Изучение активности гена lawc на политенных хромосомах Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

«Изучение активности гена lawc на политенных хромосомах Drosophila melanogaster»



Введение

Актуальность выпускной квалификационной работы связана с широким распространением изучения мутаций в современной биологии и медицине. Изучаемые процессы являются наглядной моделью для выяснения механизмов индукции экспрессии генов.

Ранее в лаборатории Регуляции морфогенеза (ИБР РАН им. Н.К. Кольцова) на культуре клеток дрозофилы было показано явление активации экспрессии гена lawc, которое заключалось в увеличении концентрации мРНК этого гена в ответ на его подавление в условиях РНК-интерференции. Однако вопрос, на каком уровне происходит активация - на транскрипционном, или пост-транскрипционном - оставался неисследованным. Политенные хромосомы были выбраны как наиболее удобная модель для наших целей, поскольку активность гена на транскрипционном уровне можно визуализировать через формирование пуфа в районе локализации гена. При этом Drosophila melanogaster является наиболее удобным лабораторным объектом.

Целью данной работы является изучение активности гена lawc на политенных хромосомах Drosophila melanogaster.

В работе были поставлены следующие задачи:

1) Отработка метода приготовления давленных микропрепаратов

2) Активировать инактивирующую конструкцию, направленную на подавление экспрессии гена lawc по пути РНК-интерференции, в слюнных железах личинок дрозофилы, используя линию драйвер Sgs>Gal4, и проанализировать морфологию района локализации гена lawc.

3) Индуцировать кратковременную активацию инактивирующей конструкции в условиях теплового шока, используя линию драйвер hsp70>Gal4, и проанализировать морфологию района локализации гена lawc на политенных хромосомах слюнных жел?з личинок дрозофилы.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 История открытия политенных хромосом

В 1881 году Эдуард Бальбиани открыл политенные хромосомы в клетках слюнных желез, мышц, гиподермы, мальпигиевых сосудов личинок хирономусов (род насекомых из семейства комаров-дергунов). [2] Политенные хромосомы были описаны как «цилиндрические шнуры, многократно изгибающиеся и заполняющие весь объем ядра» (рис. 1.).

Рис.1 Первые рисунки политенных хромосом, деланные Э.Бальбиани в 1881 (слева) и 1890 (справа) гг. [Жимул?в, 1992 г. С. 14.83]

Справа - ядро клетки слюнной железы личинки Chironomus plumosus Слева - зачаток, по-видимому, макронуклеуса инфузории Loxophyllum meleagris.

Цилиндрические шнуры были названы «перманентной спиремой», так как Бальбиани считал, что в каждом ядре присутствует один такой шнур, напоминающий спирально закрученную нить - спирему.

Ф. Рамбоусек в 1912 году впервые предположил, что спирема имеет отношение к хромосомам. К такому же выводу пришли Д. Костов (1930г.), Х. Бауэр (1935 г), Н.К. Кольцов (1934 г).

В середине 30-х годов Т. Пайнтером были получены важные доказательства в пользу хромосомной природы спиремы.

В 1935 году П. Коллером был предложен термин «политенные хромосомы», 1937 г был принят по рекомендации С. Дарлингтона.

1.2 Морфология политенных хромосом

Обычно политенные хромосомы изучают на давленных препаратах: нужные органы (чаще всего это слюнные железы личинок) фиксируют в кислых фиксаторах, красят в различных красителях и затем раздавливают между предметным и покровным стеклами. Диски и междиски становятся отчетливо видны.

Политенные хромосомы могут находиться в ядре в разных положениях:

· независимое друг от друга;

· связанное: прицентромерные районы всех хромосом объединены в общий хромоцентр;



Рис.2 Хромосомы Chironomus tentans без хромоцентра (а) и Drosophila virilis с хромоцентром (б) (Из:Beermann, 1962 и Губенко, 1983, в кн. Жимул?в, 1992, стр. 131)

Морфология политенных хромосом может быть различной, в зависимости от степени синапсиса (сближения) хроматид: [2]

· Если коньюгация гомологичных хроматид максимальна, образуются классические политенные хромосомы, т.е. рисунок дисков и междисков очень четкий, и хромосома напоминает жгут.

