Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях

Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

03.01.05 - Физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Физиологическое значение фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза в неблагоприятных условиях

Макарова Л.Е.

ИРКУТСК - 2010

Работа выполнена в лаборатории физиологии устойчивости растений Учреждения Российской академии наук Сибирского института физиологии и биохимии растений СО РАН, Иркутск

Научный консультант: д.б.н., профессор В.К. Войников

Официальные оппоненты: доктор биологических наук Озолина Н.В. доктор биологических наук Новикова Т.И. доктор химических наук, профессор Бабкин В. А.

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им К.А. Тимирязева РАН, г. Москва

Защита состоится «7» октября 2010 г. в 10 ч на заседании диссертационного совета Д 003.047.01 при Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН по адресу: 664033, Иркутск, а/я 317, ул. Лермонтова, 132. Факс (3952) 51-07-54; e-mail: matmod@sifibr.irk.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Сибирском институте физиологии и биохимии растений СО РАН.

Автореферат разослан « » 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Г. П. Акимова

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

По экономической значимости бобовые растения семейства Fabaceae (подсемейства Mimosoideae, Caesalpinoideae, Papilionoideae) ставят на второе место после злаковых культур (ван Беркум, Эрдли, 2002). Это объясняется не только пищевой и технической ценностью представителей подсемейства Papilionoideae, но и их значением для агросистем, где они являются поставщиками форм азота, доступных для соседствующих с ними растительных культур, неспособных ассимилировать атмосферный азот самостоятельно.

Формирование бобово-ризобиального симбиоза представляет собой цепь морфо-физиологических процессов у обоих симбионтов и во многом зависит от успешности прохождения его начальных этапов, которые в настоящее время остаются еще недостаточно изученными, особенно при неблагоприятных условиях. Познание физиолого-биохимических механизмов начальных этапов взаимодействия симбионтов может способствовать разработке мер, направленных на существенное повышение эффективности симбиоза.

Триггерами симбиотических взаимодействий являются специфические фенольные соединения, синтезируемые растением-хозяином. Они выступают в качестве сигнальных молекул со стороны растения и способствуют активизации микросимбионта: вызывают хемотаксис, экспрессию nod- генов, размножение ризобий в ризосфере и ризоплане. Второй аспект действия фенольных соединений - участие в процессах ауторегуляции, связанных с контролированием инфекционных процессов, формированием примордий клубеньков, нодуляцией. Такая роль может быть отведена как эндогенным фенольным соединениям растений, участвующим в контролировании проникновения ризобий в ткани корня, так и входящим в состав семенных и корневых экссудатов, регулирующих концентрацию микросимбионта в ризосфере, от которой может зависеть число формирующихся на корнях клубеньков (Мишустин, Шильникова, 1973).

Системы ауторегуляции бобового растения, вероятно, призваны обеспечивать строго нормированное проникновение бактерий в определенные корневые локусы и формирование количества клубеньков, соответствующего энергетическим возможностям растения. Поэтому ауторегуляция нодуляции имеет особое значение для растения в неблагоприятных условиях его существования. При этом роль растительных фенольных соединений, способных участвовать в системах контролирования начала взаимодействий и инфицирования в условиях действия неблагоприятных внешних факторов (низких температур, недостатка освещения и др.), остается практически неизученной. Выявленные особенности изменения в обмене и свойствах растительных фенольных соединений в неблагоприятных для симбиоза условиях позволят прогнозировать активность формирования симбиоза и будут содействовать поиску способов его регуляции при действии неблагоприятных факторов.

Цель и задачи исследования. Цель работы: изучение роли фенольных соединений в регуляции начальных этапов формирования симбиоза между бобовыми растениями и Rhizobium при неблагоприятных для его становления условиях температуры, освещения.

Для достижения поставленной цели были определены следующие задачи:

1. Изучить влияние абиотических факторов (температуры, условий гидрокультуры) на обмен фенольных соединений в корнях проростков гороха в связи с инокуляцией их Rhizobium.

2. Выяснить роль эндогенных фенольных соединений в контролировании инфицирования корней гороха бактериями Rhizobium в условиях разных температур.

3. Изучить локализацию фенольных соединений в корневых тканях после инфицирования клубеньковыми бактериями корней растений при разных температурах.

4. По показателям ПОЛ определить температурную зависимость проявления защитных реакций в корнях проростков гороха после инокуляции их ризобиями и изучить участие в регуляции ПОЛ эндогенных фенольных соединений.

5. По характеру взаимодействия эпидермальных клеток корня с Rhizobium установить локализацию участков корней, различающихся по восприимчивости к микросимбионту, у проростков, испытывавших действие разных температур.

6. Изучить влияние температуры на ПОЛ после инокуляции Rhizobium в различных по восприимчивости к микросимбионту участках корней.

7. Изучить влияние температуры на обмен фенольных соединений и выяснить характер их участия в защитных реакциях корневых клеток в различающихся по чувствительности к Rhizobium участках корней проростков гороха.

8. Изучить особенности экссудации корнями фенольных соединений и участия их в регуляции численности бактерий Rhizobium в ризосфере в зависимости от температуры и освещения.

9. Оценить роль эндогенных фенольных соединений в контролировании инфицирования корней проростков бобовых растений в светонезависимый период их развития и роль фенольных соединений, выделяемых корнями в ризосферу, в регуляции взаимодействия симбионтов на стадии преинфекции и в последующие периоды после инокуляции в зависимости от условий освещения и температуры среды.

Положения, выдвигаемые на защиту:

· Активизация метаболизма фенольных соединений в корнях бобовых при инфицировании Rhizobium в неблагоприятных условиях свидетельствует об их участии в ауторегуляции инфекционного процесса.

