Изучение механизмов внутриклеточного распределения митохондрий

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение механизмов внутриклеточного распределения митохондрий

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Некрасова Оксана Евгеньевна

Москва 2007

Работа выполнена в лаборатории биохимической эмбриологии Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН и в группе клеточной биологии Института белка РАН*.

Научные руководители:

Кандидат биологических наук Минин Андрей Александрович

Кандидат биологических наук Минин Александр Александрович*.

Официальные оппоненты: Доктор биологических наук Бродский Всеволод Яковлевич, Институт биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (г. Москва)

Доктор биологических наук Егоров Егор Евгеньевич, Институт молекулярной биологии им. В. А. Энгельгардта РАН (г. Москва)

Ведущая организация: ФГУ РК НТК Росздрава (г. Москва)

Защита диссертации состоится 23 мая 2007 года, в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 при Институте биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН по адресу: 119334 г. Москва, ул. Вавилова, д.26

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (Москва, ул. Вавилова, д. 26) Факс (495) 135-80-12 E-mail: volina46@bk.ru

Автореферат разослан: 18 апреля 2007 года.

Ученый секретарь

Диссертационного совета, Е.В.Волина

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Актуальность изучения внутриклеточного распределения митохондрий определяется его ключевой ролью в обеспечении нормального функционирования клетки в целом.

Митохондрии играют важную роль в физиологии клетки. Они обеспечивают клетку энергией в форме молекул АТФ, участвуют в регуляции концентрации ионов кальция в цитоплазме, а также являются важнейшим звеном в процессе программируемой клеточной смерти. Для нормального функционирования митохондрий большое значение имеет их внутриклеточное распределение (Capetanaki, 2002) Во многих клетках митохондрии локализуются вблизи мест высокого потребления энергии (Chada and Hollenbeck, 2003; Li et al., 2004; Morris and Hollenbeck 1993; van Blerkom., 1991; Zielinski et al., 1988). В скелетных мышцах, например, они располагаются вблизи миофибрилл; в сперматозоидах образуют спиральный футляр вокруг оси жгутика; у простейших и в других клетках, снабженных ресничками, локализуются непосредственно под клеточной мембраной, у основания ресничек. В аксонах нервных клеток транспорт митохондрий очень активен, но их основная масса находится около синапсов, в местах передачи нервного импульса (Morris and Hollenbeck, 1993). Таким образом, распределение митохондрий в клетке тесно связано с жизненной активностью различных ее участков. Нарушения транспорта и правильного распределения митохондрий могут приводить к ряду нейродегенеративных заболеваний, включая болезнь Альцгеймера и Хантингтона (Gunawardena and Goldstein, 2001; Gunawardena et al., 2003; Hurd and Saxton, 1996), а также латеральный амиотрофический склероз (Collard et. al, 1995). Поэтому открытие новых механизмов, лежащих в основе регуляции распределения митохондрий, является важным шагом на пути к пониманию причин нарушения внутриклеточной локализации этих органелл.

Локализация митохондрий находится под контролем внешних и внутренних факторов и достигается при помощи транспорта этих органелл вдоль микротрубочек и актиновых филаментов моторными белками. Считается, что транспорт митохондрий и других органелл происходит в две стадии: на большие расстояния они переносятся по микротрубочкам, а по актиновым филаментам происходит их перемещение на небольшие расстояния и локализация (Chada and Hollenbeck, 2004; Kuznetsov et al., 1992; Morris and Hollenbeck, 1995). При этом скорость движения вдоль микротрубочек намного выше, чем вдоль микрофиламентов (Morris and Hollenbeck, 1995). Недавно в нашей лаборатории было показано, что фибриллярный актин, полимеризующийся в результате действия белков из семейства форминов, специфически взаимодействует с митохондриями и ограничивает их транспорт (Кулик и др., 2006). Однако оставалось не ясным, какие белки или структуры обеспечивают это взаимодействие.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что промежуточные филаменты играют роль посредника во взаимодействии митохондрий с актиновым цитоскелетом. Так мы обнаружили, что если убрать виментиновые промежуточные филаменты к ядру подвижность митохондрий на периферии клеток возрастает. Это может говорить об их роли, как одного из элементов, удерживающих митохондрии в определенных местах. Промежуточные филаменты это третий компонент цитоскелета клетки. В клетках соединительной ткани они состоят из виментина и являются наименее динамичной структурой цитоскелета (Lodish et al., 1997). Во многих работах представлены данные о том, что митохондрии взаимодействуют с промежуточными филаментами (Collier et al., 1993; Hirokawa, 1982; Leterrier et al., 1994; Reipert et al., 1999). И хотя к настоящему времени связь промежуточных филаментов с митохондриями, и ее роль в функционировании последних не вызывает сомнения, детали их взаимодействия остаются все еще мало изученными.

