Размещено на http://www.allbest.ru/

Адаптационные изменения фотосинтеза при повышенной концентрации СО2

03.00.12 - физиология и биохимия растений

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Кособрюхов Анатолий Александрович

Москва - 2008

Работа выполнена в лаборатории экологии и физиологии фототрофных организмов Института фундаментальных проблем биологии Российской академии наук

Научный консультант: доктор биологических наук, Биль Карл Яковлевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Ниловская Нина Тихоновна доктор биологических наук, профессор Марковская Евгения Федоровна доктор биологических наук, профессор Гинс Валентина Карловна

Ведущая организация: Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН

Защита диссертации состоится «16» декабря 2008 г. в ___ час. ___ мин. на заседании диссертационного совета Д220.043.08 при ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева» по адресу: 127550, Москва, ул. Тимирязевская, 49

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ФГОУ ВПО «Российский государственный аграрный университет - МСХА имени К.А. Тимирязева»

Автореферат разослан «___»_______________2008 г.

Автореферат размещен на сайте ВАК www.vak.gov.ru

Ученый секретарь

диссертационного cовета Белопухов С.Л.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из основных особенностей середины-конца ХХ и начала ХХI века является глобальное повышение концентрации СО₂ [CO₂] в атмосфере и вызванное этим изменение климата. Повышение температуры воздуха и увеличение аридизации сельскохозяйственных регионов, усиление действия различных антропогенных воздействий на растения и окружающую среду, являются основными показателями, определяющими современный экологический кризис. Исследование путей адаптации растений к различным условиям внешней среды и изучение механизмов, обеспечивающих их устойчивость к неблагоприятным факторам, связаны с именами многих известных отечественных и зарубежных исследователей (В.Я.Александров, К.Я.Биль, В.Д.Вознесенский, С.Н.Дроздов, О.В.Заленский, А.Т.Мокроносов, О.А.Семихатова, И.А.Тарчевский, А.Ф.Титов, О.Бьеркман, Б.Лархер, Г.Муни и др.). Вместе с тем, данные о реакции растений на действие различных факторов внешней среды получены, в основном, при естественной [CO₂] в атмосфере. Положительное влияние повышенной [CO₂] на рост и продуктивность растений было отмечено еще в начале 20 века для условий защищенного грунта (Лундегорд, 1937; Катунский, 1939; Красинский, 1945; Чесноков, Степанова, 1956). В последующие годы значительное внимание уделялось изучению реакции фотосинтетического аппарата и целого растения на повышение [CO₂] (Gaastra, 1959; Ниловская, 1973; Вознесенский, 1977; Pearcy, Bjorkman, 1983; Гуляев, 1986; 1989). Наблюдаемое глобальное повышение [CO₂] в атмосфере (Baes et al, 1976; Keeling at all., 1995), способствовало повышению интереса исследователей к изучению реакции растений на действие углекислого газа. В результате, работы продолжают вестись в плане оценки действия СО₂ на растения на фоне изменения других факторов внешней среды и стрессовых воздействиях (Ниловская, 1973; Мокроносов, 1999; Ершова А.Н. 1996; Drake et al., 1997; Barron-Gafford et al, 2005). В контролируемых и естественных условиях произрастания растения находятся в условиях постоянно меняющихся уровней концентрации углекислого газа, освещенности, температуры и других факторов. При этом их адаптация к меняющимся условиям происходит в различных временных диапазонах - от секунд и минут до нескольких часов и суток. К настоящему времени наиболее изучены кратковременные (в пределах секунд и минут) реакции фотосинтетического аппарата на изменение [CO₂], интенсивности света и/или температуры (Gaastra, 1959; Hendrey et al, 1997; Pearsy et al 1997, Бухов, 2004). Значительное внимание также уделяется исследованию действия часовых и суточных снижений температуры на рост и развитие растений (Mortensen, Moe, 1992; Bakken, Moe, 1995; Марковская, Сысоева, 2004), фотосинтез, дыхание, другие метаболические процессы (Challa, 1976; Курец 1990, Дроздов, Курец, 1999; 2003).

Вместе с тем, известно, что в ряде случаев ритмические воздействия, при соответствующей величине периода, могут обеспечить нестационарные процессы, способствующие повышению фотосинтеза и продуктивности растений (Challa, 1976; Безденежных, 1982). В этой связи, изучение взаимосвязи периодического повышения [CO₂] и эндогенных ритмов основных физиологических процессов, регуляторных аспектов действия СО₂ имеет большое значение для выявления механизмов адаптации растений к переменным условиям произрастания и регулирования продукционного процесса. Решение обозначенных проблем позволяет, также, выявить резервы устойчивости фотосинтетических и продукционных функций при различных стрессовых воздействиях на фоне повышенной [CO₂] в атмосфере.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы является исследование феноменологии и механизмов адаптации растений к периодическому повышению концентрации CO₂ при модифицирующем влиянии биотических и абиотических факторов среды.

Для выявления поставленной цели предполагалось решить следующие задачи. фотосинтетический растение онтогенез

Изучить функциональные и структурные изменения фотосинтетического аппарата и целого растения на ранних этапах онтогенеза при повышенной [CO₂] в течение фотопериода.

Исследовать взаимовлияние ежесуточного повышения [CO₂] в течение фотопериода с разными уровнями интенсивности света и температуры на активность фотосинтетического аппарата и продукционные характеристики растений.

Исследовать функциональные и структурные изменения фотосинтетического аппарата и целого растения на кратковременное периодическое повышение [CO₂], изменения интенсивности света и температуры.