· В контролировании колонизации корней ризобиями важная роль принадлежит лабильной и химически активной группе «растворимых» фенольных соединений, присутствующих в периферических слоях корневого кортекса.

· Содержание, состав и физиолого-биохимические свойства «растворимых» липофильных компонентов, а также степень связывания с клеточными стенками определяют приоритетные механизмы участия фенольных соединений в защитных реакциях клеток зон корней с различной восприимчивостью к Rhizobium.

· Факторы внешней среды оказывают влияние на количественный и качественный состав фенольных соединений в корневых экссудатах растения-хозяина, изменяя направленность их воздействия на размножение клубеньковых бактерий при колонизации корня.

Научная новизна

Впервые приведены доказательства важной роли фенольных соединений растения-хозяина в ауторегуляции инфицирования корней бобового растения в неблагоприятных условиях.

Впервые представлены данные, свидетельствующие об участии фенольных соединений, выделяемых корневыми клетками во внешнюю среду, в регуляции размножения ризобий в различные периоды после инокуляции ими корней бобового растения и об изменениях этой регуляции под влиянием абиотических факторов.

Впервые показано, что механизмы реализации протекторных функций фенольных соединений зависят от восприимчивости корневых клеток к Rhizobium. Однако они могут различаться и в разных участках восприимчивых к инфицированию зон корней, при этом характер участия фенольных соединений в защитных реакциях в указанных зонах зависит от температуры выращивания.

Впервые в составе эндогенных и выделяемых корнями во внешнюю среду фенольных соединений гороха выявлены N-фенил-2-нафтиламин и сложные эфиры орто-фталевой кислоты. Предполагается, что высокоактивный и высоколипофильный N-фенил-2-нафтиламин способен участвовать в регуляции уровня АФК в корневых клетках. В составе корневых экссудатов гороха это вещество вместе со стильбеном и эфирами орто-фталевой кислоты могут выполнять роль аллелопатических веществ, подавляющих почвенную микрофлору, включая бактерии Rhizobium.

Использованные методические приемы исследования состава фенольных соединений и примененные автором схемы выращивания растений позволили разработать новое перспективное направление и получить принципиально новую информацию о регуляторной роли фенольных соединений при формировании бобово-ризобиального симбиоза.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные результаты вносят существенный вклад в познание механизмов ауторегуляции инфицирования бобовых растений Rhizobium и роли в этих механизмах фенольных соединений корней растения-хозяина.

Результаты показывают, что характер участия фенольных соединений в реакциях на инфицирование Rhizobium определяется особенностями обмена фенольных соединений в различающихся по чувствительности к ризобиальной инфекции участках корней, зависимого от температуры выращивания.

В составе корневых экссудатов гороха выявлены конкретные ароматические вещества - N-фенил-2-нафтиламин, стильбен, сложные эфиры орто-фталевой кислоты аллелопатического действия на микрофлору почвы, в том числе подавляющих размножение их микросимбионтов - клубеньковых бактерий.

Апробация работы: Основные результаты работы докладывались на международном Симпозиуме «Signal system of рlant cell» (Москва, 2001), Всероссийских научных конференциях «Стрессовые белки растений» (Иркутск, 2004), «Устойчивость растений к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2007), «Устойчивость организмов к неблагоприятным факторам внешней среды» (Иркутск, 2009), Втором международном симпозиуме «Сигнальные системы клеток растений: роль в адаптации и иммунитете» (Казань, 2006), «VII международном симпозиуме по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2009), а также на научных сессиях Сибирского института физиологии и биохимии растений (1994, 1996, 1998, 2000, 2002, 2004, 2006).

Публикации: По материалам диссертации опубликовано 45 работ.

Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, объектов и методов исследований, результатов и обсуждения, заключения и выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 469 источников (в том числе 327 на иностранных языках) и Приложения. Работа изложена на 328 страницах, содержит 76 рисунков (11 из них в Приложении) и 16 таблиц (6 из них в Приложении).

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Приводятся данные, характеризующие начальные этапы формирования симбиоза между бобовыми растениями и Rhizobium и факты о важной роли фенольных соединений, синтезируемых растением-хозяином, в становлении симбиоза.

Наиболее изучена роль фенольных соединений в период преинфекции. Установлено, что фенольные соединения, находящиеся в составе экссудатов набухающих семян и выделяемые корнями, выполняют функцию хемоаттрактантов и запускают цепь метаболических процессов у бактерий, направленных на синтез Nod-факторов - сигнальных молекул со стороны микросимбионта (Coronado et al., 1995; Buffard et al., 1996; Кравченко и др., 1998; Hirsch et al., 2001; Dakora, 2003). Фенольные соединения семенных и корневых экссудатов могут оказывать влияние на размножение микросимбионта (Hartwig et al., 1991).

С синтезом сигнальных молекул появляется у бактерий возможность к адгезии на поверхности корней (стеблей), образованию инфекционных нитей, несущих для бактерий протекторную функцию от агрессивных компонентов растительных клеток и позволяющих им проникать во внутренние слои растительного органа к месту их дальнейшего поселения.

Приведены данные, свидетельствующие о влиянии абиотических факторов на формирование симбиоза. Предположено, что темпы формирования симбиоза связаны с изменениями в обмене фенольных соединений в клетках растения-хозяина, которые одинаково зависимы от внешних воздействий.

Обсуждается необходимость ауторегуляции процессов нодуляции, сопряженных с проявлением защитных реакций у растений и роль в ней фенольных соединений. Приведенные данные позволяют отметить ряд общих черт, а также отличия в характере проявлений защитных реакций у растений при патогенезе и симбиозе.

