Бактерии-деструкторы ароматических углеводородов и их хлорпроизводных: разнообразие, особенности метаболизма, функциональная геномика

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6 Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных гену nahAc .

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11

Рис. 7 Электрофореграмма продуктов амплификации генов narAaAb штаммов-деструкторов рода Rhodococcus: 1 - G10, 2 - P25*, 3 - DB11, 4 - SMB38, 5 - SMB37, 6 - B2-1, 7 - B1-4, 8 - B13, 9 - B14, 10 - отрицательный контроль, 11 - маркер л HindIII. *Штамм Rhodococcus ruber P25 подробно описывается в разделе 2.2

В то же время, применение сконструированных праймеров с препаратами ДНК деструкторов нафталина родов Arthrobacter и Bacillus не дало положительных результатов, что свидетельствует о высокой специфичности сконструированных олигонуклеотидов, а также о различии генетических систем деструкции нафталина у разных таксонов грамположительных бактерий.

Анализ нуклеотидных последовательностей ампликонов штаммов В13, В2-1, DB11, SMB38, выделенных из засоленных почв, показал принадлежность исследуемых фрагментов ДНК к семейству nar-генов, и выявил высокую гомологию (98.5-100%) с таковыми известных штаммов-деструкторов полиароматических соединений рода Rhodococcus. На дендрограммах четко прослеживается закономерность выделения взятых в анализ фрагментов narAa-генов и narAb-генов в два кластера (рис. 8). Степень сходства нуклеотидных последовательностей была выше 98% для narAa- и narAb-генов внутри каждого кластера и не превышала 92% для narAa-генов и 90% для narAb-генов между кластерами. На основании проведенного анализа можно предположить наличие двух ветвей эволюции narАаAb-генов у бактерий рода Rhodococcus. Показано, что nar-гены этих штаммов входят в разные группы одного подкластера (рис. 8) с гомологией нуклеотидных последовательностей внутри группы 100%, а между ними - 99%.

А

Б

Рис. 8 Дендрограммы, отображающие сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных генам narAa (А) и narAb (Б).

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем деструкции нафталина бактерий рода Rhodococcus, выделенных из района разработок Верхнекамского месторождения солей

2. Бактерии-деструкторы бифенила/полихлорированных бифенилов

2.1. Характеристика бактерий-деструкторов

Методом накопительного культивирования на бифениле из техногеннозагрязненных почв, грунтов и донных отложений выделено 280 штаммов-деструкторов бифенила, из них детально охарактеризовано 42 штамма. На основании филогенетического анализа и фенотипических характеристик штаммы отнесены к родам: Arthrobacter, Alcaligenes, Cellulomonas, Comamonas, Flavimonas, Flavobacterium, Microbacterium, Pseudomonas, Rhodococcus, Janibacter, Xanthomonas.

Большинство изолированных бактерий росли в диапазоне температур 8-40?С и рН среды 6-9. У ряда бактерий-деструкторов выявлена способность к росту на полноценной и минеральной (с бифенилом в качестве субстрата) средах в присутствии повышенного содержания NaCl. Так, штаммы Alcaligenes sp. Р39, Pseudomonas sp. B2 и Pseudomonas sp. B106, R. ruber Р25 активно росли на бифениле при содержании 60 г/л соли в среде культивирования и в полноценной среде при 100-120 г/л NaCl.

Более половины изученных деструкторов бифенила способны к росту на нафталине, толуоле, бензоле и феноле, пять штаммов могут осуществлять деструкцию фенантрена. Среди исследованных штаммов выявлены бактерии, которые осуществляли деструкцию хлорированных соединений (2ХБК, 4ХБК, 2,4_Д). Особо следует отметить штаммы R. ruber Р25, Microbacterium sp. B51, Pseudomonas spр. G1, G12 и B106, которые обладают наиболее широкой субстратной специфичностью по отношению к моно(поли)ароматическим соединениям и их хлорпроизводным.

Все исследованные штаммы осуществляли разложение монохлорированного бифенила: при инкубации клеток бактерий с 4моноХБ (500 M) наблюдалось накопление 4ХБК (от 75 M до 230 M, в зависимости от штамма, за 1 час). Для изучения особенностей разложения орто- и пара-ХБ изолированными бактериями в качестве модельного соединения нами выбран 2,4'диХБ, хлорированный по обоим бифенильным кольцам. Все бактерии проявляли активность по отношению к 2,4'диХБ, однако эффективность и характер окислительных способностей штаммов различался. На основании анализа продуктов биодеструкции 2,4'диХБ выделены три группы штаммов, обладающие различными путями деградации данного соединения (табл. 4). У большинства штаммов (группы I и II) при деструкции 2,4'диХБ происходило накопление продукта мета-расщепления дихлорбифенила - 3,8-Cl ГОФДК (_max=397 нм), что указывает на 2,3_диоксигенирование пара-хлорированного кольца 2,4'диХБ (Seeger et al., 1995; Seah et al., 2000). Кроме того, все исследованные штаммы группы II накапливали разные количества 4ХБК, что в свою очередь говорит о более глубокой трансформации 2,4'диХБ по пути предпочтительного 2,3-диоксигенирования орто_хлорированного кольца. У штамма Р25 наблюдалось существенное уменьшение количества продуктов разложения 2,4'диХБ (3,8-Cl ГОФДК и ХБК), что указывает на эффективную утилизацию не только 2,4'диХБ, но и 4ХБК.

Таблица 4 Разложение 2,4'дихлорбифенила бактериями-деструкторами

Примечание: * - % от теоретически возможного, ** - к 5 часам инкубации штамма Р25 с 2,4'диХБ было отмечено: ГОФДК - ОП₃₉₇=1.1, 4ХБК - 73.8%.

Штаммы III группы - Rhodococcus sp. DB11 и Comamonas sp. S211 в присутствии 2,4'диХБ аккумулировали около 33 и 18.6% 4ХБК, соответственно, а штаммы Pseudomonas sp. G12 и Microbacterium sp. B51 - около 90% этого продукта, накопления продуктов мета-расщепления 2,4'диХБ не было зафиксировано (табл. 4). Таким образом, можно предположить, что эти штаммы атакуют только орто-хлорированное кольцо молекулы 2,4'диХБ.