Изучить влияние периодического повышения [CO₂] на кинетические параметры световых и темновых процессов фотосинтеза с использованием модели Фаркьюхара.

Исследовать временные параметры ответной реакции фотосинтетического аппарата при действии на растения стресс факторов на фоне повышенной [CO₂].

Научная новизна. Впервые проведено системное изучение адаптационных изменений фотосинтетического аппарата и целого растения Cucumis sativus L. на ранних этапах онтогенеза при периодическом, длительном и кратковременном повышении концентрации углекислоты на фоне разных уровней интенсивности света и температуры.

Показано, что повышение [CO₂] в течение фотопериода и всего времени вегетации растения приводит к адаптационным перестройкам фотосинтетического аппарата: уменьшению содержания пигментов, изменению скорости световых реакций фотосинтеза (в зависимости от интенсивности света), снижению скорости реакции карбоксилирования, обусловленному уменьшением удельной активности РБФК/О и содержания растворимого белка, а также - изменению содержания углеводов.

Зависимость накопления растениями сухой биомассы от интенсивности света в диапазоне фоновых температур - нелинейный процесс при естественной [CO₂] и линейный - при повышенной [CO₂], связана с изменением соотношения процессов синтеза и использования ассимилятов, относительным увеличением распределения биомассы в корни и стебли, увеличением площади листовой поверхности, более высоким температурным оптимумом фотосинтеза на фоне повышенной [CO₂] и уменьшением отношения дыхание/фотосинтез по сравнению с контролем.

При периодическом (в течение нескольких часов) повышении [CO₂] адаптивные перестройки фотосинтетического аппарата связаны с изменениями активности световой и темновой стадий фотосинтеза. При этом, потенциально высокая скорость реакции карбоксилирования не всегда реализуется в системе хлоропласт-клетка, вследствие ограничения скорости фотосинтеза содержанием растворимого белка, снижением скорости электронного транспорта в хлоропластах, скорости утилизации триозофосфатов и снижения эффективности карбоксилирования. Длительность сохранения преобладающей роли каждого из этих процессов различна в зависимости от предшествующего периода с естественной или повышенной [CO₂] и времени суток.

Экспериментально показано положительное влияние повышенной концентрации СО₂ на фотосинтез различных видов растений в ответ на действие сернистого газа, УФ облучения и обработку листьев раствором метанола. Выявлены общие временные закономерности реакции растений на периодическое изменение факторов среды в пределах нормы реакции и при стрессовых воздействиях.

Научно-практическая значимость. Полученные экспериментальные данные значительно расширяют представление о путях влияния повышенной [CO₂] на фотосинтез и ростовые процессы растений при модифицирующем действии других, в том числе стрессовых, факторов внешней среды.

Использование приема периодического повышения [CO₂], а также изменения уровней интенсивности света или температуры, с учетом времени адаптивных перестроек фотосинтетического аппарата, может значительно повысить эффективность выращивания растений в защищенном грунте.

Установлено, что повышенная [CO₂] снижает отрицательное действие стрессовых факторов, что необходимо учитывать при современных тенденциях глобального изменения климата.

Основные положения, выносимые на защиту:

· Системные представления о взаимосвязи фотосинтеза, дыхания и роста при повышенной [CO₂] на фоне разных световых и температурных режимов на ранних этапах онтогенеза растений.

· Регуляторное действие периодического повышения [CO₂] на донорно-акцепторные отношения в системе целого растения, направленность углеводного метаболизма и работу фотосинтетического аппарата.

· Феноменология и временные параметры адаптивных реакций при повышении [CO₂] и изменении факторов среды в пределах нормы реакции и при стрессовых воздействиях.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на Всесоюзном симпозиуме "Исследование биогенеза, структуры и функции фотосинтетического аппарата в связи с преобразованием солнечной энергии" (Пущино, 1981); III International youth symposium on plants metabolism regulation (Varna, 1983); Всесоюзной конференции "Физиолого-генетические проблемы интенсификации селекционного процесса" (Саратов, 1983); Всесоюзной конференции "Проблемы фотоэнергетики растений и повышение урожайности" (Львов, 1984); XII International Symposium on Envirommental Biogeochemistry, Biosphere and Atmosheric Changes (Rio De Janeiro, 1996); Первой Всесоюзной конференции фотобиологов (Пущино, 1996); Международной конференции "Биоэнергетика фотосинтеза" (Пущино, 1996); V Международной конференции "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 1999); XIII Международном конгрессе по фотобологии, (Сан Франциско, США, 2000); конференции «Биологические ресурсы и устойчивое развитие», Пущино 2001; Международной научно-практической конференции (Орел 2001); II-IV-V Международном симпозиуме "Новые и нетрадиционные растений и перспективы их практического использования" (Пущино, 1997; 2001; 2003); II-V съездах Всесоюзного общества физиологов растений (Минск, 1992; Санкт-Петербург, 1993; Москва, 1999; Пенза, 2003); годичном собрании общества физиологов растений России (Петрозаводск, 2004), Всесоюзной научной конференции, посвященной 75-летию со дня создания отдела физиологии и биохимии растений ВНИИССОК, 28 февраля 2007г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 47 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов и списка литературы, включающего 358 источников, в том числе 234 на иностранных языках. Работа изложена на страницах, содержит 37 рисунков и 19 таблиц.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