Показано, что фенольные соединения в защитных реакциях могут выступать в качестве сигнальных молекул, индуцирующих защитные реакции (Dixon, Paiva, 1995; Dixon et al., 2002), имеют отношение к проявлению сверхчувствительности, участвуют в формировании физического барьера для фитопатогенов, при поранении (Dixon et al., 2002). Ряд синтезируемых растениями фенольных соединений являются фитоалексинами, подавляющими микрофлору (VanEtten et al., 1994; Mert-Tьrt, 2002).

Важная функция фенольных соединений, имеющая отношение к защитным реакциям - это участие в регуляции уровня окислительных процессов, на которые они могут влиять, выступая в качестве анти- или прооксидантов в ферментативных и неферментативных реакциях (Рогинский, 1988; Меньщикова, Зенков, 1993; Pourcel et al., 2007).

М.В. Кения с соавт. (Кения и др., 1993) низкомолекулярные компоненты клеток с антиоксидантными свойствами, в числе которых фенольные соединения, отнесли к «истинным антиоксидантам», способным, при вступлении в реакцию с АФК, образовывать либо молекулярные продукты, либо радикалы с меньшей реакционной способностью.

Приведены сведения, указывающие, что механизмы влияния фенольных соединений на окислительные процессы в неферментативных реакциях многообразны, определяются структурой фенольных соединений, наличием у них химически активных функциональных групп. Отмечено, что степень активности фенольных соединений определяют все присутствующие в реакционной среде компоненты, различающиеся по активности в перехватывании свободных радикалов.

Обосновывается необходимость проведения исследований, связанных с изучением роли фенольных соединений в контролировании инфицирования корней бобового растения бактериями Rhizobium в неблагоприятствующих симбиозу условиях. Отмечено, что для оценки значения фенольных соединений в контролировании инфицирования бобового растения бактериями Rhizobium необходимо исследование роли эндогенных фенольных соединений в защитных реакциях и фенольных соединений, выделяемых растением во внешнюю среду в контролировании размножения микросимбионта. Обозначена важность исследований участия фенольных соединений в указанных процессах для условий, в которых затормаживается формирование симбиоза.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследований. Объектом исследования служили растения гороха (Pisum sativum L.) сорта Марат селекции Тулунской государственной селекционной станции (Иркутская область). Исходным растительным материалом были этиолированные проростки, длина корней которых составляла 2,5-3,0 см. Их выращивали в термостатах с температурой 22 оС (оптимальная), либо 8 оС (пониженная). Рост этих проростков от момента замачивания семян и до начала экспериментов происходил в течение 2 сут при 22 оС, 7 сут - при 8 оС.

В экспериментах, где исследовались фенольные соединения корневых экссудатов, рост растений происходил в условиях гидрокультуры. Исходными, в зависимости от температуры, также были 2-х или 7- сут проростки. Сосуды с растениями помещали в камеру типа "Илка" N6 ("VEB, Elektro-Anlagenbau", Германия) с 16-тичасовым фотопериодом при температурах 22/14 оС (день / ночь) или 9 оС (круглосуточное действие). Интенсивность освещения в обоих вариантах выращивания на уровне сосудов составляла около 7 клк, влажность воздуха в камере - около 60 %. При изучении экссудации фенольных соединений в отсутствии освещения растения экспонировали в термостате с температурой 22 оС. Питательную среду, на которую помещали растения, содержавшую микроэлементы и сменявшуюся ежедневно, готовили на прокипяченой дистиллированной воде по (Jonson et al., 1966). Инокулят вносили в питательную среду 1 раз, в 1-е сутки эксперимента.

Для инокуляции растений и изучения ростовой активности фенольных соединений использовали культуру клубеньковых бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viceae, штаммов 245а (получен из ВНИИ зернобобовых культур, Орел), или 250а - СIAM 1026 (получен из ВНИИ с/х микробиологии, Пушкин - С.-Петербург).

Методы исследований

Определение биологической активности фенольных соединений гороха по их влиянию на размножение Rhizobium. Показателем биологической активности фенольных соединений в наших экспериментах было их влияние на один из важных процессов для симбиоза - размножение микросимбионта.

Действие фенольных соединений, содержащихся в экстрактах, на размножение Rhizobium оценивали по изменению оптической плотности суспензии бактерий (А 590). Измерения оптической плотности проводили в течение 1-2 суток каждые 8 ч, затем 16 ч, или, наоборот, через 16 ч, затем 8 ч, начиная от момента внесения в среду бактерий. Характер режима наблюдений зависел от цели эксперимента. Измерения осуществляли против тех же сред, но без бактерий: 1) содержащих фенольные соединения (для эксперимента) и 2) без фенольных соединений (для контроля). Концентрация фенольных соединений в тестовых средах составляла 2 мкг/ мл. Она была оптимальной для сравнения биологической активности изучаемых веществ и подобрана экспериментально (Макарова и др., 1998).

Для определения количества бактерий, вносимых в жидкую среду в начале экспериментов, и установления концентрации их в культуральной среде в разные периоды опытов из водных сред отбирали бактериальные суспензии и высевали на твердую среду по методу (Теппер и др., 1979). По числу образовавшихся при этом колоний устанавливали число живых колонийобразующих клеток в мл среды.

Микроскопические исследования. Для наблюдений за реакцией корневых волосков в ответ на инфицирование клубеньковыми бактериями и нодуляционными процессами, а также для анализа распределения в тканях корней фенольных соединений применяли метод световой микроскопии. Во всех случаях окрашивание препаратов осуществляли витальным красителем крезиловым голубым по (Kartush, 1975; Scott, Peterson, 1979).

