Теоретическое исследование барьеров внутреннего вращения и механизма сворачивания белков

Glu 713 20 2,81 630 13 2,06 622 5 0,80

Lys 882 38 4,31 716 15 2,09 710 9 1,27

Arg 485 18 3,71 422 9 2,13 418 5 1,20

Ala 1247 41 3,29 1053 23 2,18 1039 9 0,87

Cys 365 11 3,01 315 7 2,22 311 3 0,96

Ser 1179 60 5,09 988 26 2,63 976 14 1,43

Gln 548 25 4,56 456 14 3,07 446 4 0,90

Tyr 536 22 4,10 481 16 3,33 472 7 1,48

His 375 23 6,13 281 11 3,91 276 6 2,17

Asp 801 51 6,37 689 33 4,79 675 19 2,81

Asn 716 113 15,78 596 93 15,60 551 48 8,71

? 13335 507 3,8 11233 301 2,68 11067 140 1,26

Gly 1371 798 58,20 1141 688 60,30 1141 688 60,30

Примечание. а- в 81 структуре, б- в 73 структурах, в- в 73 структурах без учета остатков, чьи координаты определены некорректно. Столбцы 1-3: общее число остатков, число остатков в положительных конформациях, относительное число остатков в положительных конформациях. ?- неглициновые остатки суммарно.

В результате анализа литературы мы обнаружили, что координаты атомов 111 остатков определены плохо: или их не видны на карте электронной плотности, или они имеют слабую электронную плотность, или обладают высоким температурным фактором (табл.5, столбец в). Таким образом, из 301 остатка атомные координаты 170 остатков нуждаются в уточнении. Если исключить эти остатки из расчета, то относительное число неглициновых остатков в положительных конформациях составило бы 1,2%.

Представленные выше результаты, полученные нами из анализа белковых структур, по нашему мнению, являются вполне надежной поддержкой сделанного нами из расчетов ППЭ пептидов вывода о значительности величины барьера при вращении вокруг NCб связей и о невыгодности положительных конформаций неглициновых остатков в белках.

Глава 6. Модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ) для конформационного анализа и изучения взаимодействия олигопептидов и других биоорганических молекул. Оценка потенциальной энергии молекул. В 1970-е гг. в работах Голованова, Соболева и Волькенштейна (ДАН СССР: 1977,236,1140; 1977,237,375; ЖСХ,1979, 20,26;Мол.биол,1979,13,633) были высказаны соображения, которые можно было использовать для создания простого расчетного метода для конформационного анализа и изучения взаимодействия биоорганических молекул. Предполагается, что молекулы составлены из фрагментов, в качестве которых рассматриваются не атомы, а локализованные единичные связи (ЛЕС) и неподеленные электронные пары (НП). Энергия взаимодействия между двумя молекулами А и В (межмолекулярное взаимодействие - ММВ), или двумя группами А и В одной молекулы (внутримолекулярное взаимодействие - ВМВ) определяется суммарной энергией взаимодействия их фрагментов а и b - Eab:

внутренний вращение белок биоорганический

= (1),

Eab оценивается по выражению:

Eab = Eкул. + Eобм.отт. + Eпер.зар. + Eдисп. , (2)

Вклады в правой части обозначают соответственно: кулоновский, обменного отталкивания, переноса заряда, дисперсионный. Они оцениваются по следующим соотношениям:

Eкул. = qi qj (Ri?j)-1 , Eобм.отт. = K1 (SЗaЗb)2 (Rab)-3 ,

Eпер.зар. = - K2 [(SЗаCb)2 + (SСаСb)2], Eдисп. = - K3 (Rab)-6 (3),

где qi , qj - заряды фрагментов a и b, Rij - расстояние между зарядовыми центрами. SЗaЗb - интеграл перекрывания занятых молекулярных орбиталей (МО) фрагментов a и b, SЗаCb - интеграл перекрывания занятой МО фрагмента a со свободной МО фрагмента b, SCаЗb - интеграл перекрывания свободной МО фрагмента a с занятой МО фрагмента b. Rab - расстояние между центрами дисперсионных сил фрагментов, K1, K2, и K3 - параметры.

Кулоновский вклад Екул вычисляется из данных о распределении зарядов в молекуле. Считается, что в каждой молекуле имеются положительные заряды атомов, определяемые суммой заряда ядра и заселенностью орбиталей атома, и отрицательные точечные заряды связей, расположенные на связи между атомами на расстоянии ковалентного радиуса. Величины зарядов определяются по данным электрических моментов тестовых молекул.

Дисперсионный вклад оценивается на основе формулы Лондона:

Е (D) = 1.51IaIb (Ia + Ib )-1 ?a?b (Rab)-6 , по выражению Едисп. = f(Rab)*E(D), (4)

где Ia и Ib - потенциалы ионизации, а ?a и ?b - поляризуемости фрагментов a и b, Rab - расстояние между центрами фрагментов, f(Rab) - функция, медленно убывающая с расстоянием. Объединение выражений (1) - (4) дает общий вид функционала для вычисления энергии взаимодействия двух молекул А и В или двух групп А и В одной молекулы:

EAB = = (q qj (Rj)-1 -1.51*f (Rab)*IaIb (Ia+Ib )-1ab (Rab)-6 - K2 [(SЗаCb)2 +(SСаСb)2] + K1 (SЗaЗb)2 (Rab)-3 (5)

Для вычисления EAB по выражению (5), необходимо: смоделировать фрагменты (единичные, двойные и сопряженные связи, НП), выбрать характеристики фрагментов, уточнить выражения для вкладов и вид функционала, определить параметры.

На основе изложенного выше алгоритма нами был создан метод связь-связевых взаимодействий (Башаров и др.1984а-1984е) и его улучшенная версия - метод ФФВ (Башаров и др. 1989а,1989б). Метод ФФВ позволил реалистически оценить ВМВ и ММВ в малых молекулах. Однако он имел по меньшей мере два серьезных недостатка: а) ВМВ и ММВ оценивались независимо с использованием двух различных наборов параметров К1 и К2; б) для расчетов ВМВ был введен дополнительный параметр «смягчения» кулоновского взаимодействия НП, кратных и сопряженных связей. Кроме того, метод давал завышенные значения равновесных межмолекулярных расстояний для некоторых комплексов. Эти недостатки оставляли под сомнением применимость метода для расчетов длинных цепных молекул - в том числе и полипептидов, в силу того, что таких молекулах взаимодействие отдаленных вдоль цепи фрагментов можно рассматривать как межмолекулярное, а взаимодействие близких - как внутримолекулярное.

