Научные основы биотестирования с использованием инфузорий

Таблица 6 - Коэффициенты потенцирования при комбинированном действии ПАВ и органических растворителей с токсичными веществами на тест-системы

Из представленных в таблице 6 данных можно заключить, что тест-система поддается внешнему целенаправленному регулированию. Порог ее чувствительности ко внешним воздействиям может быть искусственно изменен путем применения функциональной нагрузки. Для повышения чувствительности тест-реакции гибели клеток наиболее целесообразно использовать диметилсульфоксид в концентрации 50.10-3%, а из поверхностно-активных веществ - твин-80 в концентрациях от 2.10-3% до 20.10-3%. Для повышения чувствительности тест-реакции хемотаксиса более эффективным оказался додецилсульфат натрия в концентрации от 1.10-3% до 2.10-3%.

Третью группу внешних воздействий на тест-систему составляют "шумовые" факторы. Как правило, их воздействие обусловлено теми манипуляциями, которые производят с тест-системой в процессе осуществления ее контакта с исследуемым образцом. К ним относятся колебания температуры, изменения кислотности среды, осмотические воздействия и так называемый "ударный" эффект. Воздействие этих факторов на тест-систему обычно не приводит к значительному искажению результатов, однако определенный вклад в погрешность при определении тест-критерия они вносят. Поэтому, хотя эти факторы не всегда удается учитывать и устранять в процессе постановки биологического теста, следует принимать меры для их минимизации.

Разработка теоретической концепции биотестирования как метода научного исследования дала нам возможность перейти к ее практическому воплощению.

Практическая реализация научных основ биотестирования

Одной из задач, стоявших перед нами, явилась разработка нового, эффективного, экспрессного и недорогого биологического теста, с помощью которого можно было бы исследовать объекты внешней среды сельскохозяйственных птиц, такие как корма, вода и другие, а также внутренние среды организма птиц в условиях промышленного птицеводства. Поскольку новый биологический тест планировали использовать в условиях лабораторий птицефабрик и иных сельскохозяйственных предприятий, не приспособленных для осуществления ряда мероприятий по систематическому поддержанию культур инфузорий и не имеющих возможности использовать специальное дорогостоящее оборудование для наблюдения за некоторыми специфическими тест-реакциями, то такой биологический тест должен был иметь вид стандартного набора, содержащего готовую к применению тест-систему, а используемая тест-реакция доступна для наблюдения с помощью стандартных технических средств, имеющихся в любой лаборатории.

Эти условия дали нам ориентиры в поиске тест-организма. В первую очередь наше внимание привлекли те виды свободноживущих инфузорий, которые имеют в своем жизненном цикле стадию покоя и способны образовывать цисты покоя. Особый интерес в этом отношении представляют почвенные виды инфузорий. Один из них, Colpoda steinii, был выбран нами в качестве тест-организма. Среди признаков, присущих прочим инфузориям, данный вид обладает рядом уникальных свойств. Способность образовывать цисты покоя, устойчивые к высушиванию, и быстрый переход от стадии покоя к активной жизнедеятельности позволяют получать на основе культуры Colpoda steinii удобный в использовании сухой препарат-диагностикум с длительным сроком годности. А отсутствие стадии конъюгации в жизненном цикле и фазы старения в клональном цикле, специфика процесса деления макронуклеуса, в результате которого генетический материал, в отличие от большинства инфузорий, точно распределяется между дочерними вегетативными ядрами, а также тетраплоидность макронуклеуса на постцистной стадии жизненного цикла определяют относительное генетическое постоянство лабораторных штаммов данной инфузории и однородность ее культуры, полученной путем индуцированного проращивания цист покоя.

В ходе работ с данным видом выделен и депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного НИИ ОЧБ штамм инфузории Colpoda steinii П-1. Изучены его морфологические и физиологические характеристики, жизненный цикл, охарактеризована чувствительность к токсичным веществам. Результаты этих исследований дали основания для разработки на основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 токсикологического диагностикума. Форма приготовления этого препарата предложена в виде так называемого токскита, сухого стандартного набора, содержащего живую тест-систему, предназначенную для токсикологических исследований.

Необходимым этапом разработки технологии приготовления препарата явилось изучение кинетики роста смешанной культуры инфузории Colpoda steinii и бактерии Bacillus subtilis, представляющей собой систему типа "субстрат - жертва - хищник". Для математического описания этого процесса была выбрана система трех дифференциальных уравнений:

где: S - концентрация лимитирующего субстрата; X1 - концентрация жертвы; X2 - концентрация хищника; ? - время; ?1m - максимальная удельная скорость роста жертвы; ?2m - максимальная удельная скорость роста хищника; KS - константа полунасыщения по лимитирующему субстрату; KX1 - константа полунасыщения по жертве; ?0=1/?S - усвояемость лимитирующего субстрата жертвой; ?1=1/?X1 - коэффициент хищничества (усвояемость жертвы хищником).

