Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность 03.00.15 - генетика

Выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster

Рощина Наталья Викторовна

Москва

2008 год

Работа выполнена в Лаборатории геномной изменчивости Отдела молекулярной генетики клетки Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Пасюкова Елена Генриховна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Митрофанов Владимир Григорьевич

доктор биологических наук Александров Игорь Донатович

Ведущая организация: Кафедра генетики Биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.

1. Общая характеристика работы

ген мутация инсерционный

Актуальность темы. Продолжительность жизни является одним из наиболее биологически и социально значимых количественных признаков организма. Ограниченность продолжительности жизни и старение представляют собой универсальные явления. Продолжительность жизни определяется взаимодействием генетических факторов и факторов внешней среды и может сильно отличаться в разных популяциях и у разных особей одного вида. Изучение генетических факторов, лежащих в основе такой вариабельности, представляет большой интерес для понимания причин и условий, обеспечивающих высокую продолжительность жизни.

В настоящее время очевидно, что генетический контроль продолжительности жизни эволюционно консервативен, что делает целесообразным проведение исследований на модельных объектах, в том числе на дрозофиле, большинство генов которой имеет ортологи у других высших эукариот. Локусы, аналогичные выявленным у дрозофилы, могут играть роль в контроле продолжительности жизни и у других организмов, в том числе у человека, и анализ их может пролить свет на общие закономерности контроля продолжительности жизни у многоклеточных.

В течение последних лет достигнут большой прогресс в понимании генетического контроля продолжительности жизни, в частности, благодаря тому, что выявление генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, у одного из модельных организмов влекло за собой исследование роли этих и других, взаимодействующих с ними генов у других организмов. Несмотря на очевидные достоинства такого подхода, он ограничивает спектр исследуемых генов. В связи с этим по-прежнему остается актуальным поиск новых генов, не связанных с уже открытыми, но играющих важную роль в контроле продолжительности жизни. Один из возможных подходов заключается в индукции случайных мутаций, другой - в индуцированном изменении экспрессии случайных генов, с последующим тестированием возникающих эффектов. Однако эти методы основаны на выявлении искусственных изменений, часто - повреждений работы генов, приводящих к изменению продолжительности жизни. В Лаборатории геномной изменчивости Учреждения Российской академии наук Института молекулярной генетики РАН разработан и используется метод, основанный на генетическом картировании и позволяющий, во-первых, искать любые новые гены по всему геному, а во-вторых, находить те из них, которые контролируют небольшие различия по исследуемому признаку, лежащие в основе изменчивости продолжительности жизни в естественных условиях (Nuzhdin et al., 1997; Pasyukova et al., 2000). Этот метод был использован и в данной работе, в результате чего начатое ранее картирование удалось довести до выявления отдельных генов и генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость у Drosophila melanogaster дикого типа.

Цель и задачи работы. Целью работы был поиск новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни Drosophila melanogaster. Работа включала несколько этапов. Прежде всего, необходимо было уточнить границы некоторых из ранее выявленных протяженных районов предполагаемой локализации генов, определяющих различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа (Nuzhdin et al., 1997; Vieira et al., 2000; Pasyukova et al., 2000), до небольших участков протяженностью не более нескольких подсекций по карте политенных хромосом. Далее среди генов, локализованных в этих и некоторых других из ранее картированных участков, предполагалось выявить гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительности жизни. Наконец, следовало получить строгое доказательство участия в контроле продолжительности жизни наиболее интересных и перспективных генов-кандидатов. В ходе работы предполагалось также изучить особенности влияния на продолжительность жизни мутаций по этим генам.

В работе были поставлены следующие задачи: 1. Провести тесты на комплементацию с делециями, перекрывающими ранее выявленные протяженные районы хромосом, в которых предположительно локализованы гены, определяющие различие в продолжительности жизни между двумя линиями дикого типа. 2. Провести тесты на комплементацию с мутациями наиболее интересных генов-кандидатов. 3. Подобрать во всемирной коллекции линий дрозофилы линии с мутациями, вызванными встройкой векторных конструкций в район наиболее интересных генов-кандидатов, и получить линии с реверсиями этих мутаций. 4. Охарактеризовать продолжительность жизни в линиях с подобранными инсерционными мутациями и сравнить ее с продолжительностью жизни в исходных линиях без мутаций и в линиях-ревертантах.

Научная новизна работы. Для картирования генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в работе впервые использован метод количественной комплементации с мутациями в генах-кандидатах. Применение этого метода позволило выявить 7 новых генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни. Роль одного из этих генов, shuttle craft, в контроле продолжительности жизни была доказана в опытах по изучению продолжительности жизни в линии с мутацией, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в пяти независимо полученных линиях с реверсий этой мутации. Прямые доказательства участия в контроле продолжительности жизни впервые были получены еще для двух генов, escargot и crooked legs. Описаны мутации, приводящие к увеличению продолжительности жизни.

В итоге проведенной работы описаны две группы генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, кодирующими белки, необходимые для биосинтеза катехоламинов и передачи нервного импульса в нейронах (Catecholamines up, Dopa decarboxylase, Diphenol oxidase A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования мотонейронов (shuttle craft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot).

Практическая значимость. Полученные данные могут быть использованы при чтении курсов лекций по генетике и геронтологии в высших учебных заведениях, а также в биомедицинских исследованиях, при изучении генетического контроля продолжительности жизни и ряда болезней человека, включая неврологические, когда причиной патологии являются нарушения развития клеток нервной системы.

