Иммунобиологические свойства термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе взаимодействия "патоген–хозяин"

Из 17 культур энтеробактеров, продуцирующих LT-энтеротоксин, 13 штаммов оказались плазмидонесущими. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно - кишечной патологией, в 2 с урологической патологией, в 3 - гнойно-воспалительными процессами. Среди штаммов Enterobacter spp., выделенных от здоровых людей, LT-энтеротоксин продуцирующих штаммов не оказалось.

В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование штаммов Enterobacter spp., продуцирующих LТ-энтеротоксин, на предмет обнаружения внехромосомных факторов наследственности. Для этого были выделены 2 группы штаммов: первую группу составили штаммы Enterobacter spp., суперпродуценты LT-энтеротоксина, способные вызывать “отек лап” мышей с разницей между контрольной лапкой 95 мг и более, вторую - культуры, не продуцирующие LT-энтеротоксин и дающие в опытах “отек лапки” разницу не более 35 мг. Все изученные 12 штаммов первой группы являлись носителями плазмиды мол.м. 60 МД. Среди 3 штаммов второй группы 2 культуры были бесплазмидными и 1 штамм нес плазмиды с мол.м.120; 38; 3,2 МД.

Элиминирование плазмид у штаммов, продуцирующих LT-энтеротоксин, показало, что бесплазмидные изогенные пары токсигенных штаммов не вызывали гибель P.caudatum.

Из 10 отобранных клонов каждого штамма Enterobacter spp., утративших свойство продуцировать LT-энтеротоксин, у двух на фореграмме просматривалась плазмида мол.м. 60 МД, остальные клоны оказались не несущими данной плазмиды и в биологических пробах не обладали активностью.

Опыты по фенотипическому определению гемолитической активности Enterobacter spp. указывают на то, что гемолизины являются одним из ведущих факторов патогенности клинических штаммов Enterobacter spp. В связи с этим было проведено электрофоретическое исследование гемолитически активных штаммов Enterobacter spp. для обнаружения природы детерминант.

Из 35 культур Enterobacter spp., способных гемолизировать эритроциты, 21 (60%) несли плазмиду мол.м. 120 МД. В 8 случаях плазмидонесущие штаммы были выделены от больных с желудочно-кишечной патологией, в 5 - урологической патологией, в 6 - гнойно-воспалительными процессами и в 2 - здоровых людей. Различия в частоте обнаружения указанных плазмид относительно контроля носили статистически не значимый характер (р>0,05).

Полученные результаты, таким образом, говорили в пользу плазмидной природы детерминирования гемолитической активности штаммов Enterobacter spp. Существование бесплазмидных вариантов гемолитических энтеробактеров не исключало этого предположения, так как при этом на результатах могло сказаться небольшое число копий этих плазмид, которые не обнаруживались исследуемым методом.

Для проверки этой рабочей гипотезы путем обработки акридиновым оранжевым были получены 2 генетически родственные изогенные пары штаммов Enterobacter spp., различающихся по наличию плазмиды с молекулярной массой 120 МД. При этом клоны 2 штаммов не продуцировали ?гемолизин, а клоны 2 штаммов - продолжали его продуцировать.

Эти данные, по нашему мнению, свидетельствуют в пользу хромосомной природы детерминирования указанного признака. Установление этого факта представляется существенным и, по нашему мнению, заслуживает самостоятельного изучения.

Проведенные нами опыты по изучению профиля плазмидной ДНК, элиминации и конъюгативной передачи плазмид не привели к выявлению новых плазмид, контролирующих синтез энтерогемолизина, ДНК-азную, лецитиназную, антилизоцимную и антиинтерфероновую активности клинических штаммов Enterobacter spp.

Следует отметить, что сила влияния экологического фактора во всех исследованиях была низкой и варьировала от 1 до 2,5 % (р>0,05).

Таким образом, результаты изучения плазмидного профиля дают основание полагать, что генетической детерминантой адгезивной активности бактерий рода Enterobacter, возможно, являются структурные элементы хромосомной природы, продукции LT-энтеротоксина ? плазмида мол.м. 60 МД, ?гемолизина - 120 МД.

Наличие у ряда клинических штаммов Enterobacter spp. генетических детерминант, контролирующих факторы патогенности, свидетельствует о том, что среди культур Enterobacter spp. встречаются штаммы, которые следует рассматривать не как условно-патогенные, а как конкретные патовары бактерий рода Enterobacter.

Учитывая, что штаммы легко могут терять плазмиду с утратой, соответственно, фенотипического признака, мы провели серию опытов по их конъюгативной передаче от доноров реципиентам. Причем реципиентами были представители как одного рода, так и других, в том числе был использован универсальный реципиент E.coli K12 G62 Rif. В качестве доноров служили штаммы Enterobacter spp., имеющие плазмиды мол.м.м. 60 и 120 МД с выраженными фенотипическими признаками синтезировать высокоактивный LT-энтеротоксин и -гемолизин, соответственно. Опыты по скрещиванию родственных и неродственных представителей Enterobacteriaceae показали, что tox+ плазмида Enterobacter spp. может конъюгативно передаваться внутри рода Enterobacter, что объясняет трансформацию нетоксигенного реципиента в токсигенный патовар. Тогда как опыты по конъюгативной передаче tox+ плазмиды между неродственными представителями Enterobacteriaceae не увенчались успехом. Hly+ плазмида конъюгативно не перемещалась между штаммами, и это, на наш взгляд, может быть обусловлено большой мол.м. плазмиды (120 МД) или сложностью создания соответствующих условий для “интимных” процессов, либо же она является неконъюгативной.