· Если степень коньюгации хроматид минимальна, образуется полиплоидное ядро с ретикулярной структурой. Это скрытая политения.

· Если конъюгация некоторых хромосом набора очень сильно нарушается, то эти хромосомы полностью утрачивают рисунок дисков, становятся диффузными, как “помпоны”



Рис.3 Степень конъюгации и расположение хроматид в политенных хромосомах классического типа (а), при скрытой политении (б) и в помпоноподобных хромосомах.

Опытным путем доказано, что более четкая картина дисков получается, если все процедуры по выращиванию личинок проводится при более низких температурах. [2]

Морфология политенных хромосом у самок и самцов одинакова. Но у самцов дрозофилы X-хромосома имеет некоторые отличия: она более рыхлая, слабее окрашивается и площадь больше, чем у X-хромосом самок. Количество негистоновых белков в X-хромосоме самца в полтора раза выше, чем в одной хромосоме самки. X-хромосома самца синтезирует вдвое больше РНК. Это явление называется дозовой компенсацией.



1.3 Хромомерный рисунок в политенных хромосомах

Политенные хромосомы классического типа имеют - поперечную исчерченность. Вдоль каждой отдельно взятой хроматиды расположены, чередуясь, участки более (хромомеры) или менее (межхромомеры) плотной упаковки ДНК. Во время конъюгации сестринских хроматид образуются поперечные полосы - диски. Деконденсированные участки хроматид между хромомерами в политенной хромосоме образуют междиски.

Рис.4 Схематическое изображение политенной хромосомы.



Было обнаружено и такое свойство хромосом как уникальность рисунка дисков. Было замечено, что в случае локального асинапсиса (отсутствия конъюгации) гомологов порядок дисков разной толщины, был одинаковым на обоих гомологах.

Размеры и морфология дисков, расстояния между соседними дисками строго индивидуальны. В результате отдельные группы дисков могут служить маркерами не только районов, но и целых хромосом, например, у Drosophila melanogaster сдвоенные крупные пуфы, названные “китайскими фонарями” , группа из четырех близко расположенных черных дисков - “четыре брата”, длинный участок очень малого диаметра - “гусиная шея” и т.д. Все эти названия были даны К. Бриджесом еще в 1935 году. [2] Если тот или иной фрагмент хромосомы принесен перестройкой в новое положение, можно точно определить точки разрывов хромосом, а перенесенный сегмент - идентифицировать в новом положении. Все это позволяет строить цитологические карты, очень удобные тем, что можно определить положение того или иного гена, точки разрыва хромосомной перестройки, участка локализации ДНК методом гибридизации in situ или меченых антител на различные компоненты хромосом.

Построение цитологических карт включает два этапа:

а) выявление, зарисовку или фотографирование дисков и особенностей морфологии хромосом;

б) нанесение наименований дисков на изображение хромосомы;

К. Бриджес предложил принцип обозначения дисков на картах. Каждое из пяти длинных плеч хромосом дрозофилы он поделил на 20 равных по длине сегментов, начинающихся с крупного хорошо заметного диска. Четвертая, микрохромосома, поделена на два таких сегмента. В итоге получается 102 района, которые обозначают цифрами.



Рис.5 Фрагмент цитологической карты Х-хромосомы.

Это цифровые подразделения карты, каждое из которых поделено еще на 6 участков, обозначенных буквами (A- F) и содержащих по несколько дисков. Внутри буквенных подразделений каждый диск вновь обозначен цифрами. Таким образом, положение любого диска можно совершенно точно описать. Рисунок дисков и междисков специфичен для каждого вида и характерен для каждой хромосомы в разных органах или на разных стадиях развития.

1.4 Явление политении

Клетки с политенными хромосомами отличаются от клеток, делящихся митозом рядом особенностей:

1. При формировании политенных хромосом теряется весь механизм клеточного деления после каждого удвоения ДНК в ядре, в результате чего клеточный цикл в клетках этого типа состоит из:

· двух фаз S, когда синтезируется ДНК;

· G - межсинтетической;

Такой тип клеточного цикла у дрозофилы устанавливается в середине эмбрионального развития.

