Изучение росторегулирующей и протекторной активности внеклеточных полисахаридов из культуры клеток пшеницы

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение росторегулирующей и протекторной активности внеклеточных полисахаридов из культуры клеток пшеницы

Парменова А.К., Кампитова Г.А., Бишимбаева Н.К., Казыбекова С.К.

Ростстимулирующая и протекторная активность полисахаридов (ПС) разного состава была оценена в лабораторных условиях с использованием культур огурца в норме и в присутствии стрессовых агентов, создающих эффект засухи, засоления.

В результате изучения было показано, что экстрацеллюлярные ПС в очень низких (наномолярные) концентрациях ПС 0,001 и 0,0001 мкг/мл показали высокую активность в усилении роста огурца. Внеклеточные ПС в очень низких (наномолярных) концентрациях 0,001 и 0,0001 мкг/мл показали наибольшую протекторную активность в условиях засухи.

В Казахстане не налажено производство экологически чистых биостимуляторов роста и средств защиты растений, имеются единичные разработки морально устаревших препаратов на основе отходов химической промышленности. В сельском хозяйстве Казахстана, в основном, используются регуляторы роста импортного производства, большая часть из которых химически синтезированы и представляют опасность для здоровья человека и животных. Экологически чистые безопасные импортные препараты, созданные на основе инновационных технологий и обладающих высокой активностью (в нано молярных концентрациях) очень дорого стоят. Несмотря на это, они пользуются большим спросом у фермеров и крестьянских хозяйств, за счет чего очень быстро обогащаются иностранные биотехнологические компании. Это еще раз подтверждает актуальность и экономическую целесообразность разработки и производства отечественных экологически безопасных биостимуляторов роста и средств защиты растений нового поколения, что может привести кимпорт замещению по данной категории препаратов. Подобно нативным растениям клеточные культуры синтезируют широкий спектр полисахаридов, таких как пектины, арабиногалактаны, галактаны, арабинаны, ксилоглюканы и т.д. [1, 2]. Разработана биотехнология получения полисахаридов с высокой биологической активностью в культуре клеток пшеницы и ячменя на основе достижений клеточной биологии. Впервые показано, что культивируемые клетки в процессе программированной клеточной гибели - апоптоза, секретируют внеклеточные полисахариды, обладающие высокой физиологической активностью [3].

Секретируемые полисахариды были выделены из культур клеток пшеницы и ячменя, характеризующихся высоким процентом апоптоза. При помощи газожидкостной хроматографии установлено, что внеклеточные полисахариды представляют собой смесь арабиногалактанов, арабиноксиланов и ксилоглюканов [4]. Показано, что внеклеточные полисахариды из культуры клеток пшеницы и ячменя обладают высокой биологической активностью: в наномолярных концентрациях стимулируют клеточные деления, проявляя цитокининоподобный эффект, защищают клетки от стресса, стимулируют процессы дифференцировки клеток, в частности, процессы инициации и дифференциации соматических эмбриоидов, а также усиливают процесс апоптозаinvitro [5].

Разработанная нами технология получения физиологически активных полисахаридов (ФАП) отличается большим выходом фракции ФАП - от 1,0 до 3 % от сухой массы клеток только секретируемых ПС, в зависимости от состава среды; общий выход полисахаридов (секретируемых и внутриклеточных) каллуса составил от 2 % до 7,5 % от сухой массы в зависимости от уровня апоптоза. Для сравнения, в работе Е.А.Гюнтер и др. [6] из клеточной культуры ряски получены полисахариды, состоящие из арабиногалактанов и пектинов, общий выход которых составил от 3% от сухой массы. То есть, выход суммарных ПС в нашем случае в 2,5 раза выше. И это не предел, т.к. есть еще возможности для получения моделей с еще более высоким уровнем апоптоза (60-80%).