Цель работы и основные задачи исследования.

Целью работы было определить роль белка внеклеточного матрикса фибронектина, в регуляции прикрепления митохондрий к цитоскелету. Другой целью было изучить, как виментиновые промежуточные филаменты участвуют в регуляции подвижности митохондрий в клетке.

Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Выяснить, какую роль играет фибронектин в распределении митохондрий в клетках, и определить какая часть белка отвечает за этот процесс.

2. Изучить взаимодействие виментиновых промежуточных филаментов с митохондриями.

3. Выяснить роль виментиновых промежуточных филаментов в обеспечении связи между актиновым цитоскелетом и митохондриями.

4. Определить, регулируется ли связь между митохондриями и виментиновыми промежуточными филаментами.

Научная новизна работы. В результате настоящей работы найдены новые механизмы регуляции распределения митохондрий. Обнаружены внешние факторы, регулирующие распределение митохондрий, и цитоскелетные структуры, обеспечивающие прикрепление этих органелл в местах их локализации.

Впервые показано, что фибронектин (белок внеклеточного матрикса) может выполнять функцию регулятора внутриклеточного распределения митохондрий. Найден участок фибронектина, который контролирует изменение формы и распределения митохондрий в клетках - гепарин-связывающий домен. митохондрия клетка виментиновый филамент

Установлено, что виментиновые промежуточные филаменты ингибируют движение митохондрий в клетке. Кроме того, показано, что виментиновые промежуточные филаменты обеспечивают взаимодействие митохондрий со структурами актинового цитоскелета, так как изменение актинового цитоскелета не влияло на подвижность митохондрий в клетках, лишенных промежуточных филаментов.

Обнаружено, что взаимодействие митохондрий с виментиновыми промежуточными филаментами находится под контролем протеинкиназы С.

Научная и практическая значимость работы. Результаты данной работы вносят вклад в понимание процесса внутриклеточной регуляции распределения митохондрий, и влияния на него внешних и внутренних факторов. Полученные результаты могут быть использованы для разработки методик лечения нейро-дегенеративных заболеваний, связанных с нарушением транспорта и правильного распределения митохондрий.

Апробация работы. Основные научные результаты диссертационной работы были представлены на ежегодных научных конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН (Москва, 2004, 2005, 2006) и на международном симпозиуме “FEBS/ESF Workshop on Integrated Approaches in Cytoskeleton Research” (Люксембург-сити, Люксембург, 2005). Материалы диссертации были апробированы на межлабораторном семинаре группы клеточной биологии Института белка РАН 30 марта 2007 года, и на межлабораторном семинаре отдела цитологии и гистологии Института биологии развития им. Н. К. Кольцова РАН 4 апреля 2007 года.

Публикации. По данным работы опубликованы 3 статьи в рецензируемых журналах и 6 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, описание материалов и методов, главы результатов собственных исследований и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста и содержит 2 таблицы и 24 рисунка.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

F-актин - фибриллярный актин

ПФ - промежуточные филаменты

РКС - протеинкиназа С

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток. В работе использовали: линию клеток СV-1-Mito, полученную в ходе селективной трансфекции плазмидой pEYFP-Mito («Clontech», США) (Кулик и др., 2002; Некрасова и др., 2005);

крысиные эмбриональные фибробласты REF-52; линии мышиных клеток MFT-16, лишенную гена виментина, и MFT- 6 дикого типа, любезно предоставленные доктором Р. Эвансом (Университет Колорадо, США). Клетки выращивались в среде DMEM (Flow Laboratories, England) с добавлением 10% эмбриональной бычьей сыворотки («Биолот», Россия) или 10% фетальной сыворотки крови (Sigma, США), и антибиотиков 100 мкг/мл пеницилина (Sigma, США) и 100 мкг/мл стрептомицина (Sigma, США). Клетки инкубировались при температуре 37⁰С во влажной атмосфере, содержащей 5% СО_2. Для экспериментов клетки выращивали на стерильных покровных стеклах до плотности 50-70% суб-конфлуентного монослоя.