Апробация работы. Результаты, полученные в данной работе, были представлены на следующих научных семинарах и конференциях: на американских ежегодных конференциях по генетике дрозофилы (Сан-Диего, США, 2002, 2008); на 4-ом съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, Россия, 2008); 20-ом международном генетическом конгрессе (Берлин, Германия, 2008); на конкурсах работ молодых учёных на соискание стипендий фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, Россия, 2005, 2007).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы в международных реферируемых изданиях.

Структура и объём диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и включает следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы. Диссертация содержит 20 таблиц, 18 рисунков и 182 литературные ссылки.

2. Содержание работы

Работа состоит из двух частей: 1) поиск новых генов, контролирующих продолжительность жизни; 2) выбор наиболее интересных из найденных генов, окончательное доказательство их участия в контроле продолжительности жизни, а также исследование характера их влияния на изучаемый признак.

Выявление новых генов, участвующих в контроле продолжительности жизни

Первая часть работы заключалась в поиске генов, аллели которых в двух изогенных лабораторных линиях дрозофилы дикого типа (2b и Oregon) по-разному влияют на продолжительность жизни. Ранее рекомбинационное картирование позволило выявить 5 крупных фрагментов генома, потенциально содержащих гены, различные аллели которых обусловливают разную продолжительность жизни (Nuzhdin et al., 1997; Vieira et al., 2000; Leips, Mackay, 2000, 2002). Далее, для уточнения локализации генов, влияющих на продолжительность жизни, до сравнительно небольших районов генома были использованы количественные комплементационные тесты с перекрывающимися делециями, расположенными внутри районов, выявленных с помощью рекомбинационного картирования. Делеционное картирование было начато ранее (Pasyukova et al., 2000) и продолжено в ходе выполнения данной работы. Наконец, для выявления генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни, в данной работе были проведены количественные комплементационные тесты с мутациями ряда генов, локализованных в выявленных с помощью делеционного картирования небольших районах генома.

Суть количественных комплементационных тестов с делециямии и мутациями заключается в следующем. Мы исследовали небольшие различия в продолжительности жизни, обусловленные тем, что в линиях 2b и Oregon присутствуют различные аллели генов-кандидатов, контролирующих этот признак. Следовательно, нас интересовали те случаи, когда фенотипическая разница между аллелями гена-кандидата в двух исследуемых линиях заметна на фоне делеции (Df), захватывающей район его локализации, или мутантного аллеля (mut) , но незаметна на фоне хромосомы без делеции и на фоне аллеля дикого типа. Каждая использованная в работе делеция и мутация поддерживалась в линии на фоне хромосомы-балансера (Bal), не содержащей делеций и мутаций генов-кандидатов. Таким образом, в комплементационном тесте с делециями нас интересовали те случаи, когда (mut^2b/Df - mut^Oregon/Df) ? (mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal), а в комплементационном тесте с мутациями - (mut^2b/mut - mut^Oregon/mut) ? (mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal).

Для проведения комплементационных тестов с делециямии (мутациями) мы скрещивали мух из линий Ore и 2b c мухами из линий с делециями (мутациями). В потомстве каждого скрещивания в течение дня отбирали по 20 девственных особей каждого пола и генотипа (mut^2b/Df, mut^Oregon/Df, mut^2b/Bal и mut^Oregon/Bal) и помещали в пробирки по 5 штук, самок и самцов отдельно, на стандартный корм для измерения продолжительности жизни. Делеции одного района и мутации одного гена исследовали одновременно. Количество живых мух в пробирке регистрировали каждый день. Продолжительность жизни определяли как число прожитых данной особью дней. Оставшихся в живых мух пересаживали на свежий корм каждые 5-7 дней. Все культуры и скрещивания вели при 25^оC.

Для анализа данных о продолжительности жизни самцов (самок) четырех генотипов, появляющихся в потомстве от скрещивания 2b и Oregon с каждой из линий с делецией или мутацией, мы использовали двухфакторный дисперсионный анализ, рассматривая в качестве фиксированных главных факторов Линию (Л, 2b или Oregon) и Генотип (Г, делеция Df, мутация mut или балансер Bal). Достоверность взаимодействия двух факторов, Л*Г, то есть справедливость неравенств (mut^2b/Df - mut^Oregon/Df) ? (mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal) и (mut^2b/mut - mut^Oregon/mut) ? (mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal) служила указанием на некомплементарность, то есть на то, что ген, мутация в котором используется в опыте, имеет в линиях 2b и Oregon аллели, по-разному влияющие на продолжительность жизни. Однако, с учетом неоднородности генетического фона в наших опытах, достоверность Л*Г может быть объяснена не только аллельными, но и эпистатическими взаимодействиями. В связи с этим дополнительным критерием для отбора случаев аллельного взаимодействия служило соблюдение неравенства mut^2b/Df - mut^Oregon/Df ? 0 при mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal = 0 и соблюдение неравенства mut^2b/mut - mut^Oregon/mut ? 0 при mut^2b/Bal - mut^Oregon/Bal = 0. В этом случае аллели гена-кандидата, присутствующие в линиях 2b и Oregon, демонстрировали достоверные различия по продолжительности жизни на фоне делеции или мутантного аллеля этого гена и отсутствие этих различий на фоне хромосомы и аллеля дикого типа. Линии 2b и Oregon не отличаются по продолжительности жизни, поэтому мы рассматривали достоверность фактора Л как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия, описанного выше. В тех случаях, когда в работе были использованы несколько мутаций одного гена, трехфакторный дисперсионный анализ, отдельно для самцов и самок, проводили также для всей совокупности данных, касающихся этого гена, рассматривая в качестве главных фиксированных факторов Линию, Генотип и Мутацию. Достоверность факторов Л и Л*Г рассматривали как указание на некомплементарность, при условии соблюдения дополнительного критерия. Во всех случаях в качестве стандартного значения порога достоверности использовали P<0,05.