Методы выделения фенольных соединений. Фенольные соединения из растительного материала, выделяли по разработанной ранее схеме (Макарова и др., 1998), основанной на принципах, изложенных в работе (Мийдла и др., 1975). Фенольные соединения, входящие в состав корневых экссудатов, извлекали этилацетатом из водной среды (питательного раствора), подкисленной 2 н HCl до pH 3,0-4,0. После удаления этилацетата в токе холодного воздуха остаток растворяли в небольшом объеме 96 %-го этанола.

Определение содержания фенольных соединений в экстрактах из корней и корневых экссудатов. Количество фенольных соединений в исследуемом экстракте определяли с реактивом Фолина-Дениса по стандартной методике (Запрометов, 1974). Для определения количества ванилин-положительных соединений реакцию проводили согласно методики в руководстве (Луковникова, Ярош, 1987). Содержание эндогенных фенольных соединений выражали в мкг/г сырой массы корня, а количество экссудируемых корнями фенольных соединений рассчитывалось в мкг на растение.

Методы разделения и исследования состава фенольных соединений.

Состав фенольных соединений исследовали с применением методов хроматографии на бумаге, в тонком слое, на колонке с Sephadex LH-20, капиллярного электрофореза, УФ-, ИК-, ХМС-, ЯМР -спектроскопии, по цветным реакциям с реагентами, дающими специфическую окраску с определенными группами фенольных соединений. При идентификации исследуемые фенольные соединения сопоставляли с аутентичными образцами.

Исследование активности фенольных соединений в свободно - радикальных процессах. Исследование антиоксидантных свойств фенольных соединений проводили в растворах и на хроматограммах, используя липидосодержащие системы.

При изучении активности фенольных соединений в отношении ингибирования ПОЛ использовали методику из работы (Li, Xie, 2000), основанную на определении содержания ТБК - реактивных продуктов. В качестве окисляемого субстрата использовали раствор соевого лецитина в концентрации 1 мг/ мл в 10 мМ трис-HCl трис-HCl буфере с рН 7.4. Концентрацию исследуемых фенольных соединений (40 мкг/мл) оптимизировали по калибровочному графику для (-)-эпикатехина. Объемы вносимых экстрактов рассчитывали по показателям оптической плотности в результате реакции с реактивом Фолина - Дениса и количество вносимых фенольных соединений было эквивалентным 40 мкг кемпферола, по которому строили калибровочный график. Соответствующие продукты ПОЛ определяли по (Hodges et al., 1999). Содержание ТБК-активных продуктов выражали в нмоль / мг лецитина.

Выявление фенольных анти- и прооксидантов хроматографическим методом осуществляли методом обесцвечивания -каротина (Максимов и др., 1985).

Определение перекисного окисления липидов в экстрактах из корней гороха. Определение содержания эндогенных ТБК - реактивных продуктов в целых корнях проводили, основываясь на методиках (Стальная, Гаришвили, 1977; Hodges et al., 1999). Определение ПОЛ в отрезках корней проводилось в соответствии с руководством (Hodges et al., 1999).

Статистическая обработка. Повторность экспериментов была 3-5 кратная, при трех биологических и 3-5 аналитических повторностях, в зависимости от используемого метода. При статистической обработке материала использовали общепринятые характеристики: среднеарифметические значения, стандартное или квадратическое отклонение от среднего значения, коэффициент корреляции, критерий Стьюдента.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Влияние условий выращивания на нодуляцию корней гороха

При выполнении исследований растения выращивали по схемам, соответствующим поставленным в работе задачам. Роль эндогенных фенольных соединений в начальные периоды взаимодействия симбионтов изучали на проростках, произраставших на влажной фильтровальной бумаге в темноте, в термостатах с разными температурами. Исследования проводились в период роста растений, не требующего освещения. Способ выращивания позволял пронаблюдать начальные моменты взаимодействия симбионтов, однако его нельзя было применять при изучении более поздних этапов симбиоза. Выращивание растений на фильтровальной бумаге, смоченной водопроводной водой при отсутствии света позволяло инфицированному ризобиями растению образовывать на корнях клубеньки (Макарова и др., 2004). Однако полного цикла нодуляции в этих условиях достичь было невозможно. Нодуляция в этих условиях характеризовалась малочисленностью клубеньков на корнях. Отсутствие света вызывало ослабление растения, что приводило к его заболеванию и гибели до наступления стадии созревания клубеньков.

Разработанный автором и примененный в работе способ выращивания растений в гидрокультуре (Макарова, 2001) позволил выполнить поставленные задачи при изучении роли фенольных соединений корневых экссудатов в формировании симбиоза в зависимости от периода после инфицирования их Rhizobium, а также от температуры и освещения. Он позволял быстро и в любой период извлекать из водной среды фенольные соединения, выделенные растениями из корневых клеток. Условия выращивания позволяли прохождению полного цикла нодуляции, но имели некоторые минусы. Так, по сравнению с условиями выращивания растений в песчаной культуре, выращивание растений в условиях гидрокультуры замедляло нодуляцию при оптимальном температурном режиме в 2 раза, а при пониженной температуре - в 6 раз.

Микроскопические исследование зависимости от температуры реакции корневых клеток и локализации фенольных соединений в тканях корней проростков гороха при инокуляции Rhizobium

Реакция клеток при инокуляции Rhizobium в разных частях корней при 22 и 8 оС



Рис. 1. Микрофотоснимки корневых волосков в разных участках инокулированных Rhizobium корней проростков гороха, выращенных при 22 ?С.

Для определения локализации восприимчивых и невосприимчивых к ризобиальной инфекции зон через 24 ч после инокуляции методами микроскопии прослеживали взаимодействия эпидермальных клеток в разных частях корней, росших при 22 и 8 оС.

