФ 3.4.13.2) в гомогенатах слизистой оболочки определялись по описанным ранее методикам (Тимофеева и др., 1986; Егорова и др., 1986).

Экспериментально-хирургические подходы. При исследовании роли желчи и панкреатического секрета во всасывании углеводов проводили (под наркозом) перевязку желчного протока у крыс и панкреатического протока у кроликов, а через 7 и 14 дней в опытах in vitro в препаратах тонкой кишки определяли активный транспорт свободной глюкозы и глюкозы, образующейся при гидролизе мальтозы и крахмала.

Методика хронического эксперимента. Техника хирургической операции и условия проведения экспериментов в основном были такими же, как в оригинальной методике А.М. Уголева и Б.З. Зарипова (Уголев, Зарипов, 1979; Уголев и др., 1986). У крыс после анестезии изолировали участок тощей кишки длиной около 20 см, в оба конца которого вставляли металлические фистулы, выводимые на боковую поверхность живота. Проходимость пищеварительного канала восстанавливали анастомозом «конец в конец».

Хронические опыты начинали через 7 - 8 дней после операции и продолжали в течение 6 - 7 недель. Во время эксперимента животное помещали в специальную клетку, имитирующую норку и обеспечивающую щадящую фиксацию положения животного в течение 2 - 3 часов. В ходе опыта полость изолированной петли перфузировали со скоростью около 0.5 мл/мин (в ряде случаев Ї около 0.3 мл/мин) растворами исследуемых субстратов, подогретыми до 38^oС. Кроме специально оговоренных случаев, все инфузаты были изоосмолярными. Растворы субстратов готовили на растворе Рингера с пониженной концентрацией NaCl (100 или 120 мМ). При наивысшей из использованных концентраций субстрата осмолярность инфузата была около 300-320 мОсм, т.е. близкой к осмолярности стандартного раствора Рингера. При низких концентрациях субстратов для поддержания изоосмолярности инфузатов в них добавлялось соответствующее количество маннита. Для оценки вклада активного компонента транспорта глюкозы в ее суммарное всасывание в ряде опытов изолированный участок перфузировали растворами глюкозы (75 или 100 мМ) в присутствии флоридзина (1 мМ) Ї конкурентного ингибитора транспортера SGLT1.

После предварительной 15-минутной перфузии раствором исследуемого субстрата данной концентрации последовательно отбирали 2 - 3 пробы (с интервалом 5 или 10 мин) для биохимического анализа. При этом измеряли объем проб. Как правило, каждый из опытов повторялся 1 - 2 раза на тех же экспериментальных животных. В дни, когда опыт не проводился, изолированной участок кишки перфузировали раствором глюкозы (25 или 50 мМ) с целью сохранения на достаточно высоком уровне его основных функциональных характеристик.

Скорости гидролиза дисахаридов, J_H , (мкмоль/мин), всасывания свободной глюкозы, J_А^сг , и глюкозы, образующейся при гидролизе дисахаридов, J_А^д , (мкмоль/мин), а также скорости всасывания воды, J_w , (мкл/мин), в изолированной петле тонкой кишки вычисляли по следующим формулам:

J_H = C_д,вх ? v_вх - (C_{д+гл,вых} - C_гл,вых) ? _vвых,

J_А^сг = C_гл,вх? v_вх - C_гл,вых ? v_вых,

J_А^д = C_д,вх? v_вх - C_{д+гл,вых} ? v_вых,

J_w = v_вх - v_вых,

где C_д,вх и C_гл,вх - концентрации дисахаридов и глюкозы, соответственно, в инфузате (мМ глюкозы); C_гл,вых - концентрация глюкозы в оттекающем перфузате, определенная глюкозооксидазным методом (мМ); C_{д+гл,вых} - суммарная концентрация сахаров в оттекающем перфузате, определенная антроновым методом (мМ глюкозы); v_вх - скорость инфузии (мл/мин); v_вых - скорость оттекания перфузата (мл/мин).