Константы модели были определены в острых опытах, что позволило, задавая начальные условия и интегрируя систему в численном виде явным методом Рунге-Кутта четвертого порядка, предсказывать поведение смешанной культуры и управлять ее развитием. Эксперименты показали, что математическая модель достаточно точно описывает процесс культивирования смешанной культуры Colpoda steinii и Bacillus subtilis при температуре 22C. Значительные отклонения экспериментальных данных от теоретических наблюдали лишь в последние часы эксперимента. Так, реальные концентрации глюкозы и клеток Bacillus subtilis не достигали нуля, а концентрация трофонтов Colpoda steinii по достижении максимума начинала быстро убывать за счет формирования цист покоя. Но следует отметить, что максимальные концентрации организмов смешанной культуры полученной системой уравнений предсказываются верно, как и время достижения этих концентраций, что является ключевым моментом в практическом использовании модели. Отклонения экспериментальных данных от теоретических кривых мы склонны объяснять погрешностями при определении констант математической модели, измерении параметров процесса и некоторыми допущениями, принятыми при составлении модели. К последним относятся: предположение о постоянстве экономических коэффициентов (коэффициентов хищничества и усвояемости субстрата) и пренебрежение влиянием первого трофического звена на третье. Кроме того, модель не учитывает нелинейный характер зависимости скорости фагоцитоза инфузорий-седиментаторов от концентрации бактерий, особенности процесса палинтомического деления Colpoda steinii и ее способность образовывать цисты покоя. Приняв во внимание все эти моменты, можно сделать вывод, что полученная математическая модель позволяет предсказать поведение системы и целенаправленно управлять ею и, следовательно, вполне применима на практике.

Проведенные исследования позволили отработать производственные режимы выращивания больших количеств культуры Colpoda steinii для приготовления препарата. Результаты экспериментов нашли отражение в технической документации на препарат и в патентной документации.

Еще одним важным звеном в разработке диагностического препарата явилось исследование процесса его хранения и создание комплекса мер по увеличению срока его годности. Полученные кривые выживания цист покоя Colpoda steinii в сухом состоянии показывают, что значительная доля инцистировавшихся инфузорий в изученных условиях погибала в течение первых 20 суток хранения. Причем доля погибших цист зависела от вида носителя (33% на ацетилцеллюлозной пленке и 71% на стекле). В дальнейшем кинетика гибели цист менялась. Скорость гибели цист была невелика и зависела от материала носителя. Из изученных вариантов условий хранения наилучшим является хранение цист покоя, сорбированных на ацетилцеллюлозной пленке, в герметично закрытых флаконах в темном месте. В таком виде срок годности препарата составляет 24 месяца, что делает возможным его промышленное производство и коммерческое использование.

Разработанный препарат призван решить проблему экспрессной оценки интегральной токсичности кормопродуктов и воды, поступающих на птицефабрики, непосредственно в лаборатории предприятия-потребителя. Препарат прошел широкую проверку и внедрен в практику работы лабораторий ряда сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Результаты производственных испытаний подтвердили данные камеральных опытов и позволили сделать вывод о его пригодности для оценки кормов сельскохозяйственных животных на общую токсичность. Такой же вывод был сделан при независимой проверке препарата в Институте ветеринарной медицины УААН (г. Киев) и в НПЦ "Корм" (г. Санкт-Петербург).

Другой перспективной сферой применения биотестирования с использованием инфузорий является диагностика и мониторинг состояния организмов высших животных, а также их популяций путем исследования токсических свойств их внутренних сред. Применение разработанного нами препарата в этой специфической области позволило провести изучение динамики токсичности сыворотки крови кур в зависимости от их возраста в нормальных условиях, а также при различных заболеваниях и специальных технологических мероприятиях. Результаты исследования показали, что токсические свойства сыворотки крови кур находятся в зависимости от возраста, причем, возрастные изменения носят закономерный характер. Экстремальные внешние воздействия изменяют свойства сыворотки крови кур. Так, при профилактической вакцинации цыплят против болезни Гамборо и инфекционного ларинготрахеита токсичность сыворотки крови птиц увеличивалась в 3-4 раза уже на следующие сутки. Подобное явление наблюдали и при инфекционном процессе, вызванном мезогенным вирусом ньюкаслской болезни. Среднее значение регистрируемого параметра изменялось в 1,7 раза по сравнению с нормой. Таким образом, уровень токсичности крови птиц, а также статистический разброс этого параметра могут служить критерием для экспрессной диагностики общего состояния поголовья птиц в условиях промышленного птицеводства.