2. В конце каждого периода репликации дочерние хроматиды не сегрегируют (т.е. не расходятся), они остаются спаренными друг с другом.

3. Сформировавшиеся политенные хромосомы не могут митотически делиться.

4. Ядерная оболочка и ядрышко остаются интактными в ходе следующих один за одним циклов репликации ДНК.

Политения возникает в тканях, органах или на тех стадиях развития, когда есть необходимость быстрого развития органа при высоком уровне функционирования. Органы, содержащие клетки с политенными хромосомами, как правило, вовлечены в процессы интенсивной секреции, осуществляемые в течение короткого времени на фоне быстрого роста. Таковы питающие клетки ооцитов, трофобласт, глоточные, шелкоотделительные, слюнные железы, антиподы, суспензор, эндосперм.

Особенности политении создают предпосылки для выполнения этих функций. Поскольку в клеточном цикле полностью блокирован весь механизм деления ядра и клетки, процесс редупликации хромосом максимально упрощен и ускорен. В результате за счет политенизации масса органа нарастает значительно быстрее, чем за счет митотических делений диплоидных клеток. Очевидно также, что клеточный цикл по типу политении способствует сохранению высокой функциональной активности органа, так как нет перерывов, связанных с митозами.

1.5 Генетическая организация политенных хромосом

1.5.1 Диски

Диски (хромомеры) в политенной хромосоме представляют собой участки более плотной упаковки ДНК.

В 1970-1980-х годах большинство ученых-генетиков придерживалось гипотезы о том, что один диск соответствует одному гену. К такому выводу они пришли из-за фиксированного расположения дисков и междисков.

Позднее, после проведенных экспериментов, данная гипотеза была опровергнута. Были клонированы области генома дрозофилы с разной длиной. Затем отдельные фрагменты этих областей использовали как зонды для идентификации мРНК, которые синтезируются на данном участке. Этот метод позволил выявить гены на физической карте ДНК. Оказалось, что количество мРНК превышает в 3-5 раз число дисков. У дрозофилы обнаружено около 12 тыс. генов, что превышает количество дисков. Значит, каждый диск должен содержать по несколько генов.

Затем начали предполагать, что гены в одном диске действуют координировано или выполняют оду функцию. Это предположение тоже было опровергнуто, т.к. в ходе опытов выяснили, что хромосомные перестройки не влияют на работу диска. [10]

Также было доказано, что диск и междиск не составляют единой структуры.

1.5.2 Междиски

Междисками (межхромомерами) называют участки политенной хромосомы с менее плотной упаковской ДНК.

Количество ДНК, приходящееся на все междиски, составляет 3-5% от общего е? количества в политенных хромосомах.

О генетической функции междисков известно немного. Было показано, что при инсерции (вставке) транспозонов в междиски, жизнеспособность у гомозигот по инсерциям не изменяется. [10]

Была выделена ДНК одного из междисков и расшифрована ее первичная структура. Из ДНК дрозофил, была изготовлена библиотека клонов, выделили ДНК, имеющую фрагменты транспозона и междиска. Последний фрагмент использовали в качестве зонда для поиска клона ДНК, содержащей полноразмерный междиск.

Последовательности нуклеотидов междиска были секвенированы и проанализированы по компьютерным программам. Оказалось, что фрагмент ДНК длиной 1289 п.н. и заключающий в себе материал междиска, имеет следующие особенности:

1) Является уникальным, поскольку в геноме нет других фрагментов, гомологичных ДНК междиска.

2) Обогащен (53,4%) А-Т-парами нуклеотидов

3) В его пределах найдено 14 мотивов различных регуляторных элементов и две перекрывающиеся рамки считывания.

4) Анализ частот использования кодонов в рамках считывания, найденных в ДНК междиска, а также тех, которые участвуют в кодировании аминокислот у дрозофилы, показал достоверные различия. Это может свидетельствовать либо о том, что эти рамки считывания не кодируют информацию для синтеза, либо о том, что они кодируют белки с использованием редких кодонов.