На поверхности корней по скоплениям бактерий определяли области адгезии, появления корневых волосков, прослеживали за изменением размеров корневых волосков и развитием деформаций, возникающих при воздействии на них микросимбионта (рис. 1, 2), выявляли участки, где наблюдались признаки проникновения бактерий - возникновение инфекционных нитей внутри корневых волосков.

Температура влияла на скорость роста корня, на длину зоны корневых волосков и на размеры корневых волосков. Замедленный рост корней при пониженной температуре являлся причиной меньших, чем при температуре 22 оС размеров зоны корневых волосков и заторможенного роста и развития корневых волосков.

При обеих температурах зона адгезии, со скоплениями ризобий на поверхности эпидермальных клеток и между начинающими рост корневыми волосками, приходилась на участок, расположенный приблизительно на расстоянии 3-10 мм от кончика корня. Первые выступы эпидермальных клеток, дающие начало корневым волоскам, при температуре 22 ?С появлялись примерно на расстоянии 4-5 мм от кончика корня, при 8 оС - на расстоянии 8-10 мм.

Рис. 2. Корневые волоски на корнях проростков гороха, выращенных при 8 ?С.

А - неинфицированные растения. Микрофотоснимок получен на расстоянии 12-13 мм от кончика корня. Длина корня составляла 36,0 мм.

Б - инфицированные бактериями Rhizobium растения. Микрофотоснимок получен на расстоянии 15-16 мм от кончика корня. Длина корня составляла 36 мм. Стрелка указывает на инфекционную нить с ризобиями.

Температура влияла на форму корневых волосков в начале их роста. Так, при 22 ?С корневые волоски, достигавшие размеров 10-20 мкм, имели коническую форму, и с переходом к дальнейшему росту они приобретали цилиндрическую форму с закругленным апикальным концом. При 8 ?С конусовидная форма корневых волосков по достижении ими размеров около 20-30 мкм чаще переходила в грибовидную, затем в цилиндрическую. В этих условиях небольшая искривленность поверхности корневых волосков возникала даже при отсутствии взаимодействия их с ризобиями (в контроле, рис. 2А).

Первые деформации корневых волосков на поверхности корней, росших при 22 ?С, наблюдали на расстоянии около 8-10 мм от кончика корня. Здесь и далее, приблизительно до 22-25 мм (от кончика корня), слабые деформации корневых волосков проявлялись в основном небольшими поперечными перетяжками, изгибами в апекальной части корневых волосков (рис. 1А, 1Б). Начиная с 22-25 мм, корневые волоски достигали довольно больших размеров (до 200 мкм), хотя и среди них располагались более мелкие по размеру корневые волоски (60-90 мкм) (рис. 1В). В этой зоне средней протяженности 5-9 мм у корневых волосков обнаруживали наиболее зримые деформации, в некоторых корневых волосках наблюдали небольшие инфекционные нити (рис. 1В), свидетельствующие о начале процесса проникновения ризобий.

Не обнаружено признаков взаимодействий симбионтов в областях корней, содержавших до инокуляции зрелые корневые волоски, а также в прилегающей к основанию корня области длиной около 20,0 мм, где отсутствовали корневые волоски.

При 8 оС начало зоны деформаций корневых волосков приходилось на 9,0 ± 1,0 мм от кончика корня, протяженность ее при длине корня 31-34 мм, составляла 5-7 мм, где присутствовали корневые волоски разных размеров: от 10-20 до 60-80 мкм. Лишь при длине корней 35-36 мм, на расстоянии 16,0 ± 1,0 мм от кончика корня обнаруживали зону проникновения длиной 1,5 ± 0,5 мм. В этой зоне присутствовало небольшое количество корневых волосков длиной от 90-120 мкм, внутри которых обнаруживались инфекционные нити (см. рис. 2Б).

Влияние температуры на локализацию фенольных соединений в тканях корней проростков гороха

Гистохимическими исследованиями прослежено распределение фенольных соединений в тканях инокулированных и неинокулированных ризобиями корней проростков гороха, росших при температурах 22 и 8 оС. Примененный витальный краситель (крезиловый голубой) на фенольные соединения, оказался хорошим индикатором на фенольные соединения «этилацетатной» фракции и позволил констатировать сосредоточенность этих соединений преимущественно в верхних слоях корневого кортекса, то есть на пути продвижения в ткани инфекционных нитей. Средняя концентрация этих соединений в корнях в 45-80 раз превышала максимальную концентрацию, оказывающую положительное действие на размножение ризобий. Благодаря такой локализации и высокой концентрации в клетках данные фенольные соединения способны вызвать гибель ризобий, оказывающихся вне инфекционной нити при ее разрушении по каким-либо причинам.

Высокая концентрация фенольных соединений в корневых клетках, ингибирующая размножение клубеньковых бактерий, вероятно, имеет отношение к системе защиты растений, призванной предотвращать прямое инфицирование указанными бактериями корневых клеток на пути прохождения инфекционных нитей.

Не выявлено существенных различий в распределении обсуждаемых фенольных соединений по тканям в корнях проростков гороха после инокуляции их ризобиями. Температура влияла в основном на распределении окраски по тканям в апекальных участках корней (0-5 мм от кончика корня), содержащих меристематические и растягивающиеся клетки: здесь расширялась зона окрашиваемых клеток в коре и к 5-му мм в области формирования сосудистых пучков интенсивно окрашивались еще и клетки стели.