Среди методов диагностики инфекционных заболеваний в последнее время все шире используется детекция генетических маркеров, ассоциируемых с патогенностью, к которым, в частности, относятся «островки патогенности».

В этой связи нами проведена амплификация с бактериальной ДНК Enterobacter spp. с праймерами к генам “островков патогенности” E.coli, контролирующими их способность к образованию фимбрий типа S (sfaA, sfaG), типа Р (рарС, рарАН), капсулообразованию (kpsMT), продукции гемолизинов (hlуА, hlуВ) и термолабильного энтеротоксина (Lth).

Удалось установить факт наличия у протестированных микроорганизмов фрагментов ДНК, специфичных известным генам кластеров патогенности E.coli. В частности, из 34 исследованных штаммов образование искомых ампликонов при использовании праймеров к hly A имело место в 7 случаях (20,5%), hly B - в 8 (23,5%) , pap AH - в 4 (11,8%), pap C - в 5 (14,7%) случаях, sfa G и sfa A обнаружены у 2 (5,9%) и 8 (23,6%) штаммов соответственно (рис.5). Фрагменты, специфичные генам kps MT и Lth, обнаружены не были.

Рис.5. Частота обнаружения по результатам ПЦР фрагментов генов «островков патогенности» у клинических штаммов Enterobacter spp. (%)

Результаты исследования показали, что количество обнаруженных генов у штаммов, выделенных при желудочно-кишечной патологии, относительно здоровых людей составляет - 9 (ч2=4,38; р=0,04), у штаммов, изолированных при урологической патологии, - 7 (ч2=2,92; р=0,09), а у штаммов, выделенных при гнойно-воспалительных процессах, - 10 (ч2=7,64; р=0,01), т.е. имеются различия по источникам выделения в генах «островков патогенности».

Среди штаммов Enterobacter spp., изолированных от здоровых людей, встречались гены, специфичные только hlyA, hlyВ, papC и и sfaA.

Таким образом, среди штаммов Enterobacter spp., вне зависимости от источника их выделения, обнаруживаются гены hlyA, hlyB, papAH, papC, sfaG и sfaA. Это указывает на то, что между патогенными и непатогенными микроорганизмами постоянно осуществляется генетический обмен благодаря трансформации, трансдукции и конъюгации. Полученные результаты исследования дают основание полагать, что штаммы, относящиеся к разным видам и даже родам, содержат гены, кодирующие их токсигенность и вирулентность, фланкированные в состав кластеров “островков патогенности”. Это указывает на универсальный тип кодирования факторов патогенности и, соответственно, на схожий механизм развития патогенеза инфекционного процесса, обусловленного разными патоварами УПЭ.

Резюмируя выше изложенное, можно констатировать, что фенотипические признаки ряда факторов патогенности и наличие генетических детерминант, входящих в состав общих “островков патогенности”, позволяет клинические штаммы Enterobacter spp. рассматривать как конкретные патовары. Их богатый патогенный потенциал дает возможность Enterobacter spp. выживать в экологической нише, прикрепляться и колонизировать эпителиальные поверхности, способствуя противостоянию механизмам поддержания гомеостаза хозяина.

Изучение фенотипических проявлений факторов патогенности, экспрессируемых генетическими детерминантами хромосомной и нехромосомной природы, конечно, не исчерпывает всех аспектов, связанных с механизмами их патогенного действия, и констатирует факт только их этиологической значимости.

Как известно, возбудитель инфекционного процесса отличается значительной сложностью и неспецифичностью, что определяет многообразие клинических проявлений. Выяснение этих вопросов позволит определить наиболее уязвимые звенья иммунной системы хозяина и, возможно, связать их с локальными особенностями в цепи патогенеза заболевания и разработать наиболее рациональный этиопатогенетический принцип лечения инфекционных болезней и профилактики дизбиотических состояний, связываемых с УПЭ.

В качестве модели для изучения закономерностей функционирования системы “хозяин-патоген” мы использовали штамм E.cloacae №258, депонированный нами в ФГУН ГНИИСК имени Л.А. Тарасевича, обладающий продукцией термолабильного энтеротоксина. Выбор энтеротоксигенного штамма E.cloacae был обусловлен тем, что в патогенезе инфекционных заболеваний, вызванных УПЭ, ведущим фактором является его токсин.

Для выявления и характеристики дифференциального действия LT- энтеротоксина E.cloacae на клетки хозяина в инфекционном процессе был использован и липополисахарид клеточной стенки, который, наряду с термолабильным энтеротоксином, является мощным, но отличным по своей антигенной структуре иммуномодулятором.

Как известно, фагоцитоз является эффективным фактором специфической защиты организма.

Поэтому нами проведены исследования фагоцитарного звена иммунитета, позволившие констатировать факт нарушения функции макрофагов, которое сопровождалось снижением активности и интенсивности фагоцитоза в экспериментальных группах.

Результаты представлены на рис. 6.



Рис.6. Показатели активности (%) и интенсивности (усл.ед.) фагоцитоза перитонеальных макрофагов мышей в динамике

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Процесс фагоцитоза сопровождается активацией лизосомальных ферментов. Результаты наших исследований показали, что в I группе мышей, зараженной супернатантом токсигенной культуры E.cloacae, содержащей LT-энтеротоксин, прослеживается своеобразная динамика. Максимальная активация лизосомальных гранул происходит в 1 день, а быстрое “опустошение” ферментов лизосом - на 3 день исследования. Результаты отражены на рис.7.



Рис.7. Состояние лизосомальной активности перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (усл.ед.)

