Пространственные и временные характеристики экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека в ходе пренатального развития

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПРОСТРАНСТВЕННЫЕ И ВРЕМЕННЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ, КОДИРУЮЩИХ РЕГУЛЯТОРНЫЕ ФАКТОРЫ TGFbeta2, PITX2 И FOXC1 В ТКАНЯХ ГЛАЗА ЧЕЛОВЕКА В ХОДЕ ПРЕНАТАЛЬНОГО РАЗВИТИЯ

03.00.30 -эмбриология, биология развития 03.00.15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

ФИРСОВА НАТАЛЬЯ ВИКТОРОВНА

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетических механизмов онтогенеза Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук ЗИНОВЬЕВА Рина Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук СТРОЕВА Ольга Георгиевна

доктор биологических наук ЖУКОВА Ольга Владимировна

Ведущая организация: кафедра эмбриологии биологического факультета Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова.

Защита диссертации состоится « » __________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26). Сайт: http://idbras.comcor.ru/indexr.htm. email: idbras@bk.ru.

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Автореферат разослан «___»______________2008 года.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук

ele0806@mail.ru Абрамова Е.Б.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Изучение экспрессии регуляторных генов, их дифференциальной активности в ходе развития организма, участие в дифференцировке клеток различного типа представляет собой одно из центральных направлений современной биологии, находящееся на стыке молекулярной генетики и биологии развития. Глаз является уникальной модельной системой для исследования молекулярно-генетических механизмов эмбриональной индукции, пролиферации, дифференцировки, миграции клеток, апоптоза. Существенным достижением последних десятилетий в области исследования глаза стало обнаружение высокой консервативности молекулярных механизмов, направляющих развитие глаза у представителей различных систематических групп (Heanue et al., 2002; Hsieh et al., 2002). В настоящее время известно, что формирование глаза находится под контролем основного каскада дифференциально экспрессирующихся транскрипционных факторов PAX6/EYA1/SIX3/DACH1/PROX1/PITX2. Изучение молекулярно-генетических механизмов развития глаза имеет не только фундаментальное, но и прикладное значение, так как нарушение экспрессии регуляторных генов глазного поля является причиной возникновения множества наследственных заболеваний глаз. Однако данные, имеющиеся в литературе, разрознены и в основном касаются изучения экспрессии генов в отдельных структурах глаза. Кроме того, большинство исследований регуляторных генов, в частности PITX2 и FOXC1, носит сугубо медико-биологический характер и направлено на идентификацию мутаций этих генов у пациентов с различными патологиями глаза (Davies et al., 1999; Holmberg et al., 2004). В связи с этим актуальным является систематическое исследование экспрессии генов, принимающих участие в развитии глаза человека. Мы сосредоточили наше внимание на полифункциональных регуляторных факторах: сигнальном белке TGFbeta2 и транскрипционных факторах PITX2 и FOXC1, поскольку известно, что гены, кодирующие эти регуляторные факторы, начинают экспрессироваться на самых ранних этапах развития глаза позвоночных. Существуют данные, что TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в глазу функционируют в составе одного сигнального пути. Нарушение работы любого из этих регуляторных факторов приводит к серьезным, часто фенотипически сходным аномалиям глаза. Данные о характере экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в ходе развития глаза человека будут способствовать дальнейшим исследованиям, направленным на выявление взаимодействий регуляторных факторов, кодируемых этими генами.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось изучение пространственных и временных характеристик экспрессии генов, кодирующих сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2, FOXC1, в различных структурах глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития.

В работе были поставлены следующие задачи:

1. Сконструировать кДНК библиотеки, комплементарные мРНК из различных тканей глаза человека с 9,5 до 22-й недель пренатального развития. глаз пренатальный ген белок

2. Идентифицировать и изучить паттерн экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития.

3. Исследовать локализацию белковых продуктов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза с 8 до 22-й недели развития.

4. Выявить пространственные и временные особенности экспрессии анализируемых регуляторных факторов в различных структурах развивающегося глаза человека.

Научная новизна и практическая значимость работы. Для исследования характера экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в ходе развития глаза человека впервые применен комплексный подход. Получены данные об активности этих генов и локализации белков TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека на последовательных стадиях пренатального развития (с 8-й по 22-ю неделю). На основании полученных данных сделан вывод о том, что сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1 принимают участие в формировании различных структур глаза человека: роговицы, хрусталика, цилиарного тела и сетчатки. Одним из основных результатов работы является установление того факта, что гены, кодирующие транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, которые ранее считались регуляторами развития переднего сегмента глаза, экспрессируются в формирующейся сетчатке и пигментном эпителии, то есть принимают участие в формировании тканей глаза нейрального происхождения. Анализ полученных результатов приводит к заключению, что экспрессия генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в развивающемся глазу зависит от типа клеток. Таким образом, получен ряд принципиальных результатов, которые расширяют и углубляют представления о молекулярно-генетических механизмах дифференцировки различных тканей глаза человека в ходе эмбриогенеза.

Полученные данные могут быть использованы в медико-биологических исследованиях механизмов развития наследственных заболеваний глаз, а также при чтении лекций по биологии и генетике развития.