Модифицированный метод ФФВ. Вклады оценивали по формулам (3) - (4), энергию взаимодействия - по выражению (5). Модели фрагментов использовали те же, что и в методе ФФВ. В отличие от предыдущей версии метода, дисперсионный вклад оценили иначе. Известно, что формула Лондона дает завышенные значения энергии взаимодействия в средних расстояниях. Этот эффект учитывается медленно убывающей с расстоянием функцией f(R). В предыдущей версии метода ее мы определяли как: f(Rab) = 1, если Rab > 4.5Е, а в расстояниях Rab < 4.5Е дисперсионный вклад считали постоянным и равным его значению при Rab=4.5Е: Едисп. = ЕD(Rab) = ED(Rab=4.5Е). В новой версии функцию f(R) мы определяли из расчетов тестовых молекул в виде: f(Rab) = (2Rab/(R0 + Rab))2, где R0 = Rab если Rab > 4.5Е, R0 = 4.5Е если 2Е < Rab < 4.5Е, R0 = 4.5Е, Rab = 2.0Е если Rab < 2.0Е. В предыдущей версии метода потенциал ионизации всех фрагментов мы считали одинаковым и равным 13,6эв. В новой версии каждый фрагмент имел собственный потенциал ионизации, которого мы определяли из потенциалов ионизации простых тестовых молекул. Далее нами были выбраны или определены, из расчетов тестовых молекул, новые характеристики и параметры ЛЕС, НП, кратных и сопряженных связей: величины и распределение зарядов, расположение орбитальных центров, зарядов и дисперсионных сил. Из расчетов тестовых молекул был найден один набор параметров K1 и K2 для оценок как ВМВ так и ММВ (вместо двух наборов в предыдущей версии). Подробно метод описан в диссертации и опубликован (Башаров 1995а).

Метод ФФВ и внутримолекулярное взаимодействие (ВМВ). Рассчитали БВВ и дипольные моменты значительного числа «тестовых» молекул (углеводороды насыщенные и с двойными и сопряженными связями, эфиры, альдегиды, кетоны, органические кислоты, аминокислоты, амиды, пептиды), для которых были известны экспериментальные или полученные в строгих ab initio расчетах значения соответствующих величин. Во всех рассмотренных примерах точно воспроизводятся предпочтительные и метастабильные конформации, БВВ и дипольные моменты молекул. Некоторые результаты приведены в таблицах 6 и 7.

Метод ФФВ и межмолекулярное взаимодействие (ММВ). В расчетах мы выясняли предпочтительную конфигурацию, равновесное расстояние, энергию связывания и дипольные моменты димеров и комплексов органических молекул: неполярных, полярных и неполярных с полярными. С физико-химической точки зрения, исследованные классы комплексов интересны тем, что они являются простыми моделями гидрофобных и гидрофильных взаимодействий в белках. Результаты расчетов комплексов мы не приводим; они представлены в диссертации в трех таблицах и опубликованы в печати (Башаров 1995а). Анализ отдельных вкладов в общую энергию показал, что предпочтительная конфигурация комплексов неполярных молекул формируется в основном за счет дисперсионного вклада. Определяющим вкладом в стабилизацию комплексов неполярных молекул с полярными, а также димеров и комплексов полярных молекул является кулоновский.

Полученные в наших расчетах результаты свидетельствуют о том, что метод ФФВ довольно хорошо воспроизводит барьеры внутреннего вращения в молекулах различных классов, предпочтительные конфигурации димеров и комплексов различных молекул и энергию их связывания. Это дает основание полагать, что данный метод может быть использован для изучения ВМВ и ММВ органических молекул, в том числе и олигопептидов.

Применение метода ФФВ к задачам молекулярной биофизики. ППЭ глицина, аланина и их метиловых эфиров. Исследование ППЭ этих молекул представляет интерес в связи с тем, что аминокислоты являются «строительными блоками» полипептидных цепей, а их эфиры можно рассмотреть как простые модели заряженных аминоацил-т-РНК. Полученные в расчетах этих молекул результаты можно резюмировать следующим образом.

Таблица 6. БВВ (ккал/моль) и дипольные моменты (µ дебай) насыщенных молекул

Молекула	БВВ	?
	Экспер.	ab initio	ФФВ	Экспер.	ФФВ
CH3 -CH3	2.93	2.6 - 3.32	2.97
CH3 -C2H5	3.33	3.45	3.60
CH3 -CH2CH2CH3 т-г	3.4 0.4	3.58	4.13
C2H5 - C2H5 г-г	6.1 - 7.4	5.72	8.38
(г-г)	0.6	1.13	0.74
CH3 - CH(CH3)2	3.90.7	-	4.53
CH3 - C(CH3)3	4.50.2		5.40
CH3 - NH2	1.96	2.13	2.19	1.33	1.62
CH3 - NHCH3	3.28	3.62	3.66	1.03	1.40
CH3 - N(CH3)2	4.41	-	4.73	0.63	1.19
CH3 - CH2NH2	3.74		3.57		1.51
CH3 CH2- NH2 т-г	-	2.23	2.72		1.51
(т-г)		0.52	0.44		1.51
CH3 - OH	1.09	1.06	1.34	1.71	1.60
CH3 - OCH3	2.72	2.98	3.17	1.30	1.01
CH3 - CH2OH			2.84		1.54
CH3 CH2 - OH т-г		1.34	1.68		1.54
(т-г)		0.63	0.49		1.54
CH3 - CH2 OCH3	3.3		3.11		1.22

Примечание. т-г - транс-гош; (т-г) - разность энергий транс-гош. г-г - гош-гош.