2.2. Биодеградативные особенности штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51

Штамм R. ruber Р25 (=ИЭГМ 896) является активным деструктором орто-, пара-замещенных хлорированных бифенилов. При деструкции 2моноХБ в среде наблюдалось накопление 8-Cl ГОФДК (л_max=395 нм) и 2ХБК, а при деструкции 4моноХБ - 10-Cl ГОФДК (л_max=434 нм) и 4ХБК. В процессе деградации 4моноХБ к 24 часам было отмечено снижение содержания 4ХБК в среде с 66% до 41%. При культивировании штамма Р25 с 2,2'диХБ не была обнаружена ГОФДК, но в среде аккумулировались свободные ионы хлора и 2ХБК (около 14% от теоретически возможного, за 24 часа). При разложении 4,4'диХБ было отмечено накопление в среде 3,10-диCl ГОФДК (л_max=434 нм) и увеличение концентрации 4ХБК в течение первых 24 часов до 68% с последующим снижением в 5.5 раза. Установлено, что при деструкции 2,4'диХБ штамм R. ruber Р25 предпочтительнее окислял орто-хлорированное кольцо молекулы хлорбифенила (табл. 4), при деструкции 2,4,2'триХБ - ди(орто-пара)-хлорированное кольцо, а при разложении 2,4,4'триХБ - моно(пара)-хлорированное кольцо. Изучена способность штамма R. ruber Р25 использовать в качестве единственного источника углерода и энергии 2-, 4моноХБ и 2,4'диХБ (рис. 9). Кроме того, штамм эффективно утилизировал образующиеся в процессе разложения 2ХБК и 4ХБК (рис. 10).

Рис. 9 Динамика роста R. ruber Р25 на бифениле (1) и его хлорированных производных: 2 - 2 моноХБ, 3 - 4-моноХБ, 4 - 2,4'диХБ

Рис. 10 Рост R. ruber Р25 на бензойной кислоте (1) и ее хлорпроизводных: КОЕ при росте на 2ХБК (2), 4ХБК (3), 2,4ХБК (4); Cl? при росте на 2ХБК (5), 4ХБК (6), 2,4ХБК (7); концентрация ХБК при росте на 2ХБК (8) и 4ХБК (9).

R. ruber Р25 содержит три плазмиды, размером ~110 т.п.н. (рР25-1), ~90 т.п.н. (рР25-2) и ~80 т.п.н. (рР25_3) (рис. 11А). Для доказательства плазмидной локализации генов, ответственных за разложение бифенила, нафталина и ХБК, проведены эксперименты по элиминации плазмид. При скрининге клонов, утративших способность к росту на одном или нескольких субстратах, обнаружено отсутствие одной или нескольких плазмид (рис. 11Б). Клоны с фенотипом биф?наф?2ХБК?4ХБК? характеризовались отсутствием плазмид, у клонов с фенотипом биф?наф⁺2ХБК?4ХБК? было зафиксировано наличие плазмиды рР25-3 (~80 т.п.н.), а у клонов, утративших способность к росту только на ХБК, отсутствовала плазмида рР25-1 (~110 т.п.н.). Таким образом, нами сделано предположение о плазмидной локализации генетических детерминант, контролирующих деградацию бифенила, нафталина и ХБК у штамма R. ruber Р25.

1 2 3 4

Рис. 11А Электрофореграмма плазмидных ДНК: 1 - рР25-(1-3); 2 л HindIII; 3 pBS1501 (110 т.п.н.); 4 NAH7 (83 т.п.н.).

1 2 3 4 5

Рис. 11Б. Скрининг клонов R. ruber Р25 с различным фенотипом на наличие плазмидной ДНК: 1 биф+наф+ХБК? (рР25-2, рР25-3); 2 биф?наф+ХБК? (рР25-3); 3 -биф?наф?ХБК? (элиминант); 4 - л-HindIII; 5 NAH7 (83 т.п.н.).

Результаты изучения деструкции моно(ди)хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51 приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 5 Деструкция хлорбифенилов штаммом Microbacterium sp. В51

Примечание: «н.о.» - не определяли, « - » - не зафиксировано, * - % от теоретически возможного.

Штамм Microbacterium sp. В51 осуществлял практически 100% деструкцию диХБ (2,2'-, 2,4'- и 4,4'диХБ). Аккумуляция в среде 2ХБК и 4ХБК при деструкции 2,2'- и 2,4'диХБ, соответственно, свидетельствовала о предпочтительной атаке штаммом орто-хлорированного кольца этих соединений (табл. 4, 5). Microbacterium sp. В51 утилизировал 2ХБК, продукт разложения 2моноХБ и 2,2'диХБ, и трансформировал 4,4'диХБ через стадию образования 3,10_диCl ГОФДК до 4ХБК (табл. 5). Полученные данные позволяют предположить, что штамм В51 способен окислять орто- и пара-хлорированные кольца молекул ПХБ. Таким образом, Microbacterium sp. В51 по своим деградативным свойствам близок к известному штамму-деструктору ПХБ Burkholderia sp. LB400 (Seeger et al., 1995, 1999; Seah et al., 2000), но, в отличие от штамма LB400, способен деградировать 4,4'диХБ и осуществлять полную утилизацию 2моноХБ и 2,2'диХБ.

Было также установлено, что штамм В51 способен активно разлагать 2моноХБ в условиях модельной почвенной системы. Анализ динамики изменения концентрации 2моноХБ показал, что основное снижение количества субстрата (до 98%) происходило в течение первых 24 часов инкубирования. Увеличение количества жизнеспособных клеток штамма в течение эксперимента на три порядка по сравнению с контролем свидетельствовало об использовании 2моноХБ в качестве ростового субстрата.