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Как видно, термолабильный энтеротоксин E.cloacae уменьшает число лизосом в перитонеальных макрофагах, что приводит к снижению их переваривающей способности.

Фагоцитоз сопряжен с наработкой активных форм кислорода (АФК) с последующим внутриклеточным киллингом патогена (А.А. Тотолян и др., 2000; И.И. Долгушин, О.В. Бухарин, 2001; Н.С. Олиферук и др., 2005). Наиболее доступным и часто используемым подходом для оценки активности кислородзависимых систем бактерицидности фагоцитов является НСТ? тест (спонтанный и индуцированный).

Так, исследование О2 - зависимого метаболизма фагоцитов в динамике показало активацию генерации АФК в 1 день и резкое снижение количества образования супероксиданиона в последующие дни исследования, особенно в клетках мышей I и III групп.

Показатели индуцированного латексом НСТ отражают резервные возможности фагоцитов к усиленной продукции АФК.

Установлено, что искусственная активация латексом приводит к снижению восстановления НСТ в клетках мышей, контактировавших с LT - энтеротоксином. Учитывая полученные результаты, можем констатировать факт о предельных возможностях работы ГМФШ-клеток под действием токсина, что, по-видимому, отражает недостаточность антиоксидантной системы фагоцитов, поскольку показатели количества образования свободных радикалов без индукции были намного выше. Близкие результаты были получены в работах Н.С. Олиферук и др. (2005), Ю.Н. Гончарук и др. (2006), Л.М. Сомовой и др. (2006). Результаты отражены в табл. 2.

Таблица 2. Динамика НСТ-редуцирующей способности перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (М±m)

Показатели	Группа животных (n=25)	Сроки исследования, сутки
		1 - е	3 - и	5 - е	15 - е
Спонтанная НСТ-активность в %	I	52,28±1,0*	51,68±1,618*	47,56±0,95*	39,92±0,54*
	II	40,76±1,14*	39,44±0,82*	35,16±0,20	37,92±0,98*
	III	55,32±0,69*	30,64±1,04*	33,16±1,05*	26,32±0,49*
	Контроль	36,20±0,25*	36,40±0,25*	35,88±0,33*	33,44±1,85*
Индуцированная НСТ-ак тивность в %	I	64,60±2,03*	53,76±0,78*	42,44±0,62*	45,44±0,22*
	II	58,60±2,13*	52,44±0,49*	50,04±1,08	45,76±0,28*
	III	46,60±0,61*	45,76±0,77*	44,36±0,62*	42,32±0,44
	Контроль	53,04±0,28	41,52±1,19	49,08±1,23	40,80 ±0,36

*-различия статистически достоверны в сравнении с группой контрольных животных ( р<0,05)

Таким образом, у мышей, инфицированных LT-энтеротоксином E.cloacae, нарушалась способность перитонеальных макрофагов к восстановлению НСТ, что отражает дефекты кислородзависимых механизмов бактерицидности.

Исход фагоцитарной реакции, где участвуют фагоциты и бактерийные патогены, далеко не всегда заканчивается в пользу фагоцита. В ряде ситуаций микробной клетке удается, несмотря на ее поглощение фагоцитом, избежать последующего киллинга, что связано с различными приемами, выработанными патогеном в процессе микроэволюции. Как показывают приведенные данные, важным инструментом такой защиты от фагоцитов является LT-энтеротоксин E.cloacae.

Заключительным этапом функции антигенпредставляющих клеток является представление и определение направленности иммунного ответа (А.А. Тотолян и др., 2000; С.Н. Теплова и др., 2002; А.П. Топтыгина, 2008).

Исследования показали, что в селезенке I и III группы мышей выработка антителообразующих клеток (АОК) снижается, что может зависеть от подавления антигенпроцессинговой и антигенпрезентирующей функций фагоцитов на этапе фагоцитарного звена иммунитета. Различия с контролем в группе экспериментальных животных были статистически значимы (р<0,001). Результаты представлены на рис. 8.



Рис. 8. Антигенпредставляющая функция перитонеальных макрофагов мышей в разные сроки исследования (АОК•102в селезенке)

*-данные статистически достоверны по q-критерию Ньюмена-Кейлса при р<0,05

Данный факт послужил основанием к расшифровке механизма иммунной супрессии и проведению дальнейших опытов, характеризующих Т- и В- звено иммунитета.

Важнейшим показателем влияния стимулирующего агента на иммунную систему является пролиферативная активность лимфоцитов.

В результате проведенных исследований установлено, что LT-энтеротоксин E.cloacae обладает трансформирующим эффектом на Т-лимфоциты мышей. Следует отметить, что спонтанная пролиферативная активность лимфоцитов была выше, чем при стимуляции ФГА и КонА. Результаты отражены на рис. 9 и 10.



Рис. 9. Индуцированная митогенами (КонА, ФГА) пролиферативная активность Т-лимфоцитов мышей в динамике (%)

* р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Рис.10. Спонтанная пролиферативная активность Т-лимфоцитов мышей в динамике (%)

* р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Как видно из рисунка, LT-энтеротоксин E.cloacae стимулирует митотическую активность Т-лимфоцитов, подтверждением чему явились показатели индекса стимуляции.

Гуморальный иммунный ответ является специфической Th-2-зависимой формой реакции на внедрение чужеродных антигенов. Эффекторное звено такого отклика - это антигенспецифичные иммуноглобулины (А.П. Топтыгина, 2008).

Иммунный ответ организма имеет некоторые отличия, когда в роли патогена выступают внеклеточные или внутриклеточные паразиты. Поскольку ведущая роль в антиинфекционной защите организма от внеклеточной группы паразитов преимущественно принадлежит нейтрофилам, иммуноглобулинам и комплементу, в то время как в элиминации вторых - решающую роль играют Т-лимфоциты и макрофаги, хотя механизмы межклеточных коопераций в обоих случаях тесно взаимосвязаны друг с другом.