Материалы и методы

Ростстимулирующая и протекторная активность внеклеточных полисахаридов выделенных из культуры клеток пшеницы была изучена с использованием культур огурца. Для изучения протекторной активности в лабораторных условиях внеклеточных полисахаридов предварительно поставлены эксперименты по определению сублетальной концентрации стресс-факторов (NaCl). Для этого семена огурцов стерилизовали раствором КМnO4 в концентрации 0,05 мг/мл (в течение 5 мин), после чего помещали по 10 шт. в чашки Петри на фильтровальную бумагу, смоченную растворами, содержащими различные концентрации NaCl (0,25%; 0,5%; 0,75%; 1,0%; 1,25%; 1,5%; 1,68%; 2,0%;2,5%; 3,0% и 3,5%) для создания эффекта засоления. В ходе проращивания в течение 5 дней вели наблюдения за энергией прорастания семян, подсчитывали процент проросших семян и измеряли длину побегов и корней. В качестве контроля служили варианты проращивания семян на воде без добавления NaCl. В качестве сублетальных доз отбирали те концентрации, в которых под действием стрессового агента погибло более 50% и менее 100% проращиваемых семян. Концентрации стресс агентов, вызывающие 100%-ую гибель семян отбирали как летальные дозы. Определены сублетальные дозы стресс фактора (соли) для огурцов (таблицы 1). В результате для огурца определена сублетальная доза - NaCl 1,0%.

В ходе проращивания вели наблюдения за энергией прорастания семян, подсчитывали процент проросших семян и измеряли длину побегов и корней. В качестве контроля служили семена, замоченные в воде без ПС. Для изучения протекторной активности в лабораторных условиях внеклеточных полисахаридов для (огурца )предварительно поставлены эксперименты по определению сублетальной концентрации стресс-факторов солевого и осмотического стрессов, создаваемых различными концентрациями NaCl. Для культур огурца была определена своя специфическая сублетальная доза, что связано с тем, что устойчивость к стрессовым факторам не одинакова. После определения сублетальных доз стрессовых агентов семена, предварительно замоченные в растворах различных фракций ПС (0,1, 0,01, 0,001и 0,0001 мкг/мл) в течение разного периода времени (4 ч.,24 ч.), проращивали в растворах с сублетальными концентрациями NaCl (эффект засоления). В течение 5 дней наблюдали за всхожестью, энергией прорастания семян, ростом и развитием побегов. В качестве контроля служили семена без замачивания (контроль 1) и семена, замоченные в воде без ПС (контроль 2). Протекторный эффект отмечали у тех концентраций ПС с соответствующим временем замачивания (предобработка), при которых происходила стимуляция всхожести семян и роста проростков в присутствии сублетальной дозы стрессового агента по сравнению с контролем 1 (без замачивания в воде и ПС) и контролем 2 (замачивание семян в воде без ПС). Статистическую обработку данных проводили по общепринятым методам [7, 8] с использованием программы Excel.

Результаты и их обсуждения

В результате воздействия таких стресс-факторов как NaCl, определена сублетальная доза для культур огурца: огурцы - NaCl 1,0%.

Изучение рост регулирующей активности полисахаридов разного состава в лабораторных условиях проводили с использованием семян огурцов при нормальных условиях - проращивание на воде без присутствия стрессовых агентов. [3]Для этого семена огурцов стерилизовали в растворе 0,05 мг/мл КМnO4в течение 5 мин. и замачивали в растворах ПС, разведенных в различных концентрациях (0,1, 0,01, 0,001 и 0,0001 мкг/мл), в течение разного периода времени (4 ч., 24 ч.). После чего семена извлекали из растворов ПС и проращивали в течение 5 дней в чашках Петри (по 8-10 штук) на фильтровальной бумаге, смоченной водой, при температуре 26°С и 16-часовом фотопериоде. В ходе проращивания вели наблюдения за энергией прорастания семян, подсчитывали процент проросших семян и измеряли длину побегов и корней. В качестве контроля служили семена, замоченные в воде без ПС.

Было показано повышение роста проростков огурца придействий экстрацеллюлярных полисахаридов во всех концентрациях. ПС в концентрацях 0,01 мкг/мл, 0,001 мкг/мл и 0,0001 мкг/мл стимулировали рост надземной и подземной частей проростков (рисунки 1, 2). При замачивании семян огурца в растворе ПС в течение 4 часов было отмечено, что наибольшей рострегулирующей активностью обладает ПС в наномолярной концентрации 0,0001 мкг/мл, где наблюдалось повышение роста надземной и подземной части проростков. Так, если в контрольном варианте длина корней достигает 2,6 см, то в выше указанной концентрации длина корня удлинилась до 9,5 см. В контроле (вода) длина побегов достигает 1,2 см, в опыте при концентрации 0,001 мкг/мл и 0,0001 мкг/мл - 3,0 см (рисунок 1).

Обозначения: контроль - вода; растворы экстрацелюлярных полисахаридов в разных концентрациях 0,1мкг/мл; 0,01 мкг/мл; 0,001 мкг/мл и 0,0001 мкг/мл.