2.3. Разнообразие генов, кодирующих б-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ, исследуемых бактерий-деструкторов

Проведен скрининг 24 штаммов-деструкторов бифенила, на наличие в их геноме нуклеотидных последовательностей, кодирующих б-субъединицы ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000). Амплифицируемые участки ДНК соответствуют правой части генов б_субъединиц терминальных оксигеназ, включающей каталитический центр (Zielinski et al., 2002). С ДНК четырнадцати штаммов был получен ПЦР-продукт ожидаемого размера, около 500 п.н. В то же время с ДНК ряда деструкторов бифенила/ПХБ, в том числе активных штаммов R. ruber Р25 и Microbacterium sp. В51, отсутствовала специфичная амплификация. Несмотря на сформировавшуюся в процессе эволюции специализацию ферментов по отношению к конкретным субстратам, наблюдается перекрывание спектров окисляемых соединений даже для диоксигеназ, относящихся к разным подсемействам (Barriault, Sylvestre, 1999; Raschke et al., 2001). С другой стороны, известны бактерии родов Sphingomonas, Bacillus, Rhodococcus, осуществляющие деструкцию бифенила с помощью бифенил 2,3-диоксигеназ, существенно отличающихся от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ и сходных с фенантрен и нафталин диоксигеназами бактерий-деструкторов ПАУ (Romine et al., 1999; Mukerjee-Dhar et al., 2005; Taguchi et al., 2007; Yang et al., 2007). Полученные данные свидетельствуют об отличии ключевых ферментов деструкции бифенила исследованных нами активных бактерий от ферментов подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ.

Рис. 12 Электрофореграммы рестрикционных фрагментов, полученных при обработке ампликонов эндонуклеазами HhaI (A) и HaeIII (Б): Rhodococcus sp. (штаммы: 3 - P1, 4 - P12, 5 - P13, 6 - P20, 7 - G10), Janibacter sp. (штаммы: 8 - P9, 9 - P27a), 12 - Arthrobacter sp. P24a, 13 - Cellulomonas sp. P28, Pseudomonas sp. (штаммы: 14 - S9, 15 - S13, 16 - S210, 17 - S211, 18 - S212); 2, 19 - Rhodococcus sp. P20 (ампликон, не обработанный эндонуклеазой); 1, 10, 20 - маркер молекулярных масс 100-1000 п.н. («Силекс», Россия); 11 - маркер молекулярных масс pUC19 ДНК/ MspI («Силекс», Россия)

По результатам гидролиза ампликонов эндонуклеазами рестрикции HhaI и HaeIII бактерии рода Pseudomonas были выделены в отдельную группу, бактерии порядка Actinomycetales можно подразделить на три группы (рис. 12). К первой группе относятся Rhodococcus sp. P1, P12, P13, P20, утилизирующие бифенил/ХБ, нафталин, бензол, толуол. Штамм Rhodococcus sp. G10 (вторая группа) осуществляет трансформацию бифенила/ХБ и растет на бензоле и толуоле. В третью группу вошли штаммы Arthrobacter sp. Р24а, Cellulomonas sp. Р28, Janibacter sp. P27a и P9, способные к слабому росту на бифениле.

Анализируемые участки генов бактерий рода Rhodococcus существенно отличались от гомологичных генов бактерий рода Pseudomonas (рис. 13). Участки ДНК штаммов Rhodococcus sp. P1, P12 и P13 были на 98-99% сходны с генами, кодирующими б-субъединицы бифенил 2,3-диоксигеназ, известного деструктора ПХБ Rhodococcus sp. RHA1 и разлагающего бифенил R. opacus BIE-20. Амплифицированный фрагмент ДНК Rhodococcus sp. G10 на 98% сходен с геном б-субъединицы гидроксилирующей диоксигеназы деструктора толуола Arthrobacter sp. 3YC3. У бактерий родов Janibacter и Arthrobacter обнаружены уникальные нуклеотидные последовательности, отличающиеся от генов, кодирующих большие субъединицы известных гидроксилирующих диоксигеназ как грамположительных, так и грамотрицательных бактерий (рис. 13).

Полученные данные свидетельствуют о разнообразии генетических систем, контролирующих ключевые процессы деструкции ароматических углеводородов, бактерий-деструкторов бифенила из техногеннозагрязненных почв Прикамья.

Рис. 13 Дендрограмма, отображающая сходство нуклеотидных последовательностей, гомологичных исследуемым участкам генов б-cубъединиц подсемейства бифенил/толуол диоксигеназ

3. Природные и генетически-модифицированные бактерии-деструкторы хлорбензойных кислот

Более 20 бактерий-деструкторов хлорбензойных кислот (2-, 3-, 4- и 2,4ХБК) были выделены из почв и грунтов, загрязненных отходами производства галогенсодержащих соединений (г. Пермь). Подробно нами были исследованы шесть штаммов-деструкторов 4ХБК, которые на основании филогенетических и фенотипических особенностей были идентифицированы как Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120, G126, Pseudomonas sp. G107, H2.

3.1. Генетические системы, контролирующие дехлорирование 4ХБК, бактерий рода Arthrobacter

Данные ДНК-типирования двух исследованных артробактерий, штаммов H4 и H5, показали их идентичность. Наибольший уровень сходства (99%) ген 16S pРНК штамма Н4 имеет с типовым штаммом A. globiformis M23411^T. Штаммы Arthrobacter sp. H4 и Н5 эффективно растут на 4ХБК, используя данное соединение в качестве единственного источника углерода и энергии, способны к росту на высоких концентрациях хлорбензоата - до 3 г/л. Параметры роста артробактерий сопоставимы с таковыми хорошо изученного штамма-деструктора 4ХБК A. globiformis КЗТ1 (Зайцев, Карасевич, 1981). Анализ метаболитов при культивировании штаммов H4 и Н5 на 4ХБК показал наличие в среде инкубирования интермедиатов - 4ГОБК, ПКК и ионов хлора. На основании полученных результатов и анализа литературных данных было сделано предположение, что штаммы H4, Н5, как и штамм КЗТ1, осуществляет дегалогенирование 4ХБК до расщепления ароматического кольца (Зайцев, Карасевич, 1981). Описан механизм первичной атаки на молекулу 4ХБК - гидролитическое дегалогенирование (Elsner et al., 1991). Эту реакцию катализирует трехкомпонентная 4ХБК-дегалогеназа, включающая 4-хлорбензоат-KoA-лигазу (FcbA), 4-хлорбензоил-KoA-дегалогеназу (FcbB) и 4-гидроксибензоат:КоА-тиоэстеразу (FcbC).

