Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биологически активные вещества в ветеринарии

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Биологически активные вещества (БАВ), неспецифические средства, которые производятся из компонентов различного природного происхождения (морепродукты, микроорганизмы, животные, растения и т.д.), используются в качестве подкормки для животных, птиц, насекомых и растений, оказывают стимулирующий иммунитет, антимикробное, сорбционное, антиоксидантное воздействие, улучшают качество обрабатываемого продукта и находят все более широкое применение в ветеринарии.

Биологически активные вещества (БАВ), обладающие способностью воздействовать на иммунокомпетентные системы, делятся на экзогенные и эндогенные. Подавляющее большинство первых - это вещества микробного происхождения (бактериального и грибкового). БАВ эндогенного происхождения условно разделяют на две группы: иммунорегуляторные пептиды и цитокины. Пептиды представляют собой, в основном, экстракты из органов иммунной системы (тимуса, селезенки) или продукты их жизнедеятельности (костного мозга). Под цитокинами понимают всю совокупность биологически активных белков, продуцируемых лимфоцитами и макрофагами: интерлейкины, монокины и интерфероны.

Незаразные болезни молодняка сельскохозяйственных животных в первые дни жизни широко распространены в животноводстве и являются одной из основных проблем ветеринарной практики. Болезни молодняка сельскохозяйственных животных имеют повсеместное распространение и их лечение, и профилактика являются неотложными задачами ветеринарии.

Из незаразных заболеваний молодняка наиболее часто регистрируют желудочно-кишечные болезни, которые составляют у молодняка до 10-дневного возраста 60-90%. Связано это, прежде всего с нарушением технологии содержания и кормления животных, а также несовершенством естественной защиты их организма к воздействию неблагоприятных факторов внешней среды. Желудочно-кишечные болезни телят наносят огромный ущерб животноводству вследствие высокой заболеваемости и падежа (до 100%), затрат на лечебные мероприятия, снижения продуктивных качеств и племенной ценности животных. Хотя изучение данной проблемы посвящено много работ, и для лечения этой группы заболеваний предложено много схем, все же до настоящего времени не удается достигнуть 100% сохранности молодняка. Гительсон С.С. (1974), Ежиков А.А. (1970), Зароза В.Г. (1984) и др. (1984) установили, что наибольшее распространение среди болезней телят имеет диспепсия, заболеваемость которой на молочных фермах и комплексах составляет 80%-95%, а летальность от 15% до 70%. Причем, заболевание имеет сложную этиологию, что создает трудности в диагностике и лечении. При заболеваниях в ранний период жизни регистрируется высокая летальность в связи с тем, что болезни чаще протекают на фоне иммунодефицитов.

Проблема иммунной недостаточности у молодняка сельскохозяйственных животных выходит на первое место, особенно при переводе хозяйств на промышленную основу и создания комплексов с большой концентрацией поголовья животных на малой территории. Это способствует тому, что у животных создается недостаточный иммунный фон и возможно снижение напряженности иммунитета. Болезни органов пищеварения у молодняка, как правило, протекают на фоне пониженной резистентности организма. Поэтому разработка новых препаратов и схем лечения желудочно-кишечных заболеваний у молодняка, способствующих повышению неспецифической резистентности, является перспективным направлением.

В связи с вышеизложенным, проблема поиска новых биологически активных препаратов для профилактики и лечения желудочно-кишечных заболеваний молодняка весьма актуальна.

Хитозан в настоящее время используется в различных областях народного хозяйства. Особого внимания заслуживает применение его в ветеринарии и медицине. Установлено, что хитозан является слабым аллергеном, обладает достаточно низкой токсичностью и пирогенностью (Скрябин К.Г., Вихорева Г.А., Варламов В.П., 2002; Быкова В.М., Немцев СВ., 2002; Allan G.G., Peyron M., 1989).

Хитозан способен образовывать гели в слабокислых растворах (рН 5-6). Кроме того, он может создавать пленку на коже и раневых поверхностях, а также на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, обладает высокой адсорбционной емкостью, способен выводить токсичные вещества, стимулирует клеточных и гуморальный иммунитет (Албулов А.И., Самуйленко А.Я., Шинкарев СМ., Фролова М.А., 2001; Червинец В.М., Бондаренко В.М., Комаров Б.А., 2002; Muzarelli r.a.a., 1988). Эти свойства хитозана могут быть использованы для создания средств лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, приносящих большой экономический ущерб.

В зависимости от содержания в составе препарата фракций с различными молекулярными массами хитозан может проявлять в той или иной степени сорбционные, иммуномодулирующие, бактериостатические, фунгиста-тические, противовоспалительные и другие свойства (Ильин Л.А., Андрианова И.Е., Глушков В.А., 2003; Червинец В.М., Албулов А.И., Червинец Ю.В., 2006).

Туберкулез наносит значительный экономический ущерб животноводству страны, что связано с широкой распространенностью болезни, необходимостью убоя реагирующих на туберкулин животных в благополучных и неблагополучных по туберкулезу хозяйствах и населенных пунктах (Смолья-нинов Ю.И., Донченко А.С и др., 2005.). Поэтому поиск новых препаратов для антимикробной терапии туберкулеза и других заболеваний является на сегодняшний день актуальной задачей (Капков Л.Г., Smith J., Wood E., Domish M., 2004).

Принимая во внимание уникальные свойства хитина и хитозана, в последние годы значительно возрос интерес к изучению и практическому применению этих природных полимеров во многих областях, в том числе ветеринарии и медицине. Это определило интерес к изучению молекулярного механизма действия липолитических ферментов и поиску соединений, влияющих на липидный обмен. Хитозан, благодаря уникальной структуре и положительному заряду, является полифункциональным соединением, обладающим целым рядом уникальных свойств: высокой совместимостью с животными тканями, биодеградируемостью, отсутствием токсичности и др., что определяет перспективы его использования в качестве ингибитора липолитических ферментов (Sumiyoshi M., Mhurchu С).