Иммунофлюоресценция. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток проводили по стандартной методике, описанной в методическом пособии “Antibodies” (Harlow and Lane, 1988). Использовали моноклональные антитела к б-тубулину DM-1A (Sigma), поликлональные кроличьи антитела RVIM-AT, полученные ранее в нашей лаборатории (Авсюк и др., 1997), реагирующие с мышиным виментином и моноклональные антитела V9 к человеческому виментину (Sigma, США). В качестве вторых антител использовали козьи антитела к иммуноглобулинам мыши или кролика, коньюгированные с FITC (Jackson, США).

Для специфического окрашивания фибриллярного актина в клетках использовали краситель TRITC-фаллоидин (Molecular Probes, США), исходный раствор (100 мкг/мл) которого разводили в 20 раз в PBS, содержащим 1мг/мл БСА и 0,01% Triton X100 и добавляли к клеткам на 1 час при комнатной температуре. После этого клетки отмывали в PBS в течение 10-20 минут.

Трансфекция клеток. Трансфекцию клеток проводили при помощи липосомных реагентов Unifectin M (Институт биоорганической химии, Москва) или Lipofectamin 2000 (Invitrogen, США) согласно инструкциям производителей. Количество ДНК брали из расчета 1 мкг (при трансфекции с помощью Unifectin M) или 4 мкг (при трансфекции с помощью Lipofectamin 2000) на чашку диаметром 40 мм с 2 мл среды. Клетки наблюдали спустя 16-20 часов после трансфекции.

Получение покровных стекол, покрытых фибронектином. Для очистки фибронектина из плазмы крови использовали колонку с желатин-сефарозой (Sigma, США). Фрагменты белка получали после гидролиза фибронектина б-химотрипсином (Sigma, США). Выделение 40 кДа - фрагмента проводили на колонке с гепарин-сефарозой (Sigma, США). 120 кДа - фрагмент, не связавшийся с гепарин - сефарозой, осаждали сухим сульфатом аммония. Все белки после выделения лиофильно высушивали.

Для изучения роли фибронектина в распределении митохондрий в клетках был разработан метод ковалентной пришивки фибронектина и его фрагментов к поверхности стекол. Стекла обрабатывали 3-аминопропил-триэтоксиксиланом, а затем 1% раствором глутарового альдегида. Таким образом, получались стекла, поверхность которых несла альдегидные группы, способные реагировать с аминогруппами различных белков. Раствор фибронектина и его фрагментов инкубировали с такими активированными стеклами в течение 16-20 часов. Клетки культивировали на модифицированных стеклах в бессывороточной среде.

Видеомикроскопия. Для микроскопии живых клеток, покровные стекла с клетками помещали в герметичную камеру со средой и наблюдали под микроскопом Axiophot с объективами Planapo 63x и 40x (Zeiss, Германия). Температура поддерживалась постоянной 36 + / - 2 ⁰С с помощью регулируемого воздушного потока (Zeiss Air Stream Incubator, Германия).

С помощью 12-битной цифровой CCD камеры 1 MHz MicroMax (Roper Scientific) и программного обеспечения WinView 32 (Princeton Instruments) изображение записывалось, передавалось на компьютер и запоминалось в виде 8-битных файлов с размером картинки 782х582 пикселя. Время экспозиции было равно 1 секунде, пауза между последовательными кадрами - 3 секунды, количество кадров в каждом фильме - от 20 до 50.

Обработка данных. Для анализа движения митохондрий мы использовали клетки, в которых эти органеллы были флуоресцентно-меченными. Движение митохондрий в таких клетках представляло собой перемещения в направлении края клетки или к центру, которые прерывались частыми остановками. Многие органеллы не перемещались на значительные расстояния, а находились в относительном покое на протяжении всего времени наблюдения.

С помощью программы ImageJ в каждом кадре записанной последовательности определяли координаты отдельных митохондрий (геометрического центра для митохондрий малого размера или координаты одного из концов длинных митохондрий). На основании этих данных с помощью программы Excel («Microsoft», США), определяли среднюю скорость движения каждой митохондрии за промежуток времени между двумя последовательными кадрами. Для количественного анализа нами был выбран порог скорости движения - 0,2 мкм/сек. Те митохондрии, которые хоть один раз за время съемки двигались со скоростями больше чем 0,2 мкм в сек, мы считали подвижными, остальные же митохондрии - стационарными. Для каждой клетки мы рассчитывали процент подвижных митохондрий за все время съемки, а также долю времени в движении индивидуальных митохондрий, то есть, в течение какого времени они двигались быстро. Относительную подвижность митохондрий определяли перемножением доли времени митохондрий в движении на долю подвижных органелл за все время съемки. Относительная подвижность, таким образом, отражает долю быстрых перемещений митохондрий в клетке относительно всех перемещений в каждый момент времени. Данные представлены в виде средних значений (M+/- SEM).