1.5.3 Пуфы

Эдуард Бальбиани, одновременно с обнаружением гигантских хромосом, описал вздутия в политенных хромосомах в 1881 г. Позднее, в 1910-1912 гг Эрхард и Альвердез назвали эти вздутия Кольцами Бальбиани. [1]

Пуфами называют вздутия политенных хромосом. Наличие пуфа говорит об активном состоянии гена, в котором происходит активный синтез РНК.



Рис.6. Пуфы на политенных хромосомах.

Одной из особенностей третьей хромосомы дрозофил Пайнтер в 1935 году назвал серию слабо окрашенных сегментов. Эти сегменты обнаруживают поразительное варьирование диаметра, хотя у каждой конкретной личинки их форма и размеры довольно константны

У некоторых особей они могут быть в три раза толще, чем остальная часть хромосомы, у других личинок утолщений в данных районах нет, в них обычные диски. К. Бриджес в том же году назвал некоторые из вздутий, например в районе 2B, пуфами (“вздутиями”). Работая с хромосомами личинок сциарид Д.Ф. Полсон и К.В. Метц нашли, что гигантские вздутия, характерные для этого вида, формируются из дисков, а затем вздутия вновь превращаются в диски.

1.5.3.1 Контроль пуфов

У многих видов отряда Diptera, у которых личиночное развитие проходит быстро (за несколько дней), легко наблюдаются изменения картин пуфов. У наиболее изученного вида - дрозофилы - детально описано пуфирование всех хромосом на протяжении последних 24 часов личиночного развития и 12 часов - предкуколочного. [9]

Все пуфы можно разделить на два типа:

· крупные (собственно вздутия);

· малые (увеличения диаметра хромосомы нет, но диски данного района уже разрыхлены, деконденсированы, т.е. транскрипционно активны);

Каждая стадия развития личинки или предкуколки характеризуется определенным набором (паттерном) крупных пуфов. В ходе развития эти наборы закономерно изменяются.

У наиболее молодых личинок, у которых политенные хромосомы уже достаточно крупные и доступны для анализа, присутствуют только так называемые межлинечные пуфы. В самом конце личиночного развития, примерно за 6 часов до формирования предкуколки (пупариума), на фоне резкого повышения титра гормона экдистерона эти пуфы инактивируются и начинают формироваться другие пуфы, сначала “ранние”, т.е. раньше других (примерно через 30 минут) среагировавшие на поступление гормона, затем “поздние” - реагирующие с задержкой на несколько часов.

У предкуколок в момент формирования пупариума (0-час) активность пуфов наивысшая, т.е. в геноме наибольшее число пуфов активны именно на этой стадии развития. Так же именно на этой стадии развития размеры многих пуфов максимальны.

После достижения пика активности в последующие 2-3часа происходит быстрый спад активности пуфов, когда в хромосомах присутствуют единичные пуфы. В конце стадии предкуколки опять на фоне повышенного титра экдистерона проходит повторная волна ранних и поздних пуфов Исследования У. Клевера и П. Карлсона, проведенные на хирономусе

В 1960 году, и Х.И. Беккера - на дрозофиле в 1962, продемонстрировали, что активность многих пуфов, возникающих в конце личиночного развития, индуцируется гормоном экдизоном, контролирующим метаморфоз у насекомых.

Позже У. Клевер в работах на хирономусе показал, что экдизон вызывает каскад взаимосвязанных изменений, в которых гены, активируемые гормоном раньше, влияют на индукцию генов более поздно реагирующих на гормон.

Наиболее фундаментальные исследования процесса активирования генов (пуфов) под действием гормона провел английский генетик М. Эшбернер.

Исследования гормональной регуляции активности генов удобнее проводить не на живом организме, а в системе in vitro (в пробирке), благодаря чему можно по усмотрению экспериментатора изменять условия обработки гормонами, т.е. изменять продолжительность их воздействия, концентрации, использовать вещества, прерывающие протекание различных процессов (ингибиторы). В результате серии экспериментов М. Эшбернер показал, что ранние и поздние пуфы различаются по многим признакам.