Личное участие автора. Вся работа выполнена непосредственно автором. Поставленные задачи решены с применением современных молекулярно-генетических методов и классического метода иммуногистохимии. Все выводы сделаны на основании собственных оригинальных данных.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были представлены на научно-практической конференции «Современные методы диагностики и лечения заболеваний роговицы и склеры» (Москва, 2007 г.); IV и V Международных научно-практических конференциях «Пролиферативный синдром в офтальмологии» (Москва, 2006, 2008 гг.); на конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К.Кольцова (Москва, 2006, 2007 гг.); на Симпозиуме с международным участием «Клеточные, молекулярные и эволюционные аспекты морфогенеза» (Москва, 2007 г.); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, из них 3 статьи в журнале, рекомендованном ВАК, 4 статьи в научных сборниках и 9 тезисов конференций.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на __ страницах, содержит 32 рисунка, 5 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов и списка литературы, включающего 145 цитируемых источника.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект исследования. Исследование выполнено на глазах абортивных плодов человека на стадиях, соответствующих 8, 9.5, 10.5, 11, 12, 13-14, 17-18 и 22 неделям пренатального развития, полученные из лицензированных учреждений Министерства Здравоохранения в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан.

Препарирование тканей. Для молекулярно-генетических исследований на 9.5, 11, 14, 17-18 и 22-й неделях развития отрезали передний сегмент от заднего по лимбу. Затем отделяли хрусталик от роговицы, выделяли цилиарное тело вместе с радужкой. Сетчатку аккуратно отделяли от заднего отдела, подрезая глазной нерв. Пигментный эпителий брали вместе с сосудистой оболочкой (на 9.5 неделе вместе с сосудистой оболочкой и склерой).

Выделение тотРНК из различных тканей глаза, хранившихся при -70єС, проводили при помощи смеси TRI^® Reagent (Sigma, США) по протоколу предоставленному производителем.

Получение и нормировка кДНК библиотек. Синтез первой цепи кДНК проводили на матрице мРНК из различных тканей развивающегося глаза человека с помощью обратной транскриптазы SuperScript (GIBCO BRL, США) и гексануклеотидов фирмы Силекс М (Россия). Для оценки уровня экспрессии исследуемых генов, кДНК были предварительно отнормированы по рибосомальному белку, RPL19. Нормировка осуществлялась между тканями, выделенными из одного глаза. Праймеры, сконструированные по нуклеотидной последовательности RPL19, указаны в таблице 1.

In situ гибридизация проведена на 9.5 и 20 неделях пренатального развития по модифицированному протоколу Памелы Раймонд (Barthel, Raymond, 2000). В качестве отрицательного контроля использовали гибридизацию с sense РНК зондами. Используемые РНК зонды были мечены дигогсигенином с помощью набора DIG RNA Labeling Kit (SP6/T7) Roche Applie Science

Иммуногистохимическое исследование проводили по стандартной методике на криосрезах глаз человека на 8, 10.5, 12, 13-14, 17 и 22 неделях пренатального развития. Использовали антитела Rabbit to PITX2 (Sigma, USA, 1:200), Rabbit polyclonal to FOXC1 (Abcam, UK, 1:180); Mouse monoclonal to TGFbeta2 (Abcam, UK, 1:20), Antirabbit Aleksa 488 (MolecularProbs, США, 1:1000); Antimouse Aleksa 586 (MolecularProbs, США, 1:1000); Hoechst 42333 (Leica, Германия, 1:1000). В качестве отрицательного контроля, параллельно с ходом опыта на каждом препарате анализируемых стадий развития глаз ставили реакцию в отсутствие первичных антител.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Анализ экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека в ходе пренатального развития

Анализ экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза на последовательных стадиях развития: 9.5, 11, 13-14, 17-18 и 21 недели. На 9.5 неделе пренатального развития идет активный морфогенез глаза, в котором уже присутствуют зачатки всех основных структур. Происходит дифференцировка и пролиферация эпителиальных клеток и клеток стромы роговицы. В эпителии хрусталика также наблюдаются пролиферирующие клетки, которые перемещаются от периферии к экватору хрусталика, удлиняются и формируют первичные хрусталиковые волокна. Сетчатка представлена двумя слоями нейробластов: внутренним и наружным. В обоих слоях есть пролиферирующие клетки, максимальное количество которых сконцентрировано на периферии сетчатки. Во внутреннем нейробластическом слое идет дифференцировка мюллеровских и ганглиозных клеток. В пределах наружного нейробластического слоя формируются биполяры и горизонтальные клетки. Пигментный эпителий на 9.5 неделе представляет собой один слой пигментированных клеток. Со стороны наружной поверхности пигментного эпителия различима формирующаяся сосудистая оболочка.

Анализ уровня экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 на стадии, соответствующей 9.5 неделе эмбриогенеза, проводился на кДНК библиотеках, синтезированных на мРНК из роговицы, хрусталика, сетчатки и пигментного эпителия вместе с сосудистой оболочкой и склерой. Результаты ПЦР-анализа, свидетельствуют о наличии транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 во всех исследуемых тканях (Рис. 1.А). Мы впервые идентифицировали экспрессию генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в тканях глаза человека на 9.5-й неделе развития, когда интенсивно идет морфогенез глаза.

Для анализа экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 на 11 неделе пренатального развития проводилось более детальное препарирование тканей глаза. Нам удалось отделить пигментный эпителий с сосудистой оболочкой от склеры. Кроме роговицы, хрусталика и сетчатки, мы выделяли краевую область сетчатки - зону формирующихся цилиарного тела и радужки. На 11 неделе развития складчатости, характерной для цилиарного тела, еще наблюдается, однако, уже к 12-й неделе в этой области начинается формирование складок.