Мы провели делеционное картирование двух районов, 36В;38В и 6Е;10D, используя линии с делециями, полученные из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) и из европейского центра культур дрозофилы в Умее (Швеция).

Мы использовали 10 делеций, перекрывающих район 36В;38В, еще 3 делеции этого района были исследованы ранее (рисунок 1). Делеции Df(2L)Sd37 и Df(2L)TW9 оказались комплементарными аллелям искомых генов в линиях 2b и Oregon, таким образом, левая точка разрыва делеции Df(2L)Sd37 определила правую границу значимого района, 37D2. Левую границу значимого района в подсекции 36E4 определила левая точка разрыва Df(2L)TW50, для которой ранее также была выявлена комплементарность. Таким образом, значимый район находится между 36E4 и 37D2. Правая точка разрыва Df(2L)TW137 находится в 37В9-С1, а левая точка разрыва Df(2L)VA17 находится в 37С1-4, то есть эти делеции, возможно, не перекрываются. Таким образом, по крайней мере один район локализации генов, участвующих в контроле продолжительности жизни, находится между 36Е4 и 37C1, и по крайней мере еще один - между 37С1 и 37D2.

В целом картина комплементации оказалась сложной. Учитывая характер перекрывания делеций, наличие или отсутствие комплементации, а также то, что часть делеций имеет эффекты у самцов, часть - у самок, а часть - и у самцов, и у самок, мы предполагаем, в качестве наиболее общей гипотезы, что гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому признаку, локализуются в районах 36Е4;37C1 и 37С1;37D2, причем для объяснения всех полученных результатов необходимо допустить, что в каждом районе существуют два или более генов, связанных с изучаемым признаком.

Мы использовали 15 делеций, перекрывающих район 6Е;10D. Только одна делеция Df(1)Sxl-ra, перекрывающая участок хромосомы 6F5;7B3 по цитологической карте политенных хромосом продемонстрировала некомплементарность. Эта делеция перекрывается с двумя соседними комплементарными делециями, которые ограничивают значимый район в сайте 7А6 с дистальной стороны и в сайте 7B2 с проксимальной. Таким образом, локализация генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни и отвечающих за изменчивость по этому признаку, была уточнена до цитологического района 7А6;7B2.

Показаны политенные хромосомы: Х и II (плечо 2L), арабскими цифрами обозначены секции хромосом, пунктирными рамками показаны районы генома, выявленные ранее с помощью рекомбинационного картирования. Делеции показаны горизонтальными линиями; значимые делеции - толстыми горизонтальными линиями. В красные рамки заключены делеции, использовавшиеся в данной работе. Серым цветом обозначены выявленные ранее и в данной работе районы генома, содержащие гены-кандидаты, участвующие в контроле продолжительность жизни. (1) Df(1)Sxl-bt/FM7c; (2) Df(1)Sxl-ra/FM7c; (3) Df(1)ct4 b1/FM7c; (4) Df(1)C128/FM7c; (5) Df(1)RA2/FM7c; (6) Df(1)KA14/FM7c; (7) Df(1)lz-90b24/FM7c; (8) Df(1)9a4-5/FM7c; (9) Df(1)C52/FM7c; (10) Df(1)v-L15/FM7c; (11) Df(1)v^N124B/FM7c; (12) Df(1)v-L2/FM7c; (13) Df(1)RA37/FM7c; (14) Df(1)GA112/FM7c; (15) Df(1)HA85/FM7c; (16) Df(2L)Prl/CyO; (17) Df(2L)fn30/CyO; (18) Df(2L)64j/CyO; (19) Df(2L)fn7/CyO; (20) Df(2L)A376/CyO; (21) Df(2L)A263/CyO; (22) Df(2L)A217/In(2LR)Gla; (23) Df(2L)fn5/CyO; (24) Df(2L)fn1/CyO; (25) Df(2L)A245/CyO; (26) Df(2L)TE35BC-8/CyO; (27) Df(2L)osp29/CyO; (28) Df(2L)TE35BC-34/CyO; (29) Df(2L)TE35BC-24/CyO; (30) Df(2L)TE35BC-3/CyO; (31) Df(2L)TW137/CyO; (32) Df(2L)VA18/CyO; (33) Df(2L)TW50/CyO; (34) Df(2L)TW158/CyO; (35) Df(2L)pr-A16/CyO; (36) Df(2L)VA23/CyO; (37) Df(2L)TW130/CyO; (38) Df(2L)VA17/CyO; (39) Df(2L)VA12/CyO; (40) Df(2L)VA19/CyO; (41) Df(2L)Sd77/CyO; (42) Df(2L)Sd37/SM5; (43) Df(2L)TW9/CyO; (44) Df(2L)TW161/CyO; (45) Df(2L)DS6/CyO.

Всего, с учетом ранее полученных результатов, было выявлено по крайней мере 14 районов хромосом, в которых локализуются гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и отвечающие за изменчивость по этому признаку. Размер выявленных районов и количество локализованных в них генов довольно сильно варьировали.