В каждом опыте подсчитывали число митохондрии в 10-15 клетках, в каждой клетке 20-40 митохондрий. Высокое разрешение микроскопа и чувствительность камеры позволили измерить скорости с большой точностью - до десятых долей микрона в секунду.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Роль фибронектина, в регуляции формы и внутриклеточного распределения митохондрий в клетке.

Прикрепление клеток к фибронектину.

Фибронектин, гликопротеин больших размеров, взаимодействует с различными макромолекулами, как компонентами внеклеточного матрикса, так и рецепторами на поверхности большинства типов клеток. Известно, что фибронектин включает в себя несколько функционально важных доменов, которые можно выделить после расщепления б-химотрипсином. Один из фрагментов, с молекулярной массой 120 кДа, - главный связывающийся с клетками участок фибронектина, в состав которого входит трипептид RGD. С этим фрагментом связываются клеточные рецепторы интегрины (Ruoslahti, 1996). Другой фрагмент - 40 кДа, содержит высокоафинный гепарин-связывающий участок, который взаимодействует с протеогликанами (Saoncella et al., 1999).



Рис. 1 Прикрепление клеток CV1 к модифицированным стеклам. Стекла покрывали фибронектином (г) или его фрагментами: 40кДа (б) и 120кДа (в), не прореагировавшие альдегидные группы инактивировали глутаминовой кислотой. Контроль (а) - активированное стекло инкубировали только с глутаминовой кислотой. Масштаб 20 мкм

Для изучения роли фибронектина в распределении митохондрий в культивируемых клетках мы разработали метод ковалентной пришивки этого белка и его фрагментов к стеклу и подобрали условия прикрепления клеток к таким модифицированным стеклам в бессывороточной среде. Как видно на рис. 1г, фибронектин, иммобилизованный на стекле, является хорошим субстратом для клеток. Клетки распластывались и приобретали удлиненную форму. На стеклах, покрытых фрагментом фибронектина с массой 120кДа, клетки также прикреплялись и хорошо распластывались (рис.1 в), а при использовании стекол, покрытых 40кДа-фрагментом фибронектина, клетки прикреплялись, но не могли распластаться (рис.1 б). В качестве контроля использовались стекла, которые после активации инкубировали только с глутаминовой кислотой. В этом случае незначительное количество клеток (< 4%) могло прикрепиться, но не распластаться, и большая часть стекла оставалась пустой (рис.1 а).

Таким образом, для распластывания на субстрате клетки должны получить сигнал от той части фибронектина, в состав которой входит домен, взаимодействующий с интегринами (в нашем случае 120кДa-фрагмент).

Влияние фибронектина на формирование стресс-фибрилл в клетках.

Распластывание клеток на субстрате связано с полимеризацией актина и образованием ламеллиподий. Дальнейшее формирование актинового цитоскелета происходит в результате образования фокальных контактов и прикрепленных к ним стресс-фибрилл (Burridge et al., 1988). Оказалось, что клетки, прикрепленные к стеклам, покрытым фибронектином в бессывороточной среде, имели плохо выраженные стресс-фибриллы (рис.2 а). Они появлялись, только после того как в бессывороточную среду добавляли раствор фибронектина (рис.2 б).

Рис. 2 Изменение актинового цитоскелета в клетках. Клетки CV1 культивировали на стеклах, покрытых фибронектином без (а) или с добавлением в среду раствора фибронектина (б). Полимерный актин выявлен TRITC- фаллоидином. Масштаб 10 мкм

Это свидетельствуют о том, что для формирования нормального актинового цитоскелета в клетках недостаточно их прикрепления к фибронектину на поверхности стекла, но также нужен и фибронектин из раствора. Возможно, это связано с тем, что рецепторы, связавшиеся с пришитым фибронектином, не могут свободно перемещаться в клеточной мембране. Ранее было показано, что для того чтобы образовались зрелые фокальные контакты и прикрепленные к ним актиновые стресс-фибриллы, необходимо, чтобы протеогликаны, связавшие одну часть фибронектина, сблизились и образовали комплекс с интегринами, взаимодействующими с другим участком белка (Saoncella et al., 1999).