В обзоре диссертации, на основе анализа публикаций, касающихся влияния повышенной концентрации углекислоты на фотосинтетический аппарат и продукционный процесс растений, показано наличие в современной мировой литературе трех основных направлений исследований: изучения действия повышенной [CO₂] на продуктивность растений в условиях защищенного грунта (Лундегорд, 1937; Чесноков, Степанова, 1956), исследований реакции фотосинтетического аппарата и целого растения при разных световых и температурных условиях (Gaastra, 1959; Ниловская, 1973; Вознесенский, 1977; Гуляев, 1989), и анализа реакции растений различных типов на глобальное повышение концентрации СО₂ в атмосфере (Kimball, 1981; Мокроносов, 1993, 1999; Drake et al., 1997; Воронин, 2004). Однако отмечается, что проведенные исследования в условиях длительного (в течение всей вегетации) или кратковременного (углекислотные зависимости) действия углекислоты на растения, оставляют вне поля зрения вопросы перестройки фотосинтетического аппарата при периодическом повышении [CO₂], а также временные параметры развития ответной реакции. Во многом остается открытым вопрос о реакции растений на действие стрессовых факторов в условиях повышенной [CO₂]. В обзоре также приводится немногочисленные данные о положительном влиянии на растения ритмических воздействий (Challa, 1980; Безденежных, 1982). При соответствующей величине периода они могут обеспечить эффективные нестационарные процессы, способствующие увеличению скорости физиологических и биохимических процессов, направленых на приспособление к меняющимся условиям произрастания. Критическая оценка состояния проблемы и ее актуальность позволили считать необходимым проведение исследований по изучению адаптационных изменений фотосинтетического аппарата и ростовых процессов при периодическом повышении концентрации CO₂, действии других факторов в пределах нормы реакции и при стрессовых воздействиях на растения.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалы. Основным объектом исследований служили растения огурца (Cucumis sativus L.) гибрид Московский тепличный. В отдельной серии экспериментов были использованы растения сахарной свеклы (Beta vulgaris L.), проростки пшеницы (Triticum durum L.) сорт Безенчукская 182, Самарский НИИСХ и хвоя 1 года прироста 12-14 летних деревьев (Pinus silvestris L.). Экспериментальная часть работы выполнена в трех направлениях.

Первое направление исследований связано с изучением длительного (в течение светового периода и всего времени выращивания растений) действия повышенной (0,1%) концентрации углекислоты в воздухе на фотосинтетический аппарат и ростовые процессы огурца (рис. 1).

Растения выращивали одновременно в 4 вегетационных камерах при одном уровне интенсивности света (50, 105 или 175 Вт м^-2), температуре 25/20^оС день/ночь и периодическом, 1, 3, 6 часовом повышении [CO₂] в вегетационной камере (рис. 2). В контрольном варианте растения находились при естественной концентрации углекислоты в воздухе. Фотопериод начинали при естественной [CO₂], после чего, через 1, 3, 6 часов (по вариантам опыта) концентрацию СО₂ повышали до 0,1% и затем цикл повторяли (то есть, например, 1 час при естественной [CO₂], затем 1 час при повышенной [CO₂] и т. д.). В результате, независимо от периода подачи СО₂, растения в течение дня находились при повышенной [CO₂] в течение 6 часов. В начале и в конце периодов с естественной и повышенной концентрациями углекислоты

Схема эксперимента

Интенсивность света при выращивании растений

Температура, ^оС: Температура, ^оС: Температура, ^оС:

Концентрация СО₂ в воздухе: 0,03%; 0,1% СО₂

Рис. 1. Схема постановки эксперимента по изучению влияния повышенной [CO₂] на фотосинтетический аппарат и рост растений огурца. (В квадратах указаны температурные режимы день/ ночь)

Второе направление исследований обусловлено выяснением ответной реакции фотосинтетического аппарата растений на действие кратковременного в течение нескольких часов, ежесуточного периодического повышения концентрации углекислоты в воздухе в начальный период онтогенеза (рис. 2).

Схема эксперимента

1 часовой период

3 часовой период

6 часовой период

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рис. 2. Схема постановки экспериментов по изучению влияния периодического повышения [CO₂] в течение фотопериода. (Стрелки указывают начало и конец подачи СО₂ в камеры)

Ппроводили исследования активности фотосинтетического аппарата путем построения углекислотных кривых поглощения СО₂, определения активности световых и темновых реакций, накопления пигментов и содержания углеводов по органам растений. В конце периода выращивания определяли накопление сухого вещества растениями.

Для выяснения общих временных закономерностей ответной реакции растений на периодическое изменение факторов среды использовали действие переменных уровней интенсивности света и температуры: интенсивность света - 50 или 105 Вт м^-2 при температуре день/ночь 25/20^оС; температурный режим 20/20 - 25/20^оС при интенсивности света - 105 Вт м^-2). Эти параметры изменяли через 1, 3, 6 часов в течение 12 часового фотопериода. При таком подходе растения получали одинаковую дозу света и температуры, но с различной периодичностью.

Третье направление исследований связано с изучением временных параметров ответной реакции фотосинтетического аппарата при действии на растения УФ-радиации, сернистого газа или обработки листьев раствором метанола на фоне естественной или повышенной [CO₂]. Действие УФ-радиации изучали на проростках пшеницы, выращиваемых в контролируемых условиях при непрерывном освещении лампой ДРИ 2000, при интенсивности света 90-110 Вт/м², температуре 22-25^оС. 7-10 дневные проростки облучали ультрафиолетом в течение 2, 5 или 10 минут с помощью установки ЛОС-2, и интерференционных светофильтров, имеющих максимумы пропускания 320 и 250 нм. Интенсивность УФ-радиации на уровне проростков составляла 10 Вт м^-2. Oблученные растения помещали в прежние условия и после различных периодов экспозиции на свету проводили измерение скорости фотосинтеза при естественной или повышенной [CO₂], а также, определение скорости восстановления ДХФИФ и накопления углеводов.