Во-первых, это реакция на ингибиторы синтеза РНК и белков. Если через час после начала инкубации клеток слюнных желез с циклогексимидом (ингибитором синтеза белков) добавить гормон экдистерон, ранние пуфы все же образуются, т.е. для их индукции не требуется предварительного синтеза белков. Они используют те белки, которые были синтезированы ранее. В поведении ранних пуфов обнаружилась еще одна особенность. Обычно они быстро реагируют на гормон - активируются, через четыре часа развиваются до максимальных размеров, затем полностью инактивируются, и материал пуфа, компактизуясь, превращается в диск. Под действием циклогексимида ранние пуфы нормально активируются, но их обычной инактивации не происходит. Этот факт может свидетельствовать о том, что инактивация ранних пуфов - такой же гормон-индуцируемый процесс, как и их индукция. Отсюда вытекает вывод: белки, выключающие активность ранних пуфов, кодируются в самих ранних пуфах.

Поздние пуфы на фоне ингибирования синтеза белка не индуцируются. Это означает, что для их индукции необходимы белки, синтезируемые под действием гормона экдизона, т.е. в ранних пуфах.

Во-вторых, как оказалось, ранние и поздние пуфы еще более различаются по реакции на удаление гормона из клеток. Если некоторое время инкубировать железы в пробирке в растворе, содержащем гормон, а затем поместить в раствор без гормона, ранние пуфы быстро уменьшаются в размерах и вовсе исчезают. На индукцию поздних пуфов отмывка гормона влияет очень специфично. Если удалять гормон после 1,2,3-х часов от начала инкубации, то ничего не происходит. Если инкубация протекала 4 и более часов, то удаление гормона приводит к быстрой преждевременной индукции поздних пуфов. Эти эксперименты доказывают, что для поддержания активности ранних пуфов гормон нужен постоянно. Этот же гормон блокирует развитие поздних пуфов до определенного момента.

Для объяснения результатов своих опытов М. Эшбернер предложил следующую модель. Гормон обратимо связывается с молекулой белка рецептора. Рецептор облегчает проникновение гормона в клетку и связывание гормона с генами. Гормон-рецепторный комплекс взаимодействует с регуляторными областями генов, расположенных в ранних пуфах, и активирует их. Для активности ранних пуфов нужно постоянное присутствие гормона. Отмывка его приводит к инактивации этих генов. В то же время гормон-рецепторный комплекс взаимодействует с регуляторными районами генов, расположенных в поздних пуфах, и инактивирует их. По прошествии некоторого времени после начала действия гормона ранние пуфы нарабатывают белковые продукты, которые действуют двояко. Некоторые из этих белков инактивируют прежде активные ранние пуфы. Поэтому подавление синтеза белка предотвращает инактивацию ранних пуфов. Другие белки из этой категории связываются с регулирующими зонами поздних генов, вытесняют экдизон-рецепторный комплекс, в результате чего активируются поздние пуфы. Очевидно, что если подавить синтез белка, то поздние пуфы развиваться не будут: в клетках еще не синтезированы белки Р.

Легко объяснить роль отмывки гормона. Поскольку для поддержания активного состояния ранних пуфов необходимо постоянное пребывание комплекса гормон-белок рецептора на регуляторных районах генов, то удаление гормона приводит к быстрой инактивации пуфов. Сложнее с реакцией на отмывку поздних пуфов. Если начать удалять гормон слишком рано, когда белки еще не синтезированы, то отмывка не вызывает преждевременной индукции поздних пуфов. Белковые продукты синтезируются примерно через 3-4 часа после начала действия гормона.

Данная модель описывает взаимодействие только тех пуфов, которые возникают в конце личиночного развития (последние 6 часов).

хромосома цитологический пуф политенный

1.5.4 Пуфы теплового шока и синдром клеточного стресса

После того, как было доказано, что пуфы являются морфологическим проявлением генетической активности, начались многочисленные эксперименты, в которых пытались модифицировать активность пуфов с помощью различных соединений и факторов среды. Результаты были получены сразу же.