Изучение биоактиоксидантов показало их существенную роль в поддержании уровня свободно радикальных реакций и регулировании обмена липидов в мембранах клетки. Важно, что существование системы регуляции было обнаружено практически для всех изученных внутриклеточных и клеточных мембран клеток животных, растительных организмов и микроорганизмов.

Важнейшим элементом поддержания здоровья животных а, значит, продуктиности и сохранности) являются доброкачественные корма, т.е. корма, свободные от чужеродных вредных для организма веществ. Одни из самых опасных чужеродных примесей - микотоксины (ядовитые низкомолекулярные метаболиты плесневых микроскопических грибов). Даже следы микотоксинов в кормах (30-100 мкг/кг) приводят к потере продуктивности, снижению иммунитета и воспроизводительных функций. Особо актуальна проблема микотоксинов у тех видов, у которых основу рациона составляет зерно и продукты его переработки у птиц.

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В.П., 1992; Панин А.Н., Серых Н.И., 1993; Сидоров М.А., Субботин В.В., 1988; Тихонов И.В., Гаврилов В.А., 2003).

На основании литературных данных известно, что к числу высокоэффективных лечебно-профилактических средств специалисты относят пробио-тики (Воронин Е.С., 1989; Панин А.Н., 2000; Fuller R., Gibson G., 2000 и др.). По мнению многих специалистов, основополагающим принципом при создании пробиотиков является использование микроорганизмов - представителей нормальной микрофлоры животных (Бовкун Г.Ф., 1999; Сидоров М.А., 2000; Berg R., 1998 и др.).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишечного биоценоза и распространении на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка животных (Вилыпанская Ф.Л., 1987; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995; Грачева Н.М., Партий О.С, Леонтьева Н.И., 1996; Парфенов А.И., 1998; Малик Н.И., 2002).

Широкое применение в медицине и ветеринарии препаратов на основе лактобацилл и бифидобактерии при острых кишечных инфекциях и дисбак-териозах показало их эффективность и перспективность (Малик Н.И., 2000; Субботин В.В., и др., 2001).

Одной из первых отраслей сельского хозяйства, перешедших на промышленную основу производства, является птицеводство. Доля препаратов для птиц составляет 95% мирового рынка лечебных препаратов для животных (более 7 млрд. долларов в стоимостном выражении).

В связи с этим все более актуальной становится проблема профилактики, лечения и нормализации микробного баланса в пищеварительном тракте, минимизации последствий антибиотикотерапии, повышения эффективности выращивания и сохранности птицы, улучшения качества конечного продукта. Один из способов ее решения - разработка и применение биологически активны веществ (БАВ) нового поколения, которые характеризуют высокой биодоступностью и положительно влияют на микробиоценоз желудочно-кишечного тракта птицы, что приводит к оздоровлению всего организма в целом и снижению микробизма окружающей среды. К их числу относят эубиотики - пробиотики и пребиотики (Антипов В.А., 1991; Тихонов И.В., Грязнева Т.Н., 2003; Данилевская Н.В., Субботин В.В., 2005).

Наиболее перспективным является создание симбиотиков - комплексов про- и пребиотиков.

Многие из симбиотиков влияют на гуморальный и клеточный иммунитет, зоотехнические показатели, могут служить естественными стимуляторами роста и обладать токсико- и радиопротективным действием, снижающим влияние неблагоприятных экологических факторов.

Продовольственная проблема, связанная с недостатком биологически полноценных продуктов, со временем не только не теряет своей остроты, но и становится одной из актуальнейших. Эффективность решения этой проблемы определяется использованием качественно новых методов производства продуктов питания, а также привлечением новых сбалансированных источников пищевого белка, одним из которых является белок микроорганизмов. Работы многих ученых посвящены вопросам изучения возможности использования микроорганизмов как источников белковых веществ (Коновалов В.А., 1975; Беликов В.М., 1977; Шкляр Б.Х., 1977; Латов В.К., 1990; Римарева Л.В., 1993; Иванова Л.А., 1998; Неклюдов А.Д., 2000; и др.).

Наиболее перспективным источником пищевого белка является дрожжевая биомасса, что объясняется полноценностью белковых веществ, аминокислотный набор которых приближается к животному белку, а также безопасностью и абсолютным отсутствием токсичности дрожжей. Кроме того, наличие витаминов, ценных полисахаридов и микроэлементов позволяет рассматривать дрожжи как перспективные субстраты для получения биологически активных добавок.

Природные цеолиты обладают уникальными свойствами адсорбции, ионообменной, каталитической и детоксикационной способностью. Благодаря своему кристаллохимическому строению цеолиты биохимически активны и кислотоустойчивы. Поэтому их применение в различных отраслях постоянно расширяется.

В настоящее время животноводство и птицеводство в России испытывает большую потребность в кормовых белковых продуктах для своего развития и становления. Особенный дефицит кормовых белковых продуктов стал заметно ощущаться в настоящее время, так как в 90-х годах были остановлены крупнотоннажные заводы БВК, производящие кормовые дрожжи на основе углеводородов «паприн» (Ермишина И.Г. и др., 2005). Кормовые белковые продукты, полученные на основе микробиологического синтеза, по своему химическому составу и питательной ценности не уступают традиционным белковым кормам, таким, как соевый шрот, мясокостная мука, рыбная мука и др.

Сложившаяся в мире ситуация с потреблением мяса и мясных продуктов требует рационального использования сырья, повышения эффективности производства и улучшения качества готовой продукции. Для решения вышеуказанных проблем необходимо разрабатывать и внедрять в производство новейшие методы обработки мяса с целью использования при производстве различных мясопродуктов не только высокосортного сырья, но и сырья, обладающего повышенной жесткостью и требующего длительной термообработки (Рогова Н.В., Снегур Ф.М. и др., 2007)

При разработке методов обработки низкосортного сырья, содержащего большой процент соединительной ткани, необходимо учитывать, чтобы метод не приводил к потере массы, не ухудшал органолептические свойства и технологические характеристики готового продукта и позволял интенсифицировать процесс производства мясопродуктов, отличающихся высокой пищевой и биологической ценностью.