Ранее нами было показано, что у штамма A. globiformis КЗТ1 реакция дегалогенирования 4ХБК контролируется генами, расположенными в плазмиде размером ~110 т.п.н. Гены, ответственные за дальнейший метаболизм пара-гидроксибензойной кислоты, находятся в хромосоме (Zaitzev et al., 1991). У Arthrobacter sp. H4 и Н5, выделенных из техногенных почв (г. Пермь), плазмидные ДНК не были обнаружены. Можно предположить, что генетические детерминанты, контролирующие весь путь разложения 4ХБК, у этих штаммов располагаются в хромосоме.

Клонирование и изучение fcb-генов A. globiformis КЗТ1. В клетках E. coli JM109 на мультикопийном векторе pUC19 была сконструирована клонотека Sau3A-фрагментов тотальной ДНК (обогащенной плазмидной ДНК) штамма A. globiformis КЗТ1. При анализе Ар^r-клонов E.coli JM109 обнаружен рекомбинантный штамм, содержащий плазмиду pCA311, которая придавала клеткам E. coli способность к дехлорированию 4ХБК. Анализ с использованием метода ТСХ показал, что 4ГОБК является единственным продуктом конверсии 4ХБК клетками E. coli. Таким образом, в составе pCA311 были клонированы fcb_гены, кодирующие 4-хлорбензоат-4-гидроксилазу (дегалогеназу). На основе рестрикционного анализа плазмиды pCA311 и ее делеционных производных, а также анализа полипептидов, синтезированных в мини-клетках E. coli на матрицах полученных рекомбинантных плазмид была построена физическая карта клонированного фрагмента ДНК (7612 т.п.н.), определена последовательность расположения генов, кодирующих полипептиды с Mr=57, 31 и 17 кДа. Показано, что все 3 гена fcbA1(А), fcbA2(В), fcbA3(С) требуются для сохранения 4ХБК⁺ фенотипа. В дальнейшем, данные о наличии трех структурных генов, определяющих дегалогеназную активность, были подтверждены и дополнены, когда была определена и проанализирована нуклеотидная последовательность ДНК, клонированная в составе плазмиды pCA311 (номер в GenBank AF304300). Основываясь на результатах анализа нуклеотидных последовательностей и литературных данных (Babbitt et al.,1992; Schmitz et al.,1992), было сделано заключение, что проклонированные нами гены fcb объединены в структурный оперон с тремя открытыми трансляционными рамками, кодирующими полипептиды в следующем порядке: 4ХБК-КоА-лигаза, 4ХБК-КоА-дегалогеназа и 4ХБК-КоА-тиоэстераза.

3.2. fcb-Гены бактерий-деструкторов 4ХБК из техногеннозагрязненных почв (г. Пермь)

На основе нуклеотидных последовательностей fcb-генов штаммов A. globiformis КЗТ1 (GenBank AF304300) и Arthrobacter sp. SU (GenBank M93187) были разработаны праймеры, при использовании которых возможна амплификация участков ДНК, содержащих гены fcbA и fcbB (Rodrigues et al., 2001). Методом ПЦР нами были исследованы выделенные бактерии-деструкторы 4ХБК на наличие в геноме fcb-генов. С ДНК штаммов Arthrobacter sp. H4, H5, Micrococcus sp. G120 были получены ПЦР-продукты ожидаемого размера - 589 п.н. (fcbA) и 598 п.н. (fcbB) (рис. 14А). Полученные результаты позволяют сделать предположение о наличии у этих штаммов генов, контролирующих дегалогенирование 4ХБК. fcb-Гены были также обнаружены у штамма R. ruber Р25 (рис. 14Б), деструктора ХБ/4ХБК (см. раздел 2.2.).

аб

1 2 3 4 5

Рис. 14 Электрофореграммы продуктов амплификации fcb-генов штаммов-деструкторов 4ХБК: (А) Arthrobacter sp. H4 (2 - fcbA, 6 - fcbB), Micrococcus sp. G126 (3 - fcbA, 7 - fcbB), Micrococcus sp. G120 (4 - fcbA, 8 - fcbB), Arthrobacter sp. Н5 (5 - fcbA, 9 - fcbB), 1, 10 - маркер молекулярных масс IX («Sigma», Германия), 11 - отрицательный контроль; (Б) A. globiformis КЗТ1 (1 - fcbA, 4 - fcbB), R. ruber Р25 (2 - fcbA, 5 - fcbB), 3 _ маркер молекулярных масс 1000 п.н. («Силекс», Россия)

Анализ нуклеотидных последовательностей генов fcbA и fcbB штамма Arthrobacter sp. H4 показал 100% сходство с гомологичными последовательностями большинства бактерий рода Arthrobacter. Уровень сходства участка гена fcbA штамма R. ruber P25 с генами, кодирующими 4_хлоробензоат_КоА-лигазу, бактерий A. globiformis КЗТ1, A. ramosus FG1, Arthrobacter sp. SU, Arthrobacter sp. TM1 составил 98_99%; с гомологичным геном Arthrobacter sp. FHP1 - 95%. Обнаружено 98-99% сходство участка гена fcbB штамма R. ruber P25 с гомологичными нуклеотидными последовательностями бактерий рода Arthrobacter. В литературе не описано фактов присутствия fcb-генов у природных бактерий рода Rhodococcus. Следует отметить, что штамм R. ruber P25, способный полностью разлагать 4ХБ/4ХБК, и деструкторы 4ХБК рода Arthrobacter (штаммы H4, H5), выделены из одних и тех же почв, загрязненных отходами производства галогенированных соединений (г. Пермь). Известно, что гены, контролирующие деструкцию 4ХБК, могут входить в состав плазмид и транспозонов (Zaitsev et al., 1991; Peel, Wyndham, 1999), кроме того, fcb-гены бактерий рода Arthrobacter успешно экспрессируются в клетках бактерий рода Rhodococcus (Rodrigues et al., 2006). Таким образом, не исключена возможность горизонтального переноса кластера генов fcb между бактериями почвенной экосистемы, находящейся под высоким селективным давлением галогенсодержащих поллютантов.