Аналогичные формулы использовали при расчете скоростей гидролиза и всасывания дипептидов и всасывания аминокислот. Кроме того, определяли коэффициент сопряжения гидролитических и транспортных процессов как отношение скорости всасывания глюкозы в изолированной кишечной петле к скорости ее образования при гидролизе мальтозы (Уголев и др., 1984; 1986).

По окончании хронических опытов производили декапитацию животного, извлекали кишку и измеряли массу, длину изолированного участка и площадь его серозной поверхности. Определяли также массу и площадь серозной поверхности функционирующего участка кишки аналогичной длины, расположенного ниже анастомоза. Эти данные использовали при расчетах скоростей гидролиза и всасывания исследуемых субстратов на единицу массы изолированного участка и площади его серозной поверхности.

Методы определения концентрации субстратов. Во всех опытах концентрацию глюкозы и 2-дезокси-D-глюкозы определяли глюкозооксидазным методом (Dahlqvist, 1964), концентрацию галактозы и сумму концентраций глюкозы и мальтозы (в мМ глюкозы) Ї антроновым методом (Scott, Melvin, 1953), концентрацию глицина Ї методом, разработанным в Лаборатории физиологии питания (Уголев, Тимофеева, 1969), концентрацию лейцина - методом оксидазы L-аминокислот (Caspary, 1974); сумму концентраций глицина и глицилглицина, а также сумму концентраций глицина, лейцина и глицил-L-лейцина (в мМ аминогрупп) Ї методом с TNBS (Field, 1972).

Статистическая достоверность результатов оценивалась по парному или непарному t-критерию Стьюдента, а в некоторых случаях с применением непараметрических критериев.

МАТЕМАТИЧЕСКИЕ ПОДХОДЫ

Методика оценки «истинных» кинетических констант гидролиза мальтозы и активного транспорта глюкозы в тонкой кишке in vivo. Математический подход разработан на основе модели, в которой изолированная кишечная петля была аппроксимирована в виде однородной по длине трубки, в полости которой происходит интенсивное перемешивание содержимого, а функционирующая поверхность отделена от полости диффузионным барьером - преэпителиальным слоем («неперемешиваемым слоем») (Westergaard et al., 1986; Груздков, 1993; Pappenheimer, 2001; Метельский, 2007). Как и большинство других исследователей (Levitt et al., 1996; Pappenheimer, 2001), мы принимали, что гидролиз мальтозы на апикальной мембране энтероцитов может быть описан классическим уравнением Михаэлиса-Ментен (уравнение 1), а всасывание глюкозы Ї аналогичным уравнением плюс ненасыщаемый (диффузионный) компонент (уравнение 2):

V_max ^. S_m J_max ^. C_m

J_H = ; (1) J_A = + k_d ^. C_m , (2)

K_m + S_m K_t + C_m

где J_H и J_A Ї скорости гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, соответственно; S_m и C_m Ї концентрации мальтозы и глюкозы, соответственно, на пищеварительно-всасывательной поверхности; V_max Ї максимальная скорость гидролиза мальтозы; J_max Ї максимальная скорость активного транспорта глюкозы; K_m и K_t Ї константы Михаэлиса для гидролиза и активного транспорта соответственно; k_d Ї константа скорости диффузии глюкозы через кишечный эпителий.

При определении «истинных» (скорректированных с учетом влияния преэпителиального слоя тонкой кишки) значений кинетических констант гидролиза мальтозы последовательно выполняли ряд вычислительных операций.

Сначала определяли начальную (оценочную) величину диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (R_PL⁰) в расчете на 1 см длины кишки (мин/см²) по формуле:

L

R_PL⁰ = , (3)

v ^. ln (S_вх / S_вых )

где S_вх и S_вых Ї концентрации мальтозы на входе и на выходе изолированной петли тонкой кишки соответственно (мМ); L Ї длина изолированной петли; v Ї объемная скорость перфузии (мл/мин).