Следовательно, исследования, теоретическое обоснование и разработка новых биологически активных веществ (БАВ) для нужд ветеринарии являются актуальными.

Цель и задачи исследований. Цель настоящих исследований

- разработка теоретического обоснования и практического применения существующих и разработка принципиально новых биологических веществ с использованием современных методов биотехнологии для нужд ветеринарии. Для решения цели исследований были поставлены следующие задачи:

1. Теоретически обосновать использование БАВ в ветеринарной практике. 2. Исследовать влияние хитозана на механизм гомеостаза и гуморальную и неспецифическую защиту организма у животных.

3. Изучить антибактериальную активность хитозана к штаммам микобактерий и, в частности, для профилактики и лечения туберкулеза.

4. Провести работы по активации хитозана для повышения его сорбционных свойств при использовании в качестве кормовых добавок для КРС. 5. Исследовать антиметастическую активность олигомеров хитозана и его применение в сочетании с экстрактом противоонкологического фитосбора.

6. Изучить антиоксидантную активность и ранозаживляющую способность хитозана при использовании на животных.

7. Обосновать использование коллагеназы, пробиотиков, синбиотиков для профилактики и лечения в ветеринарии.

8. Изучить возможность использования в качестве кормовых добавок и компонентов питательных сред цеолита, автолизата хлебопекарных дрожжей, яично-дрожжевого гидролизата для использования в различных отраслях сельского хозяйства.

9. Осуществить практическое использование рассмотрение БАВ в ветеринарии.

10. Рассчитать предполагаемую экономическую эффективность от широкого применения исследованных БАВ в ветеринарии.

Научная новизна. Применение препаратов низкомолекулярного сукцината хитозана вызывает усиление функционирования механизмов го-меостаза у животных (телят), усиливает антителогенез и увеличивает титры циркулирующих в крови антител, а также активирует факторы, характеризующие гуморальную и неспецифическую защиту организма.

Впервые экспериментально подтверждено, что хитозан обладает бакте-риостатическим и ранозаживляющим действием по отношению к патогенным возбудителям заболеваний животных и птиц и при нанесении им химических и термических ожогов.

Впервые разработана методика активации хитозана, которая позволила получить сорбент с емкостью на 40-60% больше, чем у исходного полимера. Показано, что акцинат и сукцинат хитозана со степенью деацетилирования 87-97% и молекулярной массой 50-250 кДа обладает максимальной сорбционной емкостью (80-10 мг/г) и успешно испытан на животных и птицах.

Показано, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловливает ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана оказало ра-диопроекторное действие.

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем.

Антиметастатический синергизм действия в фитохитодезтерапии возможен при сочетании олигомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергети-ческого антиоксидантного (и, по-видимому, поливакцинного) действия экстрактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Разработана технология получения фитохитодезов - биологически активных добавок к пище, состоящих из сухих экстрактов сбора лекарственных растений и хитозана полифракционного состава в виде его водорастворимой формы.

Впервые в результате анализа полученных экспериментальных данных установлено, что использование ферментного препарата коллагеназы улучшает качественные характеристики готового продукта при внесении его в мясное сырье.

Впервые разработанный кормовой белок-добавка - синбиотик «Правита» по сравнению с другими кормовыми белковыми продуктами обладает более высокой питательной ценностью и биопротекторными свойствами в качестве кормовой добавки для птиц.

Результаты исследования кормовой биологической добавки (цео-лит+культура Echerichia coli VL 613) подтвердили ее эффективность взамен дорогого кристаллического лизина.

Разработанная кормовая добавка с использованием цеолита при добавлении в питательную среду была успешно использована при культивировании клеток перепелиных эмбрионов глубинным способом, позволила увеличить конечную концентрацию клеток.

Все изготовленные серии препарата для борьбы с личинками кровососущих комаров Aedes aegipty с использованием культуры B.thusingiensis H-14 шт. 1501 и автолизата хлебопекарных дрожжей в качестве компонента питательной среды по биологической активности соответствовали требованиям НТД и оказались эффективными.

Применение яично-дрожжевого гидролизата в качестве лечебно-профилактической добавки для подкормки пчел, обеспечивает профилактику заболевания пчел - нозематоза, компенсации белковой недостаточности и ускорения процессов жизнедеятельности пчелиных семей.

Впервые установлено, что бактерии L.planturum, шт. М-30 и B.subtilis, шт. В-1948, обладают достаточным уровнем антогонистической активностью к условно-патогенным и патогенным микроорганизмам. Кроме того, они обладают достаточным уровнем устойчивости к широкому кругу антибиотиков, что позволяет сочетать антибиотическую и пробиотическую терапию в случае эпидемии в хозяйствах.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований были использованы при совершенствовании технологий производства хитозана, биопрепаратов, используемых для профилактики, лечения, а также повышения резистентности и продуктивности животных. Аттестовано производство и получено Свидетельство о государственной регистрации лекарственного средства для животных. Зарегистрировано в Российской Федерации. Утверждено заместителем Руководителя Федеральной службы по ветеринарному и фитосаниарному надзору Е.А. Непоклоновым 15 мая 2007 г.

Апробация работы. Основные положения работы были представлены на следующих конференциях:

- Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов» ВНИТИБП, Щелково, 2007 г.; - Ш Международном ветеринарном конгрессе по птицеводству, Москва, 2007 г.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

Теоретическое обоснование и практическое использование хитозана для гуморальной и неспецифической защиты организма животных, по антибактериальной активности, сорбционных свойств, антиметастической активности и оксидантной активности для профилактики и лечения в ветеринарии.

Использование ферментного препарата коллагеназы для улучшения качественных характеристик мяса и мясных продуктов.

Теоретическое обоснование и практическое применение пробиотиков, синбиотиков в сельском хозяйстве.

