Морфологические изменения нейронов и макроглиоцитов основных отделов мезокортиколимбической дофаминергической системы при воздействии этанола

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени

доктора медицинских наук

Морфологические изменения нейронов и макроглиоцитов основных отделов мезокортиколимбической дофаминергической системы при воздействии этанола

14.03.01 - анатомия человека

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

Дробленков А.В.

Санкт-Петербург 2010

Работа выполнена на кафедре анатомии человека Государственного образовательного учреждения высшего профессионального «Санкт-Петербургская государственная педиатрическая медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научные консультанты: доктор медицинских наук,

профессор Н.Р. Карелина

доктор медицинских наук,

профессор П.Д. Шабанов

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор И.В. Гайворонский

доктор медицинских наук,

профессор Ф.Н. Макаров

доктор медицинских наук,

профессор С.В. Костюкевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Проблема алкогольной зависимости является одной из важнейших в современной наркологии и психиатрии. Широкая распространенность, высокий уровень хронической инвализизации и большая социально-экономическая значимость ставит это болезненное состояние в ряд наиболее важных проблем здравоохранения.

Несмотря на значительный успех нейронаук на пути познания биологических основ зависимости, многие звенья ее патогенеза остаются невыясненными. Отсюда вытекает наиболее актуальный вопрос алкогольной зависимости - необходимость расшифровки основных механизмов, обусловливающих генез этого состояния, приводящего к алкогольной болезни.

Большинство исследователей считает, что основной причиной алкогольной зависимости является измененное содержание дофамина (преимущественно) и норадреналина в отделах мезокортиколимбической дофаминергической системы (МДС), на которые проецируются дофаминергические ядра среднего мозга. Различают алкогольную зависимость при длительном алкогольном стаже, алкогольную абстинентную и врожденную зависимость. Алкогольную зависимость между периодами абстиненции связывают с увеличением синтеза дофамина, его содержания в синапсах и активацией рецепторов к дофамину в проекционных отделах МДС (Анохина И.П., Коган Б.М., Христолюбова Н.А., 1979; Анохина И.П. 2001; Шабанов П.В. и соавт., 2002, 2010; Bergstorm H.C. at al., 2008). Причиной алкогольной абстинентной и врожденной зависимости является сниженное содержание дофамина (преимущественно) и норадреналина в отделах МДС (McBride W.J. et al., 1990; Rossetti Z. L., Hmaidan Y., Gessa G. L., 1992; George S. R. et al., 1995).

Уровень дофамина, высвобождаемого в синапсах и взаимодействующего с рецепторами постсинаптической мембраны нейронов в проекционных отделах МДС зависит от их морфофункционального состояния и трофико-пластического влияния, которое оказывают на нейроны макроглиоциты (Певзнер Л.З., 1972; Hyden H., 1967; Dai X. at al., 2003). Однако современное представление морфологии нейронов и нейроно-глиального взаимоотношения в МДС, являющееся ключевым для выяснения механизма и морфологических признаков перечисленных видов алкогольной аддикции, затруднено тем, что не решен ряд задач. Во-первых, не определены центры МДС и их подотделы, которые могли бы демонстрировать состояние нейронов и изменения дофаминовой медиации в наибольшей степени, поскольку в разных частях этих отделов объем центров, плотность расположения нейронов и области проекций дофаминергических волокон вариабельны (Bjorklund A., Lindvall O., 1984; Oads R.S., Halliday G.M., 1987). В связи с этим параметры нейронов МДС, например, в передней цингулярной коре (ПЦК), вычислены без учета области распределения дофаминергических окончаний (Должанский О.В., 2001). Во-вторых, отсутствует единое представление вида патологических изменений нейронов МДС (и других отделов головного мозга) при остром и хроническом воздействии этанола, функционального перенапряжения дофаминергических ядер и избыточной катехоламиновой медиации. Одни авторы, например, считают признаком острого алкогольного повреждения нейронов острое набухание нейронов, наиболее выраженное в коре лобной доли головного мозга (Галеева Л.Ш., 1973; Борисова Н.Ф., Желамбеков И.В., 1998; Pentschew A., 1958), другие - ишемическое сморщивание нейронов (Пиголкин Ю.И. и соавт., 2006). В-третьих, отсутствуют данные о количестве измененных форм нейронов в МДС у крыс и здоровых людей, известные при патологии (Жаботинский Ю.М., 1965). В-четвертых, отсутствуют исчерпывающие данные о количестве нейронов, их основных особенностях строения и количестве разновидностей макроглиоцитов в МДС как при различных видах аддикции, так и при условии нормы. В-пятых, информативность многих критериев оценки напряженности нейроноглиального взаимоотношения в МДС у здоровых организмов и при различных видах воздействий недостаточна и зачастую противоречива. Имеется в виду отношение числа нейронов к числу глиоцитов (Александрова М.А., 1999), среднее расстояние макроглиоцита от тел нейронов в пределах площади рR², где R=20 мкм - глиальное расстояние (Богомолов Д.В. и соавт., 2001), среднее количество перинейрональных сателлитов на один неизмененный нейрон - глиоцито-нейрональный индекс, абсолютное количество олигодендроцитов в 0,001мм³ (Востриков В.М., 2008) и др. Они связаны с выбором различной площади исследований, либо с произвольным выбором территории для подсчета, ограниченной целым ядром или слоем поля 24б без учета различной плотности расположения нейронов и макроглдиоцитов в пределах подотдела исследуемого нервного центра. В-шестых, скудно представлены данные об устойчивости морфологических признаков зависимости, особенно алкогольной. Известно, например, что через 1 мес после отмены хронического воздействия опиатов значимо уменьшены размеры тел вентральной области покрышки (ВОП), длина и толщина их дендритов (Nestler E.J., 2005). В-седьмых, фрагментарно и недостаточно полно освещены дифференциальные признаки воздействия на нейроны МДС этанола и опиатов. Например, данные об увеличении тяжести поражения нейронов в некоторых отделах МДС при отравлении алкоголем, опиатами и экспериментальной морфиновой абстиненции (Должанский О.В., 2001) не могут облегчить эту диагностику, поскольку в показатель включены все виды дистрофических и некробиотических изменений, включая алкогольную и наркотическую энцефалопатию. В-восьмых, нет данных о фазах гибели нейронов МДС развивающегося мозга и его скорости, степени повреждения нейронов МДС при хроническом воздействии этанола на материнский организм, а также о роли нейроно-глиального взаимоотношения в регуляции программированной гибели - апоптоза. И, наконец, не определена полушарная доминанта МДС (Михеев В.В., Шабанов П.Д., 2007).