Результаты ПЦР-анализа свидетельствуют о наличии на 11 неделе развития транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в роговице, хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии/сосудистой оболочке (Рис. 1.Б). Причем уровень экспрессии гена TGFbeta2 высокий во всех анализируемых тканях. В кДНК библиотеке, ситезированной на мРНК из области формирующегося цилиарного тела, также детектируются транскрипты TGFbeta2, PITX2 и FOXC1. Следует отметить, что уровень экспрессии TGFbeta2 и PITX2 в формирующемся цилиарном теле на 11 неделе несколько выше, чем в сетчатке. Это наблюдение особенно важно, поскольку морфогенез цилиарного тела только начинается и морфологических изменений в этой области еще не наблюдается. Эти данные могут быть существены для понимания молекулярно-генетических механизмов развития этой структуры глаза. Они хронометрируют начало развития цилиарного тела как минимум с 11 недели пренатального развития.

Морфологическая характеристика глаза 14-недельного плода человека свидетельствует о еще более выраженных изменениях в гистологии тканей, по сравнению с 11 неделей эмбриогенеза. Цилиарные складки уже хорошо различимы. В сетчатке начинают формироваться наружный и внутренний сетчатые слои. Продолжается дифференцировка ганглиозных и фоторецепторных клеток. Анализ экспрессии исследуемых генов в тканях глаза на 14 неделе развития выявил наличие транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 во всех тканях глаза (Рис. 1.В).

А Б В

Г Д

Рисунок 1 Результаты ПЦР-анализа, иллюстрирующие ха-рактер экспрессии генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в различных структурах глаза чело-века на 9.5 (А), 11 (Б), 14 (В), 17-18 (Г) и 21 (Д) неделях развития. В качестве гена для норми- Г Д ровки использован RPL19. 1 - роговица; 2 - хрусталик; 3 - сетчатка; 4 - цилиарное тело/радужка; 5 - пигментный эпителий/сосудистая оболочка. На рис. 1а четвертая колонка - пигментный эпителий/сосудистая оболочка/склера

Существенных морфологических изменений роговицы и хрусталика на 17-18-неделе, по сравнению с таковыми у 14-недельного плода, не наблюдается. В сетчатке к этому времени уже отчетливо выражены все основные слои: наружный ядерный слой, наружный сетчатый слой, внутренний ядерный слой, внутренний сетчатый слой, слой ганглиозных клеток. Продолжается формирование сетчатых слоев и слоя нервных волокон сетчатки. Идет активный морфогенез цилиарного тела. Результаты ПЦР-анализа, свидетельствуют о наличии транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 во всех анализируемых тканях (Рис. 1.Г).

К 21 неделе пренатального развития все анализированные ткани глаза практически сформированы. Роговица и хрусталик увеличились в размере, по сравнению с 17-18 неделей. В сетчатке присутствуют все ядерные и сетчатые слои. Цилиарное тело сформировано. ПЦР-анализ показал наличие транскриптов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 на 21 неделе плодного развития в всех анализируемых тканях глаза, однако уровень экспрессии генов в большинстве тканей несколько снижается (Рис. 1.Д).

Таким образом, нами выявлены мРНК TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 во всех исследуемых тканях глаза с 9.5 до 21 недели развития, когда активно идет морфогенез глаза. Впервые идентифицирована экспрессия гена PITX2 в хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии/сосудистой оболочке. Обнаружение экспрессии гена FOXC1 в развивающемся глазу человека также является новым фактом. Функциональная роль этих транскрипционных факторов в развитии глаза не вполне ясна и требует дальнейших исследований.

Локализация мРНК PITX2 в тканях развивающегося глаза

Для подтверждения данных ПЦР-анализа об экспрессии одного из исследуемых генов - PITX2 - был использован метод in situ гибридизации, который позволил локализовать мРНК этого гена в глазу человека на 9.5-10 и 20 неделях развития. Транскрипты PITX2 на ранней стадии, соответствующей 9.5-10 неделям, выявлены в эпителии и формирующихся волокнах хрусталика (Рис. 2.А), в которых активно идут процессы пролиферации и дифференцировки. Наши результаты о наличии мРНК PITX2 в клетках нейромезенхимы, которые формируют волны миграции (Рис. 2.В), находятся в соответствии с данными литературы об экспрессии этого гена в клетках окологлазной мезенхимы у человека на 7 и 9 неделях развития и у мышей в раннем эмбриогенезе. Эти клетки участвуют в формировании всех структур переднего сегмента глаза и склеры. Существует гипотеза, что именно PITX2 запускает каскад генов, контролирующих дифференцировку клеток эндотелия и стромы роговицы (Gage et al., 2005; Ittner et al., 2005).

Рисунок 2 Локализация мРНК PITX2 в глазу человека на 9.5-10 неделе развития. А - угол глаза (опыт); Б - угол глаза (контроль); В - иридо-корнеальная область (опыт); Г - иридо-корнеальная область (контроль); Д - сетчатка (опыт); Е - сетчатка (контроль). Ув.: ок. х10, об. х20 (А, В, Г); ок. х10, об. х10 (Б, Д, Е). ВЯС - внутренний ядерный слой, НЯС - наружный ядерный слой, ПЭ - пигментный эпителий, Р - роговица, С - сетчатка, Эп.Х - эпителий хрусталика, МК - мезенхимные клетки, волны миграции указаны стрелками