Ф. Ритосса в 1962 году поместил личинок Drosophila busckii в условия высокой температуры, тем самым индуцировав несколько новых пуфов, которые возникали также в ответ на обработку клеток ферментными ядами, блокирующими окислительное фосфорилирование. Эти данные привели к открытию новой клеточно-физиологической системы, отвечающей на различные типы стрессов на клеточном уровне - так называемый синдром теплового шока.

Пуфы теплового шока были найдены у всех изученных видов, имеющих политенные хромосомы. Их число в геноме варьирует от 1 до 9. Индуцируются при температуре 35-37єС. [8]

Клетки очень быстро реагируют на индуцирующие факторы: формирование пуфов начинается через одну минуту после повышения температуры, через 20-30 минут размеры пуфа достигают максимума. Регрессия происходит в течение нескольких часов.

Синтез белков теплового шока - стрессовая программа, включаемая различными стрессирующими факторами. Начинается быстрая перестройка работы клетки.

Белки теплового шока представлены группой высокомолекулярных (60-110 кДа) и низкомолекулярных (15-35 кДа) белков. У дрозофилы высокомолекулярные белки теплового шока имеют массу - 83 кДа. [8]

В ответ на стресс особый полипептид, называемый фактором транскрипции при тепловом шоке (HSTF или HSF), связывается с регуляторной зоной генов теплового шока - элементом теплового шока HSE и включает активную транскрипцию данных генов.

Гены белков теплового шока экспрессируются не только под действием теплового шока, но и в ходе нормального развития.

1.6 Ядрышки

Было выяснено, что формирование ядрышек связано с определнными участками хромосом. Ф.Ритосса и С. Спигелмэн в 1965 г установили, что ядрышко - участок хромосомы, который называется ядрышковым анализатором. В нем транскрибируются гены рибосомных 18S РНК и 28S РНК. С одного гена единовременно считывается 100 молекул РНК.

Все гены, входящие в ядрышковый организатор, функционируют независимо друг от друга. [6]

1.6.1 ДНК-пуфы

К.Паваном и М.Бройером в 1954 году было установлено, что в некоторых пуфах происходит амплификация ДНК.

В результате декомпактизации обычные РНК-пуфы теряют окраску, но ДНК- пуфы остаются темными из-за накопления дополнительной ДНК. Такие ДНК-пуфы возникают в слюнных железах на поздних стадиях развития и кодируют белки секреции слюнных желез.

Одновременно с процессом амплификации происходит транскрипция.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Drosophila melanogaster как лабораторный объект

Данное исследование проводилось на классическом объекте генетики - мухе дрозофиле (Drosophila melanogaster).

Муха была выбрана из-за следующих особенностей:

* высокая плодовитость (от одной пары особей можно получить от 100 до 175 потомков);

* небольшой период развития (10-14 дней);

* малое число хромосом (2n = 8);

* Наличие в клетках слюнных жел?з личинок дрозофилы политенных хромосом;

* большое число легко различимых изученных признаков;

* удобство разведения в лабораторных условиях;

* ярко выраженный половой диморфизм;

2.2 Жизненный цикл

Рис.7. Жизненный цикл мухи дрозофилы.

Самка откладывает яйца в субстрат. Яйца удерживаются в субстрате благодаря небольшим отросткам. Из яйца появляется личинка, которая активно питается, проходит три стадии развития и окукливается.

При оптимальной температуре (25°С) продолжительность стадий развития:

* эмбриональное развитие (24 - 25 часов);

* личиночный период (4 - 5 суток);

* стадия куколки (3 - 4 суток).

Жизненный цикл дрозофилы составляет в среднем 10 дней.

2.2.1 Содержание мухи

В лаборатории мух содержат в плоскодонных пробирках с питательной средой, которые закрывают пробками из ваты.

Главными составными частями среды, на которой разводят дрозофилу в лабораториях, являются сахар и дрожжи. [3]

Сахар добавляют в среду в основном в виде изюма, который является субстратом для дрожжей. Дрожжи предохраняют среду от поражения плесенью и являются главным элементом пищи дрозофилы.

В качестве составного компонента в питательную среду входит агар-агар, придающий желеобразную консистенцию.

Чаще всего варят корма с добавлением манной каши. Содержат мух при комнатной температуре, либо в термостате.