Влияние фибронектина на форму митохондрий.

Как известно митохондрии, как и другие органеллы в клетках, связаны с цитоскелетом, и его изменения отражаются на их морфологии и распределении (Morris and Hollenbeck, 1993). Митохондрии в клетках, прикрепленных к стеклам, покрытым фибронектином, были короткие, округлой формы и почти все располагались рядом с ядром. При добавлении в среду раствора фибронектина митохондрии удлинялись, и часть их локализовалась на периферии клетки. Возможно, удлинение митохондрий при добавлении фибронектина в среду связанно с усилением стресс-фибрилл в клетке, а значит, с изменением структуры актинового цитоскелета. Для того чтобы выяснить, сигнал от какой части молекулы фибронектина, добавленного в среду, отвечает за изменение формы митохондрий, мы использовали клетки, распластанные на стеклах, покрытых 120кДа-фрагментом фибронектина. В них, как и в клетках, прикрепленных к целому фибронектину, митохондрии были короткие и располагались ближе к ядру. При добавлении 40 кДа-фрагмента или фибронектина, длина митохондрий увеличивалась, и часть их находилась на периферии клетки. В то же время добавление 120 кДа фрагмента не приводило к изменению формы и локализации митохондрий.



Рис. 3 Распределение митохондрий по форме в клетках, прикрепленных к стеклам, покрытым 120кДа - фрагментом фибронектина. Клетки культивировали на стеклах покрытых 120 кДа - фрагментом в бессывороточной среде (контроль) или при добавлении в среду фибронектина, его 40кДа и 120кДа - фрагментов или сыворотки

На рис. 3 полученные данные представлены в виде гистограммы. Видно, что в клетках, прикрепленных к 120 кДа-фрагменту, добавление в среду 40 кДа-фрагмента, как и фибронектина или сыворотки, приводило к значительному увеличению размера митохондрий по сравнению с контролем (те же клетки в среде без добавок), и отношение их длины к ширине было больше 1. Такой же результат был получен для клеток, прикрепленных к фибронектину (не показан). При добавлении 120кДа-фрагмента в среду отношение длины митохондрий к их ширине не изменялось. Таким образом, изменение формы и локализации митохондрий в клетках происходит при добавлении в среду целого фибронектина или его фрагмента, содержащего гепарин-связывающий домен. Можно предположить, что действие фибронектина, по-видимому, направлено на регуляцию взаимодействия митохондрий с актиновыми структурами в клетке.

Процесс удлинения и распределения митохондрий на периферии клетки зависит от взаимодействия их с микротрубочками.

Поскольку транспорт и локализация митохондрий в клетках зависит от микротрубочек, мы решили проверить, зависит ли от них и изменение формы этих органелл при добавлении фибронектина в среду. Для этого, в клетках, прикрепленных к фибронектину, перед добавлением фибронектина в среду, микротрубочки деполимеризовали холодом, а затем перед нагреванием до 37^оС к ним добавляли нокодазол. В качестве контроля были использованы клетки, которые инкубировали на холоде, а затем нагревали, не добавляя нокодазол. На рис.4 полученные данные представлены в виде гистограмм, показывающих распределение митохондрий по форме. Видно, что в контрольных клетках после добавления фибронектина в среду длина митохондрий увеличивалась, в то время как, в клетках, к которым был добавлен нокодазол, форма митохондрий не изменялась.

Рис. 4 Удлинение митохондрий при добавлении фибронектина зависит от микротрубочек. Перед добавлением фибронектина микротрубочки разрушали холодом, а затем нагревали до 37С без добавления (контроль) или при добавлении 10 мкМ нокодазола

Таким образом, изменение формы митохондрий в клетках, распластанных на стеклах с фибронектином в бессывороточной среде, в ответ на добавление фибронектина в среду зависит от микротрубочек. Возможно, что в процессе удлинения митохондрий участвует кинезин, моторный белок, транспортирующий их от центра клетки к периферии (Rodionov et al.,1993).

Локализация митохондрий на периферии клетки.

Одним из известных ростовых факторов, стимулирующих образование актиновых стресс-фибрилл и фокальных контактов, является лизофосфатидная кислота (ЛФК) (Ridley and Hall, 1992). В клетках, культивируемых в среде, содержащей сыворотку, ЛФК вызывает заякоривание митохондрий на периферии (рис. 5 а). При добавлении ЛФК к клеткам, прикрепленным к стеклам, покрытым фибронектином, не происходило удлинение митохондрий, и они располагались ближе к ядру (рис. 5 б). После добавления фибронектина в среду митохондрии удлинялись, и под действием ЛФК происходило их заякоривание на периферии клетки (рис. 5 в).