Исследование и практическое применение различных кормовых добавок и компонентов питательных сред при выращивании бройлерных цыплят, препаратов против кровососущих, нематоза пчел, антибиотико- и пробиотикоскопию и повысить эффективность фитопрепаратов на основе хитозана в случае угрожающей ситуации в сельском хозяйстве.

Публикации. По результатам диссертации опубликовано работ, в том числе статей в научных журналах, докладов в сборниках научных конференций.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на 192 страницах машинописного текста и состоит из следующих

разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы и данные о практическом использовании научных выводов, список использованной литературы 348 источников, в том числе 217 отечественных и 131 зарубежных. Работа содержит 18 таблиц, 9 рисунков, 52 страницы приложений.

Содержание работы

хитозан антибактериальный антиоксидантный кормовой

Материалы и методы

Работа выполнена за период с 2000 по 2007 гг. во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности (РАСХН) совместно с центром «Биоинженерия» (РАН), ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия), Кубанским государственным медицинским университетом (г. Краснодар) ГосНИИСинтезбелок по программе «Составить руководящие и информационно-справочные документы по обеспечению качества лекарственных средств для животных на этапах их разработки, апробации и производства в соответствии с Национальным Законодательством и Международными Требованиями» (per. №ИС-01.200.2.08792) и в соответствии с планом НИР и ОКР ВНИТИБП отраслевых научных программ и Федеральной целевой научно-технической программы «Ветеринарное благополучие (2001-2005 гг.).

Изучение влияния низкомолекулярного сукцината хитозана на иммунный ответ телят на фоне их плановой иммунизации против пастереллеза телят проводили в 2006 году на базе МТФ ООО «Автобан» в Краснодарском крае. Титр специфических антител определялся методом непрямого ИФА, а фракции хитозана разделялись мембранным методом. Исследования сывороток крови на содержание иммуноглобулинов различных классов проводились методом радиальной иммунодиффузии (РИД) в лаборатории иммунологии ВИЭВ под руководством члена корреспондента РАСХН Ю.Н. Федорова.

Опыты по определению антимикробного эффекта кислоторастворимого хитозана и выживаемости микобактерий проводили со следующими штаммами: типичными - Mycobacterium avium (штамм IEKBM УААН), Mycobacterium bovis и атипичными - M. fortuitum, M.smegmatis M. intracellulare предоставленными ННЦ «ИЗКВМ», Г. Харьков. Атипичные микобактерии, как и возбудители туберкулеза, вызывают сенсибилизацию к туберкулину крупного рогатого скота. Они широко распространены во внешней среде и попадая в организм, обуславливают повышенную чувствительность к туберкулину у млекопитающих. Данные бактерии часто используют как тестовые при разработке дезинфицирующих препаратов при туберкулезе.

В работе использовали крабовые кислоторастворимые хитозаны с ММ 58 и 87 кДа, а также водорастворимые: сукцинат хитозана с молекулярной массой 380,0 кДа, и низкомолекулярный хитозан с молекулярной массой 38 кДа, производства ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия).

Определение антиоксидантной активности осуществляли с помощью прибора для определения антиоксидантной активности лекарственных препаратов, продуктов питания и биологически активных веществ «Яуза AAA 01» на базе ОАО «НПР «Химавтоматика» по величине окислительно-восстановительного потенциала, определяемого амперометрическим титрованием. В качестве маркера для количественной оценки использовали дигидрокверцитин.

Раневые покрытия готовили следующим образом: хитозан производства ЗАО «Биопрогресс» растворяли в 1% янтарной кислоте, добавляли масляный раствор анестезина, эмульгировали в присутствии лецитина, частично осаждали из раствора содой и сшивали янтарным ангидридом. Полученный гель высушивали на воздухе при 25-30⁰С и получали пленки.

В качестве опытных животных использовали белых беспородных крыс с массой тела 180-200 г., которым под эфирным наркозом воспроизводили термический и химический ожоги на депилированной поверхности тела площадью 2 см.

В работе по изучению влияния ферментного препарата коллагеназы на мясопродукты препарат вводили в концентрациях 0,03%, 0,05% и 0,1% до стадии термообработки мясопродуктов.

Качество продукции оценивалось по следующим показателям: содержание влаги, содержание сухих веществ, содержание связанной влаги, потеря массы, общая органолептическая оценка.

Пребиотик «Авистим» для птиц приготовлен на основе культуральной жидкости высшего гриба Fusarium sambucinum MKF 2001 -3 и исследована его антиоксидантная активность при защите птиц.

При разработке технологии получения лечебно-профилактических кормовых белковых добавок-синбиотиков для птиц использовалась биомасса дрожжей-сахаромицетов, в которую добавлялась биомасса гриба Fusarium Sanbucinum МКГ-2001-3, пробиотики Bac.subtilis и молочнокислые бактерии.

Препарат под наименованием «Провит» был испытан на бройлерных цыплятах.

В качестве наполнителя кормовой биологической добавки для цыплят был использован цеолит Хотынецкого месторождения Орловской области в виде мелкозернистой крошки размером частиц до 1 мм и биомасса E.coli VL 613, синтезирующая одну из незаменимых аминокислот - лизин в организме цыплят.

Для производства препарата для борьбы с личинками кровососущих комаров Aedes aegipty использовался автолизат энтопатогенной культуры Bacillus thuringiensis Н-14 штамм ИПМ-1501 содержащей эндотоксин. Выращивание культуры Bac.thuringiensis осуществлялась в биореакторе АНКУМ-2 емкостью 10 л на питательной среде, содержащей автолизат хлебопекарных дрожжей.

Четыре опытные серии яично-дрожжевого гидролизата и подкормки пчел в сухом и жидком виде исследованы по основным физико-химическим характеристикам и прошли испытания на пасеке учхоза «Леоновский» Московской области, совхозе «Малынь» Шекинского района, Тульской области и пчелосовхоза «Беканский» Северная Осетия.