Рисунок 3 Локализация мРНК PITX2 - глаз человека на 20 неделе развития. А - роговица (опыт); Б - роговица (контроль); В - хрусталик (опыт); Г - хрусталик (контроль); Д - сетчатка (опыт); Е - сетчатка (контроль). Ув.: ок. х10, об. х20 (А, Б); ок. х10, об. х40 (В, Г); ок. х10, об. х10 (Д, Е). ВСС - внутренний сетчатый слой, ВЯС - внутренний ядерный слой, ГК - ганглиозные клетки, НСС - наружный сетчатый слой, НЯС - наружный ядерный слой, ПЭ - пигментный эпителий, Энд.Р - эндотелий роговицы, Эп.Р - эпителий роговицы, Эп.Х - эпителий хрусталика

Нами впервые локализована экспрессия гена PITX2 в сетчатке развивающегося глаза. На 9.5-10 неделях гибридизационный сигнал выявлен в наружном и внутреннем нейробластических слоях (Рис. 2.В), в которых идет дифференцировка клеток. В контроле сигнал не наблюдается (Рис. 2.Б,Г,Е). Черная полоса на Рис. 2.Г соответствует пигментному эпителию. К сожалению, метод in situ гибридизации не позволяет выявить окрашивание в этой структуре из-за содержания в клетках пигментных гранул.

На поздней стадии, соответствующей 20 неделе, глаз значительно продвинут в развитии, по сравнению с 9.5-10 неделей. Гибридизационный сигнал выявлен в клетках эпителия, эндотелия и стромы практически сформированной роговицы (Рис. 3.А). Существуют данные, что в роговице 15-недельного плода человека мРНК PITX2 локализуется в клетках эпителия и стромы, т.е. тканях мезенхимного происхождения. Нам впервые удалось показать наличие мРНК PITX2 в тканях эктодермального происхождения - эпителии роговицы, эпителии и волокнах хрусталика на 20 неделе.

В сетчатке к 20 неделе, по сравнению с 9.5-10 неделей, произошли существенные изменения в морфологии. Сформировались все слои сетчатки, продолжается дифференцировка клеток ганглиозного и внутреннего ядерного слоев. Кроме морфологических изменений наблюдается изменение в распределении мРНК PITX2 в этой структуре. мРНК PITX2 локализуется в клетках внутреннего ядерного и ганглиозного слоев (Рис. 3.В). В контроле гибридизационный сигнал отсутствует (Рис. 3.Б,Г,Е).

Таким образом, по мере дифференцировки клеточных слоев сетчатки изменяется локализация экспрессии PITX2, что может быть связано с участием транскрипционного фактора, кодируемого этим геном, в судьбе клеток внутреннего и наружного ядерных слоев. Идентификация PITX2 в сетчатке является принципиально новым фактом и функциональная роль этого гена требует дальнейших исследований.

Результаты исследования локализации мРНК PITX2 подтверждают и дополняют данные ПЦР-анализа. Показаны различия в распределении мРНК PITX2 в сетчатке в зависимости от стадии развития. Полученные данные расширяею наши представления о характере экспрессии регуляторного гена PITX2 в ходе развития роговицы, хрусталика и сетчатки.

Локализация белка TGFbeta2 в тканях развивающегося глаза 8 и 10.5 недели_развития. С помощью иммуногистохимии получены данные, свидетельствующие о наличии TGFbeta2 в глазу, начиная с самой ранней анализируемой стадии развития, соответствующей 8 неделе. В сетчатке локализация TGFbeta2 на 8 и 10.5 неделях развития имеет сходные черты: TGFbeta2 выявлен во внутреннем безъядерном слое сетчатки (Рис. 4, 5; указано стрелками), который образован отростками Мюллеровских клеток. В других слоях сетчатки TGFbeta2-позитивные клетки не выявлены. В отличие от 8 недели, на 10.5 неделе иммунопозитивная реакция на антитела против TGFbeta2 детектируется и в пигментном эпителии (Рис. 5). Совмещение изображения, выявляющего TGFbeta2-позитивные клетки, с изображением того же участка среза глаза, окрашенного ядерным красителем, демонстрирует локализацию TGFbeta2 практически во всех клетках пигментого эпителия. Сходную локализацию TGFbeta2 имеет в пигментном эпителии у взрослых обезьян и человека. Пигментный эпителий, расположенный между сетчаткой и сосудистой оболочкой, является барьером «кровь-сетчатка» и необходим для поддержания гомеостаза сетчатки. Существуют данные о том, что TGFbeta2 во взрослом глазу предотвращает прорастание кровеносных сосудов в сетчатку (Holtkamp et al., 1999). Наши данные позволяют предположить, что в развивающемся глазу этот сигнальный белок выполняет аналогичную функцию, по крайней мере, с 10.5 недели. В хрусталике на 10.5 неделе TGFbeta2 выявлен в эпителии и формирующихся волокнах (Рис. 5), что, вероятно, связано с участием этого сигнального белка в регуляции пролиферации. Полученные данные о наличии TGFbeta2-позитивных клеток в глазу на 8 и 10.5 неделях развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.А,Б).

Рисунок 4 TGFbeta2 в сетчатке на 8 неделе развития. пэ - пигментный эпителий

Рисунок 5 TGFbeta2 в тканях глаза человека на 10.5 неделе развития. вхр - волокна хруста-лика, пэ - пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика

На 12 неделе развития нами проанализированы следующие структуры глаза: роговица, хрусталик, сетчатка, область формирующегося цилиарного тела и пигментный эпителий (Рис. 6). В роговице на 12 неделе TGFbeta2 детектируется только в эпителии. В клетках эндотелия и стромы роговицы, несмотря на активную дифференцировку и пролиферацию этих клеток, сигнал не обнаружен. Наличие белка TGFbeta2 выявлено также в пролиферирующих клетках герминативной зоны, а также в транзиторной зоне и формирующихся волокнах хрусталика. В эпителии хрусталика окрашивание не наблюдается.

