Сравнительное изучение активности антиоксидантных ферментов в вегетативных органах Brachypodium distachyon и мягкой пшеницы при действии биотического стресса

Размещено на http://www.allbest.ru/

Сравнительное изучение активности антиоксидантных ферментов в вегетативных органах BRACHYPODIUM DISTACHYON и мягкой пшеницы при действии биотического стресса

Омирбекова Н.Ж., Жусупова А.И., Жунусбаева Ж.К., Асканбаева Б.Н.

Аннотация

В данной работе показаны некоторые результаты сравнительного анализа активности антиоксидантных ферментов (ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза), выполняющих важные функции в процессах адаптации растений в условиях биотического стресса, а именно при заражении Puccinia recondita, опасным патогеном мягкой пшеницы, полученные впервые в Казахстане при применении Brachypodium distachyon в качестве модельного объекта.

Введение

Мягкая пшеница является одной из наиболее экономически значимых сельскохозяйственных культур в Казахстане, признанном мировом экспортере зерна, значительные колебания в производстве которого, опосредованы абиотическими и биотическими стрессами. Одними из наиболее распространенных и вредоносных заболеваний злаковых культур являются ржавчинные болезни: Puccinia recondita - бурая листовая, Puccinia graminis - стеблевая, Puccinia striiformis - желтая. Создание устойчивых к патогенам сортов культурных растений методами селекции продолжительно по времени, в результате эволюция патогенов и обгоняет возможности селекционеров, а получение устойчивых сортов растений опаздывает с внедрением в производство. В связи с этим одной из первоочередных проблем сельского хозяйства и современной биологии является выявление более мобильных методов и путей формирования устойчивости растений к патогенам [1, 2].

Модельный объект Arabidopsis предоставил уникальные возможности для изучения ключевых биологических особенностей биологии растений, в том числе устойчивости к болезням. Однако грибы ржавчины рода Puccinia не способны заразить Arabidopsis и это не дало возможность использовать Arabidopsis в исследовании ржавчины. Brachypodium distachyon (коротконожка пурпурная), относящаяся к подсемейству Pooideae, была рекомендована в качестве новой модельной системы для умеренных злаков. Brachypodium имеет ряд преимуществ для понимания генетической, клеточной и молекулярной биологии умеренных злаков, в том числе и потому, что она является единственным одно-летним злаком, филогенетически наиболее близким к сельскохозяйственно-значимым злакам (пшеница, ячмень, рис) и может быть заражена различными формами ржавчины [3, 4]. В настоящее время проводятся исследования по изучению влияния стрессовых факторов окружающей среды на устойчивость и восприимчивость к стеблевой ржавчине у дикого злака Brachypodium, которые помогут расшифровать генетическую основу имеющихся механизмов ответа с применением рекомбинантных инбредных популяций от родительских форм с разным уровнем сопротивления. В частности, были получены индуцированные мутанты с нарушенной устойчивостью к стеблевой ржавчине, которые помогут познать молекулярную биологию сопротивления и восприимчивости растений к ржавчине [5]. Также выявлены геномные регионы Brachypodium, связанные с количественной устойчивостью к ржавчине Puccinia brachypodii. Инбредные линии Bd3-1 и Bd1-1, отличающиеся по уровню устойчивости к P. brachypodii, были скрещены для получения поколения F2. Три локуса количественных признаков, ответственных за устойчивость к стеблевой ржавчине были выявлены на хромосомах 2, 3 и 4. Устойчивость к ржавчине контролируется несколькими локусами [6]. Было проведено первичное определение районов генома, ассоциированных с устойчивостью к ржавчине в двух инбредных линиях Bd3-1 (устойчивая) и Bd1-1 (чувствительная), с моделированием генов, участвующих в различных сетях метаболизма, таких как гликолиз, обмен аминокислот и азота, которые могут быть далее использованы в трансляционной геномике злаковых [7]. Генетические основы устойчивости Brachypodium distachyon к стеблевой ржавчине пшеницы были изучены методом картирования при скрещивании устойчивой и неустойчивой форм в F4-5. Было выявлено влияние одного доминантного и одного рецессивного генов, один из которых, как ожидается, локализован в хромосоме 3 [8].