Исследование состава фенольных соединений в корнях и корневых экссудатах растений гороха, подверженных действию абиотических факторов и Rhizobium

Влияние Rhizobium, температуры и субстрата для выращивания на состав фенольных соединений в корнях гороха

Изменения в метаболизме фенольных соединений имеют отношения не только к реакции растений на действия абиотических факторов, но и к инфицированию их Rhizobium. В качестве доказательств о влиянии инокуляции Rhizobium и температуры на обмен фенольных соединений в корнях проростков гороха были изменения в содержании трех их групп. Две из них входили в число «растворимых», или «свободных» компонентов, извлекаемых из экстрактов при помощи этилацетата и н-бутанола, третья представляла фенольные соединения, высвобождаемые из растительных остатков после кислотного гидролиза. Влияние изученных факторов сказывалось на содержании перечисленных выше групп фенольных компонентов и соотношениях между ними.

Ощутимее изменялись состав и содержание фенольных соединений после перенесения исходных проростков на водную среду с освещением. При этом при оптимальной температуре сильнее всего возрастало содержание «растворимых» фенольных соединений, экстрагируемых этилацетатом (липофильных). В условиях пониженной температуры при меньшем возрастании содержания «растворимых» фенольных соединений среди них увеличивалась доля компонентов, экстрагируемых н-бутанолом.

При обеих температурах в условиях гидрокультуры инокуляция приводила к снижению содержания в корнях фенольных соединений этилацетатной фракции, а при выращивании проростков на влажной фильтровальной бумаге - к небольшому его возрастанию.

Определение степени участия «растворимых» фенольных соединений в начальных процессах взаимодействий симбионтов

Для сравнения степени участия указанных выше двух групп «растворимых» фенольных соединений в симбиозе исследовали их активность в отношении размножения ризобий (Макарова и др., 1998) и в ингибировании перекисного окисления липидов (Макарова и др., 2001).

Данные, указывают на различную активность в размножении ризобий (биологическая активность) фенольных комплексов этилацетатной и н-бута-нольной фракций (на рис. 3 и 4 и других ФС - фенольные соединения).

Биологическая активность фенольных соединений этилацетатной фракции различалась у корней проростков одинаковой стадии развития, подвергавшихся действию разных температур (см. рис. 3). Она изменялась по мере роста проростков, после инокуляции Rhizobium и в разные периоды после этой инокуляции (Макарова и др., 2003).

Контролируя содержание в культуральной среде живых ризобиальных клеток, мы выявили прямую зависимость эффективности фенольных соединений этилацетатной фракции в размножение ризобии от их концентрации. Однако по достижении некоторых пределов концентрации этих соединений в среде выращивания (>10-15 мкг /мл среды) дальнейшее ее увеличение интенсифицировало деструктивные процессы, приводившие к уменьшению числа живых бактериальных клеток (Макарова и др., 1998).

Рис. 3. Влияние ФС этилацетатной фракции, выделенных из неинфицированных (исходных) корней проростков гороха, выращенных при 25 и 9 оС, на размножение R. leguminosarum в минимальной среде при температуре 25 оС.

Рис. 4. Влияние ФС бутанольной фракции, выделенных из неинфицированных (исходных) корней проростков гороха, выращенных при 25 и 9 оС, на размножение R. leguminosarum в минимальной среде при температуре 25 оС

Рост бактерий в присутствии фенольных соединений, экстрагированных н-бутанолом, мало отличался от такового в среде без фенольных соединений (см. рис. 4). Это подтвердили результаты целого ряда экспериментов, где исследовали бутанольные экстракты фенольных соединений, выделенных из корней растений разных вариантов выращивания. Фенольные соединения «бутанольной» фракции не вносят вклад и в системы антиоксидантной защиты. К такому заключению привели результаты анализа соединений этой фракции на хроматограммах, обработанных в-каротином и этиллинолеатом: среди них не выявлялись как прооксиданты, так и антиоксиданты фенольной природы.

Температура и инокуляция влияют на состав и свойства эндогенных «растворимых» фенольных соединений этилацетатной фракции. Доказательством могут служить данные для экстрактов, выделенных через 24 ч после инокуляции из корней проростков гороха, росших при разных температурах (рис. 5). Они свидетельствует о различиях в составе и биологической активности экстрактов фенольных соединений, о которых можно судить по показателям количества фенольных соединений, элюируемых в различные периоды с колонки, заполненной Sephadex LH-20, и их активности в размножении ризобий, тестировавшейся в модельных системах.

По-видимому, изменения в составе наиболее химически активной и лабильной группы «растворимых» фенольных соединений, экстрагируемой при помощи этилацетата могут влиять на ход формирования симбиоза. Эти изменения обусловлены совместным действием на растения температуры и ри- зобий.

22 оС, 3 сут, неинокулированные

22 оС, 3 сут, 1 сут инокуляции

8С, 8 сут, неинокулированные

8С, 8 сут, 1 сут инокуляции

Рис. 5. Относительное содержание во фракциях, после элюирования с колонки с Sephadex LH-20 «растворимых» фенольных соединений (ФС), экстрагированных этилацетатом из растений разных вариантов выращивания, и влияние их на размножение Rhizobium в минимальной жидкой среде.

% ФС (линия) - относительное содержание от общего количества элюированных с колонки ФС. Столбики - эффект ФС на рост ризобий. Представлены средние значения из 3-х независимых экспериментов, ошибки составляли 5-20 % от средних значений.

Характеристика состава эндогенных и экссудируемых корневыми клетками фенольных соединений, экстрагируемых при помощи этилацетата

В этилацетатных экстрактах из корней и их экссудатов выявлены представители изофлавонов, флавонов, флаванонов, катехинов, стильбенов, халконов, оксикумаринов, оксикоричных и оксибензойных кислот.