В связи с этим нами были проведены серии опытов по определению числа антителообразующих клеток к эритроцитам барана в селезенке, характеризующих гуморальный иммунный ответ хозяина.

Результаты исследований представлены на рис.11.

Рис.11. Динамика количества АОК-ЭБ в селезенке мышей (АОК•102 в селезенке), усл.ед

*р<0,001по q-критерию Ньюмена-Кейлса;

**р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Как видно из рис.11, оценка В-звена иммунитета свидетельствует о снижении количества АОК в селезенке экспериментальных животных. Наиболее низкие показатели АОК отмечаются в I группе животных, зараженных LТ-энтеротоксином E.cloacae.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать вывод о том, что LТ-энтертоксин E. сloacae угнетает иммунный ответ мышей на ЭБ.

Кроме микробицидной и цитотоксической функции генерация супероксиданионрадикала способствует и иммунорегуляторному действию активированных фагоцитов, в частности, секреции цитокинов. Было установлено, что супероксидный анионрадикал участвует в выработке хемотаксических пептидов и индукции синтеза IL-1-подобного фактора (H.Schmidt et al., 2004), этому также свидетельствует большой спектр секретируемых макрофагами интерлейкинов, имеющих отношение к регуляции иммунного ответа (И.В. Дуда и др., 1978; С.А. Кетлинский и др., 1995; М.И. Карсонова и др., 2007). Функциональная активность цитокинов определяет направление дифференцировки T - клеток в Th1/Tc1, Th2/Tc2 тип, а также определяет класс иммуноглобулинов, на продукцию которого переключаются В-клетки (И.Н. Швыдченко и др., 2005).

В связи с этим было изучено влияние LT-энтеротоксина E. cloacae на уровень провоспалительных цитокинов (IL-6, IL-12, IFN-, TNF-), противовоспалительных цитокинов (TGF-, IL-10) и цитокинов, регулирующих специфические иммунные реакции (IL-2, IL - 4, IL - 15).

Изменения реактивности внутриклеточных механизмов макрофагов перитонеального экссудата подтвердили факт нарушения секреции интерлейкинов, регулирующих в последующем каскад иммуннологических реакций. В частности, в опытах по детекции посттранскрипционной экспрессии мРНК-интерлейкинов методом ПЦР с последующей амплификацией кДНК и дот-гибридизацией синтезированных ампликонов, удалось выявить существенные нарушения экспрессии отдельных цитокинов под влиянием LT-энтеротоксина E.cloacae.

В первой серии опытов мы изучали секрецию провоспалительных цитокинов, в частности, IL-6, IL-12, IFN- и TNF-б.

Результаты экспериментов показали, что транскрипция мРНК IL - 6 в клетках отмечается лишь на 3-и сутки. Так, радиографические сигналы наблюдались в клетках нейтрофилов контрольной и I группы животных, тогда как макрофаги сигнализировали их только у животных II группы.

IL - 6 повышает бактерицидность нейтрофилов без достоверных изменений показателей фагоцитоза, так как действует в постактивационный период жизни гранулоцита, запуская внутриклеточные механизмы бактериолиза и продлевая жизнь гранулоцита. IL - 6 в синергизме с IL-2 участвует также в активации и индукции пролиферации Т-лимфоцитов, является индуктором синтеза острофазных белков (А.А.Тотолян, 2000).

В экспериментах IL-12 транскрибировался в клетках макрофагов и нейтрофилов во всех группах животных как на 1-е сутки, так и на 15-е сутки исследования.

Транскрипция TNF-б отмечалась слабо на 5-е сутки исследования, как в опытных, так и в контрольной группе животных. У нейтрофилов сигнализировала радиографическая метка в контроле, а в макрофагах - только в опытных группах животных.

Существенные изменения наблюдались в транскрипции мРНК IFN-. Установлено, что транскрипция мРНК в нейтрофилах III группы животных происходила во все сроки исследования, но пик транскрипции мРНК приходился на 5-е сутки. В I группе животных радиометка сигнализировала только в 1-й день исследования. В остальных группах мышей радиографического сигнала не наблюдалось.

В макрофагах I группы животных экспрессия IFN- наблюдалась на 1-е сутки опытов и указывала на раннюю, возможно, ложную стимуляцию, поскольку в последующие дни экспериментов сигнала радиографической метки не наблюдалось. В I и II группах животных интенсивность радиографического сигнала усиливалась на 3- и сутки. В контрольной группе мышей транскрипция мРНК IFN- не обнаружена.

В следующей серии экспериментов была изучена транскрипция мРНК TGF- и IL-10.

Отличия в транскрипции мРНК отмечались в TGF-в. Как показали исследования, экспрессия TGF-в определялась макрофагальными клетками только в 1-е сутки опытов в I группе мышей. В контрольной группе животных наблюдались слабые сигналы.

В экспериментах транскрипция мРНК IL-2, IL-4 и IL-10 как у макрофагов, так и у нейтрофилов, не наблюдалась. Однако, важная роль в дифференцировке клеточного и гуморального типа иммунного ответа хозяина принадлежит именно IL-2 и IL-4 (S. Pasare, R. Medzhitov, 2004).

Изучение экспрессии мРНК IL-15 показало появление радиографического сигнала во всех изучаемых группах мышей на 1-й день опытов, как в нейтрофилах, так и в макрофагах. При этом интенсивность радиографического сигнала в макрофагах была выше в контроле и в I группе мышей.