Исходя из этого, очевидно, что выделение из МДС отделов и подотделов, в которых изменения нейронов в норме и при интоксикациях были бы наиболее информативны, детальное количественное изучение состояния нейронов на уровне их субпопуляций и изучение нейроно-глиального взаимоотношения, способные отразить влияние альтерирующих факторов на эту систему у организмов разного возраста, являются актуальной задачей в выяснении механизмов алкогольной зависимости.

Цель исследования - выявление закономерностей морфологических изменений нейронов и нейроно-глиальных взаимоотношений в мезокортиколимбической дофаминергической системе при воздействии этанола для уточнения механизмов внеабстинентной, абстинентной и врожденной алкогольной зависимости.

Задачи исследования.

1. Произвести объемную реконструкцию основных левосторонних центров МДС крысы, при помощи которой изучить их топографию и уточнить границы их сопредельной локализации.

2. Установить на основе полученной объемной реконструкции, количественного и морфометрического анализа нейронов и макроглицоитов, а также данных литературы подотделы МДС, демонстрирующие морфологические изменения нейронов в наибольшей степени. Определить количество неизмененных и патологически измененных форм нейронов, объем нейронов, количество олигодендроцитов, астроцитов и уровень нейроно-глиального взаимоотношения, представляющие собой эталон нормы для установленных подотделов МДС у интактных крыс и человека.

3. Определить фазы и сроки гибели нейронов МДС развивающегося мозга, сроки программированной клеточной гибели, а также степень повреждения нейронов исследованной системы при хроническом воздействии этанола на материнский организм у крыс, важные для понимания механизма врожденной алкогольной аддикции. Установить роль нейроно-глиального взаимоотношения в регуляции дифференцировки нейронов.

4. Выявить реактивные изменения нейронов и оценить степень напряженности нейроно-глиального взаимоотношения, характерные для внеабстинентной алкогольной зависимости у человека и крыс.

5. Определить дифференциальные морфологические признаки длительного влияния этанола, опиатов, гормонов стресса и антистресса на МДС.

6. Сопоставить полученные морфологические критерии врожденной и внеабстинентной алкогольной зависимости, а также отсроченные морфологические изменения МДС при раннем постнатальном воздействии гормонов стресса и антистресса с результатами функциональных тестов.

Научная новизна исследования.

Получены оригинальные данные объемной реконструкции, количественного и морфометрического анализа нейронов и макроглиоцитов основных отделов и подотделов МДС, связанных между собой проекционными волокнами и являющихся наиболее информативными для морфологических и физиолого-фармакологических исследований различных видов зависимости и возможности воздействия на эту систему. В МДС у человека и крыс ими являются: передние медиальные части паранигрального ядра вентральной области покрышки и компактной части черного вещества, середина вентромедиальной части прилежащего ядра и дофаминоцептивные слои передней лимбической коры. Их удобно рассматривать в подсистеме МДС - мезоаккумбоцингулярной дофаминергической системе (МАЦДС).

Выявлено, что у практически здоровых людей и интактных крыс небольшая часть нейронов патологически изменена. У человека количество патологически измененных форм нейронов больше в дофаминергических ядрах, чем в дофаминоцептивных слоях лимбической доли и, особенно, в коре теменной доли (не относящейся к МДС). Локальные изменения нейронов МАЦДС человека и высокая напряженность нейроно-глиального взаимоотношения в дофаминергических ядрах означает стертость границы нормы и патологии, а также меньшую прочность данной системы в сравнении с корковыми полями, удаленными от источника катехоламинергических волокон.

Впервые с помощью широко доступного метода световой микроскопии получены данные, позволяющие выделить морфологические признаки врожденной, внеабстинентной и абстинентной алкогольной зависимости.

Доказано, что длительное воздействие этанола на материнский организм вызывает усиление программированной гибели и уменьшение объема тел нейронов МАЦДС, сопряженные с усилением нейроно-глиального взаимоотношения. Эти дегенеративные изменения нейронов могут быть причиной сниженного уровня дофаминовой медиации в МДС и определять состояние врожденной алкогольной зависимости.

Впервые выявлено, что при развитии экспериментальной внеабстинентной алкогольной зависимости у взрослых крыс наблюдаются устойчивые компенсаторные пластические изменения нейронов, выражающиеся увеличением объема их тел и плотности расположения гранул хроматофильной субстанции, выраженные, главным образом, в дофаминергических ядрах. Эти изменения нейронов, наряду со значительным напряжением нейроно-глиального взаимодействия, объясняют увеличение уровня дофаминовой стимуляции формаций лимбической доли, считающееся одной из причин алкогольной межабстинентной аддикции.

Разработаны морфологические критерии оценки дифференциальной диагностики острого отравления этанолом, хронической алкогольной интоксикации и алкогольной абстинентной аддикции у человека. Показано, что этот вид зависимости, связанный с падением уровня дофамина в МДС, определяет высокая степень острого и хронического повреждения нейронов этой системы.

Выдвинута и доказательно обоснована гипотеза о том, что степень острого и хронического алкогольного повреждения нейронов МДС обусловлена комбинацией альтерирующих факторов - воздействия этанола, избыточной концентрации катехоламинов в синапсах дофаминоцептивных нейронов и функционального перенапряжения дофаминергических ядер.

Показано, что механизм восстановления нейронов МДС после отравления этанолом в периоде абстиненции связан с активацией нейроно-глиального взаимоотношения и его уровень обусловлен степенью острого повреждения нейронов.