ВЫВОДЫ

1 Сформированы научные основы биотестирования, как метода анализа объектов окружающей среды. Они включают в себя:

- связную систему оригинальных определений основных терминов, используемых в биотестировании;

- схему постановки биологического теста, как процесса превращения материального потока, представленного исследуемым образцом и его действующей формой, в информационный, результатом которого является оценка исследуемого образца;

- описание внутренней структуры тест-системы, как центрального звена процесса биотестирования, и трех групп факторов внешних воздействий на тест-систему;

- пути оптимизации, стандартизации и управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

2 Даны обоснования к использованию инфузорий в качестве тест-объектов в биологических тестах, разработаны системы требований для отбора тест-организмов, тест-реакций и тест-критериев, наиболее пригодных для практического применения.

3 Выведена универсальная зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции гибели, и на ее основе получены характеристики токсичных веществ - предел обнаружения, определяемый как концентрация данного вещества в растворе, вызывающая гибель 50% клеток Colpoda steinii в течение 3 часов, и токсикологическая широта действия, характеризуемая коэффициентом в показателе степени уравнения "концентрация - время", а также самой тест-системы - индекс синхронизированности, представляющий собой отношение нормирующих коэффициентов в уравнениях "концентрация - время" для 100% и 50% гибели инфузорий. Чувствительность тест-реакции гибели Colpoda steinii к изученным токсичным веществам на 1-2 порядка выше таковой для теплокровных животных. Кривые "концентрация - время", характеризующие процесс взаимодействия тест-системы с токсичным веществом, описываются уравнением степенной функции, а морфологические изменения, происходящие в клетках во время интоксикации, носят специфический характер.

4 Выведена зависимость, описывающая процесс взаимодействия культуры клеток инфузорий с токсичным веществом на модели тест-реакции хемотаксиса. Показано, что применение этой тест-реакции дает возможность исследовать интегральную токсичность объектов внешней среды с содержанием поллютантов на уровне, сравнимом с ПДК.

5 В результате изучения процесса комбинированного воздействия смеси токсичных веществ на культуру клеток инфузорий выявлены аддитивный и антагонистический типы взаимовлияния различных ксенобиотиков, выведены формулы, описывающие процесс взаимодействия смеси токсичных веществ с тест-системой при аддитивном типе взаимовлияния.

6 В результате исследования процесса комбинированного воздействия смеси токсичного вещества с органическими растворителями, а также с поверхностно-активными веществами на культуру клеток инфузорий выявлен эффект потенцирования. Показана принципиальная возможность использования органических растворителей и ПАВ в качестве функциональной нагрузки с целью управления тест-системой и процессом биотестирования в целом.

7 Сформирован комплекс мер для стандартизации процесса биотестирования и управления основными параметрами тест-систем. Он включает использование депонированных штаммов инфузорий, обладающих стабильными генетическими и физиологическими характеристиками, синхронизацию тест-систем перед применением, регулирование чувствительности тест-системы с помощью функциональных нагрузок.

8 В результате практической реализации теоретических основ использования инфузорий в биотестировании выбран вид инфузории, обладающий рядом специфических свойств, обуславливающих его преимущества перед иными тест-организмами, выделен, всесторонне охарактеризован и депонирован штамм Colpoda steinii П-1.

9 На основе культуры инфузории Colpoda steinii П-1 создана тест-система, обладающая по сравнению с существующими важными преимуществами - высокой чувствительностью к токсичным веществам, высокой степенью синхронизированности и постоянством генетических и физиологических характеристик.

10 Для управления процессом культивирования моноксеничной культуры инфузории Colpoda steinii использована математическая модель типа "субстрат - жертва - хищник", получены значения коэффициентов этой модели.

11 В результате изучения процесса хранения цист покоя Colpoda steinii в высушенном состоянии определены оптимальные условия их хранения и срок годности.

12 Разработан первый отечественный токскит на основе культуры инфузории Colpoda steinii, штамм П-1, со сроком годности более 2 лет. Препарат прошел широкие испытания и внедрен в практику работы лабораторий сельскохозяйственных предприятий России, Украины и Грузии. Метод оценки интегральной токсичности фуражного зерна и комбикормов с использованием препарата включен в Межгосударственный стандарт ГОСТ 13496.7-97, в Государственный стандарт Украины ДСТУ 3570-97 и в Национальный стандарт Российской Федерации ГОСТ Р 52337-2005. Применение препарата в исследованиях внутренних сред организмов в промышленном птицеводстве является перспективным и может быть использовано при решении вопросов, связанных с регулированием условий содержания животных, проведением профилактических мероприятий, а также при создании различных систем прогнозирования экономических показателей сельскохозяйственных предприятий.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Препарат токсикологической диагностики кормов // Ростовский ЦНТИ. - 1993. - № 97-93. - 2 с.