Исследования in vitro антогонистической активности и чувствительности к антибиотикам проводились по отношению бактерий L.plantarum, шт. М-30, B.subtilis, шт. В-1975 и методом острогенного антагонизма в отношении патогенных и условно патогенных микроорганизмов - S.tuphimurium, S.dublin, S.gallinfrum, 3 - штаммов E.coli: К-88, К-99, А-20 и полевого изолята E.coli, выделенного от больной птицы. Об антогонистической активности штаммов судили по величине зоны задержки роста тест-культуры.

Для обеспечения качества и безопасности производства биологически активных веществ в биотехнологии необходимо соблюдать Международные правила GMP, требовании ИСО и анализа рисков БАССР.

Для анализа и статистической обработки экспериментальных данных использовались методы дискретного распределения, t-распределения Стью-дента, %² - распределения, корреляционный анализ, одно и многофакторная регрессия, критерий значимости и доверительные интервалы (Н. Джонсон, Ф. Лион «Статистика и планирование эксперимента в технике и науке. Методы обработки данных. М.: Мир, 1980 - 611 с).

Результаты исследований

Применение низкомолекулярного сукцинита хитозана в качестве им-муномодулятора при вакцинации телят против пастереллеза

Разработан способ мембранного разделения фракции (ультрафильтрация) низкомолекулряного хитозана, позволяющий получать полимер с заданной молекулярной массой. По сравнению с хроматографическими методами фракционирования ультрафильтрация дает возможность получать достаточно высокий выход продукта с более низкой себестоимостью.

Результаты исследования на токсичность фракций хитозана, полученных мембранным разделением по данной методике, представлены на рис. 1.



Рис. 1. Зависимость токсичности хитозана от молекулярной массы при внутрибрюшинном введении белым мышам

Анализ уровня антител в сыворотке крови подопытных животных показал, что при введении хитозана у телят наблюдалось увеличение титра специфических антител, выявленных в непрямом ИФА, в сравнении с контролем. Средние титры антител у животных опытной и контрольной групп представлены в таблице 1.

Таблица 1. Средний титр антител при вакцинации телят против пастереллеза в сочетании с препаратом хитозана

Группы животных	Титры антител
	Через 14 дней	Через 21 день	Через 60 дней
Опыт	1:700	1:1400	1:1700
Контроль	1:666	1:733	1:1200

Через 14 суток после вакцинации разница между титрами антител у животных опытной и контрольной групп составила 0,95%. Через 21-е сутки после вакцинации содержание антител у телят опытной группы прогрессивно возрастало на 52,63% по сравнению с контролем. На 60-й день после вакцинации титры антител в обеих группах составляли 1:1700 и 1:1200 соответственно, т.е. у животных, вакцинированных совместно с хитозаном, титр антител на 70% выше, чем у контрольных животных, которым этот препарат не вводили (рис. 2)

дни

Рис. 2. Динамика титров антител в сыворотках крови КРС на фоне вакцинации совместно с хитозаном

Таким образом, на всех этапах исследования отмечена выраженная тенденция к повышению уровня выработки антител при применении хитозана по сравнению с контролем.

Результаты исследования сывороток крови на содержание иммуноглобулинов различных классов представлены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание иммуноглобулинов отдельных изотипов в крови телят опытной и контрольной групп

Группы	IgG, мг/мл	Ig M, мг/мл	Ig А, мг/мл
	Через 14 суток после вакцинации (т=5)
Опыт	20,50±1,73	2,73 ±0,28	0,24± 0,1
Контроль	20,30 ±1,36	2,47±0,14	0,22±0,01
	Через 21 после вакцинации (п=5) Опыт
Опыт	21,14±2,01	3,35 ± 0,3	0,21 ±0,03
Контроль	21,36 ±0,54	3,32 ±0,54	0,23 ± 0,04

Изучение влияния хитозана на иммунобиологический статус молодняка КРС при вакцинации против пастереллеза показало, что применение данного полимера в качестве иммуномодулятора обусловило индукцию развития долгосрочного иммунитета, повышенную выработку специфических антител и образование иммунного ответа на месте введения вакцины. Таким образом, выявлено наличие иммуномодулирующих и адъювантных свойств используемого препарата хитозана при сочетанном его введении крупному рогатому скоту с пастереллезной вакциной.

Приведенные исследования показали, что использование препаратов хитозана может вызвать оптимизацию механизмов гомеостаза у животных, усиливать антителогенез и увеличивать титры циркулирующих в крови антител.

Обобщая данные, полученные в результате проведенных экспериментов, можно заключить, что введение хитозана 4-х месячным телятам одновременно с вакцинацией против пастереллеза обусловило:

- увеличение титра специфических антител в сравнении с контролем, выявленных в непрямом ИФА;

- предотвращение снижения уровня гемоглобина и повышение коэффициента метаболической активации нейтрофилов крови к 14 суткам после вакцинации;

- активацию механизмов, обеспечивающих поглощение чужеродного материала нейтрофилами к 21 суткам после вакцинации.

Антимикробный эффект влияния кислоторастворимого хитозана против возбудителей туберкулеза

В работе использовали крабовые низкомолекулярные водорастворимые хитозаны с молекулярной массой (ММ), равной 4; 7; 8; 5; 11; 24 кДа и степенью деацетилирования (СД) 85%, N-сукцинил хитозан с ММ 396 кДа, и кислоторастворимые хитозаны с ММ 96, 177 и 380 кДа, полученные на базе ЗАО «Биопрогресс» (Щелково, Россия). Образцы низкомолекулярного хитозана были получены ферментным гидролизом с помощью хитонолитического комплекса Streptomyces kurssanovi и из хитина восковой моли Colleria mallonella.