Изучение влияния сернистого газа на фотосинтетический аппарат хвои сосны осуществляли путем обработки хвои SO₂ в концентрациях 0,5; 2,5; 5,0 мг м^-3 с последующим экспонированием хвои на свету или в темноте в течение 10-360 мин. Фотосинтез измеряли при естественной или повышенной [CO₂].

Исследование реакции фотосинтетического аппарата на обработку растений раствором метанола проводили с сахарной свеклой в возрасте 40-65 дней. Интенсивность света в середине дня при выращивании растений составляла 1200-1400 мкмоль фотонов м^-2 с^-1. В 10 часов утра измеряли газообмен листьев, после чего растения опрыскивали раствором 40% метанола, содержащего 1мМ глицин и 200 ppm Silwet, рН 6,8. Контрольный вариант обрабатывали этим же раствором, но без метанола. В последующие 9 дней эксперимента объем воды для полива уменьшали. В результате, во время опыта растения находились в условиях высоких интенсивности освещения, температуры и нарастающего дефицита воды в почве.

Методы исследований. В работе использовали газометрические установки открытого и/или закрытого типа, в зависимости от задач в каждом эксперименте. Измерение СО₂ газообмена целого растения проводили с помощью установки открытого типа, созданной нами на основе газоанализатора Infralit 4. Вся установка была размещена в вегетационной камере КВ-1Р, что позволяло регулировать температуру и световой режим в ассимиляционной камере в заданных пределах. Результаты по углекислотному газообмену пересчитывали на экспозиции с 12 часовыми периодами дня и ночи. Полученные расчетным путем результаты были близки к результатам экспериментального определения фотосинтеза и дыхания в течение дня и ночи, что позволило нам ограничить проведение опытов несколькими часами. Отдельные измерения скорости фотосинтеза и транспирации листа растения проводили с помощью СО₂/Н₂0 инфракрасного газоанализатора Ciras-2 (Великобритания), соединенного с листовой камерой-прищепкой площадью 2.5 см² с прикрепленным к ней источником света. С помощью микропроцессора устанавливали уровни интенсивности света от 0 до 1200 мкмоль фотонов м^-2 сек^-1 и [CO₂] в воздухе от 0 до 2400 мкмоль СО₂ моль^-1.

Анализ световых кривых СО₂ газообмена проводили с использованием уравнений (Prioul, Chartier, 1977; Walker, 1989); анализ углекислотных кривых СО₂ газообмена - по модифицированной модели Фаркьюхара (Farquhar et al., 1980) с помощью программы Photosyn assistant (Parsons, Ogston, 1998).

Выделение хлоропластов. Изолированные хлоропласты из листьев растений получали по методу (West, Wischih, 1968); cодержание хлорофилла в суспензии хлоропластов определяли по методу (Bruinsma, 1965); скорость электронного транспорта измеряли по восстановлению ДХФИФ и НАДФ при 620 и 340 нм по разности оптической плотности до и после освещения суспензии хлоропластов (Мухин, Чермных, 1977); cодержание АТФ в суспензии хлоропластов определяли методом сопряженной системы ферментных реакций гексокиназы и глюкозофосфатдегидрогеназы. При измерении скоростей восстановления НАДФ и фотофосфорилирования в одной пробе, количество НАДФН, восстановленного хлоропластами при освещении, вычитали из общего количества НАДФН, получаемого после завершения гексокиназной-глюкозофосфатдегидрогеназной реакции (Geller, 1973). Абсолютные значения скоростей вычисляли по калибровочным кривым.

Замедленную флуоресценцию измеряли с помощью прибора, разработанного и созданного в Институте фундаментальных проблем биологии РАН (Ананьев, Закржевский, 1978) и содержащего фотоумножитель ФЭУ-100, предварительный усилитель электрического сигнала 544 УД1А, оптический светофильтр КС-10, светонепроницаемую шлюзовую камеру с круглой кюветой из кварцевого стекла марки КУ-1, в также ксеноновую лампу-вспышку ИСШ-400. Растительный материал - высечку из листа помещали в специальный держатель импульсного фосфороскопа и выдерживали в течение 3 минут в темноте. После темновой экспозиции лист освещали последовательно серией из 1, 2, 3, 4 и 20 вспышек и записывали сигнал послесвечения на двухкоординатном самописце ЭНДИМ 622.001 в течение 3 минут после каждой серии. Эксперименты проводили в 2-3 кратной биологической повторности и 4-6 кратной аналитической повторности.

Карбоксилазную активность РБФ-карбоксилазы/оксигеназы (РБФК/О) определяли радиометрическим методом в белковом экстракте, выделенном из листьев 12-14 дневных растений, по скорости включения ¹⁴С в кислотоустойчивый продукт, в присутствии РБФ (Lorimer et al., 1977; Романова, 1980); cодержание белка определяли по методу (Bradford, 1976) с красителем Coomassie G-250; oпределение углеводов в одной навеске растительного материала проводили по методу (Ястрембович, 1960). Одновременно с определением газообмена для 4-5 растений, определяли накопление сухого вещества по органам и площадь листовой поверхности листьев. Каждый опыт был проведен в двух-трех кратной повторности. Аналитическая повторность для каждой временной точки 4-6-кратная. На рисунках и в таблицах представлены данные одного из опытов. Каждая точка на графиках представляет собой среднюю арифметическую для 4-6 растений и их стандартные ошибки. Достоверность различий между вариантами оценивали по t-критерию Стьюдента при Р_0,95.