Рисунок 6 TGFbeta2 в тканях глаза человека на 12 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, гз - герминативная зона, внс - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз - транзиторная зона, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпх - эпителий хрусталика

В формирующейся сетчатке, представленной на 12 неделе двумя слоями нейробластов, TGFbeta2 имеет дифференциальный характер экспрессии. TGFbeta2-позитивные клетки локализованы во внутреннем нейробластическом слое, которые включают дифференцирующиеся ганглиозные клетки. В наружном нейробластическом слое TGFbeta2 не обнаружен.

На 12 неделе начинается формирование цилиарного тела, появляется складчатость этой структуры. TGFbeta2-позитивные клетки локализуются в непигментированном эпителии цилиарного тела (Рис. 6, указано стрелками). Известно, что TGFbeta2 обнаруживается в презумптивном эпителии цилиарного тела уже на 6 неделе эмбриогенеза (Gatherer et al., 1990). В цилиарном теле взрослого человека также выявлено наличие этого белка. Наши результаты о наличии TGFbeta2 в активно формирующемся цилиарном теле и данные литературы, полученные на взрослом глазу, свидетельствуют об участии этого регуляторного фактора не только в функционировании цилиарного тела, но и в формировании его в эмбриогенезе. Полученные данные о наличии белка TGFbeta2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 12 неделе находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.В).

На 17 неделе локализация TGFbeta2 в тканях глаза несколько меняется по сравнению с предыдущими стадиями (Рис. 7). TGFbeta2-позитивные клетки выявлены не только в эпителии роговицы, как на 12 неделе, но и в эндотелии. В строме роговицы на этой стадии развития, так же как на 12 неделе, иммунохимической реакции не наблюдается. В хрусталике TGFbeta2 выявлен в клетках герминативной, транзиторной зон и в формирующихся волокнах. В клетках эпителия хрусталика, как и на 12 неделе, иммунохимического окрашивания не наблюдается. В сетчатке к 17 неделе развития произошли существенные изменения, что связано с появлением всех слоев этой структуры. Белок TGFbeta2 локализуется в слое ганглиозных клеток и в формирующихся внутреннем сетчатом слое и слое нервных волокон. В других слоях сетчатки окрашивания не выявлено. Вероятно, экспрессия TGFbeta2 в сетчатке связана с дифференцировкой ганглиозных и амакриновых клеток. Интенсивный иммунохимический сигнал детектируется также в клетках пигментного эпителия. На 17 неделе развития идет морфогенез цилиарного тела, которое уже имеет отчетливо выраженную складчатость. На этой стадии TGFbeta2 впервые выявлен не только в непигментированных клетках эпителия, производных нейроэпителия, но и в клетках стромы цилиарного тела, большинство которых имеет мезенхимное происхождение. Таким образом, нам удалось хронометрировать экспрессию этого сигнального белка в строме цилиарного тела, что может внести вклад в понимание молекулярно-генетических механизмов развития этой структуры. Полученные данные о локализации TGFbeta2 в роговице, хрусталике, сетчатке, цилиарном теле и пигментном эпителии на 17 неделе находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.Г).

Рисунок 7 TGFbeta2 в тканях глаза человека на 17 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, всс - внутренний сетчатый слой, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, нсс - наружный сетчатый слой, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз - транзиторная зона, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, стцт - строма цилиарного тела

На поздней стадии, соответствующей 22 неделе, наблюдается дальнейшее изменение локализации регуляторного фактора TGFbeta2 (Рис. 8). В роговице этот белок выявлен в клетках эпителия; в эндотелии и строме сигнал не детектируется. В то время как на 12-й неделе развития этот белок локализуется в эпителии, а на 17-й неделе - в эпителии и в эндотелии. Таким образом, наблюдаются региональные изменения локализации белка TGFbeta2 в развивающейся роговице. Возможно, экспрессия TGFbeta2 в эндотелиальных клетках является специфической на определенной стадии формирования роговицы. Причины дифференциальной экспрессии TGFbeta2 в роговице не ясны, поскольку молекулярные механизмы регуляции этого гена изучены недостаточно и требуют дальнейших исследований. Данные о наличии TGFbeta2 в роговице на различных стадиях развития расширяют наши представления об экспрессии гена, кодирующего этот сигнальный белок, так как к настоящему времени имеются лишь отдельные сведения о локализации TGFbeta2 в роговице 6-недельного эмбриона и взрослого человека.

В хрусталике на 22 неделе, так же как на 12 и 17 неделях, TGFbeta2 детектируется только в клетках герминативной, транзиторной зон и в формирующихся волокнах. В целом локализация белка TGFbeta2 в хрусталике человека с 12 до 22 недели сходна с таковой в глазу взрослых мышей.

В сетчатке к 22 неделе TGFbeta2 локализуется только в нервных волокнах, образованных аксонами ганглиозных клеток, дифференцировка которых близка к завершению. Таким образом, можно сделать вывод, что экспрессия этого сигнального белка зависит от типа клеток. Так же как на 17 неделе, TGFbeta2 детектируется в клетках стромы и непигментированного эпителия цилиарного тела. В пигментном эпителии иммунохимическую реакцию на окрашивание антителами против TGFbeta2 проявляли лишь единичные клетки. Мы не исключаем недостаточности чувствительности метода для детекции белка во всех клетках пигментного эпителия, однако наличие даже единичных TGFbeta2-позитивных клеток в этой структуре на 22 неделе свидетельствует об экспрессии этого регуляторного фактора не только в период активного морфогенеза глаза, 17 недель, но и на стадии, когда глаз практически сформирован.