Получены оригинальные данные, что воздействие мозгового гормона стресса (кортиколиберина) в раннем онтогенезе у крыс вызывает отсроченные компенсаторные пластическое изменения нейронов и усиление нейроно-глиального взаимоотношения в дофаминергических ядрах, аналогичные изменениям в этих ядрах при длительной алкогольной интоксикации, а также дегенеративные изменения дофаминоцептивных нейронов передней цингулярной коры. Наблюдаемое при этом усиление эмоционального реагирования (при функциональном тестировании) может являться следствием устойчивой активации МДС. Воздействие факторов антистресса (белки теплового шока 70 кДа) вызывает повреждение части нейронов дофаминергических ядер и снижение эмоционального реагирования, что может быть следствием угнетения дофаминовой медиации.

Получены новые результаты научно-практического характера, свидетельствующие о значимой компенсаторно-приспособительной роли макроглиоцитов в механизмах постнатального развития, пластических и дистрофических изменений нейронов МДС. Последние могут являться следствием функционального напряжения при синтезе избыточного количества дофамина, воздействием на дофаминоцептивные нейроны этанола и избыточного количества катехоламинов.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Полученные оригинальные данные объемной реконструкции и топографии основных отделов и подотделов МДС у крыс могут быть использованы в качестве модели для различных морфологических и прицельных функциональных исследований данной системы (электростимуляция, фармакологическое воздействие). Описанные количественные и морфометрические параметры нейронов и макроглиоцитов МДС у человека и крыс следует рассматривать как эталон нормы.

Установленные морфологические закономерности острого и хронического алкогольного повреждения нейронов МДС, а также восстановления нейронов в сочетании с усилением нейроно-глиального взаимоотношения при алкогольной абстиненции могут служить в качестве диагностических критериев перечисленных болезненных состояний.

Описаны принципы дифференциальной диагностики морфологических изменений клеток МДС при опиатной и алкогольной интоксикации, связанные с распространенностью дегенерации (хроматофильного сморщивания) нейронов МДС, количественной реакцией макроглиоцитов, значительным ростом фагоцитарной активности всех разновидностей нейроглиоцитов, угнетением защитно-приспособительной реакции перинейрональных сателлитов.

Определена реактивность структур МДС в раннем онтогенезе для возможности развития поведенческих (эмоциональных) девиаций у половозрелых животных (крыс).

Полученные сведения о морфологических и количественных изменениях нейронов и макроглиоцитов, а также степени нейроно-глиального взаимоотношения при различных способах воздействия этанола и видах алкогольной зависимости могут служить основой для дальнейшего выяснения сложных механизмов алкогольной болезни и аддикции, а также возможностей разработки новых подходов к их профилактике и лечению.

Примененный способ определения количества нейронов, астроцитов и олигодендроцитов в МДС у крыс, сравнение информативности основных параметров нейроно-глиального взаимоотношения в формациях развивающегося мозга и у взрослых могут быть использованы при изучении пластичности нервной ткани в экспериментальных и клинико-анатомических исследованиях мозга.

По исследованиям получен патент на изобретение «Способ коррекции процессов регенерации» № 2350340 от 27.03.2009 г.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Длительное воздействие этанола на материнский организм у крыс характеризуется уменьшением объема тел нейронов мезоаккумбоцингуляр-ной дофаминергический системы (МАЦДС), а также и увеличением числа их теневидных и гипохромных дегенеративных форм типа апоптотически измененных при рождении. К началу пубертатного периода (61 сутки) численность нейронов в проекционных отделах МАЦДС сокращена. Эти морфологические изменения отражают угнетение дофаминовой медиации и могут определять врожденную алкогольную зависимость.

2. Длительное воздействие этанола на головной мозг взрослых крыс характеризуется повреждением значительной части нейронов МАЦДС, особенно паранигрального ядра ВОП и прилежащего ядра (ПЯ), а также устойчивыми компенсаторными пластическими изменениями тел малоповрежденных нейронов дофаминергических ядер по типу гипертрофических. Эти изменения отражают усиление дофаминовой медиации и могут определять устойчивое состояние повышенной мотивации к этанолу.

3. Алкогольная абстиненция у человека выражается высокой степенью повреждения нейронов МАЦДС при хронической алкоголизации и частичным восстановлением дистрофических изменений нейронов при остром отравлении, низким количеством малоповрежденных нейронов в отделах этой системы, особенно в прилежащем ядре. Эти изменения отражают преходящее угнетение дофаминовой медиации и могут определять состояние алкогольной абстинентной зависимости.

4. Систематическое избыточное высвобождение катехоламинов (в частности, дофамина) в проекционных отделах МАЦДС при отравлении этанолом, длительном воздействии этанола и воздействии кортиколиберина (КЛ) в раннем онтогенезе у крыс индуцирует повреждение нейронов, степень которого убывает по мере увеличения расстояния от ядер ретикулярной формации.

5. Воздействие КЛ в раннем онтогенезе у крыс индуцирует развитие морфологических признаков активации дофаминовой медиации в виде компенсаторного увеличения объема нейронов дофаминергических ядер и плотности расположения хроматофильных гранул в их цитоплазме. Эти изменения сочетаются с усилением эмоционального реагирования и могут являться ее причиной у половозрелых крыс-самок. Воздействие белков теплового шока 70 кДа (БТШ) вызывает угнетение морфо-функционального состояния МДС.

6. Усиление нейроноглиального взаимоотношения, оцененное по уменьшению глиального расстояния и увеличению глиоцито-нейронального индекса, представляет собой универсальную защитно-приспособительную реакцию МДС при ее развитии и различных способах воздействия этанола (кроме смертельного отравления) и раннего постнатального воздействия КЛ на головной мозг. Оно потенцирует дифференцировку нейронов в постнатальном онтогенезе МАЦДС в норме и при воздействии этанола, способствует формированию устойчивых компенсаторных изменений нейронов типа гипертрофических при длительном воздействии этанола и определяет регрессию признаков дистрофии нейронов при отмене этого воздействия.