С учетом полученного значения R_PL⁰ вычисляли начальные (оценочные) значения концентрации мальтозы на всасывательной поверхности (S_m⁰) по формуле:

S_m⁰ = S - J_h ^. R_PL , (4)

где S Ї средняя логарифмическая концентрация субстрата в полости кишки. Затем, используя формулу (1), вычисляли значения кинетических констант гидролиза мальтозы (K_m⁰ и V_max⁰) методом двойных обратных величин с применением прямой линейной регрессии. В дальнейшем путем пошагового изменения значений R_PL⁰ и вычисления новых значений K_mⁱ и V_maxⁱ методом двойных обратных величин с использованием прямой линейной регрессии определяли конечные значения диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (R_PLⁿ) и кинетических констант K_mⁿ и V_maxⁿ , при которых сумма квадратов отклонений расчетных (теоретических) значений скоростей гидролиза мальтозы от соответствующих значений, полученных в эксперименте, была минимальной.

При оценке «истинных» кинетических констант активного транспорта глюкозы в условиях хронического опыта использовался сходный математический подход. Отличие состояло в том, что сначала по данным опытов с перфузией изолированной петли тонкой кишки в присутствии флоридзина вычисляли по формуле (5) значение константы скорости пассивной диффузии, k_d , (см²/мин, в расчете на 1 см длины кишки). (При ингибировании активного транспорта глюкозы ее всасывание зависит в основном от пассивного компонента, а концентрация глюкозы на всасывательной поверхности (C_m) незначительно отличается от ее концентрации в полости кишки, С_L).

J_a100

k_d = , (5)

С_L ^. L

где J_a100 - скорость всасывания глюкозы (мкмоль/мин) в изолированной петле кишки при исходной концентрации 100 мМ в присутствии флоридзина; C_L - концентрация глюкозы в полости кишки (~100 мМ); L - длина изолированной петли (см).

Далее, применяя формулу (3) в отношении данных по всасыванию глюкозы, определяли начальную (оценочную) величину диффузионного сопротивления преэпителиального слоя (R_PL⁰) в расчете на 1 см длины кишки (мин/см²) и с её учетом по формуле, аналогичной формуле (4), вычисляли начальные (оценочные) значения концентрации глюкозы на всасывательной поверхности (C_m⁰). Затем, используя формулу (2) и полученное выше значение величины k_d, вычисляли кинетические константы активного транспорта глюкозы (K_t⁰ и J_max⁰) методом двойных обратных величин с использованием прямой линейной регрессии. Далее с использованием метода итераций получали уточненные значения этих кинетических констант.

Для количественного выражения проницаемости преэпителиального слоя тонкой кишки мы, как и другие авторы, использовали такой параметр, как толщина неперемешиваемого водного слоя (d), который определяли по формуле (6) (Levitt et al.,1992; Груздков, Громова,1995; Pappenheimer, 2001):

d = R ^. D , (6)

где R - диффузионное сопротивление преэпителиального слоя в расчете на 1 см² серозной поверхности кишки (мин/см); D - коэффициент диффузии в воде для глюкозы (5.3 ^. 10^-3 см²/мин) и мальтозы (3.8 ^. 10^-3 см²/мин) (Pappenheimer, 2001).

Методика оценки «истинных» кинетических констант гидролиза и всасывания дипептидов, а также всасывания аминокислот в тонкой кишке in vivo. При оценке «истинных» кинетических констант гидролиза и всасывания глицилглицина, а также всасывания глицина, использовался в основном аналогичный математический подход. Отличие состояло в допущении, что толщина преэпителиального слоя в этих опытах равна таковой, полученной в опытах с глюкозой, а диффузионная проницаемость слоя для этих субстратов обратно пропорциональна квадратному корню из их молекулярной массы (Pappenheimer, 2001). Кроме того, использовалась итерация по k_d (коэффициенту пассивного переноса субстрата через апикальную мембрану энтероцита) для вычисления методом линейной регрессии конечных значений K_t, J_max и k_d , при которых становилась минимальной сумма квадратов отклонений вычисляемых теоретических значений скоростей всасывания исследуемого субстрата от экспериментальных значений.