В секции 35 политенных хромосом ранее было выявлено два района локализации генов, предположительно участвующих в контроле продолжительности жизни, 35B9;35C3 и 35D5;35E1. Их суммарный размер составляет около 418 тысяч пар оснований, однако количество известных и предсказанных генов невелико (31), причем только для четырех генов в коллекционных центрах культур дрозофилы можно было найти линии с мутациями, которые необходимы для количественных комплементационных тестов. Было решено довести исследование районов 35B9;35C3 и 35D5;35E1 до конца и протестировать все доступные для анализа мутации расположенных в них генов: shuttle craft (stc), кодирует транскрипционный фактор РНК-полимеразы II, четыре мутации; reduced (rd), функция неизвестна, одна мутация; guftagu (gft), кодирует белок, связывающий убиквитин-протеин лигазу, одна мутация; male sterile (2)35Ci (ms(2)35Ci), функция неизвестна, одна мутация.

Мутации генов rd и gft оказались комплементарными аллелям этих генов в линиях 2b и Oregon как у самцов, так и у самок. Следовательно, гены rd и gft не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Мутации в гене ms(2)35Ci оказалась некомплементарной аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов, но не у самок. Полученные результаты указывают на то, что ген ms(2)35Ci играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ четырех мутаций гена stc выявил достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни как самцов, так и самок. В связи с этим целесообразно было провести анализ эффектов каждой мутации по отдельности. Оказалось, что две мутации, stc⁶ и stc^k11112, некомплементарны аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самок. Две другие мутации, stc³ и stc⁰⁵⁴⁴¹, оказались комплементарными. Полученные результаты указывают на то, что ген stc играет роль в контроле продолжительности жизни у самок дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны, однако действие stc на продолжительность жизни является аллель-специфическим. Отметим, что исходя из ранее проведенного делеционного картирования, мы ожидали, что в районе 35B9;35C3 находятся гены, влияние которых на продолжительность жизни проявляется именно у самок.

Ген stc показался нам весьма интересным и перспективным для дальнейшего исследования. Отметим, что в проведенных опытах генетическое окружение исследованных мутаций было случайным. Очевидно, что эпистатические взаимодействия генов могут существенно влиять на изучаемые эффекты, поскольку продолжительность жизни представляет собой сложный признак, определяемый многими генами. Статистический анализ количественного теста на комплементацию таков, что позволяет учесть эффекты генетического окружения. Тем не менее, чтобы подтвердить участие гена stc в контроле продолжительности жизни, мы решили экспериментально оценить вклад генетического окружения в получаемые в комплементационном тесте результаты. Для этого тесты провели в разном генетическом окружении: в первом, уже описанном случае генетический фон был случайным; во втором случае вторая хромосома с мутацией stc находилась в окружении первой и третьей хромосомы изогенной линии дикого типа Samarkand (Sam; mut/Bal; Sam, линии были получены из лаборатории Труди Маккей, Государственный университет Северной Каролины, США). Для этого опыта были также использованы специально полученные в Государственном университете Северной Каролины линии, в которых вторая хромосома линий Oregon и 2b находилась в окружении первой и третьей хромосомы линии Samarkand (Sam; Ore; Sam и Sam; 2b;Sam).

Полученные результаты показали, что действие мутаций stc⁶, stc^k11112, stc⁰⁵⁴⁴¹ и stc³ по-разному проявляется в разном генетическом окружении и зависит от характера мутаций.

В случайном генетическом окружении эффект мутации stc⁶ был специфичен для самок, при этом 2b/stc⁶ самки жили дольше, чем Ore/stc⁶ самки. В гомозиготном Sam окружении мутация stc⁶ также продемонстрировала некомплементарность у самок, однако продолжительность жизни Ore/stc⁶ самок была больше, чем продолжительность жизни 2b/stc⁶ самок. В целом некомплементарность данной мутации аллелям гена stc в линиях Oregon и 2b была подтверждена результатами тестов в различном генетическом окружении. Влияния stc⁶ на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из вариантов теста. В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stc⁶ на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона.

Специфичный для самок эффект мутации stc^k11112, наблюдавшийся в случайном генетическом окружении, не удалось статистически значимо воспроизвести в гомозиготном Sam окружении, так как размеры выборки как для Ore/Bal и 2b/Bal генотипов были сильно уменьшены в этом эксперименте, что привело к значительным потерям в силе статистического анализа. Следует заметить, однако, что разница в средней продолжительности жизни между Ore/stc^k11112 и 2b/stc^k11112 самками была очень большой (30 дней) и достоверной. В случайном генетическом окружении продолжительность жизни самок Ore/stc^k11112 была больше, чем продолжительность жизни самок 2b/stc^k11112, в гомозиготном Sam окружении направление эффекта было противоположным. Влияния stc^k11112 на продолжительность жизни самцов не было обнаружено ни в одном из вариантов теста. В целом полученные данные согласуются с выводом о специфичном для самок влиянии stc^k11112 на продолжительность жизни, сила и направление которого зависят от генетического фона.

Значимый эффект stc³ и stc⁰⁵⁴⁴¹ на продолжительность жизни самок не был выявлен ни в случайном, ни в гомозиготном Sam окружении. Значимого эффекта stc³ и stc⁰⁵⁴⁴¹ не наблюдалось также и у самцов в случайном окружении. Тем не менее, в гомозиготном Sam окружении, то есть выровненном генетическом фоне, обе мутации продемонстрировали некомплементарность аллелям гена stc в линиях 2b и Oregon у самцов. Направление комплементационного эффекта для самцов в гомозиготном Sam окружении было одинаковым для обеих мутаций, при этом продолжительность жизни 2b/stc была больше, чем продолжительность жизни Ore/stc.