2 Патент № 2001951 Российской Федерации, МКИ5 C 12 N 5/00. Штамм инфузории Colpoda steinii для приготовления токсикологического диагностикума/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 8 с.

3 Патент № 2002263 Российской Федерации, МКИ5 G 01 N 33/18. Способ получения препарата для токсикологических исследований объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1993. - 10 с.

4 Vinochodov D., Vinochodov V. Preparation for toxicological estimation of poultry fodder // International conference "Biotechnology St.Petersburg94". St.Petersburg, Russia, September 21-23, 1994: Program and abstracts. - SPb, 1994. - P. 97-98.

5 Виноходов Д. О. Токсикологические исследования кормов с использованием инфузорий. - СПб: АВН, 1995. - 80 с.

6 Патент № 2039825 Российской Федерации, МКИ6 C 12 O 1/02, G 01 N 33/18. Способ определения токсичности объектов внешней среды/ Виноходов Д. О., Виноходов В. О. - М.: НПО "Поиск" Роспатента, 1995. - 6 с.

7 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Биотестирование как метод научного исследования // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 40-43.

8 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И., Ананченко И. В. Зависимость "концентрация - время" в острых опытах // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 73-78.

9 Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Colpoda steinii как тест-организм // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 85-87.

10 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Биоиндикация-98: Материалы Международной молодежной научной школы 21-28 сентября 1998. - Петрозаводск, 1998. - Т. 1. - C. 164-167.

11 Виноходов Д. О. Математическое моделирование кинетики роста культуры инфузории Colpoda steinii в периодических условиях // Архив ветеринарных наук. - 1998. - Т. 1(48). - C. 121-134.

12 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И. Определение общей токсичности зернопродуктов // 1-ый съезд токсикологов России 17-20 ноября 1998: Тезисы докладов. - М.: 1998. - C. 271.

13 Земляникина Т. А., Олемской В. В., Виноходов Д. О. Исследование свойств сыворотки крови кур с использованием культуры простейших // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 275-278.

14 Казаченок Е. Н., Виноходов Д. О. Влияние органических растворителей на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 229-232.

15 Кривицкая О. Г., Виноходов Д. О. Влияние поверхностно-активных веществ на чувствительность инфузорий к тяжелым металлам // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 225-228.

16 Соболева Л. С., Виноходов Д. О. Выявление токсигенных грибов, контаминирующих корма, при помощи инфузорий // Инфузории в биотестировании: Тезисы докладов международной заочной научно-практической конференции. - СПб, 1998. - C. 266-269.

17 Виноходов Д. О. Временное наставление к экспресс-методу определения токсичности кормов, кормовых добавок, воды и органов павших и убитых животных с использованием культуры Colpoda steinii // Ветеринарная газета. - 1999 - № 2 (153). - C. 5.

18 Виноходов Д. О., Виноходов В. О., Гинак А. И., Земляникина Т. А. Использование инфузорий в исследованиях внутренних сред высших организмов // Архив ветеринарных наук. - 1999. - Т. 1(48), ч. 3. - C. 551-577.

19 Зерно фуражне, продукти його переробки, комбiкорми: Методи визначення токсичностi. ДСТУ 3570-97 (ГОСТ 13496.7-97). Державний стандарт Украiни. Киiв: Держстандарт Украiни. - 1999. - 15 с.

20 Зерно фуражное, продукты его переработки, комбикорма: Методы определения токсичности. ГОСТ 13496.7-97. Межгосударственный стандарт. - МГС по стандартизации, метрологии и сертификации. - 1999. - 15 с.

21 Зубанов П. А., Кривицкая О. Г., Пожаров А. В., Виноходов Д. О., Ивакина А. В. Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакции инфузорий // Биотехнология в ФЦП "Интеграция": Тезисы докладов заочной научно-практической конференции. - СПб: Изд-во СПбГТИ(ТУ), 1999. - C. 107-109.

22 Патент № 2136152 Российской Федерации, МКИ6 A 01 K 67/02, A 61 B 10/00, C 12 Q 1/02. Способ определения естественной резистентности организма птиц/ Олемской В. В., Виноходов О. В., Виноходов Д. О. - М.: ФИПС, 1999. - 6 с.