В случае глицилглицина сначала выделяли так называемые «аминокислотную» и «пептидную» составляющие его всасывания. «Аминокислотная» составляющая рассчитывалась с использованием приведенного выше уравнения (2) при значениях K_t , J_max и k_d , предварительно определенных нами по результатам опытов с всасыванием свободного глицина. При этом входящая в уравнение (2) величина C_m (концентрация свободного глицина на апикальной мембране энтероцита) вычислялась по формуле (7):

C_m = J_вых ^. R_PL - C , (7)

где J_вых = v_вых ^. C_вых Ї скорость выхода из изолированной кишечной петли глицина, образующегося при гидролизе дипептида; v_вых Ї объемная скорость оттекающего перфузата, C_вых Ї концентрация глицина в оттекающем перфузате; R_PL Ї сопротивление преэпителиального слоя; C = 0.63 ^. C_вых Ї средняя логарифмическая концентрация глицина в полости изолированной петли.

«Пептидную» составляющую скорости всасывания глицилглицина находили путем вычитания «аминокислотной» составляющей из суммарной скорости всасывания дипептида, определенной в эксперименте. Скорость мембранного гидролиза дипептида рассчитывали как сумму скорости его всасывания в форме глицина и скорости выхода из изолированной петли невсосавшегося глицина.

В случае глицил-L-лейцина использовался, в основном, аналогичный подход. Отличие состояло в том, что «аминокислотная» и, соответственно, «пептидная» составляющие рассчитывались двумя способами: по глицину и по лейцину. «Пептидную» составляющую скорости всасывания глицил-L-лейцина для глицина или лейцина находили путем вычитания соответствующей аминокислотной составляющей из определенной в эксперименте суммарной скорости всасывания дипептида (в виде дипептида и в виде каждой из аминокислот). При этом принималось, что значения кинетических констант транспорта аминокислот, образующихся при гидролизе дипептида, аналогичны значениям соответствующих констант транспорта свободных глицина и лейцина. С использованием метода итераций определялось такое значение транспорта дипептида, которое соответствовало скоростям всасывания каждой из составляющих его аминокислот. Скорость мембранного гидролиза дипептида также рассчитывалась двумя способами (по глицину и лейцину) и уточнялась с использованием итерационного метода. В каждом случае она определялась как сумма скорости всасывания дипептида в виде глицина (лейцина) и скорости выхода из изолированной петли невсосавшегося глицина (лейцина).

В ряде случаев экспериментальные данные сопоставлялись с результатами математического моделирования, выполненного совместно с А.А.Груздковым.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Относительная роль различных механизмов всасывания нутриентов

Оценка вклада парацеллюлярного механизма во всасывание глюкозы в тонкой кишке. В конце 80-х годов Дж. Паппенгеймер выдвинул гипотезу о парацеллюлярном переносе глюкозы на потоке всасывающейся воды как основном механизме ее всасывания в тонкой кишке in vivo при высокой концентрации глюкозы (Pappenheimer, Reiss, 1987; Pappenheimer, 1993, 2001). Он считал, что этот механизм особенно эффективен при высоких концентрациях глюкозы, которые, по его мнению, возникают в зоне щеточной каймы энтероцитов при мембранном гидролизе олигосахаридов (Pappenheimer, 1993). Для проверки этой гипотезы в условиях хронического опыта мы исследовали гидролиз мальтозы и всасывание образующейся глюкозы, а также всасывание воды, в изолированной петле тонкой кишки крыс в широком диапазоне концентраций субстрата при различной осмолярности перфузионных растворов (рис. 1). Обнаружено, что скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы не достигают насыщения даже при чрезвычайно высоких концентрациях мальтозы в исходном перфузате (150-200 мМ), более чем в 50 раз превышающих значения констант Михаэлиса для гидролиза мальтозы (3-4 мМ) (Levitt et al., 1996; Pappenheimer, 2001) и для активного транспорта глюкозы (1-5 мМ) (обзоры: Тимофеева и др., 2000; Ferraris, 2001; Pappenheimer, 2001). При этом в случае перфузии изолированной петли гипоосмолярными растворами субстрата (кривые 1а и 2а) скорости гидролиза мальтозы и всасывания образующейся глюкозы во всем диапазоне концентраций были несколько выше (статистически недостоверно), чем в случае гиперосмолярных растворов (кривые 1б и 2б).