В обсуждаемых экстрактах количественно преобладали «неподвижные» в водных системах, высоколипофильные ароматические вещества. Мажорными компонентами этих экстрактов были конъюгаты различной сложности (установлено результатами гидролитического разложения изолированных компонентов в кислой или щелочной среде), часть из которых содержали изофлавоны (биоханин А, генистеин, даидзеин, формононетин). В составе некоторых изофлавон-содержащих конъюгатов присутствовали ванилин-положительные фенольные соединения.

Многие фенольные компоненты комплексов веществ, экстрагируемых при помощи этилацетата, одинаково присутствовали в корневых клетках и в экссудатах. Это свидетельствует об их высокой лабильности и способности к перемещению через плазмалемму корневых клеток. В тех и других экстрактах находили ликвиритигенин и его конъюгат. В составе корней и их экссудатов обнаружены ранее неустановленные у бобовых растений соединения. Одно из них первоначально обозначенное как вещество «Х» (Макарова и др., 2005, 2007), идентифицировано как N-фенил-2-нафтиламин (рис. 6).



Рис. 6. УФ-, ИК-, масс- и ЯМР- спектры, характеризующие структуру выделенного из корневых экссудатов растений гороха N-фенил-2-нафтиламина.

Второе, условно обозначенное как вещество «К», по данным масс-спектрометрии, представлено 2 компонентами: наиболее вероятно, дибутиловым и диоктиловым эфирами орто-фталевой кислоты (рис. 7).

Рис. 7. УФ-спектр вещества «К» и полученные на ГХМС Shimadzu GP-5050A хроматограмма и масс-спектры его компонентов.

Имели место и различия в составах эндогенных и выделяемых в ризосферу фенольных соединений. Так, лишь в составе эндогенных соединений был обнаружен конъюгат апигенина. Представители флаванонов, нарингенин и эриодиктиол, были изолированы из корневых экссудатов. Только в корневых экссудатах, и при этом в очень малых количествах, в свободном виде обнаружены изофлавоны. Существенно отличался состав фенольных кислот. Присутствие свободных фенольных кислот в составе экссудатов фиксировали в редких случаях. В некоторых вариантах выращивания выявлены эфиры п-кумаровой или феруловой кислот.

Изучение антиоксидантной и биологической активности некоторых фенольных соединений, представленных в корнях и корневых экссудатах гороха

По способности предотвращать окислительный распад -каротина, обнаружена высокая антиоксидантная активность в липофильных системах N-фенил-2-нафтиламина и нескольких фенольных соединений, среди которых более заметными были конъюгат биоханина А и халкон. Вещество «К» не обладало антиоксидантной активностью.

В модельных экспериментах N-фенил-2-нафтиламин, соединение стильбеновой природы и сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты показали себя ингибиторами размножения ризобий, а свободные изофлавоны - стимуляторами данного процесса.

Предполагается, что высокая степень липофильности N-фенил-2-нафтиламина, вещества «К» и соединения стильбеновой природы позволяет находиться им в области биомембран и при инфицировании выходить за их пределы и подавлять микрофлору. Кроме того, N-фенил-2-нафтиламин способен участвовать в снижении окислительных процессов в клетках корней, усиливающихся при проникновении в них микроорганизмов, а также под влиянием абиотических стрессоров (Максимов, Черепанова, 2006; Vasse et al., 1993).

Влияние Rhizobium и температуры на состав этилацетатной фракции «растворимых» фенольных соединений в различных участках корней этиолированных проростков гороха



Рис. 8. Фотография ТСХ с неподвижными в водных системах фенольными соединениями из разных участков корней проростков гороха, произраставших при 22 ^оС, после просмотра в УФ-свете+пары NH₃.

Получены доказательства различий в составе «растворимых» фенольных соединений этилацетатной фракции в 5-миллиметровых участках корней, расположенных последовательно на разном удалении от их апексов, у инокулированных и неинокулированных Rhizobium этиолированных проростков гороха, росших при 22 и 8 оС. Рис. 8 и 9 свидетельствуют о влиянии инокуляции и температуры на состав неподвижных в 5 %-ной уксусной кислоте фенольных соединений в клетках разных участков корней через 1 сут после инокуляции. В этилацетатных экстрактах данная группа фенольных компонентов доминировала по массе над подвижными в водных системах фенольными соединениями.

Из числа подвижных в водных системах фенольных компонентов предметом более детальных исследований были свободные фенольные кислоты (ФКК). Несмотря на низкое содержание ФКК в растительных тканях, их относят к физиологически высокоактивным соединениям клеток, способным оказывать влияние на метаболические системы.

В корнях гороха был идентифицирован ряд ФКК: бензойная, п-оксибензойная, ванилиновая, галловая, гентизиновая, салициловая, т -резорциловая (2,6- диоксибензойная), транс-феруловая, транс-п-кумаровая.

Рис. 9. Фотография ТСХ с неподвижными в водных системах фенольными соединениями из разных участков корней проростков гороха, произраставших при 8 ^оС, после просмотра в УФ-свете+пары NH₃.

Результаты анализа с применением метода капиллярного электрофореза указывали на присутствия в экстрактах орто-кумаро-вой кислоты, что не подтвердилось результатами других методов анализа. Данные ХМС-исследо-ваний позволили проследить изменения в корневых участках состава ФКК. Состав ФКК неодинаков в различных частях корней. Он изменялся под влиянием инокуляции и температуры среды даже в одинаково расположенных от кончика корня участках.

В некоторых случаях изменения в составе фенольных кислот наблюдали за счет гентизиновой и т-резорциловой (2,6- диоксибензойной) кислот, образующихся из салициловой кислоты, вероятно, путем скавенгирования последней ОН-радикалов, повышение уровня которых к клетках возможно вследствие усиления окислительных процессов (Dixon et al., 2002). Не во всех участках корней, особенно у неинокулированных проростков, обнаруживались п-оксибензойная, феруловая и п-кумаровая кислоты.