ГЛАВА 3. ВЛИЯНИЕ ПОВЫШЕННОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ СО₂ НА ФОТОСИНТЕТИЧЕСКИЙ АППАРАТ И РОСТОВЫЕ ПРОЦЕССЫ

В данной главе отмечается, что положительное влияние повышенной [CO₂] на рост и продуктивность растений наблюдали многие исследователи (Лундегорд, 1937; Чесноков, Степанова, 1956; Ниловская, 1973; Kimball, 1981). Установлено, что во многих случаях в основе повышенной продуктивности растений (на фоне высокой [CO₂] лежит увеличение общей площади листовой поверхности или повышение активности атрагирующих органов (Wittwer, Robb, 1964; Gifford, 1977; Андреева и др., 1979; Мокроносов, 1983; Гуляев, 1986;). Предполагалось также, что несоответствие между незначительной активацией фотосинтеза и существенной прибавкой урожая при длительном действии углекислоты на растениe связано с регуляторнoй ролью СО₂ (Чмора, Мокроносов, 1994; Bunce, Sicher, 2003; Романова, 2005). Несмотря на значительное количество публикаций, вопрос совместного действия СО₂ с другими факторами внешней среды на основные физиологические процессы растений остается в центре внимания исследователей.

3.1. Влияние СО₂ на ростовые параметры растений огурца на ранних этапах онтогенеза

Периодическое повышение [CO₂] в воздухе днем на протяжении всего времени выращивания растений приводило к увеличению накопления сухого вещества (за исключением варианта 15/20^оС), а также к относительному увеличению его распределению в стебли и корни (табл.1). При низкой интенсивности света (50 Вт м^-2 и температуре 20/20^оС) наблюдалось усиление оттока веществ в стебли и корни на 39% по сравнению с контролем. Повышение интенсивности света до 105 и 175 Вт м^-2 вызывало уменьшение оттока. В результате накопление сухой массы в стеблях и корнях при повышенной [CO₂] увеличивалось, соответственно, на 28 и 33% по сравнению с контролем. Усиление роста корневой системы при повышенной [CO₂] в атмосфере отмечалось и в ряде других работ (Peaz et al., 1980; Phillips et al., 1976), причем, возрастание отношения корни/надземная часть достигало 30% (Bowers 1993). Согласно литературным данным при естественной [СО₂] в листьях огурцов остается порядка 70% от общей массы растений при значительном варьировании соотношения массы стебли/корни (Challa, 1976; Палкин, 1986; Сысоева 1991). Подобные величины при естественной концентрации СО₂ отмечены и в нашей работе. Повышение [СО₂] приводило к увеличению отношения корни/надземная часть, особенно при низкой интенсивности света.

Таблица 1. Накопление и распределение сухой биомассы по органам растений огурца при повышенной [CO₂] и различных уровнях интенсивности света и температуры на 16 день с момента действия факторов*

(*Разброс данных составляет не более 5%.)

Рис. 3. Накопление сухого вещества и площадь листьев растений огурца при естест-венной и повышенной [СО₂], различных уровнях интенсивности света и температуры

Изучение взаимодействия факторов внешней среды на растения огурца позволило получить кривые зависимости накопления сухого вещества и площади листьев от концентрации СО₂ в атмосфере, интенсивности света и температуры (рис. 3). Действие повышенной [CO₂] проявлялось в увеличении накопления биомассы растениями и изменении характера зависимости накопления сухого вещества от интенсивности света - от нелинейного при 20 и 25^оС и естественной [CO₂] к линейному при повышенной [CO₂] в атмосфере и тех же температурах. Для более детальной характеристики ростовых процессов мы использовали ряд расчетных показателей, позволяющих выявить характер изменения параметров роста при повышенной концентрации СО₂ в атмосфере (данные приведены в диссертации). Высокая относительная скорость роста (ОСР) в начальный период роста растений при повышенной [СО₂], в последующие сутки уменьшалась и ОСР в контроле была даже выше, чем в опыте. Уменьшение различий в ОСР у контрольных и опытных растений в вариантах 105 и 175 Вт м^-2 было связано с некоторым снижением относительной площади листьев у растений в опыте и уменьшении их удельной плотности. При этом площадь листовой поверхности растений в опыте была больше, чем в контроле. Следовательно, при повышенной концентрации углекислоты и различных уровнях интенсивности света и температуры происходит увеличение скорости ростовых процессов по сравнению с контролем, что проявляется в изменении скорости накопления сухого вещества растениями при большем его распределении в стебли и корни, увеличении площади листьев при уменьшении их удельной плотности. В работе отмечается, что увеличение площади листьев растений при повышенной [CO₂] наблюдали многие исследователи (Hofstra, Hesketh, 1975; Imai, Murata, 1977; Sionit et al., 1980). Вместе с тем, для растений огурца совместное действие факторов внешней среды на ростовые параметры в значительной степени оставалось неизученным.