Публикации. По теме диссертационной работы опубликованы 31 научная работа, в том числе 15 статей в журналах, включенных в перечень рецензируемых научных журналов ВАК, разделы в 3 коллективных монографиях, 2 методических рекомендации.

Апробация диссертационной работы. Основные положения диссертации были доложены и обсуждены на отечественных и международных конференциях: на XV Всероссийской конференции с международным участием «Актуальные вопросы прикладной анатомии и хирургии» (СПбГМУ, 2007), на 4 международной конференции «Cancer therapeutics» (Канада, 2007), на 11 многодисциплинарной международной конференции по нейронауке и биологической психологии «стресс и поведение» (CПб, 2008), на 621 и 638 пленарных заседаниях Санкт-Петербургского научного общества судебных медиков (2008 и 2010), на межрегиональной научно-практической конференции «Судебно-медицинская диагностика алкоголь-ассоциированной смерти» (СПб, 2009).

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 323 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материал и методы исследования, результаты, обсуждение полученных результатов, заключение, выводы, список литературы, содержащего 243 источника (57 отечественных и 186 иностранных). Диссертация иллюстрирована 103 рисунками и 76 таблицами. 2 таблицы составляют приложения к диссертации.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал исследования. Для решения поставленных задач было проведено морфологическое изучение основных левосторонних отделов МДС - паранигрального ядра вентральнй области покрышки среднего мозга, компактной части черного вещества, прилежащего ядра и передней цингулярной коры человека и крыс - самок линии Вистар. Для сравнения количества измененных нейронов и нейроноглиального взаимоотношения в МДС у здорового человека, при отравлении этанолом и алкогольной абстиненции с этими же параметрами в формациях мозга, не относящихся к данной системе были исследованы слои III и V средней части постцентральной извилины (поле 1 - контроль). Экспериментальная часть работы проведена на базе вивария физиологического отдела НИИ экспериментальной медицины РАН. Головной мозг человека был исследован на базе ГУЗ «Бюро судебно-медицинской экспертизы» Санкт-Петербурга.

Всего было выполнено: 20 морфологических исследований головного мозга людей обоего пола в возрасте 24 - 45 лет, 98 морфологических исследований головного мозга крыс в возрасте от 0 суток до 17 мес. жизни, 82 половозрелые крысы подвергнуты функциональному тестированию.

Методы исследования.

Серия экспериментальных морфологических исследований основных отделов МДС.

1). Выполняли объемную реконструкцию основных левосторонних отделов МАЦДС (с использованием программы Reconstruct, Fiala G.С., 2005), а также изучали в этих отделах количественные и морфологические особенности нейронов, количество астроцитов и олигодендроцитов у интактных половозрелых крыс.

Головной мозг 6 крыс-самок в возрасте 7 мес. (180г) через 3 минуты после декапитации фиксировали в 9% растворе нейтрального формалина, проводили через спирты и заливали в парафин по стандартной методике приготовления гистологических препаратов (Меркулов Г.А., 1956). Производили ленточные серийные срезы головного мозга во фронтальной плоскости от лобного полюса левого полушария до рострального отдела моста. Шаг лезвия бритвы составлял 8 мкм, для последующей съемки на цифровой фотоаппарат Leica DFC290, Германия через микроскоп Leica DM2500, Германия - 3 мкм. Расстояние среза от лобного полюса полушария определялось по количеству серийных срезов. При подсчете учитывались дефектные срезы, не вошедшие в микропрепараты. Вычислялись средние арифметическое и квадратическое отклонение.

Объемная реконструкция основных отделов МАЦДС была составлена при микроскопии 87 фронтальных срезов головного мозга (выполнены через одинаковые промежутки), окрашенных гематоксилином и эозином. Отделы исследуемой системы были определены по цито-, миелоархитектоническим и топографическим особенностям в соотвествии с топографиеской картой головного мозга крысы (Paxinos G., 1986).

Количественные и морфометрические параметры клеток были определены в среднем и переднем отделах медиальной части паранигрального ядра ВОП и медиального края компактной части черного вещества (ЧВ) (13,3 и 12,2 мм от лобного полюса), в середине ПЯ (5,1 мм от лобного полюса) на территории обоих его частей (ядерной и скорлуповой) между передней мозговой спайкой и комплексом обонятельных ядер нижне-медиального края полушария (область проекции медиальных отделов паранигрального ядра и компактной части ЧВ), в слое VI 3 цингулярного поля (2,4 мм от лобного полюса) и слое III 2 цингулярного поля (на уровне измерений ПЯ). Срезы были окрашены крезиловым фиолетовым по методу Ниссля. Подсчет нейронов был произведен после их идентификации по классификации Жаботинского Ю.М. (1965) на неизмененные, гипохромные, сморщенные гиперхромные (пикноморфные) и теневидные. Подсчет нейронов и макроглиоцитов был произведен на площади 0,01 мм² со стороной квадрата 100 мкм в 5 срезах серии толщиной 3 мкм, состоящей из каждого пятого последовательного среза (групповое n=30). Подсчет клеток в ПЯ произведен на площади 5 квадратов, начиная от передней спайки мозга в одном срезе у каждого животного (групповое n=30). Учитывали клетки с различимыми ядрами. Были вычислены количество тел нейронов в 0,01 мм² (полотность) и объем неизмененных нейронов (по формуле объема эллипсоида).