Для изучения чувствительности клеток к антимикробному действию хитозана готовили 0,025; 0,05; 0,75; 0,1; 0,2; 0,3; 0,5; 1,0% растворы хитозана в питательной яичной среде, после чего коагулировали при температуре 90°С в течение 60 минут. Затем высевали 0,5 мл микробной суспензии на чашку Петри с питательной средой в присутствии хитозана или без хитозана (контроль). Посевы с клетками культивировали в течение 28 дней при температуре 37°С, учет роста культур на средах проводили каждые 7-10 дней.

Работу проводили с штаммами микобактерий Mycobacterium smegmatis шт. 211 (предоставлен лабораторией «Биотехнология стероидов», Центра «Биоинженерия» РАН), штаммы Mycobacterium avium (штамм Vailee) предоставлены ННЦ «ИЭКВМ), г. Харьков.

Таблица 3. Влияние кислоторастворимого хитозана с различной ММ на гибель микобактерий M.smegmatis при экспозиции в течение 1 часа,

	t=37°C и рН=6,8 ед. рН
№пп	ММ, кДа	X=lgx	Y% гибели микобактерий
1.	4	0,60	80
2.	7	0,84	77
3.	8,5	0,93	75
4.	11	1,04	68
5.	24	1,38	57
6.	96	1,98	37
7.	177	2,25	18
8.	396	2,60	4

Оценка зависимости процента гибели бактерий от кислоторастворимого хитозана с различной ММ и времени экспозиции проводились методами регрессионного и корреляционного анализа.

Предварительные исследования и аналитические соотношения позволяли считать% гибели микробных клеток линейной функцией от логарифма молекулярной массы (ММ) хитозана. При этом регрессионная задача сводится к оценке параметров в уравнении



где Х - lgx (молекулярная масса хитозана) (1)

Y -% гибели клеток

Коэффициент корреляции R рассчитывался из уравнения вида:

(2)

R= 0,9

Данные значения R свидетельствуют о тесной линейной связи между% гибели микобактерий и ММ кислоторастворимого хитозана, который особенно эффективен при низких значениях ММ = 4,7,8,5,11.

Первоначально опыты по определению выживаемости микобактерий были проведены на атипичном тестовом штамме M.smegmatis.bGieTKH M.smegraatic инкубировали с хитозаном краба с ММ-4-396 кДа и хитозаном восковой моли с ММ от 7-177 кДа в концентрациях 0,1% при температуре 37⁰ С, на качалке. После этого пробы титровали и высевали на чашки Петри. В качестве контроля использовали клетки, не обработанные хитозаном. По истечении 72 часов инкубации определяли количество жизнеспособных клеток (КОЕ).

Из рис. 3 следует, что процент гибели клеток М. smegmatis после 60 мин экспозиции при 37°С и рН 6,8 оставлял 0-76% в зависимости от ММ испытанных хитозанов. Наименьшей чувствительностью клетки обладали к высокомолекулярным образцам хитозана с ММ 96 и 177 кДа. Высокомолекулярный крабовый хитозан с ММ 396 кДа в концентрации 0,1% не обладал антибактерийным действием. Максимальной активностью в отношении клеток микобактерий обладали низкомолекулярные хитозаны с ММ 4-8,5 кДа.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что хитозан обладает бактериостатическим действием по отношению к возбудителю туберкулеза видов M.bovis и М. avium, что указывает на перспективность дальнейших исследований с целью применения его для лечения и профилактики туберкулеза сельскохозяйственных животных и птиц.

Наиболее выраженный антимикробный эффект в отношении всех изучаемых тест-культур показали препараты кислоторастворимого хитозана с молекулярной массой (ММ) 58 и 87 к Да и степенью деацетилирования 80-80,3% (см. табл. 4).

Таблица 4. Антимикробный эффект хитозана в отношении изучаемых тест-культур

Конц, %		Хитозан, ММ 87 кДа		Хитозан, ММ 58 кДа
0,025	М. avium	М. Bovis	М. fortuitum	М. intracellulare	М. avium	М. Bovis	М. fortuitum	М. intracellulare
0,0 5	+	++++	++++	++++	+	++++	++++	++++
0,075	-	++++	++	++	-	++++	++++	++++
0,1	-	+++	++	++	-	+++	++++	++++
0,2		++	++	++		++	++++	+++
0,3	-	-	+	+	-	-	++++	+
0,5	-	-	+	+	-	-	++++	+

Проведенное исследование позволило сделать вывод, что изучаемые хитозаны, обладающие свободными аминогруппами, оказывали влияние на рост микобактерий. Наличие NH₂-rpynn хитозана придает полимеру положительный заряд, в результате чего он способен взаимодействовать с анионными группами поверхности клетки и за счет электростатических и ионных взаимодействий формировать полиэлектролитные комплексы с компонентами бактериальной поверхности, вызывая их гибель.

Низкомолекулярный кислоторастворимый хитозан с низким значением ММ обладал антибактериальной активностью по отношению к штаммам ми-кобактерий M.smegmatis и может быть использован в дальнейших исследованиях для инактивации (гибели) других патогенных и непатогенных микроорганизмов.

Сорбционные свойства хитозана и его применение при выращивании молодняка сельскохозяйственных животных

Полученный активированный хитозан с высокой абсорбционной емкостью был испытан как препарат «Энтеросорбент» вначале на лабораторных, а затем на молодняке сельскохозяйственных животных и птицы. По результатам научно-хозяйственных опытов в хозяйствах Московской, Тульской, Брянской и Курской областей, в том числе в зонах высокого загрязнения почвы продуктами распада тяжелых металлов, была проведена оценка лечебного воздействия хитозана при желудочно-кишечных заболеваниях телят и поросят, а также его радиопротекторного действия.

Влияние препаратов хитозана на морфологический состав крови телят в условиях плотности загрязнения почв радиоцезием (Брянская область), представлены в таблице 5.