3.2. Фотосинтез и дыхание при повышенной концентрации СО₂

Имеющиеся в литературе данные свидетельствуют, что при длительном действии повышенной [CO₂] увеличение накопления сухой биомассы растениями часто сопровождается снижением фотосинтетической активности единицы листовой поверхности (Fridrych, 1976; Kramer, 1981) и интенсивности дыхания (Bunce, 1990; Wullshleger et al., 1994). В наших опытах чистая продуктивность фотосинтеза (ФЧП) растений при повышенной [CO₂] была выше по сравнению с контролем при всех уровнях интенсивности света. Повышение [CO₂] приводило к увеличению интенсивности фотосинтеза целого растения в течение фотопериода и относительному уменьшению дыхания в ночной период. В зависимости от интенсивности света, температурного режима, а также стадии онтогенеза, имело место уменьшение или увеличение дыхательного газообмена по сравнению с контролем. Снижение фотосинтетической активности единицы листовой поверхности в онтогенезе, наряду с изменениями дыхательного газообмена, приводило к уменьшению соотношения дыхание/фотосинтез в расчете на целое растение. Так, при низкой интенсивности света - 50 Вт м^-2 отношение дыхание/фотосинтез (Д/Ф) снижалось от 0,70-0,76 до 0,20-0,30 в течение первых 3-х недель выращивания растений, в зависимости от температурного режима. При 105 Вт м^-2 отношение Д/Ф менялось от 0,50-0,70 до 0,20-0,30, а при 175 Вт м^-2 - от 0,28-0,40 до 0,20-0,22. Повышение [CO₂] приводило к уменьшению величин отношения по сравнению с контролем в первые сроки определения при 50 и 105 Вт м^-2 и относительно более высоким значениям отношения Д/Ф в последние сроки определения. При высокой интенсивности света (175 Вт м^-2) отношение Д/Ф при повышенной [СО₂] было ниже в течение всего времени эксперимента по сравнению с контролем при одной и той же температуре. Относительно высокие значения отношения Д/Ф при 50 Вт м^-2 во многом связаны с низкой интенсивностью фотосинтеза. С увеличением интенсивности света и, соответственно, увеличением фотосинтеза, отношение Д/Ф снижалось. Полученные данные частично объясняют различия в реакции растений на повышение [CO₂] и наблюдаемые в ряде работ изменения дыхательного газообмена в ту или иную сторону по сравнению с естественной концентрацией углекислоты в атмосфере (Reuveni and Gale, 1985; Zizka and Bunce, 1993; Bunce, 1994). Следует, однако, отметить, что в нашем случае растения находились при повышенной [CO₂] в дневное время и влияние СО₂ на дыхательный газообмен было опосредованным, через синтез, накопление и распределение ассимилятов. С другой стороны, накопление углеводов в листьях растений могло оказывать прямое действие на скорость фотосинтеза (Sasek et al, 1985; Sawada et al, 2001; Lewis et al., 2002; Bunce, 2003).

3.3. Углеводный обмен растений при повышенной [CO₂]

Повышение содержания неструктурных углеводов в листьях при повышенной [СО₂] отмечалось во многих работах (Mauney et al., 1979; Vong, 1990; Korner and Miglietta, 1994). По мнению ряда авторов (Madsen, 1976; Nafziger and Koller, 1976; Cave et al., 1981; Peet et al., 1986), снижение скорости фотосинтеза связано с увеличением содержания крахмала. В литературе имеются и противоположные данные, свидетельствующие о высокой скорости фотосинтеза в присутствии значительного количества крахмала в хлоропластах (Курсанов и др., 1979). В наших опытах повышение [СО₂] в дневное время на протяжении всего времени выращивания растений при низкой интенсивности света и одной и той же температуре не приводило к увеличению накопления углеводов в листьях по сравнению с контролем (табл. 2).

При высокой интенсивности света (175 Вт м^-2) наблюдалось увеличение накопления крахмала и сахаров по сравнению с контролем. В работе предполагается, что увеличение содержания углеводов в условиях длительного периодического действия углекислоты на растения при высокой интенсивности света могло быть причиной снижения скорости фотосинтеза (по принципу обратной связи). О такой возможности свидетельствуют и данные работ (Goldschmidt, Huber, 1992; Bunce, Sicher, 2003).

Таблица 2. Содержание крахмала и растворимых сахаров в листьях огурцов при повышенной (0,1%) концентрации СО₂ в дневной период, различных уровнях интенсивности света и температуры

3.4. Содержание пигментов и активность световой стадии фотосинтеза при повышенной концентрации СО₂

Увеличение содержания растворимых углеводов может, также, приводить к снижению синтеза и накопления пигментов в листьях растений (Krapp et al., 1991; Drake, 1997). Из данных, приведенных в диссертации следует, что повышение [CO₂] в атмосфере при выращивании растений огурца приводит к снижению содержания хлорофиллов а и b в расчете на дм² площади листьев. При расчете на грамм сухой массы эти различия сглаживались, хотя некоторое снижение содержания пигментов имело место. Также наблюдалось изменение соотношения хл. а/хл. b за счет уменьшения содержания хлорофилла b при интенсивностях света 50 и 105 Вт м^-2, а при 175 Вт м^-2 - в результате снижения содержания хлорофилла а. Действие температурного фактора проявлялось в уменьшении накопления пигментов на 23% и 54% соответственно при 20^оС и 15^оС, по сравнению с максимумом при 30^оС. При более высоких уровнях интенсивности света (105 и 175 Вт м^-2) содержание хл. а+b в листьях снижалось на 13-16% при повышении и понижении температуры на 5^оС от 25^оС. Однако при 15^оС и интенсивности света 175 Вт м^-2 содержание хл а+b в расчете на дм² резко снижалось и составляло 34,2% от максимума.

Рис. 4. Кинетические кривые замедленной флуоресценции листьев огурцов, выращенных при естественной и повышенной [СО2] в атмосфере и различных уровнях интенсивности света (50, 105 и 175 Вт м-2)

Полученные результаты указывают на структурные перестройки фотосинтетического аппарата у растений и возможность изменения активности фотохимических реакций фотосинтеза. Это подтверждено анализом кинетических кривых замедленной флуоресценции: ход кривых флуоресценции имеет свои особенности в листьях растений, выращенных при повышенной [CO₂] и различных уровнях интенсивности света (рис.4). Так, скорость снижения кривой замедленной флуоресценции в контроле, при выращивании растений в условиях низкой освещенности (50 Вт м^-2), была больше по сравнению с опытом. Повышение интенсивности света до 105 Вт м^-2 приводило к уменьшению различий в кинетике кривых флуоресценции в контроле и опыте.