GFAP в астроцитах был выявлен при помощи мышиных антител (клон GA5, разведение 1:250), набора “VECTASTAIN ABC”, CША (со вторичными биотинилированными антителами) и хромогена DAB. В срезах с окрашиванием GFAP и докрашенных гематоксилином Караци была определена плотность расположения астроцитов и олигодендроцитов (количество клеток в 0,01 мм²). Количество олигодендроцитов после подсчета суммарного количества макроглиоцитов в срезах, окрашенных по методу Ниссля, было определено как их разность с количеством астроцитов, выявленных на этой же площади в следующем срезе, окрашенном на GFAP. Среднее глиальное расстояние макроглиоцитв от тел нейронов (глиальное расстояние) было определено для всех учтенных нейронов на площади рR², где R=20 мкм, снаружи клеточной границы согласно (Богомолов Д.В., Пиголкин Ю.И. и Должанский О.В., 2001). Ошибка среднего арифметического количества нейронов, макроглиоцитов, объема нейронов, глиального расстояния (Х±S_x) была определена по методике Лакина Г.Ф. (1980) для малых выборок. Значимость различий средних определяли по критерию Стьюдента при р<0,05.

2). Изучали количество и морфологические изменения нейронов, количество макроглиоцитов мезоаккумбоцингулярной дофаминергической системы в раннем постнатальном онтогенезе у крыс. Задачей данного раздела исследования являлось также определение фаз программированной гибели нейронов МАЦДС развивающегося мозга и их сроки, а также роли нейроно-глиального взаимоотношения в регуляции этого процесса, представляющие собой эталон нормы, необходимый для сравнения с ним результатов различных воздействии на эту систему.

Количество и морфологические особенности нейронов и макроглиоцитов МАЦДС у 20 крысят-самок, рожденных интактными самками: новорожденных, на 5, 10 и 61 сутки развития (групповое n=25) были исследованы в тех же отделах системы и таким же образом, что и у интактных крыс в возрасте 7 мес. Дополнительно в этой части исследования и у взрослых интактных крыс был определен глиоцито-нейрональный индекс (как отношение количества перинейрональных сателлитов к количеству неизмененных нейронов). Перинейрональным сателлитом считался макроглиоцит, ядро которого находилось на расстоянии от тела неизмененного нейрона не более 2,5 мкм. Это расстояние было выбрано в силу того, что средний диаметр ядра олигодендроцита (наиболее частый вид сателлита) составляет 5 мкм, цитоплазма его очень узкая, слабо видима при окраске по методу Ниссля, и поэтому ядро практически прилежит к телу нейрона.

3). Изучали изменения количества и морфологических особенностей нейронов, количества макроглиоцитов МАЦДС в раннем постнатальном онтогенезе у крыс, рожденных самками, содержавшимися в условии хронической алкогольной интоксикации. Задачей данного раздела исследования являлось выявление степени повреждения нейронов и изменения нейроно-глиального взаимоотношения, важные для понимания врожденной алкогольной аддикции.

Были исследованы 20 крысят-самок, рожденные самками, содержащимися в условиях длительной алкогольной интоксикации. Последние в течение 5 мес., в период спаривания и беременности находились на сухом корме, в качестве единственного источника жидкости получали 15%-ный раствор этанола. Сроки, подотделы МАЦДС, методы исследования и приемы статистической обработки полученных результатов были аналогичны таковым в группе интактных крысят. Глиальное расстояние в данном разделе исследования не определялось.

4). Изучали количественные и морфологические изменения нейронов, количества макроглиоцитов МАЦДС при длительном воздействии 15%-го раствора этанола и после длительного перерыва. Задачей данного раздела исследования являлось выявление реактивных изменений нейронов и выраженности нейроно-глиального взаимоотношения, характерные для внеабстинентной алкогольной аддикции у крыс и их устойчивость.

Для определения микроморфологических параметров МАЦДС использовали 26 крыс-самок, которые были разделены на 3 группы. 1-ая группа состояла из 6 особей в возрасте 7 мес. (интактные). Крысам 2-ой группы (16 особей), находящимся на сухом корме, в качестве единственного источника жидкости предлагали 15%-ный раствор этанола. Длительность их алкоголизации составила 7 сут., 1, 3 и 5 мес. (по 4 особи в каждый срок), по истечении которых животных 7 сут. содержали на воде. Исключение периода абстиненции, во время которой содержание дофамина в структурах МДС падает (Rossetti Z. L., Hmaidan Y. аnd Gessa G. L., 1992) делало возможным получение параметров в условиях роста дофаминовой нагрузки на отделы данной системы, индуцированной длительным потреблением этанола (Анохина И.П., 2001; Николаев С.В., 2001; Шабанов П.Д., Лебедев А.А. и Мещеров Ш.К., 2002). Головной мозг крыс 3 группы (4 особи) исследовали после алкоголизации в течение 5 мес. и перерыва в 5 мес. (когда животных переводили на воду) с целью определения устойчивости измененных параметров.

Исследование МАЦДС крыс и оценка достоверности полученных результатов были осуществлены аналогичным способом, как и в группе интактных половозрелых крыс.

5). Изучали количественные и морфологические изменения нейронов МАЦДС при первичном быстро и медленно развивающимся отравлении этанолом. Задачей данного раздела исследования являлось получение дифференциальных признаков изменений нейронов при данных вариантах острого воздействия этанола, способствующих разрешению противоречий во мнениях о морфологических признаках острого алкогольного отравления.

Были исследованы 2 группы половозрелых крыс (7 мес.). Крысам 1 группы (4 особи) принудительно через зонд внутрь желудка вводили 15% раствор этанола по 3 мл каждый час, визуально оценивая поведение, позу, дыхание, сердцебиение, изменение цвета кожи до регистрации смерти через 9 часов. Крысам 2 группы (4 особи) однократно через зонд внутрь желудка вводили 25 мл 30% раствора этанола и регистрировали наступление смерти через 0,5 - 1 час.

Исследовали морфологические изменения нейронов в переднем медиальном отделе ВОП. В качестве контроля был использован слой V 1 теменного поля (Par 1, bregma -0,8), определенное по атласу Рaxinos G. (1986). Он не относится к МДС, поскольку не содержит дофаминергических окончаний. Норадренергические окончания в нем малочисленны (Bjorklund A., Lindvall O., 1984).