Таблица 7. БВВ (ккал/моль) в молекулах с кратными и сопряженными связями

Молекула	БВВ	?
	Экспер	ab initio	ФФВ	экспер.	ФФВ
CH3 -CHCH2	1.98	1.55	1.89
CH3 -C(CH3)CH2	2.21	1.70	1.99
Цис- CH3 -CНCHCH3	0.731	0.42	0.57
Транс- CH3 -CНCHCH3	1.95	1.54	1.80
CH3 -C(CH)3CHCH2	2.03		2.24
CH3 -C6H5	0.014		0.02
Орто- CH3 -C6H4CH3	1.49		1.46
CH3 -CH=O	1.16	1.09	0.93	2.69	2.12
CH3 -C(CH3)=O	0.78		0.97	2.90	2.22
CH3 -CH=С=O	1.18		1.50	1.79	2.09
CH3 -C(CH3)=С=O	2.07		1.93	1.94	2.12
CH3 -CH=NCH3	1.64		1.90		1.74
CH3 -CH=N-OH -транс	1.83		1.98		0.94
CH3 -OCHO	1.19	3.68	1.39	1.77	1.70
CH3 -COOH	0.48	1.1	0.51	1.70	1.62
CH3 -CONH2		0.15 - 1.16	1.14	3.4 - 3.9	3.76
CH3 -CONHCH3		0.06 - 1.10	0.94	3.6 - 4.2	3.78
CH3CONH-CH3		-.73 - -.03	0.92	3.6 - 3.9	3.78
CH3 -NHCHO	0.1 - 1.2	0.12 - 0.86	0.82	3.4 - 3.9	3.66

Относительные энергии стабильных и предпочтительной конформаций, а также величины барьеров между этими конформациями не превышают 3 ккал/моль. Эти результаты можно отнести и к другим аминокислотам и их эфирам, поскольку у аминокислот атомы боковой группы удалены достаточно от аминной и карбоксильной группы.

Н-р водородные связи в пептидах. Методом ФФВ нами была исследована возможность образования специфических Нр водородных связей в комплексах амидов, пептидах и белках. В образовании таких связей в качестве акцептора протона выступают р?связи (пептидные связи основной цепи полипептидов и сопряженные связи боковой цепи ароматических и полярных аминокислотных остатков), а донором - атомы водорода при атомах N, O и C. В исследованиях на модельных системах нами было установлено, что энергия Н-р связей может составлять до 2,5 ккал/моль (Башаров и др. 1986б, 1987б), и поэтому эти связи могут сыграть существенную роль в формировании и стабилизации пространственной структуры белков. На основании нашего предсказания Н-р связи были обнаружены в структуре миоглобина, а впоследствии в трехмерных структурах многих белков.

С использованием метода ФФВ нами были рассчитаны ППЭ дипептидов глицина, аланина, валина, фенилаланина, серина и тирозина, гомологичных олигопептидов (от ди- до декапептида) глицина и аланина. Полученные результаты были представлены в главе 4.

Часть вторая. Степень адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков

внутренний вращение белок биоорганический

Глава 7. Степень обоснованности гипотезы случайного клубка применительно к полипептидной цепи. Обычно в исследованиях по выяснению механизма сворачивания белков объектом исследования рассматривают состояние случайного клубка полипептидных цепей белков. Насколько обосновано такое рассмотрение? Выяснению этого вопроса посвящена настоящая глава работы.

Гипотеза случайного клубка и БВВ. В предыдущей части работы из расчетов ППЭ олигопептидов мы выяснили, что БВВ вокруг связей NCб и CбC главной цепи полипептидов значительны и составляют около 16 ккал/моль и 6 ккал/моль соответственно. Наличие высоких энергетических барьеров дает основание считать полипептидную цепь белка достаточно жесткоцепной макромолекулой. Понятие же «случайный клубок», как известно, используется для описания гибкоцепных линейных макромолекул, в которых возможны свободные вращения. Это понятие было применено к белкам на основании предположения о незначительности БВВ в полипептидных цепях.

Белки при денатурации не приобретают вид случайного клубка (обзор нового поколения денатурационных экспериментов). Экспериментальной базой для рассмотрения исходным состоянием случайного клубка полипептидных цепей в процессе сворачивания белков послужили, в основном, полученные к началу 1970-х в экспериментах денатурации результаты, согласно которым белки проявляли характеристики случайного клубка при денатурации, при этом остаточные упорядоченные структуры не наблюдались. С целью выяснения надежности этих результатов, мы провели анализ литературы по исследованию денатурации белков с использованием нового поколения точных биохимических и биофизических методов.

Анализ показал, что полученные в многочисленных экспериментах в течение около последних двух десятилетий результаты нового поколения по денатурации белков противоположны результатам классических экспериментов. Согласно новым результатам, почти все исследованные белки остаются достаточно компактными и обладают значительной остаточной вторичной и третичной структурами при любых, даже сильно денатурирующих условиях. Т.е., любое денатурированное состояние белка далеко от состояния случайного клубка. Такие результаты в частности были получены на белках фосфоглицераткиназа, иммуноглобулин-связывающий домен белка L, барстар, субтилизиновый ингибитор, цитохром c и его мутанты, рибонуклеаза А и ее S- пептид, ДНК связывающий домен 434-репрессора, FK506 связывающий белок, барназа, лизоцим, шаперонин GroEL, папаин, стафилококковая нуклеаза, химотрипсиновый игибитор-2, субтилизин, в?лактамаза, апомиоглобин, парвальбумин, б-амилаза, лактальбумин, трипсиновый ингибитор, рибонуклеаза Т1, и многие др.

Новосинтезированные белки не имеют вид случайного клубка. В посттрансляционном подходе полипептидные цепи новосинтезированных на рибосоме белков представляют как случайные клубки. Следует отметить, что такое представление не имеет экспериментальную основу или разумного объяснения. Наоборот, множественные эксперименты in vivo демонстрируют, что белки сворачиваются котрансляционно (глава 2), т.е., полипептидные цепи структурируются в процессе биосинтеза.

Глава 8. Синтетические белки и проблема сворачивания белков. Возможность получения синтетических аналогов нативных белков путем химического синтеза традиционно считают одним из серьезных доводов в пользу посттрансляционного сворачивания белков. Она, как полагают, также отвергает котрансляционное сворачивание белков, поскольку химический синтез белковой цепи обычно проводится в противоположном к биосинтезу направлении, от C-конца к N-концу. Мы впервые провели анализ данных о химически синтезированных белках. Результаты позволили нам дать достаточно адекватное объяснение - почему в экспериментах удавалось получить синтетические аналоги белков, вкратце следующим образом.

Приобретение химически синтезированной полипептидной цепью, обладающей идентичной с нативным белком ковалентной структурой, особой конформации для проявления специфической биологической функции, происходит благодаря ярко выраженным особенностям вторичной и третичной структуры нативного белка. Проявление этих особенностей химически синтезированными полипептидными цепями происходит лишь при тщательном подборе для каждого индивидуального белка особых методик и благоприятствующих условий в экспериментах для того, чтобы воспроизвести желаемое известное заранее свойство нативного белка; иначе генерировать функциональную конформацию для химически синтезированных полипептидных цепей было невозможно. Возможность получения синтетических аналогов нативных белков, по нашему мнению, лишь подтверждает, что имеется взаимосвязь между первичной структурой и нативной конформацией белка и вряд ли свидетельствует о посттрансляционном сворачивании белков.