В Казахстане Brachypodium distachyon в качестве модельного объекта используется впервые для изучения активности антиоксидантных ферментов (ксантиндегидрогеназа, альдегидоксидаза), существенных в процессах адаптации растений в условиях биотического стресса, вызванного патогенами, в их числе и листовой ржавчиной, что зачастую приводит к накоплению активных форм кислорода. Ксантиндегидрогеназа - сильный антиоксидант, снижающий уровень окислительного стресса в клетках. Ксантиндегидрогеназу рассматривают как фермент, имеющий физиологические функции в метаболизме активных форм кислорода. Так, одновременное продуцирование активных форм кислорода и увеличение активности ксантиндегидрогеназы наблюдали при взаимодействии «растение-патоген». Известно, что интенсивность деградации пуринов, контролируемая ксантин-дегидрогеназой, повышается в период инфекции пшеницы при поражении грибом Puccinia recondita. В свою очередь, альдегидоксидаза вовлечена в путь биосинтеза абсцизовой и индолилуксусной кислот в растениях. Этот фермент привлекает особое внимание, поскольку абсцизовая кислота является многофункциональным фитогормоном, играющим важную роль в предотвращении предуборочного прорастания семян и регуляции транспирации, также установлена прямая корреляция аккумуляции абсцизовой кислоты с возрастающим образованием активных форм кислорода в растительных клетках; индолилуксусная кислота же поддерживает постоянный апикальный рост и регулирует фототропическое и гравитропическое поведение растений. В связи с тем, что альдегидоксидаза обладает широкой субстратной специфичностью, нельзя исключать ее участие и в других реакциях метаболизма, например, реакции детоксификации и реакции ответа на воздействие патогена [9, 10].

Материалы и методы

Объекты исследования - два сорта яровой пшеницы местной селекции (Казахстанская раннеспелая, Казахстанская 19) и Brachypodium distachyon (21 линия), семена которого были предоставлены Центром биоресурсов RIKEN BRC (Япония). Основанием для выбора сортов пшеницы являлась степень устойчивости или чувствительности к листовой ржавчине. По результатам оценок лаборатории иммунитета и защиты растений КазНИИ земледелия и растениеводства и НИИ проблем биологической безопасности РК сорт Казахстанская 19 проявляет устойчивость к бурой (14%) и желтой ржавчинам, тогда как сорт Казахстанская раннеспелая поражается бурой ржавчиной до 40 %. Оба сорта отвечают требованиям ГОСТа. В фазе роста двух листьев, растения опытного варианта подвергали инокуляции урединиоспорами, контролем служили необработанные растения. Инокулят - казахстанская популяция спор гриба Puccinia recondita предоставлена Научно- исследовательским институтом проблем биологической безопасности страны. Симптомы заражения у растений регистрировали на 7-е сутки. Они проявлялись на верхней стороне листьев, реже на листовых влагалищах в виде бурых пустул (урединий) диаметром 0,5-2,0 мм.

Определение активностей ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы проводили методом нативного гель-электрофореза. Листья экстрагировали (в соотношении 1:4) экстракционным буфером, содержавшим в себе 250 мМ Трис-НСl (рН = 8,48), 1 мМ ЭДТА, 14 мМ L-глутатион, 4 мМ дитиотрейтол, 5 мМ L-цистеин, 0,05 мМ раствор Na2MoO4*2H2O, 0,1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 0,001 мМ пепстатин и 250 мМ раствор сахарозы. Экстракты центрифугировали при 14000 оборотах в минуту при 40C в течение 20 минут. Супернатанты полученные из листьев, сначала прогревали при 600C в течение 2 минут и только после повторного центрифугирования в течение 5 минут при тех же условиях в охлаждаемой центрифуге использовали для анализа. Активность ферментов определяли в 7,5% полиакриламидном геле после фракционирования белков методом нативного гельэлектрофореза по стандартной методике (Laemmli, 1970). По завершении электрофореза полученные гели снимали со стекол и обрабатывали реакционной смесью, содержащей 50 мМ трис-НСl (рН=8,48), 3,4 мМ 3(4,5-диметилтиазолил-2)2,5- дифенилтетразолий бромид и 0,1 мМ феназинметосульфат. В качестве субстрата для ксантиндегидрогеназы служили 1,5 мМ гипоксантин и 0,5 мМ ксантин, в качестве субстрата для альдегидоксидазы - 2,5 мМ ванилин, 0,5 мМ индол-3-альдегид. Для визуализации активности ферментов гели в течение 20-30 минут инкубировали в указанной выше смеси в темноте на качалке при температуре 370C. Активности ферментов ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы оценивали по относительной интенсивности окрашивания формазановых полос с помощью обработки программой ImageJ цифровых изображений гелей, полученных на сканере Epson Perfection V750 PRO.