23 Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Влияние поверхностно-активных веществ на тест-реакцию хемотаксиса Paramecium caudatum // Концептуальные вопросы питания населения и военнослужащих: Сборник трудов по материалам Всероссийской научной конференции, посвященной 45-летию научно-исследовательской лаборатории питания и водоснабжения (25 мая 2001 год). - Санкт-Петербург, 2001, с. 46-49.

24 Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Перспективы применения поверхностно-активных веществ в биотестах // Химия и биотехнология биологически активных веществ, пищевых продуктов и добавок. Экологически безопасные технологии: Материалы международной конференции молодых ученых (15 ноября 2002 г.), выпуск второй. - Тверь, 2002. - с. 20.

25 Виноходов Д. О., Гинак А. И. Исследование токсичности зернопродуктов: новая редакция ГОСТ // Ветеринария в птицеводстве. - 2002 - №1. - С. 9.

26 Ковбасенко В. М., Горобей А. М., Ляшкевич А. А., Полежаев Ф. И., Григорашева И. Н., Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Экспресс-метод определения токсичности пищевых продуктов с использованием инфузории Colpoda steinii // Ветеринария в птицеводстве. - 2002 - №3. - С. 26-29.

27 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Биотестирование в птицеводстве и ветеринарии: Введение в биотестирование // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 41-46.

28 Виноходов Д. О. Методические рекомендации по определению токсичности продуктов животноводства и кормов (микробиологический экс-пресс-метод) // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 49-54.

29 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Определение микотоксинов методами биотестирования // Ветеринария в птицеводстве. - 2003 - №5-6. - С. 47-48.

30 Храпунова Н. М., Рачеева Ю. А., Илюшин М. А., Зубанов П. А., Виноходов Д. О. Оценка биологической активности новых веществ экспрессными методами (на примере перхлоратных аммиакатов кобальта (III)) // Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (20-21 ноября 2003 года). - СПб: ВМедА, 2003. - С. 184-185.

31 Конюшенко Е. Н., Никитина Ю. А., Виноходов Д. О., Дубяго Н. П., Илюшин М. А., Шугалей И. В., Целинский И. В., Жилин А. Ю., Козлов А. С., Илюшина Т. М. Генерация, реакционная способность активных форм кислорода и их деструктивная роль в процессах жизнедеятельности // VII Вишняковские чтения: Стратегия и тактика вузовской науки в регионе: Материалы международной научной конференции (Бокситогорск, 2 апреля 2004 г.). - СПб. - 2004. - С. 100-110.

32 Конюшенко Е. Н., Никитина Ю. А., Дубяго Н. П., Илюшин М. А., Виноходов Д. О., Шугалей И. В., Целинский И. В., Жилин А. Ю., Козлов А. С., Илюшина Т. М. Влияние комплексообразования на свойства коразола // Химия и технология синтетических биологически активных веществ: Сборник трудов Всероссийской научно-технической конференции «Успехи в специальной химии и химической технологии». - М., 2005. - С. 58-62.

33 Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Профилактика ассоциированных токсикозов методами биотестирования // Международный вестник ветеринарии. - 2005 - №1/ - C. 91-95.

34 Корма, комбикорма, комбикормовое сырье: Методы определения общей токсичности. Национальный стандарт Российской Федерации. ГОСТ Р 52337-2005. - М.: Стандартинформ, 2005. - 16 с.

35 Виноходов Д. О. Биотестирование на культурах инфузорий в диагностической профилактике пищевых отравлений животных (обзор) // Ветеринарная патология. - 2006. - №1. - С. 90-96.

36 Зубанов П. А., Виноходов Д. О., Филимон Е. В. Зависимость чувствительности Paramecium caudatum к токсичным веществам от условий обитания // IV съезд Общества биотехнологов России им. Ю. А. Овчинникова (17-19 октября 2006 г.), Пущино, 2006.

37 Виноходов В. О., Виноходов Д. О., Поляков Н. Л. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Практик. - 2006. - №2. - С. 26-31.

38 Виноходов Д. О., Пожаров А. В. Методологические особенности токсикологических тестов с инфузориями // Известия СПбГЭ-ТУ «ЛЭТИ». Серия «Биотехнические системы в медицине и экологии». - 2006. - Вып. 3. - С. 60-67.

39 Поляков Н. Л., Виноходов Д. О., Виноходов В. О. Новый экспресс-метод определения токсичности мясопродуктов // Ученые записки Казанской академии ветеринарной медицины. - 2006. - Т. 180. - С. 210-219.

Размещено на Allbest.ru