Глава 9. Эксперименты денатурации-ренатурации и проблема сворачивания белков. Денатурация и физические свойства белков. Эксперименты по денатурации и ренатурации традиционно используют как удобный способ для выяснения механизма сворачивания белков. Обычно эти эксперименты проводятся следующим образом. Объектом для исследования используют нативный белок. Сначала внешним воздействием (химические реагенты, температура, рН и др.) нарушают нативную конформацию - белок денатурируют. Далее воздействие убирают и следят за восстанавливаемостью той же исходной нативной структуры белковой молекулы во времени. Такой прием - обычный способ изучения физических свойств исследуемого объекта (твердых тел, полимеров и составляющих их молекул), таких, как упругость, эластичность, гибкость, деформация и т.д. Способность макромолекулы к конформационным изменениям тоже является важным ее физическим свойством. С этой позиции можно оценивать и процесс денатурации-ренатурации белков. При денатурации белок претерпевает конформационные изменения под внешним воздействием, преодолевая энергетические барьеры по вращательным степеням свободы. Глубина денатурации (степень нарушения нативной структуры) белка, очевидно, может зависеть как от гибкости (жесткости) самой полипептидной цепи, так и от характера и величины внешнего воздействия. Зависимость конформационных изменений белка от величины внешнего воздействия может быть представлена следующим образом. Если структурно-функциональные характеристики белка не претерпевают заметных изменений под воздействием внешней силы, то имеет место устойчивость (стабильность) - одно из важных физических свойств нативной структуры. В терминах конформации молекул это может означать, что полипептидная цепь не преодолевает барьеры по вращательным степеням свободы, а совершает крутильные колебания в пределах соответствующих нативной конформации потенциальных ям. Далее, с увеличением внешнего воздействия белок начинает денатурировать, преодолевая энергетические барьеры по вращательным степеням свободы, и переходить в отличное от нативного конформационное состояние. При этом могут проявиться, в зависимости от величины внешнего воздействия, свойства эластичности и невозвратной денатурации - другие физические характеристики белка. Показателем того или иного свойства может служить время спонтанной релаксации белка из денатурированного в нативное состояние после удаления денатурирующего воздействия. Область эластичности нативной структуры может быть идентифицирована "биологически приемлемым" релаксационным временем, протяженность которого составляет, допустим, до нескольких минут в лучшем случае. Если нативная конформация белка не восстанавливается за это время, значит, белок переведен в область необратимой денатурации. Проявление всех трех типов свойств белками в экспериментах по денатурации и ренатурации, известно, явление обычное.

Основываясь на вышеизложенном обсуждении и принимая во внимание результаты нового поколения кинетических экспериментов, о том, что почти все белки при любых денатурирующих условиях обладают значительной остаточной вторичной и компактной структурами (глава 7), нет запрещающих причин для следующего предположения. Структурированные элементы, которые наблюдаются в белках при их денатурации, вполне возможно, служат центрами ренатурации, от которых начинается восстановление исходной нативной структуры денатурированного белка. Мы полагаем также, что спонтанная ренатурация проявление физических свойств белков и вряд ли имеет тесное отношение к фундаментальной проблеме сворачивания белков in vivo. Как нам представляется, в исследованиях денатурации-ренатурации белков имеют дело с изучением их физических свойств (гибкость, жесткость, эластичность, стабильность, и др.) или характеристик (спиральность, компактность, вращательный радиус, температура плавления, и др.) белков в зависимости от внешнего воздействия (химические реагенты, рН, температура, давление и т.д.).

Времена ренатурации денатурированных и in vivo сворачивания белков. Считается, что ренатурация денатурированного белка и сворачивание того же белка in vivo происходят за одинаковое время, которое сравнимо со временем биосинтеза полипептидной цепи. Это мнение, однако, и противоречивое и неверное. Прежде всего, тем, что, согласно посттрансляционной концепции, полипептидная цепь начинает сворачиваться после синтеза и полного выхода из рибосомы. Поэтому нет никакой взаимосвязи между временами биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме и сворачиванием этой цепи вне рибосомы. Процессы биосинтеза и сворачивания различны по своей природе: первый - это сопряженный химический и требующий энергию механохимический, тогда как второй - спонтанный физический. Оба процесса происходят независимо друг от друга и в различных местах, разделенных расстоянием между пептидилтрансферазным центром и местом выхода цепи из рибосомы (70 - 100Е), по меньшей мере. Биосинтез белка занимает время, равное произведению среднего периода элонгации цепи на один аминокислотных остаток (около 0,1 с/остаток) на число остатков в среднем. О времени же сворачивания белков достоверно известно лишь то, что белки проявляют активность сразу после выхода из рибосомы и даже раньше. Что же касается быстрого спонтанного восстановления нативного состояния денатурированных белков в ренатурационных экспериментах, это явление нерядовое. Во многих случаях регенерировать нативной конформации белков после денатурации задача достаточно проблематичная.

Белки сворачиваются, как традиционно считают, за времена 10-4с - 10-2с, а вторичные и компактные структуры в белках, как известно, формируются за времена 10-4с - 10-2с. В то время как наблюдаемое время для наращивания полипептидной цепи на один аминокислотный остаток рибосомой составляет в среднем 0,1с (см. третью часть). Из сравнения этих масштабов следует, что времена формирования вторичных структур и компактных состояний в полипептидной цепи, а также предполагаемые времена для сворачивания белков в целом, меньше времени изменения химической структуры полипептидной цепи на один аминокислотный остаток при биосинтезе. Именно поэтому мы считаем, что достаточно проблематично выяснить механизм формирования нативной конформации белка в исследованиях, которые используют целые белки или полноценной длины полипептидные цепи белков, как это делают в экспериментах по денатурации-ренатурации. Как было отмечено выше, полипептидные цепи денатурированных и ново синтезированных белков не имеют вид случайного клубка. Поэтому не имеет твердую основу утверждение, что полипептидная цепь сворачиваться в нативную структуру из этого состояния, а процесс сворачивания белка может быть представлен как перехода «клубок - глобула».