Результаты исследований и обсуждение результатов

Изучение активности к сантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы, как показателей степени развития окислительного стресса и признака устойчивости исследуемых растений в условиях биотического стресса показало следующие результаты.

На рисунке 1 представлены данные определения активности ксантиндегидрогеназы, где 0 - это контроль, а Р - патоген. Относительные интенсивности относятся к соответствующим формазановым полосам ксантиндегидрогеназы.

Как видно из рисунка 1 активность ксантиндегидрогеназы в листьях сортов пшеницы Казахстанская раннеспелая и Казахстанская 19 после поражения патогеном бурой ржавчиной повысилась незначительно (на 10 и 5 % относительно контроля). Активность фермента у галофита Brachypodium distachyon снизилась на 36 % относительно контроля.

Ингибирование активности ксантиндегидрогеназы Brachypodium distachyon может быть связано с увеличением устойчивости клеток к патогенам. Соответственно полученным нами данным можно сделать вывод, что ксантиндегидрогеназа играет важную роль в процессах адаптации растений к патогену.

На рисунке 2 представлены данные определения активности альдегидоксидазы, где 0 - это контроль, а Р - патоген. Относительные интенсивности относятся к соответствующим формазановым полосам альдегидоксидазы.

Как видно из рисунка 2 активность альдегидоксидазы в листьях сортов пшеницы Казахстанская раннеспелая и Казахстанская 19 при заражении патогеном бурой ржавчиной показала уменьшение активности фермента на 41 и 49 % относительно контроля, соответственно, тогда как у Brachypodium снизилась на 42 %. На основе полученных результатов можно сделать вывод о важной роли альдегидоксидазы в процессах адаптации растений к биотическому стрессу.

биотический стресс антиоксидантный фермент

Выводы

Изучение влияния биотического стресса, который вызван патогеном Puccinia recondita у Brachypodium distachyon на активность ферментов окислительного стресса ксантиндегидрогеназы и альдегидоксидазы показало отрицательную корреляцию при инфицировании на уровне 36 % для ксантиндегидрогеназы и 42 % для альдегидоксидазы относительно контроля.

Работа выполнена при поддержке грантового финансирования научных исследований МОН РК, в рамках проекта «Внедрение нового модельного объекта Brachypodium distachyon L. в селекционную практику для повышения устойчивости злаковых культур к биотическим факторам среды».

Литература

1. Абиев С.А. Ржавчинные грибы злаковых растений Казахстана. - Алматы: НИЦ «Гылым», 2002. - 296 с.

2. Boyd A., Ridout Ch., O'Sullivan D.M., Leach J.E., Leung H. Plant-pathogen interactions: disease resistance in modern agriculture // Trends in Genetics. - 2013. - Vol. 29, Issue 4. - P. 233- 240.

3. Peraldi A., Goddard R., Nicholson P. Brachypodium distachyon provides insights into plant trade-offs between growth and stress tolerance // ISB news report. - 2015. - P. 6-10.

4. Ayliffe M., Singh D, Park R, Moscou M., Pryor T. Infection of Brachypodium distachyon with selected grass rust pathogens // Mol Plant Microbe - 2013. - Vol. 26, Issue 8. - P. 946-957.

5. Garvin F. Investigating rust resistance with the model grass Brachypodium. 2011. Proceedings of the 2011 Borlaug Global Rust Initiative Technical Workshop. - 2011. - P. 88-91.

6. Barbieri , Marcel T.C., Niks R.E. QTLs for resistance to the false brome rust Puccinia brachypodii in the model grass Brachypodium distachyon L. // Genome. - 2012. - Vol. 55. - P. 152-163.

7. Mazzamurro , Marcel T.C., Milc J., Francia E., Roncaglia E., Malagoli G., Bicciato S., Tagliafico E., Pecchioni N. Transcriptome analysis in the interaction Brachypodium. - Puccinia brachypodii. 1st International Brachypodium Conference. - Italy. - 2013. - Р. 73.

8. Bettgenhaeuser. Deciphering the genetic basis of wheat stripe rust resistance in Brachypodium distachyon. 1st International Brachypodium Conference. - Italy. - 2013. - P. 76.

9. Taylor J., Cowan A.K. Xanthine dehydrogenase and aldehyde oxidase impact plant hormone homeostasis and affect fruit size in 'Hass' avocado // J. Plant Res. - 2004. - Vol. 117, Issue 2. - Р. 121-130.

Размещено на Allbest.ru