Для этих кривых характерен более медленный, по сравнению с вариантом низкой освещенности, спад во времени. При высокой интенсивности света (175 Вт м^-2) выход флуоресценции в контроле в начальный период определения (20 сек) был ниже, чем у растений, выращенных при повышенном содержании СО₂ в атмосфере. В последующем, на 40-180 сек. картина менялась на противоположную.

Для сравнения кривых флуоресценции были рассчитаны величины отношения послесвечения через 20, 40 и 60 сек на 20 вспышку к послесвечению на 2 вспышку в те же временные сроки. Количество вспышек в серии, равное двадцати, было достаточно для выхода кинетических кривых на стационарный уровень. Напротив, общим для всех растений после двух вспышек, являлись большие абсолютные значения величины пика и более медленное затухание флуоресценции. Влияние повышенной [CO₂] на величину отношения носило сложный характер, определяемый совместным действием СО₂ и света на растения в процессе их выращивания, а также временем регистрации послесвечения. Действие СО₂ проявлялось в более высоких величинах отношения Н₂₀/Н₂ при интенсивности света 50 Вт м^-2 по сравнению с контролем и, напротив, меньших значениях отношения при 175 Вт м^-2. Увеличение времени регистрации замедленной флуоресценции с 20 секунд до 1 минуты приводило к уменьшению величины отношения Н₂₀/Н₂ независимо от условий выращивания растений. Низкие значения величин отношения Н₂₀/Н₂ при естественной [CO₂] и интенсивности света 50 Вт м^-2 в процессе выращивания растений свидетельствуют о высокой эффективности использования световой энергии в фотосинтетический реакциях. Повышение [CO₂] при 50 Вт м^-2 не приводило к заметному увеличению эффективности работы световой стадии фотосинтеза. При высокой интенсивности света (175 Вт м^-2) повышение [CO₂] способствовало увеличению активности световой стадии фотосинтеза.

3.5. Активность РБФК/О в листьях огурцов при повышенной [CO₂]

Высокая активность работы световой стадии фотосинтеза при 0,1% СО₂ в атмосфере и высоких уровнях интенсивности света реализуется в системе хлоропласт-клеткa путем увеличения скорости накопления углеводов, что, в свою очередь, может приводить к уменьшению активности и содержания РБФК/О (Stitt et al., 1990; Krapp et al., 1991; Cheng et al., 1992; Harter et al., 1993; Sheen, 1994). При действии повышенной [CO₂] на растения огурца в течение дня и всего периода вегетации, наблюдали относительное снижение удельной активности РБФК/О (по сравнению с контролем) при высоких интенсивностях света (табл. 3). Одновременно с уменьшением удельной активности фермента при интенсивностях света 105 и 175 Вт м^-2 происходило снижение содержания растворимого белка. Повышение интенсивности света при выращивании растений в диапазоне от 50 до 105 Вт м^-2 приводило к уменьшению удельной активности РБФК/О.

Таблица 3. Удельная активность РБФК/О и содержание водорастворимого белка в листьях огурцов при повышении [CO₂] в течение фотопериода и всего времени выращивания

Дальнейшее повышение интенсивности света до 175 Вт м^-2 способствовало значительному увеличению активности фермента. Содержание растворимого белка в листьях, напротив, увеличивалось в диапазоне от 50 Вт м^-2 до 105 Вт м^-2 и снижалось при 175 Вт м^-2. В результате, изменение интенсивности света оказывало большее влияние на активность и содержание РБФК/О, чем повышение [CO₂].

Уменьшение активности РБФК/О и содержания белка в листьях растений при повышенной СО₂ отмечается во многих работах (Campbell et al., 1988; Tissue et al., 1993; Downton et al., 1994; Jacob et al., 1995). Вместе с тем, многие данные были получены на выделенных белковых препаратах. В интактной системе, на уровне целого листа, скорость реакции карбоксилирования зависит как от активности РБФК/О, так и ряда других звеньев (Лайск, 1977; Farquhar et al., 1980). Поэтому, для оценки влияния на скорость фотосинтеза in vivo других звеньев реакции карбоксилирования, мы провели анализ углекислотных кривых СО₂ газообмена растений огурца, выращенных при различных уровнях интенсивности света, с использованием модели Фаркьюхара (Farquhar et al., 1980; von Caemmerer, Farquhar, 1981) (табл. 4).

Повышение интенсивности света при выращивании растений от 50 Вт м^-2 до 175 Вт м^-2 приводило к увеличению скорости карбоксилирования от 27,5 до 101 мкмоль м^-2с^-1. При этом скорость фотосинтеза увеличивалась только в диапазоне 50-105 Вт м^-2. Дальнейшее повышение интенсивности света до 175 Вт м^-2 приводило к снижению ассимиляции СО₂, несмотря на относительно высокую скорость реакции карбоксилирования РБФ. Наблюдаемое снижение скорости фотосинтеза в этом случае могло быть связано с низкой скоростью карбоксилирования и, соответственно, высоким сопротивлением мезофилла, а также, с уменьшением скорости транспорта электронов и регенерации РБФ при световом насыщении. Таким образом, потенциально высокая скорость реакции карбоксилирования не всегда реализуется в системе хлоропласт-клетка, вследствие ограничения скорости фотосинтеза другими факторами - содержанием растворимого белка/г массы (табл. 3), снижением скорости электронного транспорта, скорости утилизации триозофосфатов и снижения эффективности карбоксилирования (табл. 4).