Данные отделы мозга были получены, зафиксированы, проведены через спирты, залиты в парафин аналогичным способом, как и в группе интактных половозрелых крыс. Таким же образом были получены и окрашены гистологические срезы ВОП и Par 1 (групповое n = 20). В срезах были визуально оценены морфологические изменения нейронов, а также морфометрические изменения среднего диаметра их клеточных тел (косого, продольного и поперечного). Для сопоставления изменения этого параметра с нормой, средний диаметр был определен в аналогичных структурах взрослых интактных крыс (6 особей, групповое n = 30). Достоверность полученных результатов была оценена тем же способом, что и у взрослых крыс.

6). Определяли количественные и морфологические изменения нейронов, изменения количества глиоцитов МАЦДС при перинатальном воздействии морфина у крыс. Задача данного раздела работы состояла в определении дифференциальных морфологических признаков длительного влияния на МДС этанола и опиатов. Пластические способности нейронов при длительном воздействии на МАЦДС морфина были изучены на модели позднего пренатального и раннего однократного введения морфина в организм плодов и новорожденных, тормозящего постнатальное развитие МДС (Hu Z., Cooper M., Crockett D.P. et al., 2004; Deng D.R., Djalai S., Holtje M. еt al., 2007).

Под эфирным наркозом крысам-самкам (n = 4) линии Wistar на 17 сутки после оплодотворения внутрь амниона плодов, а также крысятам на 4 сутки после рождения (n = 4) внутрибрюшинно вводили 10 мкл 1% раствора морфина гидрохлорида. Контрольным животным (n = 8) аналогичным образом в том же объеме вводили асептический 0,9% раствор хлорида натрия. Через 3 мес. от начала опыта экспериментальных и контрольных крыс декапитировали. Нейроны и макроглиоциты (групповое n в эксперименте = 20, в контроле = 40) были исследованы способом, аналогичным для интактных половозрелых крыс. Дополнительно было сосчитано количество микроглиоцитов и количество фагоцитируемых нейронов (в 0,01 мм²).

7). Определяли отсроченные количественные и морфологические изменения нейронов, изменения количества глиоцитов основных отделов МДС при раннем постнатальном воздействии гормонов стресса и атистресса у крыс. В задачу также входило определение пластической способности и особенностей повреждения нейронов МДС при длительном экспериментальном стрессе в период синаптогенеза системы.

Крысятам в возрасте 4 суток жизни внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мкг/крысу КЛ (Sigma, США) или 5 мкг/крысу БТШ-70 кДа (Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург).

Морфологическая оценка нейронов и макроглиоцитов была осуществлена способом, аналогичным для интактных половозрелых крыс. Для проверки предполагаемой роли избыточной катехоламиновой медиации в повреждении нейронов МДС, был аналогичным способом исследован дофаминоцептивный III слой заднего (гранулярного) цингулярного поля позади валика мозолистого тела (CgG - контроль). Раздельного подсчета олигодендроцитов и астроцитов не велось. Результаты воздействия были сопоставлены с данными у интактных половозрелых крыс.

Серия функциональных экспериментов.

1). Определяли уровень врожденной алкогольной зависимости, зависимости при хронической алкогольной интоксикации и после ее отмены у крыс. Задачей данного раздела работы являлось выявление фактической связи выявленных морфологических признаков внеабстинентной и врожденной алкогольной зависимости и ее степень в функциональном тесте.

Степень алкогольной зависимости определяли в двухпоилочном тесте (в одной поилке была вода, в другой - 15% раствор этанола), используемом для определения уровня аддикции в физиологическом отделе СПб НИИ экспериментальной медицины РАН (Николаев С.В., 2001). О степени зависимости судили по индексу предпочтения этанола. Он был вычислен как отношение объема употребленного этанола к объему употребленной воды в течение 3 суток.

Для определения исходного уровня алкогольной зависимости (серия 1) индекс предпочтения этанола был вычислен у крыс-самок в возрасте 7 мес., исследованных в условии нормы (10 особей).

Для определения алкогольной зависимости между периодами абстиненции (серия 2) этот индекс был определен у 24 самок. Животных подвергали алкоголизации длительностью 7 сут., 1, 3 и 5 мес. (по схеме морфологического эксперимента №№ 3 и 4), затем 7 сут. содержались на воде, после чего в течение 3 суток измеряли объемы вывитой ими воды и раствора этанола (по 6 в каждый срок). Интервал отмены этанола длительностью 7 суток (во время которого животных переводили на воду) исключал активации дофаминовой системы и предполагаемый рост зависимости в периоде абстиненции.

Для определения устойчивости алкогольной зависимости (серия 3) индекс определяли в течение 3 суток после 5 месячной алкоголизации и 5 месяцев перерыва (6 особей).

Для определения врожденной алкогольной зависимости (серия 4) индекс предпочтения этанола был вычислен у 6 крыс в возрасте 2 мес., рожденных от самок, длительно потреблявших 15% раствор этанола (по схеме морфологического эксперимента №№ 3 и 4) и у 10 крыс, рожденных от интактных самок.

2). Определяли эмоциональное поведение при воздействии гормонов стресса и антистресса в раннем онтогенезе у крыс. Задачей данного раздела работы являлось выявление фактической связи выявленных пластических и дегенеративных изменений нейронов развивающихся основных отделов МДС с изменениями эмоционального поведения.

Опыты выполнены на 40 крысах-самках в возрасте 4 мес., выращенных в группе по 5 особей в стандартных пластмассовых клетках в условиях вивария. Все животные были разделены на 3 группы. Крысятам 1 группы в возрасте 4 сут. жизни внутрибрюшинно однократно вводили 0,5 мкг/крысу КЛ (Sigma, США). Крысятам 2 группы на 4 сут. жизни вводили 5 мкг/крысу БТШ-70кДа (Институт Цитологии РАН, Санкт-Петербург). Крысята 3 группы были интактными.

Уровень свободной двигательной активности и тревожности определяли в тесте «открытое поле» и приподнятом крестообразном лабиринте (методика, использованная Шабановым П.Д., Лебедевым А.А. и Мещеровым Ш.К., 2002).