Рис.1 Гидролиз мальтозы (1) и всасывание образующейся глюкозы (2) в изолированной петле тонкой кишки крыс при ее перфузии в хроническом опыте гипоосмолярными (а) и гиперосмолярными (б) растворами мальтозы в диапазоне ее супервысоких концентраций. По оси абсцисс - концентрация мальтозы в исходном перфузате, мМ глюкозы; по оси ординат - скорости гидролиза мальтозы и всасывания глюкозы, мкмоль/мин.

При увеличении концентрации мальтозы в исходном перфузате в диапазоне с 6.25 до 37.5 мМ скорость всасывания воды возрастала с 21.05.4 до 43.95.1 мкл/мин, (P<0.05) и тесно коррелировала (r=0.97) со скоростью всасывания образующейся глюкозы. В диапазоне высоких концентраций мальтозы при перфузии изолированной петли гиперосмолярными растворами наблюдалась секреция воды со скоростью 15.0-25.0 мкл/мин, а в случае гипоосмолярных растворов скорость трансэпителиального потока воды варьировала от -11.7 (секреция) до +3.8 (всасывание) мкл/мин. При этом отсутствовала корреляции между всасыванием глюкозы и воды.

Таким образом, согласно нашим данным, парацеллюлярный перенос на потоке всасывающейся воды не является преимущественным механизмом всасывания глюкозы, поскольку в диапазоне высоких концентраций мальтозы (150 - 200 мМ) отсутствует результирующее всасывание воды, то есть не выполняется необходимое условие для осуществления конвективного парацеллюлярного переноса субстрата.

Роль облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов. Недавно группой английских исследователей (обзор: Kellett, 2001) была предложена гипотеза, согласно которой перенос глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов происходит не только путем активного транспорта с участием SGLT1, но и путем облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2, который при высоких углеводных нагрузках может встраиваться в апикальную мембрану. Одним из аргументов в пользу этой гипотезы является то, что в опытах in vivo на анестезированных животных флоретин (ингибитор GLUT2), введенный в полость кишки, вызывает торможение всасывания глюкозы.

Для проверки указанной гипотезы в условиях хронического опыта на крысах мы исследовали влияние флоретина и флоридзина - ингибитора транспортера SGLT1 - на всасывание глюкозы и галактозы, транспортируемых с участием SGLT1 и GLUT2, в изолированной кишечной петле. Обнаружено, что в присутствии флоретина (1 мМ) скорость всасывания глюкозы снижается по сравнению с контролем на 67, 62 и 50% при исходных концентрациях глюкозы 12.5, 25.0 и 50 мМ соответственно (P<0.01), а в присутствии флоридзина (1 мМ) она снижается на 78 % (P<0.01) при исходной концентрации глюкозы 50 мМ (рис. 2). Сходное действие этих ингибиторов наблюдалось в отношении всасывания галактозы.

Рис. 2 Влияние флоридзина (1 мМ) и флоретина (1 мМ) на всасывание глюкозы в изолированной петле тонкой кишки крыс в хроническом опыте. По вертикали - скорость всасывания в мкмоль/мин. К -- контроль; +Флд -- в присутствии флоридзина; +Флт -- в присутствии флоретина. 50 мМ (слева) -- концентрация глюкозы в исходном перфузате в опытах с флоридзином;12.5 мМ, 25.0 мМ и 50.0 мМ (справа) -- концентрация глюкозы в исходном перфузате в опытах с флоретином.