Выявленные различия в составе фенольных соединений в участках инокулированных и неинокулированных корней объясняют неодинаковость физиолого-биохимических свойств комплексов фенольных соединений в разных частях корней и изменения этих свойств после инокуляции и под влиянием температуры.

Влияние Rhizobium, света и температуры на состав фенольных соединений в корневых экссудатах растений гороха

Данные литературы указывают на влияние абиотических факторов на состав фенольных соединений, представленных в корневых экссудатах, определяеющих начальные этапы взаимодействия симбионтов (Cho, Harper, 1991; Graham, 1991; Dakora et al., 1993; Novak et al., 1994; Lawson, 1996).

Общее число фенольных компонентов в их корневых экссудатах растений гороха варьировало в разные периоды их роста и развития, изменялось после инокуляции корней Rhizobium, зависело от температуры и освещения. В экссудатах преобладали коньюгаты, содержавшие изофлавоны, катехины, халконы, ликвиртигенин, обнаруживались проантоцианидины. В минорных количествах присутствовали свободные изофлавоны: биоханин А, генистеин, даидзеин, формононетин. При этом, биоханин А был постоянным компонентом всех экстрактов, остальные изофлавоны выявлены не во всех экстрактах. Постоянным компонентом экссудатов был свободный ликвиритигенин и его конъюгат. В следовых количествах в экстрактах находили нарингенин.

На составе фенольных соединений в корневых экссудатах растений гороха сказывались условия для роста растений, их возрасти и влияние ризобий. Так, при оптимальной температуре и освещении в экссудатах выявили эриодиктиол, а в условиях темноты обнаружено 2 соединения, отсутствовавших в них при освещении. Предварительно одно из них отнесено к стильбенам, второе - к халконам. В отсутствии света через 1 сут после инокуляции в них находили свободные п-кумаровую и феруловую кислоты, обнаруживаемые в другие периоды роста в тех же условиях в составе эфиров. В отдельные периоды в экссудатах инокулированных растений, росших при пониженной температуре на свету, выявлены свободные феруловая и ванилиновая кислоты.

В экссудатах проростков, произраставших в темноте, обнаружено 2 соединения, отсутствовавших при освещении. Предварительно одно из них отнесено к стильбенам, второе - к халконам.

От света и температуры зависело время появления в экссудатах азотсодержащего соединения N-фенил-2-нафтиламина (Макарова и др., 2005, 2007). Не во все периоды наблюдений в экссудатах присутствовали сложноэфирные соединения орто-фталевой кислоты.

Качественные различия состава фенольных соединений между экстрактами корневых экссудатов, возникающие под влиянием освещения и температуры, указывают на регуляторную роль этих соединений в ризосфере на протяжении длительного времени симбиотических отношений между бобовым растением и Rhizobium.

Изучение роли фенольных соединений в размножении Rhizobium в ризосфере в изменяющихся условиях среды

От света и температуры зависит формирование симбиоза между бобовыми растениями и Rhizobium. Вероятно, фенольные соединения, выделяемые корнями в ризосферу, являются важным звеном в формировании симбиоза. Их регуляторные возможности в данном процессе зависимы от света и температуры.

Отмечена зависимость nod-гениндуцирующего действия фенольных соединений, представленных в корневых экссудатах, от света (Lawson et al., 1996), от возраста растений (Maxwell et al., 1989; Hartwig et al., 1990; Maxwell, Phillips, 1990; Novak et al., 1994). Изменчивость во времени nod-гениндуцирующего действия фенольных соединений, вероятно, имеет определенный биологический смысл. Вероятно, это один из механизмов, позволяющих растению регулировать взаимоотношения с микросимбионтом в зависимости от его собственного обмена, подверженного ритмичности, связанной с его ростом и развитием. Тем более это становится важным в условиях стрессов, когда, вероятно усиление высвобождения в ризосферу фенольных соединений, блокирующих индукцию ризобильных nod-генов (Maxwell, Phillips, 1990). При стрессе не исключается накопление фенольных ингибиторов размножения микросимбионтов, обусловливающих снижение их численности в ризосфере. Таковыми, по результатам наших исследований, в экссудатах гороха могут быть N-фенил-2-нафтиламин, вещество стильбеновой природы и сложные эфиры орто-фталевой кислоты.

По нашим представлениям, отражением изменений в составе фенольных соединений корневых экссудатов являются показатели ростовой активности в отношении микросимбионта в модельных системах, о которых будет сказано ниже.

Влияние температуры на экссудацию корнями гороха фенольных соединений и их биологичеcкую активность

Рис. 10. Влияние температуры на выделение фенольных соединений инфицированными и неинфицированными Rhizobium корнями растений гороха, росшими в условиях освещения.

Исследования на проростках гороха, произраставших в условиях освещения при разных температурах, показали, что выделение в ризосферу фенольных соединений и изменение их активности в размножении ризобий неравномерно во времени и зависят от условий произрастания растений.

Эксперименты по изучению роли температуры в экссудации фенольных соединений корнями гороха проводили при освещении (интенсивность 7 клк) и при разных температурных режимах (см. Методику). Данные рис. 10, 11 свидетельствуют, что растение может контролировать размножение ризобий в ризосфере бобового растения в разные периоды после инокуляции. Оно лимитирует активность размножения либо путем уменьшения количества выделяемых корнями фенольных соединений в ризосферу, либо путем снижения общей (результирующей) биологической активности присутствующих в экссудатах фенольных соединений.

...