Показано повышение роста проростков огурца придействий экстрацеллюлярных полисахаридов во всех концентрациях. ПС в концентрацях 0,01 мкг/мл, 0,001 мкг/мл и 0,0001 мкг/мл стимулировали рост надземной и подземной частей проростков (рисунки 1, 2).

При замачивании семян огурцов в течении 24 часов в основной фракции ОПС и при проращивании в сублетальной дозе NaCl(1%) протекторная активность ОПС наблюдалась во всех концентрациях в отношении роста побегов и корней: они стимулировали по росту побегов от 1,18 (0,1 мкг/мл) - 1,84 (0,001 мкг/мл) раза, а по росту корней во всех концентрациях повышается рост от 1,1 (0,0001 мкг/мл) - 1,5 раза (0,001 мкг/мл) по сравнению с контролем (замачивание в воде без ПС) (рисунок 3)

Рисунок 3 - Протекторная активность основной фракции ПС на уровне роста проростков огурцов (замачивание в течение 24 ч.)

биостимулятор пшеница полисахарид огурец

В результате показано, что экстрацеллюлярные полисахариды повышают всхожесть огурца. Выявлено, что все концентрации ПС повышают всхожесть семян, особенно очень низкие (наномолярные) концентрации 0,0001 мкг/мл. Процент всхожести под действием ПС повышался у огурца в 2 раза - с 50% до 100%.

Показано, что экстрацеллюлярные ПС усиливают всхожесть и энергию прорастания в условиях засоления культур огурца, выявлено, что экстрацеллюлярные ПС усиливают рост стебля и корня (огурца).

Все концентрации показали протекторную активность к засолению, особенно средние (0,01 мкг/мл) и очень низкие (0,001 и 0,0001 мкг/мл наномолярные) концентрации. В условиях засоления ПС усиливают рост стебля в 1,5- 2 раз, рост корня в 1,5- 6,5 раз. Выявлено, что экстрацеллюлярные ПС повышают процент всхожести семян огурца в условиях засоления. Протекторные эффекты экстрацеллюлярных ПС в условиях засоления проявились в средних (0,01 мкг/мл) и очень низких концентрациях (0,001 и 0,0001 мкг/мл). В целом, ПС повышают всхожесть в условиях засоления от 12,5-37,5% в контроле (замачивание в воде без ПС) до 50-100%в опыте (замачивание в растворах ПС).

Литература

1. Goubet F., Morvan C. Synthesis of cellwallgalactansfromflax (LinumusitatissimumL.) suspension-culturedcells // -1994. -Vol.35, №5. - P.719-727.

2. Гюнтер Е.А. Влияние регуляторов ростанаклеточную культуру Silenevul garis инахимическиех арактеристики продуцируемых ею полисахаридов / В кн.: Е.А. Гюнтер, Ю.С. Оводов. Химияраст. сырья. - 2001. -№ -С. 57-62.

3. Bishimbayeva K. A role for apoptosis and polysaccharides secretion in the long-term somatic embryogenesis of cereals //Bull.of State Nikit. Bot. Gard. - 2002. -№ 86. -P. 47-52.

4. Сартбаева И.А., Гюнтер Е.А., Бишимбаева Н.К. Бидайды? суспензия культурасында?ы полисахаридтер ??рамын талдау //«Физиолого-биохимические и генетико-селекционные исследования растений в Казахстане»: сборник трудов, посвященный 70- летию профессора, доктора биологических наук Мамонова Л.К. - Алматы, - С. 235- 241.

5. Bishimbayeva N.K., AmirovaА.К., Murtazina A.S., Sartbayeva I.A., RakhimovaЕ.V., Rakhimbaev I.R. Study the cells with signs of PCD in cereals embryogenic tissue culture //Proceeding of Meeting of SEB.- CzechRepublic. -Praque, 2010. - Р. 137.

6. Гюнтер Е.А. Продуцирование полисахаридов каллусными культурами ряски малой /В кн.: Прикл. биохим. мкробиол.-2008. - Т. 44, № 1. - С.117-122.

7. Валиханова Г.Ж., Бабаев Р.А., Бишимбаева Н.К., Заирова А.С. Методическое руководство по применению ЭВМ в НИРС по культуре тканей. - Алма-Ата,1989.- 31 с.

8. Лакин Г.Ф. Биометрия. - М.: Высшая школа, - 352 с.

Размещено на Allbest.ru