Эти результаты согласуются с данными других исследователей (Kellett, 2001; Au et al., 2003; Shepherd et al., 2004) и подтверждают возможность участия GLUT2 в транспорте глюкозы через апикальную мембрану энтероцитов. Они подкрепляются также данными о наличии транспортера GLUT2 в апикальной мембране энтероцитов после нагрузки тонкой кишки раствором с высокой концентрацией глюкозы, полученными другими авторами, а также нами в совместной работе с группой Я.Ю. Комиссарчика (Институт цитологии РАН) (Грефнер и др., 2006).

Однако, вопреки нашим ожиданиям, после нагрузки изолированной петли в течение 40 мин раствором глюкозы (75 мМ) скорость всасывания 2-дезокси-D-глюкозы (5 мМ) - специфического субстрата для GLUT2 - возрастала незначительно (на 18%, P>0.05) по сравнению с исходным уровнем (до нагрузки), а присутствие в инфузате 2-дезокси-D-глюкозы (50 мM) не вызывало конкурентного снижения всасывания галактозы (50 мМ). Это означает, что наличие GLUT2 в апикальной мембране энтероцитов само по себе не является показателем преимущественной роли облегченной диффузии во всасывании моносахаридов. Тем более, что отмеченное выше торможение флоретином всасывания глюкозы in vivo могло быть связано с его способностью ингибировать транспортер GLUT2, локализованный в базолатеральной мембране, и тем самым тормозить выход глюкозы из энтероцитов через эту мембрану, что, в свою очередь, должно выражаться в снижении общего всасывания глюкозы.

Это предположение подтвердилось в опытах in vitro на эвертированных мешках тонкой кишки крыс. Было обнаружено, что в присутствии флоретина (100 мкМ) с мукозной стороны вывернутых мешков аккумуляция глюкозы в ткани препарата в условиях оксигенации менялась незначительно по сравнению с контролем (в отсутствие ингибитора), тогда как в серозной жидкости она снижалась на 43% (P<0.01). А в присутствии флоридзина (10 мкМ) с мукозной стороны аккумуляция глюкозы в условиях оксигенации почти в равной степени (на 50%, P<0.05) снижалась как в ткани препаратов, так и в серозной жидкости.

Кроме того, нами показано неспецифическое снижение (на 34%, P<0.05) скорости всасывания глицина в изолированной петле тонкой кишки крыс в присутствии флоретина (1 мМ), а также ингибирование флоретином (1 мМ), добавленным в гомогенаты слизистой оболочки тонкой кишки, активности щелочной фосфатазы (на 24%, P<0.05) и аминопептидазы М (на 15%, P<0.05)

Таким образом, флоретин, введенный с мукозной стороны, не только ингибирует GLUT2-зависимую облегченную диффузию глюкозы через апикальную мембрану энтероцита, но и способен опосредованно снижать общее всасывание глюкозы, реализуемое ее транспортом с участием SGLT1. Использование некоторыми авторами такого подхода в острых опытах in vivo (Kellett, Helliwell, 2000; Shepherd et al., 2004) сопряжено с завышением вклада облегченной диффузии с участием транспортера GLUT2 и занижением вклада активного транспорта, опосредованного SGLT1, во всасывание глюкозы в физиологических условиях. Это не позволяет считать адекватным применение данного подхода для оценки реального соотношения двух указанных механизмов транспорта глюкозы через апикальную мембрану энтероцита.

В целом, наши данные подтверждают факт участия механизма облегченной диффузии, опосредованной GLUT2, в переносе глюкозы через апикальную мембрану энтероцита, однако при физиологических концентрациях глюкозы в кишке (<50 мМ) основным является, по-видимому, ее активный транспорт с участием SGLT1, тогда как облегченная диффузия с участием GLUT2 начинает играть заметную роль лишь при повышенных углеводных нагрузках.