«Открытое поле» представляет собой круглую площадку диаметром 80 см и с 16 отверстиями (норками) диаметром 3 см каждая. Продолжительность опута составляла 3 мин. Регистировали число горизонтальных и вертикальных движений, заглядываний в норки.

Крестообразный лабиринт состоял из двух открытых рукавов 50х10 см и двух закрятых рукавов 50х10 см с открытым верхом, расположенных перпендикулярно друг относительно друга. Высота над полом - 1м. Животное помещали в центр лабиринта. Путем нажатия соответствующей клавиши этографа, связанного с компьютером, фиксировали время пребывания в закрытых и открытых рукавах, число свешиваний с платформы лабиринта.

В группах тестируемых животных среднее арифметическое и стандартная ошибка среднего (Х±S_x) были определены по методике Лакина Г.Ф. (1980) для малых выборок. Значимость различий средних определяли по критерию Стьюдента при Р<0,05.

Морфологическое исследование МАЦДС взрослых людей.

1). Выявляли количественные и морфологические изменения нейронов, изменения количества макроглиоцитов в слое III поля 1, содержащем небольшое количество дофаминергических окончаний (низкодофаминоцептивном) и слое V поля 1, лишенном этих окончаний (недофаминоцептивном) при отравлении этанолом, алкогольной абстиненции и хронической алкогольной интоксикации у человека. Задача этого раздела работы состояла в выяснении механизма морфологических изменений нейронов, а также степени участия в нем нейроноглиального взаимоотношения в данном отделе головного мозга, который не относится к МДС, но чаще всего используется как стандарт в судебно-медицинской диагностике отравлений (Исаков В.Д. и соавт., 2005).

Гистологически были исследованы средняя часть слоя III и слой V постцентральной извилины (поля 1 Бродмана) из области середины расстояния между верхним краем и латеральной бороздой полушария у 4-х групп людей обоего пола (n=20) в возрасте 24 - 45 лет.

Условную норму (n=5) составили умершие вследствие сочетанной травмы и кататравмы при дорожно-транспортном происшествии. Макро- и микроскопические признаки повреждения костей черепа, кровоизлияния в головной мозг, а также признаки алкогольной, опиатной интоксикаций, иные патологические изменения внутренних органов отсутствовали. Вторую группу (n=5) объединил судебно-медицинский диагноз «отравление этанолом» и признаки алкогольной болезни (стеатоз печени, алкогольная кардиомиопатия и энцефалопатия), подтвержденные судебно-гистологическим исследованием. Исследование головного мозга с признаками глубокой алкогольной патологии внутренних органов (алкогольный гепатит, цирроз печени, печеночная энцефалопатия) не проводилось. Третью группу (n=5) объединил судебно-медицинский диагноз «алкогольная кардиомиопатия» и аналогичные признаки алкогольной болезни. В эту группу вошли только те судебно-медицинские объекты, в моче которых определено остаточное количество этанола, то есть предполагалась алкогольная абстиненция. Четвертую группу (n=5) объединила смерть от последствий травм и отравлений в стационаре более, чем через 7 суток после поступления и аналогичные признаки алкогольной болезни. Поскольку 7 суток перерыва в употреблении алкоголя на ранних этапах алкогольной болезни составляет максимальную продолжительность алкогольного абстинентного синдрома (Афанасьев В.В., Рубитель Л.Т. и Афанасьев А.В., 2002), изменения нейронов и макроглиоцитов в коре головного мозга этой группы объектов характеризуют состояние хронической алкогольной интоксикации «в чистом виде». нейрон этанол мезокортиколимбический

Участки головного мозга, вырезанные при аутопсии не позже, чем через 12 часов с момента наступления смерти. Изготовление срезов, подсчет нейронов (неизмененных, гипохромных, пикноморфных и теневидных) и макроглиоцитов на площади 0,25 мм² - в 4 последовательных квадратах со стороной 250 мкм (групповое n = 5) и статистическая обработка данных были произведены способом, аналогичным для интактных крыс.

2). Определяли количество и морфологические особенности нейронов, количество макроглиоцитов во взаимосвязанных отделах МАЦДС человека в условии нормы. Задача данного раздела работы состояла в определении количественной характеристики нейронов и макроглиоцитов, структурных особенностей нейронов и выявлении степени нейроно-глиального взаимоотношения в основных подотделах МАЦДС человека, аналогичных установленным подотделам у крыс, представляющие собой эталон нормы. В задачу данного раздела входило также сравнение количественных особенностей нейронов, макроглиоцитов и нейроно-глиального взаимоотношения в слоях III и V поля 1, лишенных дофминергических окончаний и с их низким количеством. Результаты исследования подотделов МАЦДС человека и крысы были сопоставлены между собой.

3). Изучали реактивные изменения нейронов, степень выраженности нейроно-глиальных взаимоотношений, выясняли механизмы алкогольной абстинентной зависимости у человека.

При этом были исследованы левосторонние взаимосвязанные подотделы МАЦДС человека у групп людей, умерших от отравления этанолом и в состоянии алкогольной абстиненции, выделенных в исследовании 1. Способ исследования и методика статистической обработки были также аналогичными. Для выяснения наиболее вероятной доли участия нейронотоксических факторов в генезе алкогольного повреждения нейронов МДС (выброс катехоламинов, функциональное напряжение ядер, этанол) и степени их восстановления при алкогольной абстиненции были исследованы слои III и V поля 1, лишенные дофминергических окончаний и с их низким количеством.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Установление подотделов МДС, представляющих собой (по количественным и морфологическим особенностям нейронов, количеству макроглиоцитов и напряженности нейроно-глиальных взаимоотношений) эталон нормы для интактных крыс и человека.

Иммуноцитохимическими и авторадиографическими методами у крыс были выявлены проекционные связи аксонов медиального отдела паранигрального ядра ВОП с медиальной частью ПЯ и слоем VI передней цингулярной коры - Сg3, а также медиального отдела компактной части ЧВ с медиальной частью ПЯ и слоем III супрагенуальной цингулярной коры -Cg2 (Bjorklund A., Lindvall O., 1984; Oads R.S., Halliday G.M., 1987). У человека слоя III поля 24б (дофаминоцептивного) и медиальной части ПЯ достигают все аксоны нейронов медиальной части паранигрального ядра и около 25% нейронов переднего медиального отдела компактной части ЧВ (Porrino L.J., Goldman-Rakic P.C., 1982; Oads R.S., Halliday G.M., 1987).