Рисунок 8 TGFbeta2 в тканях глаза человека на 22 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гз - герминативная зона, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, тз - транзиторная зона, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, стцт - строма цилиарного тела

Локализация белка PITX2 в тканях развивающегося глаза 8 и 10.5 недели развития. С помощью иммуногистохимии впервые получены данные, свидетельствующие о наличии белка PITX2 в тканях глаза человека, начиная с 8 недели эмбрионального развития (Рис. 9). Характер распределения PITX2 на 8 и 10.5 неделях сходен как в клетках хрусталика, так и сетчатки (Рис. 9, 10). В хрусталике на обеих стадиях развития интенсивная иммунохимическая реакция на антитела против PITX2 детектируется в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон. В сетчатке PITX2-позитивные клетки локализуются во внутреннем и наружном нейробластических слоях. Совмещения изображений среза, окрашенного антителами против PITX2 и ядерным красителем, демонстрирует локализацию PITX2 практически во всех клетках формирующейся сетчатки.

Рисунок 9 PITX2 в тканях глаза человека на 8 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, внс - внутренний нейро-бластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 10 PITX2 в сетчатке на 10.5 неделе развития. внс - внутренний нейробластичес-кий слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий

Важным фактом было обнаружение PITX2-позитивных клеток в пигментном эпителии на 8 и 10.5 неделях (Рис. 9, 10). Это совпадает с данными ПЦР-анализа, а также дополняет и уточняет результаты in situ гибридизации, которая не позволила судить о наличии мРНК PITX2 в пигментированных клетках. Полученные данные о локализации PITX2-позитивных клеток во всех анализируемых тканях на 8 и 10.5 неделях развития согласуются с результатами ПЦР-анализа и in situ.

На 13-14 неделе развития иммунопозитивный сигнал на окрашивание антителами против PITX2 детектируется в ядрах клеток эпителия, эндотелия и стромы роговицы (Рис. 11), в которой продолжаются пролиферация и дифференцировка клеток. Известно, что на 15 неделе PITX2 экспрессируется в эндотелии и строме, т.е. тканях нейромезенхимного происхождения. Нами же впервые показано, что на 13-14 неделе белок PITX2 локализуется не только в клетках эндотелия и стромы, но и эпителия роговицы, имеющего эктодермальное происхождение. Таким образом, экспрессия этого транскрипционного фактора не является тканеспецифической. В хрусталике PITX2 локализуется в ядрах клеток эпителия и формирующихся волокон (Рис. 11). В сетчатке иммунохимическая реакция детектируется практически во всех клетках обоих нейробластических слоев (Рис. 11). В клетках пигментного эпителия также выявляется белок PITX2 (Рис. 11). Полученные нами данные свидетельствуют о наличии PITX2 в клетках формирующегося цилиарного тела (Рис. 11, указано стрелками), в котором на 13-14 неделе развития появляется складчатость. PITX2-позитивные клетки детектируются в непигментированном эпителии цилиарного тела (Рис. 11). О специфичности окрашивания пигментированных клеток эпителия цилиарного тела судить сложно из-за высокой автофлуоресценции этих клеток. Наличие белка PITX2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 13-14 неделе согласуется с результатами ПЦР-анализа.

Рисунок 11 PITX2 в тканях глаза человека на 13-14 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, внс - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

На 17 неделе плодного развития, когда продолжается активный морфогенез глаза, локализация белка PITX2 в тканях глаза существенно не изменяется (Рис. 12). Так же как на 13-14 неделе, PITX2-позитивные клетки выявлены в эпителии, эндотелии и строме роговицы. В хрусталике PITX2-позитивные клетки детектируются в эпителии и формирующихся волокнах. В сетчатке интенсивный иммунохимический сигнал детектируется практически во всех основных клеточных слоях сетчатки - ганглиозном, внутреннем ядерном, включающем амакриновые, горизонтальные клетки и биполяры, и наружном ядерном слоях, включающем фоторецепторные клетки. Таким образом, нами впервые показано наличие белка PITX2 как в недифференцированных клетках сетчатки на 10.5 неделе эмбриогенеза, так и в дифференцированных клетках 17- недельного плода, что свидетельствует о новых, еще не известных функциях этого фактора транскрипции в гистогенезе сетчатки. Иммунопозитивными к антителам против PITX2 являются также клетки пигментного эпителия. Идентификация белка PITX2 в сетчатке и пигментном эпителии является принципиально новым фактом, поскольку известно, что этот фактор контролирует развитие только переднего сегмента глаза.

Рисунок 12 PITX2 в тканях глаза человека на 17 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, ссхр - сосудистая сумка хрусталика, стр - строма роговицы, стцт - строма цилиарного тела, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

На 17 неделе развития, когда морфогенез цилиарного тела приближается к завершению, нами выявлено наличие белка PITX2 в непигментированных клетках эпителия цилиарного тела (на рисунке указано стрелками). В пигментированных клетках цилиарного тела иммунохимический сигнал отсутствует. Полученные данные о локализации белка PITX2 в роговице, хрусталике, сетчатке, цилиарном теле и пигментном эпителии на 17 неделе развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа.

На 22 неделе плодного развития локализация белка PITX2 несколько меняется (Рис. 13). В роговице PITX2 выявлен в эпителии, эндотелии и строме. В хрусталике, также как на 8-17 неделях, белок PITX2 детектируется в эпителии и формирующихся волокнах.