Следует отметить, что, по литературным данным, IL-15 вырабатывается только макрофагами и по своему действию близок к IL-2. При участии IL-15 осуществляется пролиферация активированных Т-клеток и дифференцировка цитотоксических Т-лимфоцитов, а также активация NK-клеток (A.J. Talati et al., 2008), что противоречит полученным нами результатам. Таким образом, можно заключить, что LT-энтеротоксин E.cloacae, способствуя повышенной экспрессии TGF-в, подавляет в целом иммунологические реакции организма хозяина. Ранняя ложная индукция экспрессии IFN- макрофагами, возможно, имеет иммунокомпрометирующее значение, поскольку IFN- обладает плейотропным действием. Отсутствие в нейтрофилах транскрипции мРНК ключевых цитокинов указывает на то, что они как бы выключаются из цитокиновой регуляции иммунного ответа в инфекционном процессе. Макрофаги определяют первую линию защиты организма и испытывают на себе влияние факторов как бактериальной природы, так и образующихся в процессе иммунного ответа, причем патогены способны индуцировать их апоптоз.

Представления о спектре механизмов бактерийного выживания при инфекции в последнее время расширились за счет установления способности микробных патогенов регулировать процесс апоптоза. В условиях инфекционной патологии обычно апоптоз выполняет функцию защиты макроорганизма, где гибель инфицированных клеток с последующей их элиминацией из организма предотвращает распространение инфекции. Однако некоторые патогены, в частности, облигатные внутриклеточные паразиты в условиях инфицированного организма «отменяют» клеточную гибель, поддерживая жизнь клеток хозяина, тем самым способствуя собственному выживанию и персистенции (D.W. McGee et al., 1992; S. Mathias et al., 1993; C.S. Reise et al., 1999).

В связи с этим, представлялось целесообразным изучить влияние LT-энтеротоксина E.cloacae на программированную клеточную гибель клеток хозяина. Цитометрический анализ клеток перитонеального экссудата (КПЭ) с использованием двух видов светорассеяния (малого и под углом 90 С) показал, что КПЭ содержит две основные субпопуляции клеток, различающихся размерами и гранулярностью цитоплазмы.

Результаты исследования представлены на рис.12.

Рис.12. Уровень апоптоза клеток перитонеального экссудата мышей в динамике (усл.ед.)

*р<0,001 по q-критерию Ньюмена-Кейлса;

**р<0,05 по q-критерию Ньюмена-Кейлса

Из рис. 12 видно, что во всех опытных группах отмечается появление апоптотических клеток. Однако, статистически достоверные различия по сравнению с контролем наблюдались только в I группе мышей. Установлено, что в I группе мышей, зараженной LТ-энтеротоксином E.cloacae, количество ушедших в апоптоз клеток было значительно больше по сравнению с другими опытными группами. При этом количество апоптотических клеток в указанных группах были сопоставимы с показателями контрольной группы.

Данные B. Yankelevich и др. (1997) свидетельствуют о факте запуска программированной смерти CD4+ лимфоцитов, индуцируемого Ext В фрагментом термолабильного энтеротоксина E.coli и CD8+-холерогеном.

Таким образом, результаты изучения апоптоза клеток перитонеального экссудата, показывают, что термолабильный энтеротоксин E.cloacae может влиять на процесс апоптоза клеток перитонеального экссудата мышей.

Обобщая полученные результаты, можно заключить, что LT-энтеротоксин Enterobacter spp. является важным фактором патогенности, определяющим особенность развития инфекционного заболевания. Мишенями для его действия являются иммунокомпетентные клетки. Характеристика термолабильного энтеротоксина создает основу для разработки рациональных подходов в диагностике и лечении патологий, вызванных энтеротоксигенными Enterobacter spp.

ВЫВОДЫ

1. Штаммы бактерий рода Enterobacter, выделенные при инфекционно-воспалительной патологии желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и гнойно-воспалительных процессах различной локализации, фенотипически характеризуются свойствами патогенности (способностью к адгезии, продукции цитолизинов, токсинообразованию и персистентными свойствами).

2. Колониальная организация микроорганизмов Enterobacter spp. характеризуется морфологической гетерогенностью, входящих в её состав клеток: обнаружены активно делящиеся формы с образованием клеточных кластеров; покоящиеся; спонтанно аутолизирующиеся клетки. В концентрических зонах колоний микробы преимущественно представлены клетками, образующими «швермеры», с избыточным количеством жгутиков, не способных к делению. Адгезивная активность бактерий рода Enterobacter обусловлена наличием ресничек длиной 297,8±152,8 нм и шириной 4,91±0,53 нм, способных агглютинировать эритроциты птиц.

3. Выявление у бактерий рода Enterobacter генетических фрагментов, определяющих их патогенность и токсигенность, идентичных с генами, входящими в состав “островков патогенности” E.coli, свидетельствует о едином генетическом механизме изменения патогенности и токсигенности.

4. В основе патогенетического механизма инфекционных процессов, обусловленных энтеротоксинпродуцирующими штаммами бактерий рода Enterobacter, лежит иммуносупрессивное действие термолабильного энтеротоксина на антигенпрезентирующую и антигенпроцессинговую функцию макрофагов, которое отражается на развитии иммунных реакций как алло-, так и аутогенных антигенов снижением числа антителообразующих клеток.

5. Механизм супрессивного действия термолабильного энтеротоксина может быть связан с ложной индукцией трансформирующего ростового фактора- макрофагами перитонеального экссудата, основная функция которого заключается в подавлении пролиферативной активности антигенспецифических клеток. Термолабильный энтеротоксин нарушает экспрессию интерферона- макрофагами и нейтрофилами, что может оказывать иммунокомпрометирующее плейотропное действие на развитие иммунных реакций хозяина.