Таким образом, проведенные опыты подтвердили, что stc является геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни, но подчеркнули, что результаты тестов на комплементацию зависят от пола особей, используемого мутантного аллеля и генетического окружения. У дрозофилы stc экспрессируется в эмбрионах, у личинок, куколок и взрослых самцов и самок. Экспрессия в центральной нервной системе эмбрионов необходима для нормального развития мотонейронов и роста аксонов и, как следствие, иннервации мышечных клеток (Stroumbakis et al., 1996).

Согласно современным представлениям нервная система является ключевой тканью в контроле продолжительности жизни. В частности, мотонейроны либо представляют собой клетки, лимитирующие продолжительность жизни целого организма, либо регулируют продолжительность жизни, благодаря системному воздействию на другие клетки и ткани (Parkes et al., 1999). Все вышесказанное делает ген stc интересным геном-кандидатом, участвующим в контроле продолжительности жизни.

В выявленных нами районах 36E4;37C1 и 37С1;37D2 второй хромосомы также локализуются гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, связанные с развитием и функционированием нервной системы. Для проведения дальнейшего мутационного картирования мы выбрали мутации трех таких генов, tup, Lim3 и Fas3.

Суммарный анализ двух мутаций гена tup у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. Различия между действием разных мутаций на продолжительность жизни обнаружены не были. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген tup играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ двух мутаций гена Lim3 у самцов продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. Различия между действием разных мутаций на продолжительность жизни обнаружены не были. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген Lim3 играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Исследованная мутация гена Fas3 оказалась комплементарной аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon как у самцов, так и у самок. Следовательно, ген Fas3 не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Гены tup и Lim3 кодируют транскрипционные факторы, вовлечённые в определение идентичности серотониновых и дофаминовых нейронов. Предполагается, что дифференциальная экспрессия этих генов в разных нейронах образует код, определяющий пути их узкой специализации (Thor, Thomas, 1997). Таким образом, наши результаты свидетельствуют о том, что, кроме stc, еще два гена, tup и Lim3, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II и регулирующие развитие нервной системы, и в частности, мотонейронов, являются кандидатами на участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы.

Всего в выявленных в результате делеционного картирования районах находится несколько сотен генов-кандидатов, которые потенциально могут участвовать в контроле продолжительности жизни. Для дальнейшего исследования мы выбрали гены-кандидаты, также связанные с развитием и функционированием нервной системы.

Два выявленных в данной работе района, 36Е4;37C1 и 37C1;37D2, расположены вплотную друг к другу, имеют суммарный размер около 920 тысяч пар оснований и содержат около 120 генов и предсказанных генов, для 43 из которых существуют мутации, необходимые для дальнейших комплементационных тестов. Мы обратили внимание на то, что в этом районе расположен так называемый Ddc-кластер, в котором локализуется около 20 генов, участвующих в биосинтезе катехоламинов. Катехоламины принимают участие в передаче нервного импульса, а также необходимы для правильного отвердевания и окрашивания кутикулы у мух. Они влияют на плодовитость и поведение при скрещивании, циркадные ритмы, эндокринную секрецию, агрессивность, способность к обучению и память (Blenau, Baumann, 2001).

По три мутации четырех наиболее интересных генов, входящих в Ddc-кластер, были использованы для постановки количественных комплементационных тестов, позволяющих понять, участвуют ли эти гены в контроле продолжительности жизни. В число исследуемых генов вошли Catecholamines up (Catsup, регулирует активность тирозингидроксилазы, катализирующей первую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение тирозина в дофа), Dopa decarboxylase (Ddc, кодирует дофадекарбоксилазу, катализирующую вторую реакцию в цепи биосинтеза катехоламинов, превращение дофа в дофамин, основной катехоламин, участвующий в передаче нервного импульса), Diphenol oxidase A2 (Dox-A2, кодирует фенолоксидазу, катализирующую превращение дофамина в дофа хинон, необходимый для образования пигмента) и alpha metil dopa-resistant (amd, катализирует превращение дофамина в некоторые производные, необходимые для отвердевания кутикулы).

Суммарный анализ трех мутаций гена Catsup продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. При этом достоверных различий между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни выявлено не было. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты указывают на то, что ген Catsup играет роль в контроле продолжительности жизни самцов дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ трех мутаций гена Dox-A2 продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon у самцов. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил их некомплементарность. И в этом случае формально мутации не отличались между собой. У самок во всех случаях достоверных эффектов не наблюдалось. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ген Dox-A2 играет роль в контроле продолжительности жизни у самцов дрозофилы, а аллели его в линиях 2b и Oregon различны.

Суммарный анализ трех мутаций гена Ddc продемонстрировал их некомплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon и у самцов, и у самок. Однако при этом достоверные различия между влиянием разных мутаций на продолжительность жизни были выявлены как у самцов, так и у самок. Анализ, проведенный для разных мутаций отдельно, подтвердил некомплементарность мутаций Ddc²⁷ и Ddc^lo1 у самцов и мутации Ddc⁴³ у самок. Полученные результаты указывают на то, что ген Ddc играет роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, а его аллели в линиях 2b и Oregon различны, причем действие Ddc на продолжительность жизни зависит от аллеля гена и пола особей.