Степень обоснованности термодинамической гипотезы для белков. Эта гипотеза является одной из основополагающих посттрансляционного подхода к сворачиванию белков. Она была выдвинута на основе полученных к началу 1970-х экспериментальных результатов, согласно которым белки приобретали вид случайного клубка при денатурации (гипотеза о случайном клубке) и восстанавливали исходное нативное состояние спонтанно после удаления денатурирующего воздействия (принцип спонтанности самоорганизации нативной конформации). Однако согласно результатам нового поколения экспериментов (глава 7), денатурированные белки не приобретают вид случайного клубка, а обладают значительной остаточной вторичной и компактной структурой. Кроме того, спонтанная ренатурация денатурированных белков событие, скорее исключение, нежели правило; необходимы значительные усилия для ренатурации белка в экспериментах.

В последние годы появляется все большее число данных, которые свидетельствуют о том, что функционально активное состояние многих белков не является наиболее стабильным термодинамически (Baker&Agard, Biochem:1994,33,7505; Thomas etal,TIBS:1995,20,456; Baker,NatStrBiol :1998,5,1021; Berkenpas etal,EMBO J:1995,14,2969; Sohl etal,Nature:1998,392,817). Объяснением этих наблюдений может быть то, что из-за высоких энергетических барьеров молекула белка может находиться в кинетически стабильном и термодинамически метастабильном состоянии, соответствующей нативному белку, достаточно долго, не имея возможности приобрести соответствующую глобальному минимуму свободной энергии конформацию. Высокие энергетические барьеры в полипептидной цепи, как мы установили (глава 4), имеет место.

Заключение. Посттрансляционная концепция сворачивания белков базируется на двух гипотезах (статистический клубок и термодинамическая) и двух утверждениях (что процесс фолдинга белка может быть представлен как перехода клубок - глобула, и что ренатурация может служить удобной моделью фолдинга), выдвинутых на основе старых экспериментальных данных. В данной части работы мы пытались представить достаточно надежную базу, которая наводит легкое сомнение на надежность этой базы и теоретической основы посттрансляционной концепции, ее полную адекватность решению проблемы сворачивания белков.

Часть третья. Котрансляционное постепенное сворачивание белков

Результаты множественных экспериментов in vivo и на модельных системах свидетельствуют о котрансляционном, во время биосинтеза сворачивании белков (введение, глава 1). Принимая во внимание эти результаты, а также представленный во второй части анализ степени адекватности посттрансляционного подхода решению проблемы сворачивания белков, мы пытались найти обоснование, почему белки должны сворачиваться котрансляционно и выяснить возможный механизм процесса сворачивания на этой основе. Чтобы решить эти задачи, мы полагали, что необходимо проследить биогенез белков от начала их биосинтеза на рибосоме и до завершения сворачивания. При этом учитывать следующие, по меньшей мере, факторы: 1) механизм, способ и скорость импорта полипептидных цепей из рибосомы в цитоплазму для сворачивания, 2) возможные изменения в химической структуре - аминокислотной последовательности - и пространственной структуре полипептидной цепи, которые она может претерпевать в цитоплазме с начала выхода из рибосомы и до завершения сворачивания, 3) силы, обуславливающие сворачивание белков, 4) времена сворачивания белков и белковых фрагментов.

Глава 10. Сворачивание белка около рибосомы. Почему белки должны сворачиваться котрансляционно? Как известно, белковая цепь строится в пептидилтрансферазном центре рибосомы с N-конца, по одному аминокислотному остатку. Синтезируемая цепь продвигается далее по узкому рибосомному каналу и котрансляционно выходит из рибосомы в цитоплазму (рис.6).

Известно, что рибосомный канал заполнен водой, а его стенки обладают редгезивным свойством, - полипептидная цепь не прилипает к стенкам канала. Установлены размеры канала, которые составляют, по разным данным, по длине 50 - 100Е, и в диаметре 15 - 28Е. Известно также, что полипептидная цепь продвигается по каналу и выходит из него без резких изгибов в развернутом виде.

Рис.6. Схематическое представление синтезирующей полипептид рибосомы. (А)- узнающий антикодон участок, (Р)- пептидилтрансферазный центр, (Ex)-место выхода цепи из рибосомы. (Адаптирован из: Спирин, «Молекулярная биология» том 1 (1986).)

Обратим внимание на скорость выхода полипептидной цепи из рибосомы, т.е. скорость элонгации цепи на рибосоме. Средние скорости элонгации полипептидных цепей различных белков определены в разных клетках и при различных условиях в многочисленных экспериментах in vivo и на модельных системах. Определены также абсолютные скорости трансляции отдельных кодонов м-РНК в E.coli. Наибольшая скорость составила 21,6 кодонов/с, следовательно, наименьшее время для трансляции одного кодона - 0,046 секунды. Учитывая это значение, можно даже предполагать, что наименьший период трансляции кодонов - периодичность поступления остатков в цитоплазму, не быстрее 0,01 с/остаток (т.е., меньше наименьшего наблюдаемого периода почти в пять раз). Справедливость нашего предположения обоснована (Basharov,2003). Можно посмотреть и цитированные там литературу, где обсуждается взаимосвязь скорости и надежности трансляции м-РНК на рибосоме, а также принимать во внимание данные о том, что в водной среде максимальная скорость питаемого нуклеозид-трифосфатом клеточного мотора не быстрее 102/сек (Vale,1996, JCellBiol:135,291; Kinosita et al,1998,Cell:93,21).

Далее сосредоточимся на данных о временах сворачивания белков и белковых фрагментов. Хорошо известно, что характеристические времена конформационных изменений молекул составляет 10-12 - 10-7с, б-спирали и в-листы в полипептидах формируются за 10-7 - 10-4с (Eigen,1968,ChimPhys:65,53), а компактные состояния за 10-5 - 10-2с (Eaton et al,1997,CurrOpinStrBiol:7,10). Сворачивание малых однодоменных белков, как полагают, происходит 10-4 - 10-2с (Ptitsyn,1991,FEBS Lett,285,176; Sosnick etal,1997,PNAS:94,8545). Белки сворачиваются очень быстро также in vivo (Kolb et al, JBC:275,16597).

При сопоставлении представленных выше временных масштабов становится очевидным, что формирование вторичных структур и компактных состояний в полипептидной цепи происходит быстрее изменения ее химической структуры на один аминокислотный остаток при биосинтезе. Даже сама нативная конформация белка может формироваться быстрее по сравнению с самым коротким периодом элонгации полипептидной цепи на один остаток на рибосоме. Поэтому, пока очередной любой остаток присоединяется к полипептидной цепи в пептидилтрансферазном центре, в выступающем из рибосомы N-концевом сегменте цепи могут формироваться и б-спирали, и в-листы, и компактные состояния, и какая-нибудь определенная пространственная структура самого сегмента. Именно этот простой и очевидный вывод, по нашему мнению, является надежным обоснованием того, почему белки должны сворачиваться в процессе биосинтеза полипептидной цепи на рибосоме - котрансляционно.