6. Термолабильный энтеротоксин Enterobacter spp. нарушает функцию ферментов гексозо-монофосфатного шунта фагоцитов, что проявляется снижением образования супероксиданионов, с последующим уменьшением микробиоцидной функции макрофагов и нейтрофилов.

7. Термолабильный энтеротоксин Enterobacter spp. усиливает реакцию бласттрансформации лимфоцитов, в основе которой лежит нарушение проницаемости лизосомальных мембран, характеризующееся “опустошением” лизосомальных гранул клеток.

8. В результате действия энтеротоксинпродуцирующего штамма Enterobacter spp. прекращется транскрипция мРНК фактора некроза опухоли-б нейтрофилами. Это явление может служить причиной дизрегуляции запрограммированной клеточной смерти под влиянием фактора некроза опухоли-б, секретируемого нейтрофилами.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Штаммы Enterobacter gergoviae ГИСК №259, Enterobacter cloacae ГИСК №258, Enterobacter agglomerans ГИСК №257 рекомендуется использовать в качестве эталонных культур при идентификации выделенных штаммов от больных и в биотехнологии в качестве суперпродуцентов термолабильного энтеротоксина.

2.Для установления этиологической значимости Enterobacter spp. при патологиях желудочно-кишечного тракта, мочевыделительной системы и гнойно-воспалительных процессах рекомендуется определение их факторов патогенности.

3.Для расшифровки инфекций, вызванных УПЭ, а также бактериями рода Enterobacter, рекомендуется определение генетических маркеров патогенности: HlyA, HlyB, papAH, papC, sfaA, sfa G.

4.Знания об иммуномодулирующих свойствах термолабильного энтеротоксина Enterobacter spp., рекомендуется использовать при подборе лечебно-профилактических препаратов в терапии инфекций, вызванных токсигенными условно-патогенными энтеробактериями, в частности, бактериями рода Enterobacter.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. О некоторых биологических свойствах бактерий рода Еnterobacter Текст А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Д.Т. Гашимова, А.Р. Мавзютов // Идеи Пастера в борьбе с инфекциями: материалы второй международной конференции, посвященной 75-летию института им. Пастера. - СПб., 1998. ? С. 124.

2. Об антибиотикорезистентности бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Д.Т. Гашимова, А.Р. Мавзютов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. ? С. 13.

3. Ахтариева, А.А. К вопросу о патогенном потенциале бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, Д.Т. Гашимова, М.М. Туйгунов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.

4. Ахтариева, А.А Продукция энтеробактерами энтеротоксина [Текст] / А.А. Ахтариева, Д.Т. Гашимова, М.М. Туйгунов // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.

5. Ахтариева А.А. Адгезивная способность бактерий рода Enterobacter Текст А.А. Ахтариева, А.А. Камалова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов Республиканской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 1999. - С. 13.

6. Пат. №2161197 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter gergoviae ГИСК №259, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, М.М. Алсынбаев, З.Г. Габидуллин, Р.Х. Хананова, А.К. Булгаков, В.Ф, Кулагин, Р.З. Суфиярова, Ю.З. Габидуллин, М.М, Гафаров, Р.А. Очилова (Российская Федерация). - №99124328; заявл. 18.11.1999, опубл. 27.12.2000, Бюл. №36. - 6с.

7. Пат. №2162485 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter agglomerans ГИСК №257, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, В.Ф. Кулагин, О.В. Кунягина, В.В. Ленгесова, А.А.Гарифуллин, А.Р. Мавзютов, М.М. Гафаров, Р.С. Суфияров, Д.Т. Гашимова (Российская Федерация). - №2000106136; заявл. 13.03.2000, опубл. 27.01.2001, Бюл. №3. - 6с.

8. Пат. №2164942 Рос. Федерация Штамм бактерий Enterobacter cloacae ГИСК №258, обладающий комплексом факторов патогенности / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, М.М. Алсынбаев, В.Ф. Кулагин, В.В. Ленгесова, Р.Х. Хананова, А.К. Булгаков, А.А.Гарифуллин, Ю.З. Габидуллин, Р.З. Суфиярова,А.Б. Бакиров (Российская Федерация). - №2000106268; заявл. 13.03.2000, опубл. 10.04.2001, Бюл. №10. - 6с.

9. Некоторые биологические свойства бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, В.В. Ленгесова, Р.К. Хананова, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин // Дерматовенерологической службе Республики Башкортостан - 80 лет: сборник трудов Республиканской конференции. - Уфа, 2000. ? С. 67?68.

10. Ахтариева, А.А. Ауксо- и прототрофность бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 16.

11. Ахтариева, А.А. Антилизоцимная и антиинтерфероновая активность бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 16?17.

12. Ахтариева, А.А. Гемолитическая активность бактерий рода Enterobacter Текст А.А. Ахтариева, А.А. Камалова, А.Н. Ишмухаметова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 17.

13. Некоторые персистирующие свойства штаммов провиденция и энтеробактер [Текст] / А.Н. Ишмухаметова, А.А. Ахтариева // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов 65?й юбилейной научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2000. ? Т. 1. - С. 19.

14. Ахтариева, А.А. Некоторые персистентные свойства бактерий рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, А.А. Камалова // Здравоохранение Башкортостана. ? 2000. ? № 2: спец. вып. ? С. 15?17.