3.3. ohb-Гены, контролирующие окислительное дегалогенирование орто-замещенных хлорбензоатов, Pseudomonas aeruginosa 142

Другим механизмом первичной атаки хлорбензойных кислот является окислительное дегалогенирование, описанное для ряда бактерий-деструкторов 2ХБК, 2,4диХБК и 2,5диХБК рода Pseudomonas, в том числе P. aeruginosa 142 (рис. 15). В нашей работе были клонированы и охарактеризованы ohb-гены, контролирующие отщепление галогена из орто-положения до расщепления ароматического кольца, штамма деструктора 2ХБК и 2,4диХБК P. aeruginosa 142 (Романов и др., 1993). На основе вектора широкого круга хозяев pSP329 в клетках E. coli DH5бF' была создана клонотека генов тотальной ДНК P. aeruginosa 142, среди 3700 клонов которой обнаружены 2 клона, осуществляющие превращение 2ХБК в катехол и 2,4диХБК - в 4-хлоркатехол. На основании полученных результатов был сделан вывод, что в рекомбинантных плазмидах pOD33 и pOD22, содержащихся в этих клонах, присутствуют ohb-гены орто-галобензоат 1,2_диоксигеназы (ОГБД) (рис. 15).

Рис. 15 Молекулярный механизм окислительного орто-дегалогенирования хлорбензоатов, описанный для P. aeruginosa 142 (Romanov and Hausinger, 1994)

Плазмида pOD33, содержащая вставку ДНК около 6 т.п.н. и стабильно поддерживающаяся в клетках E. coli, была использована для дальнейших исследований. Путем субклонирования плазмиды pOD33 с применением экзонуклеазы Bal31 была получена плазмида pE43 с размером вставки ДНК 3.7 т.п.н., проявляющая наибольший уровень экспрессии ohb-генов в клетках E. coli, которая была трансформирована в клетки P. putida mt-2 (штамм PB2440) (Bagdasarian et al., 1981). Рекомбинантный штамм P. putida PB2440(pE43) приобрел новые свойства: рос на 2ХБК как единственном источнике углерода и энергии при концентрации субстрата до 2 мМ. В опытах с отмытыми клетками была показана способность штамма окислять дихлорированные субстраты - 2,4диХБК, 2,5диХБК и 2,6диХБК.

Определена нуклеотидная последовательность вставки ДНК плазмиды pOD33 размером 6052 п.н. (GenBank AF121970). Обнаружены 6 открытых рамок считывания, в том числе генов ohbB, ohbA, кодирующих большую и малую субъединицы терминальной диоксигеназы, соответственно (рис. 16). Кроме того, обнаружен регуляторный ген ohbR, транслируемый им белок относится к регуляторным белкам IclR-типа (Donald et al., 1996). Интересен факт, что орто-галобензоат 1,2-диоксигеназная активность проявлялась в отсутствие генов, кодирующих ферредоксин и редуктазу, предполагается, что терминальная оксигеназа ОГБД использует электрон-транспортную систему, синтезируемую различными бактериями-хозяевами. Терминальная оксигеназа, кодируемая генами ohbB и ohbA, образует отдельный филогенетический кластер, который включает ароматические оксигеназы нетипичной структурно-функциональной организации и отличающиеся от других членов семейства ароматических диоксигеназ (Gibson, Parales, 2000).

В составе клонированной вставки была обнаружена открытая рамка считывания ORF5 (ohbC); функция транслируемого полипептида массой 48969 Да неизвестна (рис. 17). ohb-Гены фланкированы IS1396-подобными инсерционными последовательностями, в состав транспозона входили гены tnpA и top, кодирующие транспозазу А и топоизомеразу I/III, соответственно. Кроме того, было обнаружено, что весь «ohb-регион» ограничен инвертированными повторами размером 14 п.н. в позициях (56 - 69) и (5984 - 5997) (GenBank AF121970).

Рис. 16 Физическая карта и организация ohb-локусов в составе рекомбинантных плазмид pOD22 и pOD33. Плазмиды pK33A16, pK33H7 и pK33A20 были cконструированы на основе вектора BlueScript; для других вариантов использовали вектор pSP329. Фенотипы указаны справа от названия плазмид. Локализация и ориентация ORF1 (top), ORF2 (ohbR), ORF3 (ohbA), ORF4 (ohbB), ORF5 (ohbC), ORF6 (tnpA) показана в нижней части рисунка, там же указаны молекулярные массы соответствующих полипептидов.

Рис. 17 Авторадиограмма [35S]метионин-меченных полипептидов, синтезируемых в миниклетках E. coli 925, содержащих рекомбинантные плазмиды. Дорожки: 1, pSP329; 2, pOD33; 3, p33K21; 4, pOD22; 5, pE43; 6, pE33-1. Стандарты молекулярных масс (SDS-7; «Sigma»): бычий сывороточный альбумин (66.2 kDa), овальбумин (45 kDa), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (36 kDa), карбоангидраза (29 kDa), трипсиноген (24 kDa), ингибитор трипсина (20.1 kDa), and -лактальбумин (14.2 kDa).

3.4. Конструирование метаболических путей деструкции хлорароматических соединений в клетках бактерий

3.4.1. Клонирование и экспрессия fcb-генов в составе рекомбинантной плазмиды в клетках P. putida

На основе вектора с широким кругом бактерий-хозяев pRK415 (Keen,1988) нами была сконструирована рекомбинантная плазмида pPC3, содержащая fcb-гены. Из клеток рекомбинантного штамма E. coli JM109(pPC3) плазмида была мобилизована в клетки штамма P. putida KЗ6R (Rif^r), способного к полному окислению пара-гидроксибензойной кислоты (ПГБК), но не 4ХБК (Карасевич, Зайцев, 1984). Эксперименты по выращиванию в Cl^--cвободной среде в присутствии возрастающих концентраций 4ХБК показали, что за 48 часов роста рекомбинантный штамм P. putida KЗ6R(pPC3) полностью дехлорирует 3.5 г/л субстрата в сравнении с 1.5 г/л в случае родительского штамма KЗT1. Таким образом, внесение fcb-генов в штамм, утилизирующий ПГБК, привело к образованию гибридного пути деградации 4ХБК путем вертикального наращивания предсуществовавшего пути.