Рисунок 13 PITX2 в тканях глаза человека на 22 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эпр - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

Идентификация PITX2 в хрусталике развивающегося глаза свидетельствуют о существовании еще не известных функций этого транскрипционного фактора. В сетчатке к 22 неделе, когда завершается дифференцировка всех клеточных типов, наблюдается изменение локализации PITX2, по сравнению с 8-17 неделями развития. На 22 неделе иммунопозитивная реакция выявлена только в ядрах ганглиозных клеток. В других слоях сетчатки иммунохимический сигнал не детектируется. Также не выявлено этого белка в клетках пигментного эпителия. Отсутствие иммунохимического окрашивания в этих клетках может быть связано с недостаточной чувствительностью метода, однако с помощью ПЦР-анализа показано наличие мРНК PITX2 в пигментном эпителии/сосудистой оболочке на 22 неделе (Рис. 1.Д). В цилиарном теле на 22 неделе, так же как на 13-14 и 17 неделях развития, интенсивная иммунохимическая реакция на антитела против PITX2 детектируется только в клетках непигментированного эпителия (рис. 13, указано стрелками). Полученные данные о локализации белка PITX2 в роговице, хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 22 неделе развития согласуются с результатами ПЦР-анализа и in situ гибридизации (Рис. 1.Д).

Локализация белка FOXC1 в тканях развивающегося глаза 8-10.5 недели развития. С помощью ПЦР нами впервые идентифицирована экспрессия гена FOXC1 в развивающемся глазу человека. Локализация соответствующего белкового продукта проведена методом иммуногистохимии. Полученые данные свидетельствуют о наличии белка FOXC1 в хрусталике, начиная с самой ранней анализируемой стадии развития, соответствующей 8 неделе эмбиогенеза. Интенсивный иммунохимический сигнал выявлен в клетках эпителия и формирующихся волокон хрусталика (Рис. 14).

Рисунок 14 FOXC1 в тканях глаза человека на 8 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, внс - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластический слой, пэ - пигментный эпителий, эпхр - эпителий хрусталика

Рисунок 15 FOXC1 в сетчатке на 10.5 неделе развития. внс - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейробластичес-кий слой

В сетчатке на 8 и 10.5 неделях развития FOXC1-позитивные клетки локализуются во внутреннем и наружном нейробластических слоях (Рис. 14, 15). Наибольшей интенсивностью свечения обладали ядра дифференцирующихся ганглиозных клеток центральной области сетчатки. Важным фактом является также обнаружение белка FOXC1 в клетках пигментного эпителия на 8 неделе развития (Рис. 14). Полученные данные о наличии белка FOXC1 в хрусталике, сетчатке и пигментном эпителии на 8 и 10.5 неделе эмбриогенеза находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.А,Б). Функциональная роль этого транскрипционного фактора в морфогенезе глаза требует дальнейших исследований. Наши результаты свидетельствуют об экспрессии FOXC1, принадлежащего к каскаду генов, контролирующих морфогенез глаза человека, начиная с самых ранних стадий развития.

На 13 неделе развития белок FOXC1 выявлен в эпителии, эндотелии и строме (Рис. 16). Распределение FOXC1 в хрусталике и сетчатке на 13 неделе, по сравнению 8 и 10.5 неделями эмбриогенеза, существенно не меняется (Рис. 16). Иммунопозитивную реакцию проявляют ядра клеток эпителия и формирующихся волокон хрусталика. FOXC1, как и PITX2, локализуется в обоих нейробластических слоях сетчатки - наружном и внутреннем, включающем дифференцирующиеся ганглиозные клетки. Существенной разницы в интенсивности свечения отдельных клеток, наблюдаемой в сетчатке на 8 и 10.5 неделе эмбриогенеза, на этой стадии не выявлено. На 13 неделе развития, как на 8 и 10.5 неделях, белок FOXC1 выявляется в клетках пигментного эпителия (Рис. 16). В цилиарном теле интенсивный иммунохимический сигнал детектируется в непигментированных клетках эпителия (Рис. 16; указано стрелками). Полученные нами сведения о наличии белка FOXC1 во всех исследованных тканях на 13 неделе развития находятся в соответствии с результатами ПЦР-анализа (Рис. 1.В).

Рисунок 16 FOXC1 в тканях глаза человека на 13 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, внс - внутренний нейробластический слой, ннс - наружный нейро-бластический слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

Рисунок 17 FOXC1 в тканях глаза человека на 17 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

Рисунок 18 FOXC1 в тканях глаза человека на 22 неделе развития. вхр - волокна хрусталика, вяс - внутренний ядерный слой, гк - ганглиозные клетки, няс - наружный ядерный слой, пэ - пигментный эпителий, стр - строма роговицы, энр - эндотелий роговицы, эп - эпителий роговицы, эпхр - эпителий хрусталика

К 17 неделе развития характер распределения FOXC1 практически не меняется. В роговице этот белок локализуется в эпителии, эндотелии и строме (Рис. 17). В хрусталике иммунохимическую реакцию проявляли ядра эпителия и формирующихся волокон (Рис. 17).

В сетчатке FOXC1 выявлен в ганглиозных клетках, которые к этому времени обособляются в отдельный слой, а также клетках внутреннего и наружного ядерных слоев (Рис. 17). Иммунопозитивными являются и клетки пигментного эпителия (Рис. 17).Как и на 13 неделе, интенсивный сигнал наблюдается в ядрах только непигментированных клеток эпителия цилиарного тела (Рис. 17). Полученные нами результаты о локализации белка FOXC1 в роговице, хрусталике, сетчатке, цилиарном теле и пигментном эпителии на 17 неделе развития находятся в соответствии с данными ПЦР-анализа (Рис. 1. Г).