Примерный механизм сворачивания белков: котрансляционное постепенное формирование нативной конформации. Как было отмечено выше: а) аминокислотные остатки синтезируемой полипептидной цепи поступают из рибосомы в цитоплазму для сворачивания с N-концевого, последовательно друг за другом и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01с; б) времена сворачивания белковых фрагментов и белков меньше этого времени. Опираясь лишь на эти данные, и учитывая наблюдения, о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты ни при синтезе цепи и ни после его завершения, можно сформулировать следующую простую и вполне очевидную примерную схему процесса сворачивания белка в непосредственной близости рибосомы.

- Сворачивание белка начинается с момента выхода первого N-концевого аминокислотного остатка полипептидной цепи из рибосомы в цитоплазму, продолжается во время трансляции цепи и завершается после выхода из рибосомы C-концевого последнего остатка.

- Сворачивание белка происходит последовательными этапами, по мере транслокации остатков цепи из рибосомы. На каждом этапе формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, выступающего из рибосомы, причем вторичная и третичная структуры сегмента формируются одновременно и вместе. Число и последовательность этапов процесса аналогичны тем, что и событий трансляции при биосинтезе цепи.

- Элементы вторичной структуры (б-спирали, в-листы, повороты), сформированные на каждом этапе, могут разрушаться, изменяться или оставаться неизменными на следующем этапе, после удлинения сегмента на очередной аминокислотный остаток.

- На всех этапах процесса, формирование структуры N-концевой части цепи, а также на последнем этапе - нативной структуры белка, происходит не дольше 0,01с. Общее время процесса сворачивания белка имеет такой же порядок, что и суммарное время синтеза цепи на рибосоме.

Предлагаемая нами модель схематически представлена в левой части рис.1, на примере полностью б?спирального белка апомиоглобина, где зафиксированы четыре стадии сворачивания синтезируемого на рибосоме полипептида во времени. Отметим, что при формулировке модели мы полагали, что область поверхности рибосомы, возле которой полипептидная цепь сворачивается, составлена из полярных аминокислотных остатков и сильно гидратирована. Предположение поддерживается данными о кристаллической структуре рибосомы и наблюдениями о том, что рибосома и синтезируемая полипептидная цепь не образуют ассоциаты во время синтеза цепи до его завершения. Гидратный слой, по-видимому, экранирует (явление, скорее, сильно выраженное в клеточной биологии), синтезируемую и сворачивающуюся цепь от взаимодействия с рибосомой.

Анализ известных моделей о возможном механизме сворачивания белков. В данном параграфе диссертации представлен анализ известных моделей о возможном механизме котрансляционного сворачивания белков и указаны их недостатки. Результаты анализа опубликованы (Башаров 2000б).

Глава 11. Сворачивание белка в компартментах клетки отдаленных от рибосомы. Полипептидные цепи многих белков транслируются в отдаленные от рибосомы различные водные компартменты клеток и сворачиваются там. Ими являются в прокариотических клетках периплазма, а в клетках эукариот, в частности, - матрикс и межмембранное пространство митохондрий, строма, межмембранное пространство и тилакоидный люмен хлоропласт, люмен эндоплазматического ретикулуума (ЭР), матрикс пероксисом. Для того, чтобы выяснить процесс сворачивания белков в этом случае, проследим, как и в случае сворачивания белка около рибосомы, судьбу белковых цепей в компартменте, с момента поступления туда и до завершения сворачивания, учитывая при этом механизм, способ и скорость импорта цепи, возможные изменения, которые может она претерпевать, а также силы обуславливающие сворачивание и времена сворачивания белков и белковых фрагментов.

Полипептидные цепи предшественников белков пересекают одну или несколько мембран, чтобы попасть в компартменты сворачивания. (Пути транспорта определяет расположенный впереди N- конца цепи прекурсор, состоящий из одного или нескольких расщепляемых сигнальных пептидов.) Цепи поступают в компартмент через узкий гидрофильный белковый канал в мембране диаметром 20 - 26Е. Канал является частью системы импорта белков, транслокона. Все транслоконы сильно похожи (рис.7). Они состоят из нескольких мембрано-встроенных, -причаленных или -ассоциированных гетероолигомерных белков, которые формируют четыре функционально разные системы: узнавания и причаливания сигнального пептида, проводящий белок узкий гидрофильный трансмембранный канал, узнавания и процессинга сигнальной последовательности, транслокационный мотор.

Транслокация полипептидных цепей в различные компартменты сворачивания происходит по одинаковому механизму. Предшественники полипептиды импортируются в компартменты в развернутом виде N-концом (рис.7). Сигнальный пептид отщепляется сигнальной пептидазой котранслокационно, как только N-конец цепи поступает в компартмент. Любая другая реакция процессинга полипептидной цепи в компартменте происходит котранслокационно также (напр., гликозилирование остатков Asn в люмене ЭР). Импорт полипептидов в компартмент осуществляется посредством транслокационного мотора, за счет энергии АТФ или ГТФ.



Рис.7. Система и механизм импорта полипептидов в митохондрии (а) и хлоропласты (б) (Haucke&Schatz,1997,TICB,7,103), бактерии (E.coli) и эукариот (S.cerevisiae) (Pohlschroder et al,1997,Cell,91,563). Импорт белков из цитоплазмы осуществляется транслоконом внешней (OM) и внутренней (IM) мембран митохондрий (Tom, Tim) и хлоропласта (Oep/lap, Iep/lap). По мере синтеза пробелки могут ассоциировать в цитоплазме с шаперонами (Hsp70, MSF), которые доставляют их к рецепторным белкам на внешней мембране. SRP- сигнал-узнающая частица. SecYEG и Sec61 формируют проводящий белок канал в мембране. Hsp70,mHsp70,sHsp100,SecA,Kar2 - транслокационные моторы.

Итак, согласно известным данным молекулярной клеточной биологии, изложенным выше вкратце, транслокация полипептидных цепей белков в отдаленные от рибосомы компартменты клетки происходит определенным, одинаковым как из рибосомы, образом. Цепи поступают в эти компартменты N-концом в развернутом виде из узкого белкового канала в мембране, как из канала рибосомы в цитоплазму (рис.8).