Путем пересевов рекомбинантного штамма P. putida КЗ6R(pPC3) на среды с постепенно повышающимися концентрациями 4ХБК (от 1 до 10 г/л) были получены варианты, характеризующиеся суперэкспрессией fcb-генов. Наиболее эффективное фенотипическое выражение функции дехлорирования наблюдалось у штамма KЗ6R(pPC3-10), адаптированного к росту на 10 г/л 4ХБК, который полностью минерализовал до 6 г/л 4ХБК при росте в минеральной среде. Все штаммы, адаптированные к высоким концентрациям 4ХБК, характеризовались более высокой степенью стабильности поддержания плазмиды в клетках по сравнению с исходным штаммом КЗ6R(pPC3). Рестрикционный анализ плазмид из всех адаптированных вариантов штамма КЗ6R(pPC3) выявил во всех случаях наличие делеции размером 3 т.п.н. в векторной части плазмиды pPC3. Основываясь на этом факте, можно предположить, что повышение стабильности плазмид в клетках адаптированных штаммов связано со структурными изменениями исходной рекомбинантной плазмиды pPC3.

3.4.2. Конструирование рекомбинантного штамма, содержащего fcb_гены в хромосоме P. putida

Реальный путь достижения генетической стабильности - интеграция желаемого гена в хромосому реципиента. С этой целью нами были проведены эксперименты по конструированию штамма, содержащего fcb-гены в хромосоме P. putida KЗ6R. На основе вектора pDK8, содержащего модифицированный транспозон Tn5-K2GA(Tc^r), была сконструирована плазмида pCDK4, содержащая fcb-гены, которая была мобилизована в клетки P. putida KЗ6R. При селекции трансконьюгантов на среде, содержащей тетрациклин и 4ХБК в качестве единственного источника углерода и энергии, был получен рекомбинантный штамм KЗ6R::Tn5-K2GA[Tc^r fcbA1,A2,A3], характеризовавшийся высокой стабильностью признака 4ХБК⁺. Сравнительный анализ эффективности деградации 4ХБК полученного штамма и плазмидных вариантов штамма КЗ-6R показал, что за 20 суток штамм полностью утилизирует до 4 г/л 4ХБК. Эта величина сравнима с таковой для штамма KЗ6R(pPC3), но много ниже для адаптированных вариантов последнего.

Таким образом, введение генов дехлорирования в хромосому, с одной стороны, приводило к стабилизации проявления функции. С другой стороны, плазмидные варианты штамма P. putida КЗ6R обладали более высокой эффективностью дехлорирования 4ХБК, так как в хромосоме fcb-гены находились в единственной копии.

3.4.3. Штаммы-деструкторы ПХБ, сконструированные при использовании fcb- и ohb-генов

Описано большое количество бактерий-деструкторов, осуществляющих разложение различных конгенеров ПХБ, и наиболее изученными из них являются штаммы Burkholderia xenovorans LB400 и Rhodococcus sp. RHA1 (Chain et al., 2006; McLeod et al., 2006). Однако подавляющее большинство деструкторов ПХБ, в том числе и вышеперечисленные, в процессе разложения этих токсикантов аккумулируют хлорбензоаты. Для создания рекомбинантного пути полной утилизации орто- и пара-ХБ были использованы ohb и fcb гены (рис. 18), контролирующие орто- и пара-дегалогенирование хлорбензоатов (см. разделы 3.1. и 3.3.).

Первоначально были проведены эксперименты по созданию модифицированных путей полной утилизации моноХБ путем добавления генов дегалогенирования ohb и fcb в составе рекомбинантных плазмид в штамм-деструктор хлорбифенилов Comamonas testosteroni VP44 (Мальцева et al., 1999). Рекомбинантные штаммы C. testosteroni VP44, содержащие ohb и fcb гены приобретали способность расти на 2ХБК, 2моноХБ и 4ХБК, 4моноХБ, соответственно, при концентрации 10 мМ каждого из субстратов (Hrywna et al., 1999). Аналогичные эксперименты были проведены с использованием штамма Rhodococcus sp. RHA1 в качестве реципиента генов fcb (плазмиды pRHD34): сконструированный штамм приобретал способность к росту на 4ХБК и 4моноХБ (Rodrigues et al., 2001).

Рис. 18 Рекомбинантные пути деградации 2ХБК (вверху) и 4ХБК (внизу), конструированные путем наращивания предсуществовавших путей окисления (хлор)бифенилов, орто-гидроксибензоата, катехола и пентадиена с использованием дегалогеназных генов ohbAB и fcbABC. Показано анаэробное дехлорирование Арохлора, в результате которого аккумулируются, в основном, орто- и пара-замещенные ХБ (слева) и метаболизм 2ХБ и 4ХБ через орто-ХБ-ГОФДК и пара-ХБ-ГОФДК, соответственно, которые трансформируются в ХБК и пентадиен (цит. по Hrywna et al., 1999).

Рекомбинантные штаммы B. xenovorans LB400 (pRO41, ohb) и Rhodococcus sp. RHA1 (pRHD34, fcb) были исследованы в модельных почвенных экспериментах при деструкции коммерческой смеси ПХБ «Aroclor 1242». После 30 дней инкубирования количество ПХБ-конгенеров сократилось на 57%, при этом рекомбинантные бактерии стабильно сохранялись в загрязненной ПХБ почве в течение всего эксперимента (Rodrigues et al., 2006).

Таким образом, использование клонированных генов раннего дегалогенирования при создании бактерий с новыми метаболическими характеристиками, существенными при разложении хлорароматических ксенобиотиков, имеет фундаментальное и практическое значение.

4. Природные и модельные ассоциации бактерий, перспективные для использования в биотехнологиях очистки окружающей среды

4.1. Нафталинметаболизирующие ассоциации бактерий, выделенные из техногеннозасоленных почв

Из почв района солеразработок методом накопительного культивирования получены две ассоциации бактерий, способные расти на нафталине в присутствии повышенной солености среды: ассоциация SMB1 - до 80 г/л NaCl, ассоциация SMB3 - до 90 г/л NaCl.