Рис. 5 Лизофосфатидная кислота вызывает «заякоривание» митохондрий на периферии клеток в присутствие фибронектина. Распределение митохондрий в клетках, культивируемых в нормальных условиях (а) или в бессывороточной среде без добавления (б) и при добавлении фибронектина (в). Масштаб 10 мкм

Таким образом, ЛФК не оказывает влияние на локализацию и морфологию митохондрий в клетках при отсутствии растворенного фибронектина в бессывороточной среде.

В целом наши данные свидетельствуют о том, что для взаимодействия митохондрий с цитоскелетом необходимо наличие фибронектина, который оказывает большое влияние на формирование цитоскелета в клетке и, тем самым, является внеклеточным регулятором распределения митохондрий.

2. Роль промежуточных филаментов в распределении митохондрий.

Ранее в нашей лаборатории было показано, что F-актин, который образуется в результате активации белка mDia1 из семейства форминов, специфически взаимодействует с митохондриями и подавляет их транспорт (Кулик и др., 2006). Однако оставалось неясным, как митохондрии и актин взаимодействуют между собой. Существовало две возможности. Во-первых, митохондрии могли взаимодействовать с найденными нами актиновыми структурами непосредственно, и, во-вторых, взаимодействие могло осуществляться через промежуточные филаменты (ПФ). Чтобы исключить одну из двух возможностей мы анализировали подвижность митохондрий в клетках, где были нарушены ПФ или их не было совсем. Для этого мы использовали три подхода:

а) удаление ПФ с периферии клеток за счет временного разрушения микротрубочек;

б) разрушение ПФ доминантно-негативным мутантом виментина;

в) использование клеток мышиных фибробластов линии MFT-16, лишенной гена виментина.

Стоит отметить, что в клетках соединительной ткани ПФ состоят в основном из виментина (Helfand et al., 2004).

Виментиновые промежуточные филаменты подавляют подвижность митохондрий.

а) Удаление промежуточных филаментов с периферии клеток.

Известно, что при деполимеризации микротрубочек в присутствии нокодазола наблюдается коллапс ПФ в околоядерной зоне. Для большинства клеток коллапс ПФ приводит и к коллапсу митохондрий. Однако при разборке нокодазолом микротрубочек в клетках линии REF, мы заметили, что многие митохондрии в них оставались распределенными по всей цитоплазме, несмотря на коллапс ПФ. Мы решили использовать эту особенность клеток REF, чтобы наблюдать движение митохондрий по микротрубочкам в отсутствии ПФ. Для этого мы сначала добавляли к клеткам 10 мМ нокодазол и инкубировали их до тех пор, пока ПФ не собирались к ядру. После того, как ПФ образовывали плотный жгут в околоядерной области, мы отмывали нокодазол. Через 10 минут система микротрубочек полностью восстанавливалась, а ПФ все еще были плотно собранны около ядра. Полное восстановление ПФ наблюдалось только через 3 часа. Таким образом, у нас в распоряжении было время (около 40 мин), в течение которого мы могли анализировать движение митохондрий на периферии клетки в отсутствие ПФ, и сравнивать их с данными, полученными в клетках с восстановившимися ПФ (3 часа отмывки от нокодазола). В таблице 1 приведены полученные результаты.

Таблица 1

Эффект удаления ПФ на подвижность митохондрий в клетках линии REF

Условия эксперимента	Доля подвижных митохондрий,%	Доля времени в движении,%	Средняя скорость, мкм/с	Относительная подвижность, %	Число клеток (митохондрий)
10 мин отмывки от нокодазола 3 часа отмывки от нокодазола	53+/-16 32+/-16	10+/-2 9+/-3	0.33+/-0.04 0.29+/-0.04	5+/- 0.7 3+/-0.7	9(212) 9(211)

Данные представлены в виде M ± SD.

Видно, что через 10 мин митохондрии были более подвижны, чем через 3 часа. Доля подвижных митохондрий на периферии клеток с восстановленными ПФ была меньше - чем в клетках, где на периферии их не было. При этом подвижные митохондрии в обоих случаях находились в движении равную долю времени, и скорость их движения не менялась. Относительную подвижность митохондрий в клетках с коллапсированными ПФ была в два раза выше, чем в клетках с восстановленной сетью ПФ. Таким образом, при удалении ПФ к ядру подвижность митохондрий на периферии клетки возрастала.