Таблица 4. Параметры СО₂ газообмена листьев огурцов выращенных при различных уровнях интенсивности света, рассчитанные по модели Farquhar (Farquhar et al., 1980)

Проведенные исследования отражают реакцию растений, адаптивных перестроек фотосинтетического аппарата при длительном действии повышенной [CO₂] на растения в течение всего фотопериода и времени вегетации, а также, при различных уровнях интенсивности света, температуры. Вместе с тем, в контролируемых и естественных условиях произрастания растения находятся в режиме постоянного изменения [CO₂], интенсивности света, температурного режима. Соответственно этому и приспособление к меняющимся условиям среды идет в динамическом режиме, обусловленнoм естественным или задаваемым периодом изменения факторов среды. Поэтому наше внимание было направлено на изучение функциональных и структурных перестроек фотосинтетического аппарата, активность отдельных физиологических процессов и на целое растение в условиях периодического изменения факторов внешней среды, прежде всего [CO₂].

ГЛАВА 4. АКТИВНОСТЬ ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОГО АППАРАТА ПРИ ПЕРИОДИЧЕСКОМ ИЗМЕНЕНИИ ФАКТОРОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ

Выяснение механизма действия углекислоты при периодическом ее повышении представляется важным как в плане изучения адаптационных изменений фотосинтеза растений, так и для выяснения возможностей направленной регуляции продукционного процесса в регулируемых условиях выращивания. Поэтому, нами была разработана методология и проведена серия экспериментов по изучению активности фотосинтетического аппарата и ряда метаболических процессов у растений огурца на фоне периодических (часовых) повышений [CO₂] и изменений уровней других факторов среды - интенсивности света или температуры.

4.1. Активность фотосинтетического аппарата при кратковременном периодическом повышении концентрации СО₂ в атмосфере

Периодическое повышение [CO₂] в рабочем объеме вегетационной камеры осуществляли через 3 часа (с 11 до 14 и с 17 до 20 часов) в дневное время и в течение всего периода выращивания растений. Повышение [CO₂] в камере приводило к увеличению скорости фотосинтеза в начале и в конце периодов (рис. 5).

При этом в начале периода фотосинтез был выше, чем в контроле во всем диапазоне углекислотной кривой. В конце периода с повышенной [CO2] фотосинтез был выше только при высокой [CO2]. Наблюдаемые изменения скорости поглощения СО2 могли быть связаны с изменениями сопротивления устьиц и мезофилла и активностью световых и темновых реакций фотосинтеза. Прямые измерения подтвердили это предположение. В частности, сопротивление устьиц в утренние часы было значительно ниже, чем днем и, соответственно, проводимость устьиц была выше. Высокое сопротивление устьиц в конце первого периода с повышенной [CO₂], уменьшалось уже через 30 минут при естественной [CO₂] и оставалась низким течение всего периода. Изменение проводимости устьиц происходило, таким образом, быстро, уже через 30 минут после уменьшения [CO₂], что свидетельствует о важной роли работы устъичного аппарата в условиях периодического изменения уровня [CO₂] и является одним из определяющих звеньев скорости фотосинтеза растений.

Рис. 5. Углекислотные кривые СО₂ газообмена, транспирации и устъичного сопротивления листьев огурцов. Растения выращивали при 105 Вт м^-2, температуре 25/20^оС день/ночь. Концентрацию СО₂ в воздухе повышали до 0,1% с 11 до 14 и с 17 до 20 часов

Другим звеном регуляции фотосинтетической активности могла быть скорость световых и темновых реакций фотосинтетического аппарата. Действительно, повышение [CO₂] в течение 2,5 часов приводит к увеличению максимальной скорости поглощения СО₂ на 33,7%, а реакции карбоксилирования на 71,2% (табл. 5). В этих условиях происходит, также, увеличение эффективности карбоксилирования, скорости использования триозофосфатов в цикле Бенсона-Кальвина и скорости электронного транспорта в хлоропластах. В начале периода с повышенной [CO₂], максимальная скорость фотосинтеза и реакции карбоксилирования оставались на уровне контроля. Резко снижалась эффективность карбоксилирования и увеличивалась скорость утилизации триозофосфатов.

Таблица 5. Параметры аппроксимации углекислотных кривых СО₂ газообмена листьев растений огурца при периодическом, трехчасовом, повышении [CO₂]

Приведенные результаты анализа углекислотных кривых отражают потенциальные возможности работы отдельных звеньев фотосинтетического аппарата в начале или конце периодов с естественной или повышенной [CO₂]. В условиях периодического повышения [CO₂] приспособление фотосинтетического аппарата к изменяющимся условиям происходит в динамическом режиме. В этом случае, для выявления лимитирующих звеньев фотосинтетического аппарата, необходимо было оценить работу отдельных звеньев реакции карбоксилирования во всем диапазоне углекислотной кривой.

Нa рисунке 6 приведены углекислотные кривые фотосинтеза, аппроксимированные моделью Фаркьюхара, при условии, что реакция карбоксилирования лимитирована активностью РБФК/О (W_c), электронным транспортом и регенерацией РБФ (W_j), или доступностью неорганического фосфата и использованием триозофосфатов в пентозофосфатном восстановительном цикле (W_p).

Рис. 6. Скорость фотосинтеза при различных концентрациях [CO₂] в межклетниках мезофилла и лимитировании процесса активностью РБФК/О (W_c) регенерацией РБФ (W_j) или доступностью неорганического фосфата (W_p). Кривые получены путем прямого измерения поглощения СО₂ (символы) или аппроксимацией кривых по модели.