Выясним теперь скорость транслокации полипептидных цепей через мембрану в компартменты, которая почти не исследована. Представляется разумным, если предположим, что транслокация цепей через мембраны осуществляется при скоростях не быстрее высокой скорости элонгации полипептидной цепи на рибосоме, т.е. с периодичностью 0,01 с/остаток (см. предыдущий §). Предположение справедливо в случае котрансляционной транслокации полипептидной цепи в люмен ЭР, по меньшей мере, т.е. когда рибосома причалена к мембране ЭР и непосредственно синтезирует цепь прямо в люмен через транслокационный канал мембраны (рис.8б).

Рис.8.Полипептидные цепи поступают в различные компартменты из узкого канала рибосомы (а) или транслокона в мембране (b, с) и сворачиваются там во время транслокации, ко- (а, b), или посттрансляционно (с) (Basharov,2003).

Предположение поддерживается оценочными экспериментальными данными: от 20 до 30 остатков переходит через мембрану E.coli в периплазму за время от нескольких сек. до одной мин. (Economou etal,1995,Cell: 83,1171), максимальный период транслокации цепи через внутреннюю мембрану митохондрий посредством транслокона ~0,7 с/остаток (Schwartz & Matouschek, 1999,PNAS:96,13086). Предположение оправдано, если учесть уже упомянутые данные о том, что в водной среде максимальная скорость клеточного мотора не быстрее 102/сек, и тем, что рибосома и транслоконы обладают общими структурно-функциональными особенностями в части выполнения транслокационных функций. Рибосома сама является транслокационной машиной и состоит из тех же функциональных элементов, что и транслоконы, за исключением системы процессинга сигнального пептида.

Вышеизложенное обсуждение можно резюмировать так. Для сворачивания, импорт аминокислотных остатков полипептидных цепей из транслоконов в мембране в отдаленные от рибосомы компартменты и из рибосомы в цитоплазму происходит одинаковым образом: направленно N- концевым, последовательно и постепенно с периодичностью не быстрее 0,01секунды. Таким образом, сворачивание белка в отдаленных от рибосомы водных компартментах также может произойти согласно предложенной выше схеме сворачивания белка возле рибосомы, с единственной разницей, что термин «рибосома» следует заменить на «транслокон».

Глава 12. Поддерживающие предлагаемый механизм сворачивания белков данные. Здесь мы приводим ряд известных экспериментальных данных и некоторые результаты наших расчетов, которые, по нашему мнению, поддерживают предложенную нами модель сворачивания белков.

Основу предлагаемой модели составляет три важных положения. Первое: субстратный полипептид не образует ассоциат с рибосомой при биосинтезе и транслоконом при транслокации через мембраны, а также при сворачивании, т.е., транслокационный комплекс или рибосома в сворачивании белка не участвует. Второе: за время поступления каждого очередного аминокислотного остатка в компартмент (не меньше 0,01с), формируется определенная структура N-концевого сегмента цепи, находящегося в компартменте. И третье: сформированная на каждом этапе структура динамична - она может измениться с изменением химической структуры цепи по мере постепенного роста. Все три положения достаточно очевидны.

Первое положение экспериментальный факт, установленный клеточными биологами (Nissen etal,2000,Science:289,920; Kramer etal,2001,IntJBioch&CellBiol, 33,541). В этой связи мы обращаем особое внимание на экранирующую роль гидратного слоя вблизи полярной белковой поверхности, около которой сворачивается белок. Второе положение хорошо известные данные о временах формирования вторичных и компактных структур в полипептидной цепи. Оно подтверждается также результатами экспериментов in vivo, согласно которым белки проявляют активность сразу после выхода из рибосомы, или даже пока продолжается синтез полипептидной цепи.

Что касается третьего положения о динамическом изменении конформации цепи по мере ее удлинения в каждом цикле элонгации, оно, прежде всего, очевидно из природы физических сил, вызывающих сворачивание белков. Изменение химической структуры полипептидной цепи при ее росте по одному аминокислотному остатку, обуславливает дополнительные взаимодействия нового остатка с остальными и молекулами среды. Подтверждающие это положение некоторые данные приведены ниже.

Динамичность конформации в зависимости от длины полипептидной цепи. Экспериментальная поддержка модели. Конформационный анализ десяти различной длины фрагментов полипептидной цепи химотрипсинового ингибитора (ХИ2; 64 остатков) проведен методами КД, ЯМР и др. (Prat Gay et al,1995a,JMolBiol.254,968; 1995b,PNAS,92,3683). Нативная структура ХИ2 составлена из одной б-спирали (остатки 12-24), шести в?листов (3-5, 8-11, 28-34, 45-51, 55-58, 60-64) и четырех в?поворотов (5-8, 25-28, 35-42, 52-54). Фрагменты состояли из 5 (ХИ2-5), 13 (ХИ2-13), 25 (ХИ2-25), 28 (ХИ2-28), 40 (ХИ2-40), 50 (ХИ2-50), 53 (ХИ2-53), 60 (ХИ2-60), 62 (ХИ2-62) и 63 (ХИ2-63) N-концевых остатков. Пептиды ХИ2-5 и ХИ2-13 проявляют признаки в?поворота, тогда как в нативном белке остатки 1-13 образуют два в?листа и один поворот. Пептиды ХИ2-25 и ХИ2-28 неупорядоченно компактны, тогда как в нативном ХИ2 остатки 12 - 24 образуют стабильную б-спираль. Пептид ХИ2-40 обладает компактной структурой с гидрофобным кластером, а ХИ2-49 компактнее, но нативнооподобные взаимодействия в них отсутствуют. Фрагмент ХИ2-53 обладает хорошо сформированным мини ядром, а ХИ2-60 свернут сильнее и более компактен. В формировании нативноподобной структуры ХИ2 определяющую роль играют пять С-концевых остатков. Эти результаты свидетельствуют о том, что пространственная структура цепи ХИ2 при ее постепенном удлинении динамична - вторичная и третичная структуры полипептида постепенно меняются по мере его роста.

В исследованиях зависимости структуры семи фрагментов барназы от длины биофизическими методами установлено, что вторичная и третичная структуры фрагментов формируются вместе и динамичны: компактность неуклонно растет в фрагментах с длиной от 22 до 68 остатков по мере удлинения цепи, потом резко падает в фрагменте с длиной 79 остатков, а затем снова растет (Neira&Fersht,1999, JMolBiol:287,421).

Результаты исследований зависимости структуры N-концевых фрагментов апомиоглобина с длиной 36, 77 и 119 остатков представлены на рис.9, где также приведены известные схемы сворачивания этого белка.