Таблица 5. Влияние применения препарата хитозана на содержание клеток крови и гемоглобина в эритроцитах у молодняка крупного рогатого скота

Группы	Эритроциты, 10.2/л	Гемоглобин, г/л	Гемоглобин в эритроцитах, г* 109/л	Лейкоциты, 109/л	Гематокрит, %
Перед началом опыта (п=12)
	7,44±0,21	120,50±3,28	16,35±0,66	10,54±0,70
Через 63 суток использования препаратов (п=6)
1.	6,45±1,7	107,10±4,75	1б, 66±0,75	10,43±2,31	34,17±0,70
2.	6,26±0,16	104,42±5,16	16,73±0,85	7,56±0,76	35,33±0,76
3.	7,28±0,54	109,00±6,24	15,34±1,37	8,02±0,88*	32,83±1,35
Через 85 суток использования препаратов при убое (п=3)
1.	7,35±0,19	138,67±17,34	18,82±2,12	7,63±1,25	37,00±2,08
2.	8,34±0,19	146,67±20,74	17,51±2,32	10,47±2,14	43,00±1,53
3.	7,22±0,79	110,33±10,41	15,88±3,11	8,70±1,28	36,67±3,71

Опыты по добавке низких доз хитозана к кормовому рациону молодняка сельскохозяйственных животных показали достоверное повышение привесов на 5-6% у животных опытных групп по сравнению с контролем. Данные о влиянии скармливания хитозана и фитохитодеза (водорастворимого хитозана с экстрактом лекарственных растений) на динамику живой массы телят представлены на рисунке 3.

Рис. 3. Динамика роста живой массы телят при скармливании хитозана и фитохитозана

Проведенные исследования показали, что повышенная удельная активность радиоцезия в рационе животных обусловила ряд негативных изменений, таких как снижение числа эритроцитов, гемоглобина в крови по сравнению с нормой. Скармливание дополнительно к основному рациону препаратов хитозана препятствовало развитию этих процессов, т.е. оказало радиопротекторное действие.

Высокомолекулярная фракция хитозана обладает бактериостатическим действием, пролонгирует действие растительного экстракта в составе препарата, связывает и выводит из организма токсины и ионы тяжелых металлов.

Олигомеры хитозана, всасываясь в кровь, быстро разносятся по всем органам и тканям, оказывая стимулирующий эффект на иммунную систему и неспецифические факторы резистентности организма, в первую очередь посредством активации Т- и В-клеток иммунной системы. Фракции с ММ 50 Кда в условиях топкого кишечника переходят в коллоидное состояние, в котором усиливаются хелатообразующие и комплексообразующие свойства хитозана оказывают детоксицирующее действие на организм.

Антиметастатическая активность олигомеров хитозана в фитохитодезтерапии

Исследована антиметастатическая активность олигомеров хитозана. Смесь глюкозамина и его димера (~ 50%) использовалась в качестве адъюванта в комбинированной терапии с цитостатиками в низких дозах в эксперименте по изучению антиметастатической активности на L-карциноме. В опытах были использованы мыши-гибриды BDF, весом 21-22 г. Инокулум составлял (10⁶) опухолевых клеток, вводимых подкожно (табл. 6.).

Таблица 6. Антиметастатическая активность олигомеров хитозана

Препарат	Разовая доза, мг/кг	НИМ.
Глюкозамин + димер	200	35,0
Циклофосфан	30,0	40,0
Цисплатин	1,2	2,0
Циклофосфан + цисплатин	30,0+1,2	57
(Циклофосфан + цисплатин) + (глюкозамин + димер)	(30,0+1,2)+ (200)	98

Как видно из таблицы 6, циклофосфан и цисплатин использованы в низких, неэффективных дозах. Антиметастатический эффект (индекс ингибирования метастазов = ИИМ, %) в этих случаях составлял 40 и 2%, соответственно, а для смеси циклофосфана с цисплатином и этих же количествах (30 + 1,2) ИИМ= 57. При добавлении олигомеров хитозана этот показатель возрастал до 98%.

Антиметастатический синергизм действия возможен при сочетании оли-гомерной фракции хитозана с компонентами сложного состава экстракта противоонкологического фитосбора. Кроме этого, обнаруженный эффект может быть косвенным подтверждением наличия синергетического антиок-сидантного (и, по-видимому, поливалентного) действия экстрактов лекарственного сырья, особенно для многокомпонентных фитосборов и при сочетании с полиэлектролитами природного происхождения.

Изучение биологической антиоксидантной активности хитозана и его производных

Таблица 7. Антиоксидантная активность различных образцов сырья природного происхождения

№ п/п	Величина АОЕ	Галоген	Содержание антиоксидантов	Исследуемые образцы сырья
1.	мг на 1 купон	Вг	0,024	Пектин цитрусовый
2.	мг на 1 купон	Вг	0,048	Хитозан
3.	мг на 1 купон	Вг	0,0001	Розвератроп
4.	мг на 1 купон	Вг	0,325	Кверцетин

В таблице 7 представлены результаты определения суммарной антиоксидантной емкости (АОЕ) различных образцов сырья природного происхождения кулонометрическим титрованием, которое является методом количественной оценки антиоксидантных свойств различных продуктов.

Представленные выше данные свидетельствуют о значительно более высокой антиоксидантной активности хитозана по сравнению с биологически активными веществами растительного происхождения (в 2 раза выше, чем у пектина и в 266 раз, чем у розевератропа).

Ранозаживляющее свойство хитозана

Из существующего в настоящее время широкого ассортимента полимерных покрытий на раны и ожоги, рассасывающиеся покрытия в наибольшей степени отвечают всем медико-биологическим требованиям, могут быть полезны как на ранних стадиях лечения ран и ожогов, так и на более поздних стадиях. Следовательно, разработка рассасывающихся прилипающих полимерных покрытий с различными сроками биодеструкции является в настоящее время актуальным направлением создания эфективных аппликаций на раны и ожоги.