Замаривание мух происходит с помощью специальной морилки с диэтиловым эфиром. Делается это для удобства работы.

В ходе опыта мухи пересеивались в новые пробирки каждый день, чтобы избежать перенаселения личинок в пробирке (в пробирке должно быть не более 20 личинок).

2.2.2 Отбор девственных самок

Отбор девственных самок провести очень легко, так как у дрозофилы выражен половой диморфизм. Самки крупнее, имеют более круглое брюшко. Брюшко самцов более узкое и на конце брюшка отчетливо виден половой аппарат. Самцы также имеют половые гребешки на лапках.

Самки отбираются через каждые шесть часов. Делается это, потому что самцы становятся фертильными (способными к оплодотворению) через шесть часов после вылупления из куколки.

Девственные самки отличаются от оплодотворенных более светлым телом.

2.3 Используемые в работе линии

Исследуемый ген: lawc (leg-arista-wing-complex), который отвечает за эмбриональное развитие и развитие крыльев.

1) Линия с конструкцией Sgs ( Salivary gland secretion)

2) Линия-драйвер Hsp-Gal4 ( heat shock protein)

3) Линия с конструкцией Ri13 - содержит конструкцию, направленную на инактивацию гена lawc по пути РНК-интерференции.

В ходе работы были поставлены два эксперимента: Эксперимент 1: +Sgs x >Ri13

Мухи содержались в термостате при температуре 27єС Эксперимент 2: +hsp-Gal4 x >Ri13

Мухи содержались при комнатной температуре. Тепловой шок давался один раз на короткое время.

2.4 Приготовление фиксированных микропрепаратов

1) Дать личинкам heatshock (нагревать на водяной бане в течение 30 мин) для активации конструкции (для + hsp-Gal4 x > UAS-Ri13) [2]

Содержать личинки в термостате при t=27єC (для +Sgs x >Ri13)

2) Выделить слюнные железы из личинки дрозофилы

3) Зафиксировать слюнные железы в уксусной кислоте (CH3COOH) на предметном стекле и накрыть покровным стеклом [1]

4) Заморозить микропрепарат в камере с жидким азотом (15 мин) [1]

5) Достать готовый микропрепарат, удалить покровное стекло и промыть в стаканчике с этиловым спиртом два раза по 15 мин. [1]

6) Высушить и окрасить 4%-раствором Гимзы (Азур-Эозин метиленовый синий) в течение 2-х минут [1]

В ходе работы было сделано и проанализировано более 100 давленных микропрепататов.



3. РЕЗУЛЬТАТЫ

В своей работе мы исследовали индуцибельную экспрессию гена D. melanogaster - lawc - на политенных хромосомах слюнных жел?з личинок дрозофилы. Этот ген локализуется в цитологическом районе 7Е на карте политенных хромосом (рис. 8).

Нужный участок политенной хромосомы находился с помощью цитологической карты.

В ходе опыта был сделан контрольный микропрепарат из слюнных желез мух линии Ri13 (содержались при комнатной температуре, тепловому шоку не подвергались). Предварительные данные (Черезов, неопубл.) показывали, что на стадии личинки исследуемый ген неактивен, чему соответствовала полоса в районе 7Е на политенных хромосомах контрольной линии (Рис. 8).

Рис. 8. Политенная Х-хромосома. Контроль. Пуфа в 7Е-районе нет. Полоса в районе 7Е говорит о морфологически неактивном хроматине этого района.

Активацию гена lawc проводили в потомках от скрещивания +Sgs x >Ri13 с постоянными условиями в термостате. При этом использовалась линия- драйвер Sgs-Gal4, которая активировала конструкцию UAS-Ri13 (линия Ri13) в гибридных потомках от этого скрещивания. Далее, из слюнных жел?з гибридных личинок Sgs/Ri13 были получены препараты политенных хромосом и проанализирован район локализации гена lawc - 7E.

Были обнаружены слабые пуфы, и исчезновение полосы гетерохроматина в 7Е районе, что говорит об активности исследуемого гена (рис. 9).