15. Ахтариева, А.А. Антибиотикорезистентность штаммов Enterobacter, выделенных в городе Уфе [Текст] / А.А. Ахтариева, Д.Т. Гашимова, А.А. Камалова // Вопросы теоретической и практической медицины: тезисы докладов научной конференции студентов и молодых ученых Башкирского государственного медицинского университета. - Уфа, 2001. ? С. 16.

16. Ахтариева, А.А. Роль бактерий рода Enterobacter в патологии экстрагенитальных заболеваний [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова // Актуальные проблемы материнства в медицине труда: материалы докладов российской научно-практической конференции. - Уфа, 2001. ? С. 251?253.

17. Ахтариева, А.А. Распространенность бактерий рода Enterobacter в больничных стационарах г. Уфы [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002. ? Т. 3. ? С. 137-138.

18. Лекарственная устойчивость штаммов Enterobacter spр., выделенных на территории республики Башкортостан [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова, И.Ш. Хурамшина, А.Р. Мурзаганеева // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2002. ? Т. 4. ? С. 78-80.

19. Ахтариева, А.А. Изучение антибиотикорезистентности бактерий рода Enterobacter, выделенных на территории республики Башкортостан [Текст] / А.А. Ахтариева, Р.З. Саляхов, Т.А. Савченко // Здравоохранение Башкортостана. - 2002. ? № 3: спец. вып. ? С. 14-16.

20. Ахтариева, А.А. Анализ распространенности бактерий рода Enterobacter в экологически неблагоприятных регионах Башкирии [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова // Наука-Образование-Производство в решении экологических проблем: материалы международной научно ? технической конференции. - Уфа, 2002. - Т. 2. ? С. 349?351.

21. Адгезивная активность клинических штаммов Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, А.А. Камалова // Гомеостаз и инфекционный процесс: III общероссийская конференция с международным участием. - Сочи, 2002. ? С. 11.

22. Показатели иммунного статуса у больных с гнойно-воспалительными заболеваниями [Текст] / Р.А. Нигматуллина, А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, Р.З. Саляхов, А.А. Камалова // Иммунология Урала. - 2003. ? № 1 (3): Материалы III конференции иммунологов Урала. ? С. 67-68.

23. Антибиотикочувствительность условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при инфекциях мочевыводящих путей [Текст] / Р.З. Саляхов, З.Г. Габидуллин, В.З. Галимзянов, А.К. Булгаков, А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов // Иммунология Урала. - 2003. ? № 1 (3): Материалы III конференции иммунологов Урала. ? С. 109.

24. Ахтариева, А.А. Гемолитическая активность бактериий рода Enterobacter Текст А.А. Ахтариева, Т.А. Савченко, Р.З. Саляхов, А.А. Камалова // Успехи современного естествознания. - 2003. ? № 8: Гомеостаз и инфекционный процесс: материалы III общероссийской конференции с международным участием. - С. 72.

25. Факторы патогенности клинических штаммов Enterobacter [Текст] / Ю.З. Габидуллин, А.А. Ахтариева, Т.А. Савченко Р.З. Саляхов, А.А. Камалова, Ю.З. Габидуллин // Современные проблемы диагностики и лечения дисбактериозов: материалы конференции, посвящ. 10-летию НПЦ лечения дисбактериозов НИИ иммунологии ЧелГМА и 60-летию ГОУ ВПО «Челябинская Государственная медицинская академия МЗ РФ». ? Челябинск, 2004. ? С. 10-11.

26. Гемолитическая активность клинических штаммов бактерий рода Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Proteus, E.coli, Shigella dуsenteriae, Serratia, St.aureus, Str. pneumoniae, выделенных в виде смешанных и монокультур [Текст] / З.Г. Габидуллин, А.К. Булгаков, Р.З. Саляхов, Ю.З. Габидуллин, М.М. Туйгунов, А.А. Ахтариева // Актуальные вопросы инфекционной патологии человека, клиники и прикладной медицины: материалы Всероссийской научной конференции молодых ученых. - Уфа, 2004. ? С. 43-44.

27. Структура высеваемости и антибиотикорезистентность бактерий рода Enterobacter, выделенных от пациентов урологического отделения ГКБ №8 за 2003 год [Текст] / Р.Р. Нигматуллина, Д.В. Шемагонов, А.А. Ахтариева, Р.З. Саляхов, Ю.З. Габидуллин, Т.А. Савченко, А.А. Камалова // Материалы 69-ой межвузовской научной конференции. - Курск, 2004. - Ч. 1. ? С. 224-225.

28. Влияние термолабильного энтеротоксина Enterobacter cloacae на отдельные звенья иммунной системы [Текст] / А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова // Иммунология Урала. - 2005. - Вып. 1, № 4: Материалы VI конференции иммунологов Урала. ? С. 2-3.

29. Некоторые особенности факторов патогенности бактерий рода Enterobacter spр. , Serratia spр. в виде моно - и ассоциированных культур [Текст] / Ю.З. Габидуллин, З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, А.К. Булгаков, М.М. Туйгунов, Р.З. Саляхов, Э.Ф. Мамбетова, Н.Н. Гибазов // Здравоохранение Башкортостана. - 2005. ? № 3: Актуальные вопросы урологии, заболевания предстательной железы. Новые технологии в урологии: материалы Респуб. науч. конф. ? С. 322-323.

30. Ахтариева, А.А. Роль термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter в системе «патоген - хозяин» [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, А.А Камалова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2006. - № 1: Актуальные вопросы современной фармации и фармацевтического образования: сборник научных трудов юбилейной конференции, посвящ. 25-летию фармацевтического факультета Башкирского государственного медицинского университета. ? С. 218-220.