б) Разрушение промежуточных филаментов при помощи доминантно- негативного мутанта виментина.

Для разрушения ПФ использовали плазмиду pEGFP-vim_(1-138), любезно предоставленную доктором Р. Голдманом (Чикаго, США). Трансфекция мышиных фибробластов линии MFT-6 плазмидой pEGFP-vim_(1-138) приводила к экспрессии белка, представляющего собой N-конец виментина человека, меченный GFP, который локализовался как в ядре, так и в цитоплазме. В клетках, экспрессирующих мутантный белок, ПФ разрушались на периферии и образовывали агрегаты в околоядерной области. В контрольных клетках сеть ПФ была хорошо развита. Анализ подвижности митохондрий показал, что в клетках, где экспрессировался белок EGFP-vim_(1-138), доля подвижных митохондрий была больше, чем в контрольных клетках. Так, в контрольных клетках она составляла 50+/-19%, а в клетках, экспрессирующих мутантный виментин, она возросла до 68+/-16%. Кроме того, увеличилась и доля времени, в течение которого индивидуальные подвижные митохондрии находились в движении, с 8+/-3% до 11+/-3%.

На рис. 6 показано изменение относительной подвижности митохондрий в клетках, экспрессирующих белок EGFP-vim_(1-138), по сравнению с контрольными клетками. Как видно из рисунка, относительная подвижность в клетках с разрушенными ПФ была выше.



Рис. 6 Эффект разрушения промежуточных филаментов на подвижность митохондрий

в) Анализ движения митохондрий в клетках линии MFT-16, лишенных виментина.

Наш третий подход заключался в использовании клеток линии MFT-16, в которых отсутствовал ген виментина. В качестве контроля использовали клетки линии MFT-6, содержащие ПФ. Для того чтобы изучить, как ПФ в клетках влияют на транспорт митохондрий, мы сравнивали подвижность этих органелл в клетках MFT-6 и MFT-16 после трансфекции плазмидой Mito-GFP. В таблице 2 приведены полученные результаты. Видно, что доля подвижных митохондрий, как и доля времени, в течение которого они находились в движении, в клетках MFT-16 была больше чем в клетках MFT-6. При этом средняя скорость митохондрий в двух типах клеток была одинаковой.

Таблица 2

Анализ движения митохондрий в клетках линий MFT-6 и MFT-16

Тип клеток и условия эксперимента	Доля подвижных митохондрий,%	Доля времени в движении,%	Средняя скорость, мкм/с	Относительная подвижность, %	Число клеток (митохондрий)
MFT-6 MFT-16 MFT-16 + vim	50+/-19 77+/-19 52+/-24	8+/-3 13+/-4 8+/-3	0,29+/-0,03 0,29+/-0,01 0,28+/-0,02	4+/-0.5 9+/-1 4+/-1	22(431) 17(397) 11(230)

Данные представлены в виде M ± SD.

Относительная подвижность митохондрий в клетках без виментина была практически в два раза больше, чем в клетках MFT-6. Для того чтобы убедиться, что именно отсутствие ПФ в клетках MFT-16 приводит к увеличению подвижности митохондрий, мы трансфецировали их плазмидой, кодирующей виментин человека. Сеть ПФ в таких клетках полностью восстанавливалась. Для выявления живых клеток с восстановленными ПФ мы использовали рекомбинантный белок mCherry-Vim, меченный красным флуоресцентным белком, который встраивался в филаменты, состоящие из немеченого виментина. Ко-трансфекция клеток линии MFT-16 тремя плазмидами: pEGFP-Mito, pVim и рmCherry-vim, таким образом, позволила нам анализировать подвижность митохондрий, в этих клетках. Из данных, приведенных в табл. 2 видно, что при восстановлении ПФ относительная подвижность митохондрий в клетках MFT-16 уменьшалась и становилась равной относительной подвижности этих органелл в клетках MFT-6.

Таким образом, тремя разными, независимыми способами мы показали, что наличие ПФ в клетках уменьшает подвижность митохондрий в них.

Роль промежуточных филаментов во взаимодействии митохондрий с актиновым цитоскелетом.