Рис.9. Схемы сворачивания апо-Мб. а-ренатурация из денатурирован-ного состояния (Jennings&Wright, 1993,Sci:262,892;ЯМР); b- гипотети-ческий механизм на основе посттр-ансляционного подхода: цепь имеет вид случайного клубка пока не синтезирована полностью; c-другой гипотетический механизм: вторич-ная структура формируется по мере синтеза соответствующего сегмента цепи; d- механизм, предложенный на основе ЯМР исследований (Chow et al., 2003).

Основной вывод этих исследований такой же, как и в случае с белком ХИ-2: вторичная и третичная структуры динамичны и значительно меняются с удлинением цепи. Содержание элементов вторичной структуры исследованных фрагментов и нативного апомиоглобина приведены в табл.8. Сравнивая данные соответствующих столбцов панелей а и d рис.9 и табл.8 можно убедиться и в том, что пути формирования пространственной структуры апомиоглобина из денатурированного мочевиной состояния и при постепенном росте его полипептидной цепи отличаются кардинально.

Таблица 8. Содержание элементов вторичной структуры в апомиоглобине (апо-Мб) и его фрагментах

Фрагмент апо-Мб	Содержание элементов (в долях)
	б	в	в + t	rc
(1 - 36) апо-Мб	0.04	0.40	0.62	0.34
(1 - 77) апо-Мб	0.16	0.29	0.51	0.33
(1 - 119) апо-Мб	0.30	0.18	0.40	0.30
(1 - 153) апо-Мб (нативный)	0.50	0.04	0.28	0.21

Примечание. Символы б, в, в+t и rc соответственно обозначают: б?спирали, в?листы, в?листы плюс в?повороты, неупорядоченные структуры (random coil).

Зависимость стабильности спиральных конформаций олигопептидов от длины цепи. Динамическое изменение конформации полипептидной цепи в зависимости от ее длины следует из наших расчетов ППЭ олигопептидов глицина и аланина методом ФФВ. В качестве примера в табл.9 приведены относительные энергии двух конформеров последовательных олигопептидов этих аминокислот. Конформеры соответствуют популярным конформациям: полностью вытянутой С5 (ц=180o, ш=180o) которая, как считают, наиболее удобно представляет конформацию статистического клубка, и б-спиральной (ц=-60o, ш=-40o).

Таблица 9. Относительные энергии двух конформаций олигопептидов глицина и аланина с длиной от двух до десяти остатков (в ккал/моль)

n- пептид	Gly	Ala
	С5(ц=180o,ш=180o)	б(ц=-60o,ш=-40o)	С5(ц=180o,ш=180o)	б(ц=-60o,ш=-40o)
	ДЕ пол.	ДЕ кул.	ДЕ пол.	ДЕ кул.	ДЕ пол.	ДЕ кул.	ДЕ пол.	ДЕ кул.
2	0,8	0,8	6,7	6,4	3,9	0,0	6,7	6,4
3	0,6	0,6	5,2	5,2	3,8	0,4	5,7	5,1
4	0,7	0,6	3,8	4,0	3,8	0,4	4,1	4,0
5	0,6	0,6	2,9	3,4	3,8	0,3	3,1	3,1
6	0,6	0,6	2,3	2,9	3,8	0,3	3,1	3,3
7	0,6	0,6	1,8	2,3	3,8	0,3	2,4	2,7
8	0,6	0,6	1,4	2,0	3,8	0,3	1,4	2,0
9	0,6	0,6	1,1	1,7	3,8	0,3	1,1	1,8
10	0,6	0,6	0,9	1,5	3,8	0,3	0,9	1,6

В таблице приведены также величины кулоновского вклада в общую потенциальную энергию. Из представленных в табл.9 данных следует, что в олигопептидах аланина от дипептида до пентапептида предпочтительной является полностью вытянутая С5 конформация, а начиная с пентапептида предпочтительной становится б-спиральная. В дипептиде глицина б-спиральная конформация невыраженная, энергия ее стабилизации растет с увеличением числа остатков, с 6,7 ккал/моль в дипептиде до 0,6 ккал/моль в декапептиде, и судя по тенденции, она становится предпочтительной начиная с одиннадцати пептида.

Заключение

Изменение химической структуры полипептидной цепи белка на один аминокислотный остаток при биосинтезе происходит на порядки медленнее формирования элементов вторичной структуры и компактных состояний в развернутой цепи, а также предполагаемого для сворачивания белков времени. Именно поэтому белки должны сворачиваться котрансляционно, в процессе биосинтеза. Сворачивание белка динамический процесс формирования пространственной структуры постепенно удлиняющегося с N-конца полипептида, происходящий последовательными этапами по мере его роста - изменения химической структуры, в процессе биосинтеза первичной структуры. На каждом этапе этого процесса, протяженность которого не дольше 0,01 сек, формируются, одновременно и сопряженно, вторичная и третичная структуры синтезированного N-концевого сегмента, которые могут изменяться на следующем этапе, а на последнем этапе - нативной структуры полной нативной последовательности полипептидной цепи белка.

Основные выводы

I. Впервые проведено фундаментальное исследование по выяснению реалистических оценок барьеров внутреннего вращения (БВВ) вокруг связей NCa и CaC главной цепи полипептидов.

1. Разработан новый полуэмпирический расчетный метод для конформационного анализа и изучения взаимодействия олигопептидов и других органических молекул - модифицированный метод фрагмент-фрагментных взаимодействий (ФФВ). Показано, что метод позволяет получить реалистические данные о структуре, конформациях, барьерах внутреннего вращения и дипольных моментах широкого класса органических молекул, предпочтительные структуры, стабильные конфигурации, энергии взаимодействия и дипольные моменты димеров и комплексов таких молекул, исследовать структуру, конформации и поверхности потенциальной энергии аминокислот и их дипептидов.

2. Расчетами полной поверхности потенциальной энергии аминокислот глицина и аланина методом ФФВ установлено, что относительные энергии предпочтительной и равновесных конформаций аминокислот и величины потенциальных барьеров между этими конформациями составляют не более 3 и 5 ккал/моль соответственно.

3. Расчетами комплексов амидов и пептидов методом ФФВ установлено, что в белках возможны образования специфических Н- водородных связей с энергией стабилизации до 2,5 ккал/моль, которые могут сыграть существенную роль в формировании и стабилизации пространственной структуры белков; наличие таких связей в структурах белков было обнаружено впоследствии к...