Рис. 9. Политенные хромосомы слюнных жел?з личинок линии Ri13(сверху контроль), и Sgs/Ri13 (снизу - результат эксперимента). Видно исчезновение полосы гетерохроматина в районе 7Е на нижней фотографии (стрелка).

В результате опыта +hsp-Gal4 x >Ri13 с воздействием теплового шока в течение 30 минут также были получены пуфы на исследуемых участках (рис. 10).

Рис.10 Политенные хромосомы слюнных желез личинок линии Ri13 (сверху контроль), и hsp-Gal4/Ri13 (снизу - результат эксперимента). Отчетливо видно вздутие в 7Е районе (районе локализации исследуемого гена).



ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В ходе работы было установлено, что линию Ri13 можно использовать в экспериментах по визуализации экспрессии гена lawc на политенных хромосомах. Была показана активность гена lawc на уровне транскрипции. Таким образом, мы In vivo продемонстрировали явление РНК-активации гена lawc, которое заключается в усилении экспрессии гена в ответ на двухцепочечные молекулы РНК, комплементарные его транскриптам, впервые показанное для дрозофилы в нашей лаборатории (Черезов, неопубл). Конструкция UAS-Ri13 мух линии Ri13 способна синтезировать эти двухцепочечные комплементарные lawc, РНК после е? активации драйвером. Исходно, эта конструкция была синтезирована с целью инактивировать экспрессию lawc по пути РНК-инреференции (нок-даун гена), однако, вместо инактивации, ген lawc активировал свою работу, что было показано на культуре клеток дрозофилы. В своей работе на политенных хромосомах мы подтвердили предварительный результат и показали, что активация ид?т на уровне транскрипции.

В будущем мы планируем дальнейшие эксперименты по гибридизации in situ хромосом этой линии с меченым зондом из района локализации гена, для более над?жной демонстрации результата нашего эксперимента.



ВЫВОДЫ

1) Результатом инактивации гена lawc в условиях РНК-интерференции в слюнных железах, используя линию-драйвер Sgs>Gal4, стало формирование пуфа в районе локализации этого гена, что говорит об активации его экспрессии на уровне транскрипции мРНК.

2) Результатом инактивации гена lawc в условиях РНК-интерференции в слюнных железах, используя линию-драйвер Hsp70>Gal4, стало формирование пуфа в районе локализации этого гена, что подтверждает первый вывод.



Список литературы

1. Воронцова Ю.Е., Черезов Р.О, Симонова О.Б. Влияние мутаций гена lawc/Trf2 на формирование хромоцентра и расхождение хромосом у Drosophila melanogaster. // Генетика. 2013.

2. Жимул?в, И.Ф. Общая и молекулярная генетика [Текст]: учеб. пособие для вузов / И.Ф. Жимул?в; под ред. Е.С. Беляева, А.П. Акифьева - 4-е изд., стер. - Новосибирск: Сиб. Унив. Изд-во, 2007.

3. Копытова Д.В., Краснов А.Н., Симонова О.Б. и др. Изучение гена lawc- trf2 Drosophila melanogaster и его белкового продукта //ДАН. 2005. Т.405. №1. С.125-127.

4. Медведев Н.Н. Практическая генетика. Издание второе, исправленное и дополненное, 1968 г.

5. Модестова Е.А., Воронцова Ю.Е.,. Корочкин Л.И. и др. Получение летальных мутаций гена leg-arista-wing complex у D. melanogaster II ДАН. 2005. Т. 403, №4. С. 564-565.

6. Прокофьева-Бельговская А.А. Гетерохроматические районы хромосом. М:. Наука, 1986, 431 с.

7. Симонова О.Б., Кузин Б.А., Георгиев П.Г. и др. Новая регуляторная мутация Drosophila melanogaster II Генетика. 1992. № 2. Т.28. С. 164- 167.

8. Хлебодарова Т.М. Как клетки защищаются от стресса? // Генетика. 2001 (в печати)

9. Richards G. The ecdysone regulatory cascades in Drosophila // Advances in Developmental Biology, 1997. Vol. 5. P. 81-135

10. Zhimulev I.F. Genetic organization of polytene chromosomes // Advances in Genetics. 1999. Vol. 39. P. 1-599

Размещено на Allbest.ru

...