Роль пептидной транспортной системы во всасывании дипептидов в тонкой кишке. В хронических опытах на крысах мы исследовали кинетику гидролиза и всасывания глицилглицина и глицил-L-лейцина (дипептидов, в разной степени подверженных мембранному гидролизу), а также кинетику всасывания свободных глицина и лейцина в изолированной петле тонкой кишки. Предварительно, по данным исследования на тех же животных кинетики всасывания глюкозы, была определена диффузионная проницаемость преэпителиального слоя. С ее учетом, используя разработанные нами математические подходы, мы определили значения «истинных» кинетических констант гидролиза и транспорта дипептидов и всасывания аминокислот, что позволило затем, используя математическое моделирование (выполнялось совместно с А.А. Груздковым), оценить в широком диапазоне концентраций субстратов относительную роль «пептидного» компонента во всасывании указанных дипептидов.

Полученное нами значение проницаемости преэпителиального слоя соответствовало диффузионной проницаемости неперемешиваемого водного слоя толщиной 48.5±8.0 мкм, что согласуется с оценками, полученными нами ранее в аналогичных экспериментальных условиях (Груздков, Громова, 1995; Громова и др., 2002; Громова, Груздков, 2003), а также с данными других авторов, полученными в опытах на неанестезированных животных (Strocchi, Levitt, 1991; Uhing, Kimura, 1995).

В отношении всасывания глицина и лейцина в изолированной петле тонкой кишки крыс были получены следующие значения «истинных» кинетических констант: K_t =46.7±4.0 и 2.15±0.59 мМ и J_max =0.74±0.15 и 0.16±0.03 мкмоль • мин^-1· см^-1 (для глицина и лейцина, соответственно). В отношении K_t (константа Михаэлиса для транспорта) эти значения хорошо согласуются с данными, полученными нами ранее в сходных экспериментальных условиях (Громова, Груздков, 2003), а также с оценками других авторов, полученными в опытах на эвертированных препаратах тонкой кишки крыс и на везикулах щеточной каймы энтероцитов крыс (Munck, 1981; Pascual et al., 2000; Castilla-Cortazar et al., 2004).

В отношении гидролиза и всасывания дипептидов нами получены следующие значения кинетических констант. Для «пептидной» составляющей всасывания глицилглицина: K_t=4.4±0.6 мМ дипептида и J_max=0.24±0.02 мкмоль дипептида • мин^-1· см^-1. Для «пептидной» составляющей всасывания глицил-L-лейцина: K_t=4.8±0.9 мМ дипептида и J_max=0.23±0.02 мкмоль дипептида • мин^-1· см^-1. Для мембранного гидролиза дипептидов (глицилглицин и глицил-L-лейцин) значения «истинных» кинетических констант были равны: K_m=5.4±1.0 и 38.2±4.4 мМ дипептидов (соответственно) и V_max=0.09±0.02 и 0.24±0.07 мкмоль дипептидов • мин^-1· см^-1 (соответственно).

Согласно нашим расчетам, в случае глицилглицина доля «пептидного» компонента в его суммарном всасывании относительно постоянна (77ч80%) во всем диапазоне исходных концентраций этого дипептида (2.5ч40 мМ). При этом около 70% дипептида расщепляется внутриклеточно и 30% - в результате мембранного гидролиза. В случае глицил-L-лейцина при увеличении исходной концентрации дипептида с 5 до 40 мМ доля «пептидного» компонента в результирующем всасывании глицина снижается с 89.4 до 83.7%, а лейцина - с 86.0 до 71.2%. При этом доля внутриклеточного гидролиза глицил-L-лейцина снижается с 83.1 до 62.9%. Соответственно, до 37.% возрастает доля мембранного гидролиза этого дипептида.

Анализ полученных результатов показывает, что доля «пептидной» составляющей во всасывании конкретного дипептида определяется соотношением кинетических параметров его мембранного гидролиза и мембранного транспорта. Например, в случае глицил-L-лейцина заметная зависимость доли «пептидной» составляющей его всасывания от исходной концентрации дипептида обусловлена высоким значением K_m для мембранного гидролиза глицил-L-лейцина (38.2 мМ) по сравнению с низким значением K_t для его мембранного транспорта в интактном виде (4.8 мМ).

...