31. Изучение влияния термолабильного энетротоксина бактерий рода Enterobacter spр. на функциональную активность перитонеальных макрофагов в эксперименте [Текст] / А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, Н.Г. Насибуллин // Известия Челябинского научного центра: электронный журнал. - 2006. - Вып. 2, № 32. ? С. 120-122.

32. Патогенетическое значение термолабильного энтеротоксина и антикомплементарной, антиинтерфероновой и антилизоцимной активности бактерий рода Enterobacter в условиях выживания в организме хозяина Текст А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, Ф.С. Билалов, Э.Ф. Мамбетова, А.А. Камалова // Новые лабораторные технологии в диагностике и лечении заболеваний человека: материалы конференции, посвящ. 25-летию ЦНИЛ ЧГМА. - Челябинск, 2006. ? С. 98-100.

33. Изучение влияния ЛТ - энтеротоксина некоторых представителей бактерий семейства Enterobacteriaceae на лизосомальную активность перитонеальных макрофагов в эксперименте [Текст] / А.А. Ахтариева, Э.Ф. Мамбетова, Ф.С. Билалов, З.Г. Габидуллин // Здоровье семьи - XXI века: материалы X международной научной конференции (Бангкок - Паттайя, Тайланд, 2006 г.). ? М., 2006. - С. 25?26.

34. Характеристика свойств, определяющих персистенцию моно-ассоциированных культур условно - патогенных энтеробактерий [Текст] / Ю.З. Габидуллин, А.А. Ахтариева, М.М. Алсынбаев, М.М. Туйгунов, Э.Т. Галимова, Ф.С. Билалов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2006. ? № 4. ? С. 62-64.

35. Функциональная активность перитонеальных фагоцитов и энтеротоксигенные бактерии рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, Р.А. Кудакаева, Д.Н. Аскарова, Т.С. Корюкова, А.А. Камалова // Медицинская наука - 2007: материалы Респуб. конф. молодых ученых Республики Башкортостан, посвящ. году единства Башкортостана с Россией, 75-летию БГМУ, Дню медицинского работника. - Уфа, 2007. ? С. 6-7.

36. Влияние термолабильного энтеротоксина бактерий рода Enterobacter cloacae на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов мышей Текст А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, А.А. Камалова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2007. ? № 4. ? С. 58-61.

37. Состояние некоторых звеньев иммунной системы мышей, инфицированных энтеротоксинпродуцирующими штаммами бактерий рода Enterоbacter [Текст] / А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, Ю.З. Габидуллин, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, Г.К Давлетшина // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2007. ? № 4. ? С. 84-87.

38. Оценка влияния энтеротоксинпродуцирующих Enterоbacter cloacae на внутриклеточный кислородзависимый метаболизм перитонеальных макрофагов мышей [Текст] / Ю.З. Габидуллин, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, Ф.С. Билалов, Э.Ф. Мамбетова, А.А Камалова // Материалы IX съезда Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. - М., 2007. ? Т. 2. ? С. 209.

39. Функциональная активность перитонеальных фагоцитов и энтеротоксигенные бактерии рода Enterobacter [Текст] / А.А. Ахтариева, З.Г. Габидуллин, Т.А. Савченко, Р.Х. Кудакаева, Д.Н. Аскарова, Т.С. Корюкова, А.А. Камалова // Медицинская наука - 2007: материалы Респуб. конф. молодых ученых Республики Башкортостан, посвящ. году единства Башкортостана с Россией, 75-летию БГМУ, Дню медицинского работника. - Уфа, 2007. ? С. 6-7.

40. Влияние энтеротоксина Enterobacter на клеточное звено иммунитета Текст А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, А.А. Камалова // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2008. ? № 3. - С. 96-98.

41. Изучение действия термолабильного энтеротоксина Enterоbacter cloacae на экспрессию генов цитокинов мышей [Текст] / А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, А.А. Камалова, Р.М. Ахмадеев // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2009. ? № 5. - С. 62-66.

42. Влияние термолабильного энтеротоксина Enterоbacter cloacae на иммунную систему мышей [Текст] / А.А. Ахтариева, И.И. Долгушин, З.Г. Габидуллин, Ю.З. Габидуллин, А.А. Камалова, Р.Р. Суфияров // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. ? 2009. ? № 6. - С. 98-104.

43. Взаимодействие бактерий семейства Enterobacteriaceae c антигенпрезентирующими клетками иммунной системы организма [Текст] / З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева. М.М. Туйгунов, Р.С. Суфияров, В.Г. Туйгунова, Н.Х. Насибуллин. Р.Р. Суфияров, Ю.З. Габидуллин, Г.А. Идиатуллина, В.М. Изикаев // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. Т. 4, № 5. - С. 78-86.

44. Факторы патогенности бактерий семейства Enterobacteriacae, обеспечивающие выживание в организме хозяина [Текст] / З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов, Р.С.Суфияров, В.Г. Туйгунова, Р.Р. Суфияров, Ю.З. Габидуллин, В.М. Изикаев, Г.А. Идиатуллина // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - Т. 4, № 5. - С. 86-94.

45. Регуляция апоптоза бактериальными клетками семейства Enterobacteriacеae [Текст] / З.Г. Габидуллин, А.А. Ахтариева, М.М. Туйгунов, Р.С. Суфияров, В.Г. Туйгунова, Р.Р. Суфияров, Ю.З. Габидуллин, Г.А. Идиатуллина, В.М. Изикаев, А.А. Габдрахманова // Медицинский вестник Башкортостана. - 2009. - Т. 4, № 6. - С. 68-76.

Размещено на Allbest.ur

...