Все три мутации гена amd, проанализированных как вместе, так и по отдельности, продемонстрировали комплементарность аллелям этого гена в линиях 2b и Oregon и у самцов, и у самок. Следовательно, ген amd не связан с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях.

Исследование молекулярного полиморфизма двух из выявленных нами генов, Ddc и Catsup, в природной популяции мух Raleigh, проведенное в Государственном университете Северной Каролины, подтвердило, что эти два гена определяют изменчивость продолжительности жизни, по крайней мере, в этой популяции (De Luca et al., 2003; Carbone et al., 2006). Примечательно то, что один из значимых полиморфизмов в гене Ddc затрагивает экзон, характерный для фермента, функционирующего исключительно в нервной системе.

Мы обратили внимание, что в цитологическом районах 7А6;7B2, выяленном в данной работе, и в цитологическом районе 64C;65C, выявленном с помощью делеционного картирования ранее, расположены гены inactive (iav) и pale (ple), соответственно. Эти гены влияют на уровень катехоламинов у дрозофилы. Единственная найденная в коллекционных центрах культур дрозофилы мутация каждого из этих генов была использована для постановки теста на комплементацию. Полученные результаты мутационного картирования свидетельствуют о комплементарности мутаций генов iav и ple аллелям соответствующих генов в линиях 2b и Oregon. Следовательно, гены iav и ple не связаны с контролем продолжительности жизни в исследуемых нами линиях. Можно предположить, что в районах 7A6;B2 и 64C;65C локализуются другие контролирующие продолжительность жизни гены, аллели которых различны в линиях 2b и Oregon.

В итоге проведенной работы мы описали две группы генов-кандидатов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, участвующими в биосинтезе катехоламинов и передаче нервного импульса в нейронах (Catsup, Ddc, Dox-A2), вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы, в частности, мотонейронов (stc, tup, Lim3).

Доказательство участия генов stc, crol и esg в контроле продолжительности жизни

Эксперименты по картированию позволили нам выявить гены, которые предположительно играют роль в контроле продолжительности жизни дрозофилы, так называемые гены-кандидаты. Доказательство реальной вовлеченности выявленных нами генов-кандидатов в контроль продолжительности жизни представляет собой важную самостоятельную задачу, имеющую существенное значение для пополнения наших знаний о молекулярно-генетических основах изменчивости такого важного признака как продолжительность жизни.

Один из способов прямого доказательства участия какого-либо гена в контроле какого-либо признака заключается в исследовании влияния на этот признак инсерционных мутаций данного гена, вызванных встройкой в него специальных векторных конструкций, и их реверсий. Считается, что если инсерция приводит к изменению изучаемого признака, а чистое вырезание вектора к реверсии по этому признаку, то ген участвует в контроле данного признака. Главное преимущество этого подхода заключается в том, что выводы о влиянии на признак изменений в каком-либо гене основываются на сравнении линий, отличающихся только аллельным состоянием данного гена при полной идентичности генетического окружения.

Большинство векторных конструкций имеют в своем составе маркерный ген - нормальный аллель гена white (w). Исходная линия без инсерций содержит мутацию этого гена, приводящую к белоглазости, встройка векторной конструкции детектируется по изменению цвета глаз на красный. Особенностью векторных конструкций является то, что встройка их в геном остается стабильной. Однако использование стандартных скрещиваний позволяет мобилизовать векторную конструкцию и вырезать ее из места встройки, что фенотипически может быть детектировано по восстановлению белоглазости и формально должно привести к реверсии инсерционной мутации. Известно, однако, что вырезание может произойти неточно, так что часть гена окажется делетированной или же, наоборот, в месте встройки сохраниться часть конструкции, не содержащая маркерный ген. В принципе возможна также встройка части конструкция в какой-либо другой район генома.

Мы начали работу с гена stc. Из коллекционного центра культур дрозофилы в Блумингтоне (США) были выписаны две линии: исходная контрольная линия и линия с инсерцией векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена stc. Мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны, что является необходимым условием использования мутации в опытах, доказывающих участие гена в контроле продолжительности жизни. Из этой линии, используя стандартные скрещивания, позволяющие мобилизовать векторную конструкцию, мы получили 5 линий с реверсией маркерного фенотипа. Данные молекулярного анализа этих линий, полученные А. В. Симоненко и Е. В. Ершовой, свидетельствуют о том, что во всех 5 линиях произошло точное вырезание векторной конструкции из сайта встройки.

В контрольной и мутантной линиях, а также в линиях с реверсиями, мы измерили продолжительность жизни 300 девственных самцов и 300 девственных самок. Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в опытах по делеционному и мутационному картированию. Для сравнения средних значений продолжительности жизни использовали критерий Стьюдента. Было показано, что инсерция вектора не влияет на продолжительность жизни самцов, но приводит к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самок (рисунок 2). Поскольку в результате инсерции фенотип менялся только у самок, результат реверсии тоже можно было обнаружить только у самок. Во всех линиях с чистым вырезанием вектора средняя продолжительность жизни самок достоверно отличалась от средней продолжительности жизни самок мутантной линии и не отличалась от контроля (рисунок 1). Этот вывод подтверждает и анализ выживания самок (рисунок 2). На рисунке 3А приведены кривые выживания контрольных и мутантных самок с указанием стандартных ошибок (GraphPad Prism 4, GraphPad Software, San Diego, California, USA), масштаб которых характерен для всех полученных в работе кривых выживания. В связи с этим во всех остальных случаях кривые выживания будут приведены без указания ошибок, чтобы не загромождать рисунки. Кривая выживания мутантных самок достоверно отличается как от кривой выживания контрольных самок (P<0,0001; тест Каплана-Мейера), так и от кривых выживания самок-ревертантов (P<0,0001 во всех случаях), в то время как различия между контрольными самками и самками-ревертантами недостоверны (P=0.4784; P=0.7472; P=0.6234; P=0.5789; P=0.7496).