4.1.1. Характеристика нафталинметаболизирующих ассоциаций

Ассоциация бактерий SMВ1. При росте ассоциации SMВ1 на агаризованной минеральной среде в парах нафталина наблюдалось формирование биопленки на агаре при содержании хлорида натрия до 140 г/л (табл. 6). В то же время, рост ассоциации в жидкой минеральной среде на нафталине как единственном источнике углерода и энергии был зафиксирован при содержании соли не более 80 г/л. Наибольшие показатели роста сообщества были установлены в отсутствие NaCl в среде культивирования (ОП₅₄₀=0.66 о.е.), в присутствии 50, 70 и 80 г/л NaCl оптическая плотность культуры уменьшалась и достигала 0.25, 0.19 и 0.11 о.е., соответственно.

Галотолерантные штаммы Arthrobacter sp. SMВ11 и Arthrobacter sp. SMВ145 филогенетически близки (99.7% сходства нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК) к A. сrystallopoietes (см. раздел 1.1). Штаммы росли на нафталине, салицилате и ацетате (интермедиаты деструкции нафталина), а также бензойной и пара-гидроксибензойной кислотах.

Таблица 6 Рост ассоциации SMB1 и индивидуальных штаммов на агаризованной среде в присутствии разных концентраций NaCl (г/л)

Примечание. «+» - рост (колонии размером 1-3 мм); «» - слабый рост (колонии размером менее 1 мм); «» - отсутствие роста бактерий.

*Рост фиксировался по образованию биопленки на агаризованной среде. При росте на полноценной среде в присутствии 240 г/л и 290 г/л NaCl присутствовали только колонии штамма Chromohalobacter sp. SMB17.

Грамположительный штамм SMB14 (=ВКМ Ас-2280^Т =LMG 22207) на основании результатов изучения генотипических, хемотаксономических и морфо-физиологических характеристик был валидно описан как новый вид Brevibacterium permense. Штамм рос на бензойной, парагидроксибензойной кислотах и ацетате как единственном источнике углерода и энергии, а также на полноценной среде Раймонда без NaCl в среде культивирования и при концентрации соли до 120 г/л (табл. 6).

Штамм SMB17 - умеренно галофильная бактерия семейства Halomonadaceae, растет на средах при 30-290 г/л NaCl и не растет в отсутствии соли (табл. 6). Сравнительный анализ нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК (около 1470 п.н.) показал, что штамм входит в филогенетический кластер, включающий представителей рода Chromohalobacter, и наиболее близок (более 99% сходства 16S рРНК генов) к C. canadensis ATCC 43984^Т, C. beijerinckii ATCC 19372^Т и C. japonicus CECT 7219^T. Штамм растет на бензойной, парагидроксибензойной кислотах и ацетате.

Ассоциация бактерий SMB3. Изучение влияния солености среды на рост консорциума SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии показало, что максимальные значения оптической плотности культуры наблюдаются при 30 г/л NaCl и в отсутствие соли. Увеличение концентрации хлорида натрия в среде культивирования до 90 г/л приводило к снижению показателей ростовых характеристик. При более высоких концентрациях соли увеличения оптической плотности не зафиксировано (рис. 19). Из исследуемой ассоциации выделено семь штаммов бактерий (табл. 7), отличающиеся между собой и от выделенных ранее из района солеразработок бактерий по фенотипическим и генотипическим характеристикам (REP-, BOX-ПЦР и ARDRA).

Рис. 19 Рост ассоциации SMB3 в минеральной среде Раймонда с нафталином при разных концентрациях NaCl (г/л). 1 - без соли, 2 - 30, 3 - 60, 4 - 75, 5 90.

В состав ассоциации входят Rhodococcus sp. SMB37 и Rhodococcus sp. SMB38 - деструкторы нафталина (см. раздел 1.2.), а также штаммы, не деградирующие данное соединение (бактерии-спутники) (табл. 7), характеристики которых приводятся ниже.

Штамм Halomonas sp. SMB31, согласно филогенетическому анализу (16S рРНК), наиболее близок к Halomonas taeanensis (уровень сходства 99.8%) и характеризуется фенотипическими признаками, свойственными роду.

Таблица 7 Рост бактерий из ассоциации SMB3 на полноценной и минеральной (с нафталином) средах в присутствии разных концентраций NaCl (г/л)

Примечание. * - рост на полноценной агаризованной среде Раймонда, ** - рост в жидкой минеральной среде Раймонда с нафталином, «-» - нет роста, «+» - «+++» - активность роста.

Штамм SMB35 образует периферическую ветвь в филогенетическом кластере, включающем роды Halomonas, Cobetia и Chromohalobacter. Уровни сходства 16S рРНК гена штамма SMB35 и видов рода Halomonas - в пределах 90.6% - 95.1%. Наиболее высокие величины сходства (95.0-95.1%) обнаружены с тремя видами рода Halomonas - H. pacifica, H. taeanensis и H. ventosae. Штамм SMB35 отличается также от видов Halomonas sensu stricto и близкородственных видов Halomonas, а также от представителей других родов семейства Наlomonadaceae по фенотипическим характеристикам (подвижность и характер расположения жгутиков, диапазон концентраций NaCl, при которых возможен рост, способность гидролизовать крахмал, желатину, твин 80, мочевину). На основании вышеперечисленных характеристик, а также отличий по содержанию Г+Ц-пар в ДНК, штамм SMB35 (=ВКМ В_2397^Т =DSM 19940Т) валидно описан в качестве нового рода и вида Salinicola socius в семействе Halomonadaceae.