На 22 неделе развития распределение белкаFOXC1 в роговице и хрусталике не изменяется. Так же как и PITX2, FOXC1 локализуется в эпителии, эндотелии и строме роговицы (Рис. 18.А), что демонстрирует сходный характер распределения этих транскрипционных факторов в формирующейся роговице. Предполагается, что взаимодействие Pitx2 и Foxc1 необходимо для уплощения нейромезенхимных клеток, формирующих эндотелий роговицы (Berry et al., 2006). Хотя наши данные не позволяют с полной уверенностью говорить о колокализации изучаемых транскрипционных факторов, однако, наличие этих белков практически во всех клетках роговицы и данные литературы о взаимодействии Pitx2 и Foxc1 в роговице мышей (Beery et al., 2006) позволяют предположить не только их колокализацию, но и взаимодействие. Известно, что Foxc1 у мышей участвует в дифференцировке клеток эндотелия и стромы роговицы. Мы предполагаем, что FOXC1 в дифференцирующихся клетках эндотелия и стромы роговицы человека выполняет аналогичную функцию. В хрусталике, как и на предыдущих стадиях, FOXC1 локализуется в эпителии и формирующихся волокнах (Рис. 18). Данные об экспрессии FOXC1 в хрусталике развивающегося глаза человека нами получены впервые. Для понимания функциональной роли этого транскрипционного фактора требуются дальнейшие исследования.

В сетчатке на 22 неделе наблюдаются изменения локализации FOXC1, который, как и PITX2, детектируется только в слое ганглиозных клеток, дифференцировка которых близка к завершению. В цилиарном теле, так же как и на предыдущих стадиях развития, FOXC1 локализуется только в клетках непигментированного эпителия. Результаты о наличии белка FOXC1 в хрусталике, сетчатке и цилиарном теле на 22 неделе согласуются с данными ПЦР-анализа. Данные об идентификации экспрессии и локализации FOXC1 в развивающемся глазу человека представляются новыми и весьма интересными, поскольку современные знания об экспрессии этого гена у человека ограничиваются сведениями, полученными при исследовании тканей взрослого глаза.

Анализ полученных результатов и данных литературы позволяет заключить, что регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, функционирующие в составе TGFbeta сигнального пути, контролируют развитие структур глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение. Несмотря на то, что мРНК TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 выявлены во всех проанализированных тканях глаза, пространственные и временные характеристики распределения соответствующих белковых продуктов имеют ряд различий. Причем, гены, кодирующие транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, имеют сходный характер экспрессии, несколько отличающийся от экспрессии гена, кодирующего сигнальный белок TGFbeta2. Причины этого могут быть найдены при изучении взаимодействий этих регуляторных факторов, а также при идентификации и более подробном анализе промежуточных звеньев сигнального каскада TGFbeta.

Работа выполнена при поддержке РФФИ, гранты №05-04-48026, №08-04-00462.

Выводы

1. Впервые проведено комплексное исследование характера экспрессии генов, кодирующих регуляторные факторы TGFbeta2, PITX2 и FOXC1, в тканях глаза человека на 8-22-й неделях пренатального развития.

2. Показано, что сигнальный белок TGFbeta2 и транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1 принимают участие в формировании тканей глаза, имеющих различное эмбриональное происхождение: эктодермальное, нейромезенхимное и нейральное. Экспрессия генов TGFbeta2, PITX2 и FOXC1 в глазу не является тканеспецифической.

3. Впервые получены данные об экспрессии в формирующейся сетчатке и пигментном эпителии человека генов, кодирующих транскрипционные факторы PITX2 и FOXC1, которые считаются регуляторами развития переднего сегмента глаза. Установлено, что уровень экспрессии этих генов в клетках сетчатки зависит от степени их дифференцировки.

4. Наличие транскриптов PITX2 в мигрирующих клетках нейромезенхимы и увеличение уровня экспрессии генов TGFbeta2 и PITX2 в краевой области сетчатки являются доказательствами того, что молекулярно-генетические процессы, в регуляции которых принимают участие TGFbeta2 и PITX2 предшествуют видимым признакам морфогенеза цилиарно-радужного комплекса.

5. Показано, что экспрессия TGFbeta2 в роговице, хрусталике и сетчатке в ходе развития имеет дифференциальный характер, который зависит от типа клеток. В роговице региональные изменения локализации белка TGFbeta2 могут быть связаны со специфичностью экспрессии TGFbeta2 в эндотелиальных клетках на 17 неделе развития, а в хрусталике - с участием TGFbeta2 в гистогенезе в качестве регулятора пролиферации. В сетчатке в ходе развития источником секретируемого белка TGFbeta2 являются ганглиозные и мюллеровские клетки.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

а) статьи в изданиях согласно перечню ВАК:

1. Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Смирнова Ю.А., Панова И.Г., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д. Локализация экспрессии гена PITX2 в клетках глаза человека в ходе пренатального развития // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 139-145.

2. Панова И.Г., Маркитантова Ю.В., Фирсова Н.В., Подгорный О.В., Смирнова Ю.А., Сухих Г.Т., Зиновьева Р.Д. Исследование экспрессии -III тубулина в тканях глаза человека в пренатальном развитии // Известия РАН. Серия биологическая. 2008. № 2. С. 146-150.