Рисунок 1. Средняя продолжительность жизни девственных самок контрольной линии, линии w¹¹¹⁸; stc^KG01230 и линий с реверсиями.

А

Б

Рисунок 2. Кривые выживания девственных самок контрольной линии, линии w¹¹¹⁸; stc^KG01230 и линий с реверсиями. А. Сравнение контрольной и мутантной линии. Б. Сравнение контрольной и мутантной линий с ревертантами

В результате мобилизации векторных конструкций довольно редко удается добиться чистого их вырезания. Как правило, для доказательства участия гена в контроле признака приходится ограничиваться анализом одного истинного ревертанта. Получение пяти истинных реверсий мутации stc^KG01230 является большой редкостью, и это позволило нам проанализировать связь между состоянием гена и характером признака в пяти независимых случаях. По признаку «средняя продолжительность жизни самок» реверсия мутации на молекулярном уровне в пяти независимых случаях сопровождалась реверсией фенотипа. Проведенный дополнительно анализ продолжительности жизни скрещивавшихся самок контрольной и мутантной линий, а также линий с реверсиями в целом подтвердил полученные выводы. Направление эффекта мутации stc^KG01230 в данном случае оказалось противоположным: продолжительность жизни самок в линии с мутацией была ниже продолжительности жизни самок в контрольной линии и в линиях с реверсиями. В одной линии с реверсией продолжительность жизни скрещивавшихся самок не вернулась к контрольному уровню. Причины этого непонятны и заслуживают дальнейшего исследования. В целом, несмотря на это исключение, мы считаем, что причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры гена stc и изменениями продолжительности жизни хорошо доказана. Таким образом, ген stc действительно участвует в контроле продолжительности жизни.

Наши коллеги из Государственного университета Северной Каролины проводили поиск линий, в которых встройка различных векторных конструкций на основе P-элемента в случайные районы генома привела к увеличению продолжительности жизни мух. В одной из найденных линий встройка векторной конструкции на расстоянии 100 пар оснований от начала структурной части гена crooked legs (crol) привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов. В другой линии встройка на расстоянии 600 пар нуклеотидов от конца структурной части гена escargot (esg) также привела к увеличению средней продолжительности жизни самцов. И в том, и в другом случае мухи, несущие эту инсерционную мутацию в гомозиготном состояний, были жизнеспособны.

Ген crol кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, экспрессия которого в центральной нервной системе, ножных имагинальных дисках и слюнных железах индуцируется экдизоном (D'Avino, Thummel, 1998). В настоящее время остается, правда, неясным, какую именно роль этот ген играет в развитии и функционировании нервной системы. Ген esg кодирует транскрипционный фактор РНК полимеразы II, который принимает участие в регуляции асимметричных делений нейробластов во время развития нервной системы, клеточной спецификации и формирования поведенческих реакций (Cai et al., 2001; Yagi et al., 1998). Таким образом, эти два гена так же, как гены stc, tup и Lim3 кодируют транскрипционные факторы, участвующие в регуляции развития и функционирования нервной системы. Мы решили исследовать эти гены более подробно и доказать их участие в контроле продолжительности жизни дрозофилы.

Поскольку первичная характеристика продолжительности жизни в контрольных линиях и в линиях с инсерцией векторной конструкции в районы генов crol и esg были известны, мы начали работу с получения линий-ревертантов. Из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена crol мы получили три линии с реверсией маркерного фенотипа, а из линии с инсерцией векторной конструкции в район гена esg - семь линий. Данные, полученные А.В. Симоненко, свидетельствуют о том, что для каждого из этих генов только в одной линии произошло точное вырезание векторной конструкции из места встройки.

Мы измерили продолжительность жизни 200 девственных самцов и 200 девственных самок контрольных линий и линий с инсерцией в районы генов crol и esg. Отбор мух и измерение продолжительности жизни проводили так же, как в опытах по делеционному и мутационному картированию. Было показано, что инсерция векторной конструкции в районы генов crol и esg не повлияла на среднюю продолжительность жизни самок, но привела к достоверному увеличению средней продолжительности жизни самцов. Поскольку продолжительность жизни контрольных самок и самок с инсерционной мутацией не отличалась, эффект реверсии у мух этого пола наблюдать было невозможно. Чтобы оценить фенотипический эффект реверсии, мы сравнили продолжительность жизни 200 самцов контрольных, мутантных линии и самцов каждой из линий-ревертантов, в которых произошло чистое вырезание вектора (рисунок 3).

Рисунок 3. Средняя продолжительность жизни самцов контрольной линии, линий с инсерциями P{GT1} в районы генов esg и crol и линий-ревертантов с чистым вырезанием.