В настоящем исследовании установлено, что в переднем и среднем отделах медиальной части паранигрального ядра у крысы численная плотность нейронов, их объем и количество астроцитов значительно не различались (р>0,05). Меньшее количество олигодендроцитов в его переднем отделе (р<0,05) может обусловить более низкую устойчивость нейронов этой части ВОП к повреждению, поскольку известна способность данного вида глиоцитов передавать нейронам РНК, аминокислоты и трофические факторы (Певзнер Л.З., 1972; Hyden H., 1967; Dai X. et al., 2003; Wilkins A. et al., 2003).

Через передний отдел паранигрального ядра проходит медиальный пучок переднего мозга - МПП (Paxinos G., 1986). В срезах этой части ядра мы наблюдали цепочки клеток, вытянутые тела нейронов и основания их отростков, ориентированные параллельно этому пучку. Известно, что аксоны норадренергических нейронов глубоватого места образуют синапсы на нейронах этой части ВОП (Steward O., 2000). Избыточное количество норадреналина и дофамина обладает нейронотоксическим действием. О повреждении нейронов при накоплении в отделах головного мозга катехоламинов известно из работ Аничкова С.В. (1984), Анохиной И.П. и соавт. (2001). Увеличение количества светлых нейронов с небольшим количеством поврежденных органелл и пикноморфных клеток обнаружено при повышении концентрации норадреналина в палеоамигдале на стадии проэструс (Ахмадеев А.В., 2009). Можно предположить, что избыточное высвобождение катехоламинов, выявленное методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, в проекционных отделах МДС при стрессе и интоксикациях (Нуманд Л.Б., Оттер М.Я., 1083; Афанасьев В.В. и соавт., 2002; Wise R.A., Rompre P.P., 1989; McBride W.J. et al., 1990; Koob G.F., 1992), происходит и в синапсах передней медиальной части паранигрального ядра ВОП, где оно способно вызывать наиболее выраженные морфологические изменения, чем в остальных отделах этого ядра и других ядрах комплекса ВОП. Переднемедиальный отдел паранигрального ядра имеет наибольшую диагностическую ценность при морфологической оценке различных воздействий еще и потому, что его латеральная часть содержит наибольшее количество светлых нейронов (недофаминергических по Oads R.S., Halliday G.M., 1987), а тела нейронов остальных ядерных групп ВОП имеют малые размеры.

Передний отдел компактной части ЧВ характеризует свойства МАЦДС в наибольшей степени, поскольку он имеет наибольшие объем (рис. 1) и численную плотность нейронов (р<0,05) при близких значениях их объема и количества олигодендроцитов спереди и посередине. Практически полное отсутствие в нем астроцитов может характеризовать недостаточность гематоэнцефалического барьера и. следовательно, большую устойчивость этого отдела ЧВ к повреждению. Переднемедиальные подотделы паранигрального ядра ВОП и компактной части ЧВ могут быть изучены в одинаковых фронтальных плоскостях на уровне 12,2±0,1мм от лобного полюса.

Медиальная часть ПЯ наибольший объем (и, следовательно, количество нейронов) имеет в центральной части ядра (5,1±0,1мм от лобного полюса) на уровне передней части супрагенуального цингулярного поля (Cg2). Слой VI прегенуального цингулярного поля (Сg3) наиболее близок к МПП. На уровне основания передних щипцов (2,4±0,1мм от лобного полюса) численная плотность его нейронов и астроцитов превосходит их удельное количество в остальных отделах МДС, что может означать максимальную концентрацию рецепторов к дофамину.

У интактных крыс в установленных подотделах МАЦДС гипохромные, пикноморфные и теневидные нейроны были единичными (табл. 1). Их происхождение не вполне понятно. Напряженность нейроно-глиального взаимоотношения в дофаминергических ядрах оказалась больше, чем в дофаминоцептивных слоях лимбической коры: глиоцито-нейрональный индекс в ядрах был меньше, а глиальное расстояние - больше, чем в коре (р<0,05).

В подотделах МАЦДС человека, аналогичных установленным у крысы, количество патологически измененных нейронов было значительно большим (см. табл. 1). Доля теневидных нейронов и доля их фагоцитоза уменьшаются с увеличением расстояния от паранигрального ядра ВОП.

Доля гипохромных нейронов в проекционных отделах МДС убывает с увеличением расстояния от ПЯ. Доля пикноморфных нейронов в паранигральном ядре ВОП больше, чем в ПЯ, слоях поля 1 и в ЧВ. Степень выраженности нейроно-глиального взаимоотношения в дофаминергических ядрах у человека, как и у интактных крыс значительно больше, чем в проекционных отделах МДС и не относящихся к системе слоях поля 1.

Таблица 1

Долевое соотношение нейронов в установленных отделах МДС и в соматосенсорной коре у здоровых людей на площади 0,25 мм² (Х±S_x; n=5) и интактных крыс на площади 0,01 мм² (Х±S_x; n=30).

* - различие при сравнении с показателем у крыс значимы (р<0,05); ** - различие при сравнении с показателем в паранигральном ядре ВОП значимы (р<0,05); *** - различие при сравнении с показателем в паранигральном ядре ВОП значимы (р<0,05); **** - различие при сравнении с показателем в ЧВ, ПЯ и поле 24б значимы (р<0,05); ***** - различие при сравнении с показателем в паранигральном ядре ВОП, ПЯ и поле 24б значимы (р<0,05)

2. Определение фаз и сроков программированной гибели нейронов МАЦДС, сроков появления GFAP⁺ астроцитов и роли нейроно-глиальных взаимоотношений в регуляции дифференцировки нейронов.