Природный полисахарид хитозан обладает широким спектром действия. Его производные регулируют пролиферацию фибробластов и стимулируют нормальную регенерацию кожи. Болеутоляющее и антимикробное действие обусловлены уникальной способностью хитозана неспецифически взаимодействовать с болевыми рецепторами и клеточной стенкой микроорганизмов. Одной из причин эффективного влияния хитозана на заживление ран является стимулирующее воздействие на иммунную систему, т.к. его можно рассматривать как аналог липополисахаридов клеточных стенок микроорганизмов, выполняющих роль активаторов макрофагов. Существенной проблемой послеожоговых участков являются рубцы, образующиеся в местах регенерации кожи. Использование хитина и его производных позволяет значительно снизить гиперразрастание гранулляционной ткани. Известно, что производные хитина имеют структурные характеристики подобные глюкозаминам кожи и могут служить подложкой для роста кератиноцитов и фибробластов.

Начиная с 3 дня после нанесения ран ежедневно накладывали хитозановые пленки (1 опытная группа крыс), 200 мг левомиколя (2 опытная группа крыс) и физраствора (контрольная группа). Раневую поверхность оценивали планиметрически в день образования ожога, после 3,6,11 и 15 обработок препаратами.

Результаты изучения скорости выхода анестезина в водную среду из хитозановой пленки представлены на рис. 7. Как видно из представленных экспериментальных данных выход анестезина происходит не сразу. За первые 2 часа выходит около 35%. Далее в течение последующих 10 часов выход постепенно снижается. Кинетика выхода носит диффузионный характер. Полученная зависимость позволяет говорить о том, что в пленке анестезин распределен совместно с хитозаном, который и пролонгирует выход.

Полученные данные позволяют полагать, что биоактивный слой покрытия с анестезином и хитозаном позволит пролонгировать анестезирующее действие раневого покрытия.

Рис. 4. Кинетика выхода анестезина из пленочного слоя хитозана

Результаты планиметрической оценки раневой поверхности при химическом и термическом ожогах представлены в таблицах 8 и 9. После 3-х кратных аппликаций хитозана и левомиколя гиперемия и отечность отсутствовали, раневая поверхность уменьшилась на 54% по сравнению с контролем (табл. 8). Еще более значительные результаты были достигнуты после 6 аппликаций, а полное заживление ран и полноценное восстановление волосяного покрова наступало соответственно к 10 и 12 дню лечения. При этом образовавшаяся при регенерации ткань была очень похожа на интактную кожу. В контрольной группе полное восстановление раневой поверхности происходило только к 15 дню, волосяной покров восстанавливался не полностью.

На начальном этапе лечения химического ожога процент уменьшения раневой поверхности в группе животных, где применяли хитозановую пленку составил 8-11%, а к 11 дню лечения - 60% по сравнению с контролем. Полное заживление наступало на 15 сутки лечения, а в контроле - на 21 сутки.

Таблица 8. Динамика сокращения раневой поверхности после термического ожога

Группы	Количество аппликаций
	3	6	11
Хитозан	45,73,8	17,02,7	0
Левомиколь	44,9+2,6	25,8+4,8	7,3+1,1
Контроль	96,74,5	64,1+3,8	27,0+2,1

Р0,05

Таблица 9. Динамика сокращения раневой поверхности после химического ожога

Группы	Количество аппликаций
	3	6	11	15
Хитозан	80,7+1,8	42,02,3	18,9+1,7	0
Левомиколь	78,9+2,1	45,2+1,8	27,0+1,3	9,0+1,2
Контроль	90,7+2,5	51,4+1,8	33,7+2,4	14,8+2,3

Р0,05

По данным, представленным в табл. 9 видно, что стимулирующее действие хитозана и левомиколя в начале лечения существенно не отличается. Но к 11 суткам лечения эффективность хитозана возрастает до 23% по сравнению с левомиколем, а полное восстановление кожного покрова происходит на 3 суток быстрее.

Влияние ферментного препарата коллагеназы на функционально-технологические свойства мясопродуктов

Учитывая актуальность проблемы рационального использования мясного сырья, были проведены исследования по изучению влияния ферментного препарата коллагеназы различной концентрации на функционально-технологические свойства таких мясопродуктов, как голяшки говяжьи копчено-вареные и зельц.

В работе использован ферментный препарат коллагеназа. Изучали влияние препарата на функционально-технологические свойства сырья и готового продукта. Фермент вводили в концентрациях 0,03%, 0,05% и 0,1% до стадии термообработки (образцы №1,2 и 3 соответственно).

Оценивалось качество продукции по следующим показателям: содержание влаги, содержание сухих веществ, содержание связанной влаги, потеря массы, общая органолептическая оценка.

Полученные данные представлены в таблицах 10 и 11.

Из таблицы 10 следует, что до термообработки лучшие результаты по сравнению с контрольным образцом, выявлены у ферментированного сырья с 0,03% концентрацией коллагеназы, а именно, у образца №1 отмечено большее на 8,2% и 6,7%, соответственно содержание общей и связанной влаги.

Таблица 10. Функционально-технологические свойства голяшек говяжьих копчено-вареных с добавлением ферментного препарата коллагеназа

Показатели	До термообработки	После термообработки
	Контроль	1	2	3	контроль	1	2	3
Содержание влаги, %	62,7	70,9	70,6	68,7	28,7	32,5	32,1	37,7
Содержание сухих веществ, %	32,0	25,0	28,9	21,5	-	-	-	-
Содержание связанной влаги, % к фаршу	64,4	71,1	71,3	73,9
Содержание связанной влаги, % общей влажности	94,6	94,8	86,2	94,1
Потеря массы, %	-	-	-	-	18,0	31,8	37,0	38,5
Общая органолептическая оценка, балл					3,9	4,2	3,9	3,7

Образцы №2 (0,05% о) и №3 (0,1%), в свою очередь, также имели на 7,9% и 6,0% большее содержание влаги по сравнению с контрольным образцом без ферментативного воздействия, но наряду с такой положительной динамикой у них были отмечены большие потери массы после термообработки и меньшее содержание связанной влаги (на 19,0-20,5%) и 0,6-8,4% соответстве...