А

Б

Рисунок 4. Кривые выживания самцов контрольной линии, линий с инсерцией векторной конструкции P{GT1} в районы генов esg (А) и crol (Б) и соответствующих линий-ревертантов с чистым вырезанием

Средняя продолжительность жизни самцов линий-ревертантов была достоверно ниже средней продолжительности жизни самцов мутантных линий. Очевидно, что точное вырезание векторной конструкции из районов генов crol и esg, то есть реверсия мутаций на молекулярном уровне, сопровождалось и реверсиями фенотипа - возвращением средней продолжительности жизни к существенно более низкому уровню, характерному для контрольных линий. Этот вывод подтверждают и кривые выживания (рисунок 4), которые не отличаются у самцов исходной линии и самцов-ревертантов (P=0,8713 для crol; P=0,6524 для esg), в то время как кривые выживания мутантных самцов и по одному, и по другому гену достоверно отличаются от кривых выживания контрольных самцов и соответствующих самцов-ревертантов (P<0,0001 для всех сравнений).

В целом, мы считаем, что причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 5'-концу структурной части гена crol, а также района, прилежащего 3'-концу структурной части гена esg, и изменениями продолжительности жизни хорошо доказана. Встройки векторных конструкций произошли в непосредственной близости от генов, и это позволяет нам с большой долей вероятности говорить о том, что именно гены crol и esg, участвуют в контроле продолжительности жизни.

В целом группа генов и генов-кандидатов, кодирующих транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития и функционирования нервной системы (shuttle craft, tail up, Lim3, crooked legs, escargot) представляется нам весьма интересной в связи с той ролью, которую нервная система, видимо, играет в контроле продолжительности жизни.

Выводы

1. Комплементационные количественные тесты с делециями позволили выявить три района хромосом, 7А6;7B2, 36Е4;37C1, и 37С1;37D2, в которых находятся гены, участвующие в контроле продолжительности жизни и определяющие ее изменчивость в лабораторных линиях Drosophila melanogaster дикого типа.

2. Комплементационные количественные тесты с 26 мутациями 13 генов позволили выявить семь генов-кандидатов, участвующих в контроле продолжительности жизни и определяющих ее изменчивость в лабораторных линиях Drosophila melanogaster дикого типа: shuttle craft, tail up, Lim3, Catecholamines up, Dopa decarboxylase, Diphenol oxidase A2, male sterile (2)35Ci.

3. Характер изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{SUPor-P} в 5'-нетранслируемую область гена shuttle craft, и в результате четырех независимо полученных реверсий этой мутации свидетельствует о том, что ген shuttle craft участвует в контроле продолжительности жизни. Влияние мутаций гена shuttle craft на продолжительность жизни зависит от пола и физиологического статуса особей, а также от эпистатических взаимодействий.

4. Анализ изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{GT1} в 3'-окружение гена escargot, и в результате полученной реверсии этой мутации доказал, что существует причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 3'-концу структурной части гена escargot, и изменениями продолжительности жизни самцов.

5. Анализ изменения продолжительности жизни в результате мутации, вызванной встройкой векторной конструкции P{GT1} в 5'-окружение гена crooked legs, и в результате полученной реверсии этой мутации доказал, что существует причинно-следственная связь между изменениями молекулярной структуры района, прилежащего к 5'-концу структурной части гена crooked legs, и изменениями продолжительности жизни самцов.

6. В результате проделанной работы описаны две группы генов, связанных с ранее неизвестными путями контроля продолжительности жизни. Первая группа представлена генами, кодирующими белки, необходимые для биосинтеза катехоламинов и передачи нервного импульса, вторую группу составляют гены, кодирующие транскрипционные факторы РНК-полимеразы II, которые участвуют в контроле развития нервной системы Drosophila melanogaster.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. De Luca M., Roshina N.V., Geiger-Thornsberry G.L., Lyman R.F., Pasyukova E.G., Mackay T.F.C. Dopa decarboxylase (Ddc) affects variation in Drosophila longevity. // Nature Genetics. 2003. 34: 429-433.

2. Pasyukova E.G., Roshina N.V., Mackay T.F.C. Shuttle craft: a candidate quantitative trait gene for Drosophila lifespan. // Aging Cell. 2004. 3: 297-307.

3. Mackay T.F.C., Roshina N.V., Leips J.W., Pasyukova E.G. Complex genetic architecture of Drosophila longevity. // Handbook of the Biology of Aging, Ed. Masoro E., Austad S. 2005. P. 181-216.

4. Pощина Н.В., Пасюкова Е.Г. Гены, регулирующие развитие и функционирование нервной системы, определяют продолжительность жизни Drosophila melanogaster. // Генетика. 2007. 43: 356-362.

5. Pasyukova E.G., Roshina N.V., Mackay T.F.C. Quantitative trait genes affecting longevity in Drosophila melanogaster. // 43 Drosophila Research Conference. San-Diego. USA. 2002.

6. Roshina N.V., Symonenko A.V., Tcybulko E.A., Ershova E.V., Pasyukova E.G. The shuttle craft locus controlling motoneuron axon guidance proves to affect Drosophila melanogaster lifespan. // Drosophila Research Conference. San-Diego. USA. 2008.

7. Рощина Н.В., Симоненко А.В., Пасюкова Е.Г. Ген shuttle craft, регулирующий развитие мотонейронов, участвует в контроле продолжительности жизни дрозофилы. // IV Съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. Новосибирск. Россия. 2008.

8. Roshina N.V., Symonenko A.V., Tcybulko E.A., Ershova E.V., Pasyukova E.G. The shuttle craft gene controlling axon guidance proves to affect Drosophila melanogaster lifespan. // XX International Congress of Genetics. Berlin. Germany. 2008.

Размещено на Allbest.ru