Штамм SMB34 (сем. Rhodospirillaceae) является аэробом, хемоорганотрофом, клетки - изогнутые палочки, подвижные (один полярный жгутик). Оксидазо- и каталазоположительные. Штамм растет как в отсутствии NaCl, так и при высокой солености среды культивирования (до 80 г/л соли). Филогенетический анализ (16S рРНК) показал, что штамм группируется с представителями рода Thalassospira и имеет наиболее высокий уровень сходства гена 16S рРНК (99.5%) с T. xiamenensis M-5^T. Уровень сходства с типовым штаммом типового вида рода Thalassospira (T. lucentensis QMT2^T) - 96.6%. Состав жирных кислот SMB34 и референтных штаммов оказался близким, преобладали C_18:1щ7, C_16:0 , C_18:0, C_16:1щ7c, C17:0 cyclo. Однако у штамма SMB34 дополнительно выявлены iso-C15:0 и anteiso-C15:0, не обнаруженные у близкородственных видов. Уровень ДНК-ДНК сходства между штаммом SMB34 и типовыми штаммами (T. xiamenensis M-5^T , T. tepidiphila 1-1B^T и T. profundimaris WPO211^T) не превышает 50%. Основываясь на перечисленных выше данных, штамм SMB34 (=ВКМ B_2527^T =NBRC 106175^T) отнесен к новому виду «Thalassospira permensis».

Штаммы SMB32 и SMB33 на основании филогенетического анализа и ряда фенотипических признаков на данном этапе исследований определены как Arthrobacter sp. (группа «A. nicotianae») и Microbacterium sp., соответственно. Штаммы являются компонентами нафталинметаболизирующего консорциума SMB3, способны использовать в качестве единственного источника углерода и энергии интермедиаты деструкции нафталина - салицилат и гентизат.

Галотолерантные штаммы Rhodococcus sp. SMB37, Rhodococcus sp. SMB38, Arthrobacter sp. SMB32 и Microbacterium sp. SMB33 способны к росту на полноценной среде Раймонда без и в присутствии NaCl до 100 г/л , а «Thalassospira permensis» SMB34 растет при концентрации соли до 80 г/л в среде культивирования (табл. 7). Умереннно галофильные, согласно классификации Кашнера (Кашнер, 1981; Ventosa et al., 1998), штаммы SMB31 и SMB35 (сем. Halomonadaceae) растут на полноценной среде Раймонда при 30 - 300 г/л NaCl; оптимальный рост - при 30-100 г/л NaCl в среде культивирования.

Штаммы Halomonas sp. SMB31 и Salinicola socius SMB35 при росте в минеральной среде Раймонда с глюкозой в качестве субстрата в условиях высокой осмолярности среды (50, 100 г/л NaCl) внутриклеточно накапливали эктоин и глутамат. В клетках S. socius при росте в присутствии 100 г/л NaCl был дополнительно обнаружен гидроксиэктоин. Полученные результаты о качественном составе осмопротекторов представителей семейства Halomonadaceae согласуются с литературными данными (Calderon et al., 2004; Vargas et al., 2006).

4.1.2. Протокооперация в нафталинметаболизирующем консорциуме бактерий SMB3

Поскольку бактерии-спутники консорциума SMB3 способны расти на интермедиатах катаболизма нафталина (салицилате, гентизате, ацетате), было проведено исследование влияния промежуточных метаболитов деструкции нафталина на структуру консорциума, используя метод ДГГЭ и подсчет КОЕ. Установлено, что культивирование консорциума на ацетате, салицилате и гентизате приводит к элиминации ряда бактерий, в то время как при инкубировании с нафталином в качестве единственного источника углерода и энергии состав стабильно сохраняется. Наблюдаемое уменьшение биоразнообразия консорциума SMB3 при смене источника углерода и энергии (нафталина на промежуточные продукты его метаболизма) можно объяснить сокращением звеньев трофической цепи, что ведет к конкуренции между бактериальными популяциями, трансформирующими одинаковый субстрат. Полученные результаты доказывают, что в ассоциации присутствуют сформированные трофические связи, в которых каждый член сообщества занимает определенную экологическую нишу.

Изучены кинетические параметры роста модельных смешанных культур на нафталине в условиях высокой солености среды. В экспериментах были использованы родококки - деструкторы нафталина SMB37 и SMB38, умеренно галофильный штамм Halomonas sp. SMB31 в следующих вариантах: штаммы SMB37 и SMB31 (I); штаммы SMB38 и SMB31 (II); штаммы SMB37, SMB38 и SMB31 (III). Контроль качественного состава смешанных культур бактерий осуществляли методом ДГГЭ. Результаты электрофореза подтверждают данные, полученные на основе макроморфологических свойств бактерий (подсчет КОЕ).

Показано, что умеренно галофильная бактерия Halomonas sp. SMB31 сохраняется в составе смешанных культур при культивировании на нафталине и, более того, способна к эффективному росту (рис. 20 А,Б). При совместном культивировании штаммов-деструкторов с умеренно галофильной культурой Halomonas sp. SMB31 значительно сокращается lag-период и увеличивается удельная скорость роста Rhodococcus sp. SMB38, а также увеличивается количество клеток Rhodococcus sp. SMB37 (рис. 20 В).

Результаты модельных экспериментов, демонстрирующие наличие взаимовыгодных отношений между деструкторами и бактериями-спутниками в искусственно созданных ассоциациях, могут быть спроецированы как на отношения организмов в полученных нами путем селекции консорциумах (SMB1, SMB3), так и на отношения в микробиоценозах природных и техногенных экосистем. По всей вероятности, описанные выше взаимодействия между бактериями в условиях высокой осмолярности среды связаны с обменом осмопротекторными соединениями между членами микробных сообществ (консорциумов). Способность синтезировать осмолиты была нами выявлена у умеренно галофильных бактерий сем. Наlomonadaceae (см. раздел 4.1.1.) и галотолерантных бактерий из ассоциаций SMB1, SMB3 (см. раздел 1.5.).

I вариант II вариант

III вариант

Рис. 20 Рост модельных ассоциаций и индивидуальных штаммов-деструкторов в среде Раймонда на нафталине в присутствии 70 г/л NaCl. Не заштрихованные маркеры - индивидуальные бактерии, заштрихованные маркеры - штаммы в составе ассоциаций.

4.2. Двухкомпонентная бактериальная ассоциация, осуществляющая полную деструкцию 2,4'-дихлорбифенила

Штамм-деструктор хлорбифенилов Microbacterium sp. B51 не осуществляет по...