Таким образом, мы выяснили, что две цитоскелетные структуры вызывают подавление движения митохондрий в клетках. Это пучки актиновых микрофиламентов, которые образуются в результате активации белка mDia1, и виментиновые ПФ. Мы решили определить, действуют ли эти две цитоскелетные структуры вместе или независимо друг от друга? Для этого в клетках, не содержащих ПФ, мы изменяли количество пучков F-актина, которые отвечают за подавление движения митохондрий: а) увеличивали содержание F-актина, и б) уменьшали его содержание.

а) Экспрессия белка mDia?N3 в клетках MFT-16.

Для увеличения содержания актиновых пучков, мы экспрессировали мутантный белок mDia1?N3 (Кулик и др., 2006) в двух типах клеток, MFT-16 и MFT-6.

Рис. 8 Траектории движения митохондрий в клетках MFT-16 и MFT-6. В клетках экспрессирующих EGFP-Mito и mDia1ДN3 анализировали движение митохондрий. Положения индивидуальных митохондрий отмечали в последовательных кадрах в течение 3 минут

Затем в трансфецированных клетках мы сравнивали подвижность митохондрий. На рис. 8 показаны траектории движения индивидуальных органелл в клетках двух линий, экспрессирующих конститутивно активный мутант белка mDia1, mDia1?N3.

Видно, что в клетках MFT-6 экспрессия белка mDia1N3 приводила к полной остановке митохондрий, а в клетках MFT-16 митохондрии продолжали двигаться с низкой скоростью. Следовательно, для полного подавления подвижности митохондрий в результате экспрессии белка mDia1N3 необходимы ПФ.

б) Разрушение F-актина при помощи латрункулина Б.

Чтобы уменьшить содержание актиновых пучков, клетки обрабатывали латрункулином Б, который разрушает актиновые микрофиламенты.

Рис. 9 Действие латрункулина Б на подвижность митохондрий в клетках MFT-6, MFT-16 и MFT-16+vim. Клетки обрабатывали латрункулином Б в концентрации 0,1 мкМ для клеток MFT-6 и MFT-16 + vim, и 0,04мкМ для клеток MFT-16 соответственно в течении 20 мин и анализировали подвижность митохондрий в них относительно контроля

Из данных, представленных на рис. 9, видно, что в клетках линии MFT-6, как и в других типах клеток, исследованных ранее (Кулик и др., 2006; Chada, Hollenbeck, 2003), это приводило к увеличению подвижности митохондрий. В то же время разрушение F-актина в клетках линии MFT-16 не влияло на относительную подвижность митохондрий в них; она оставалась такой же, как до обработки клеток латрункулином Б. А добавление латрункулина Б к клеткам MFT-16 с восстановленной сетью ПФ приводило к увеличению подвижности митохондрий в них.

Таким образом, наши данные показывают, что изменение актинового цитоскелета влияет на подвижность митохондрий только при наличии ПФ в клетке. Полученные нами данные позволяют предположить, что митохондрии непосредственно связаны с ПФ, которые в свою очередь взаимодействуют с определенными структурами F-актина.

3. Протеинкиназа С регулирует подвижность митохондрий.

Подвижность митохондрий зависит от активности протеинкиназы С.

Нами было установлено, что увеличение доли подвижных митохондрий вызывает обработка клеток форболовым эфиром (ТРА). Активирующее действие ТРА проявлялось в том, что, во-первых, при его добавлении уменьшалась доля стационарных митохондрий в клетках с 60±6% до 13±3%, и, во-вторых, увеличивалась доля времени, в течение которого подвижные митохондрии находились в движении, с 15±4% до 26±6%. На рис. 10 видно, что относительная подвижность в клетках обработанных ТРА значительно возрастала.

Рис. 10 Подвижность митохондрий в клетках CV-1 зависит от активности протеинкиназы С. В клетках CV-1, определяли относительную подвижность митохондрий без обработки, после инкубации с ТРА в концентрации 50 нг/мл, с Bim в концентрации 2.5 мкМ, или с обоими реагентами вместе в течение 30 мин

Известно, что форболовые эфиры могут влиять на внутриклеточные процессы как за счет активации протеинкиназы С (РКС), так и других рецепторов, например Ras-GRP у млекопитающих и Unc-13 у C. elegans (Ron et al., 1999). Для того чтобы проверить играет ли РКС роль в регуляции подвижности митохондрий, мы обработали клетки специфическим ингибитором этого фермента, бис-индолилмалеимидом (BIM), который блокирует его АТФ-связывающий центр (Toullec et al., 1991). Как видно на рис. 10, этот ингибитор практически полностью подавлял движение митохондрий, и последующее добавление ТРА не восстанавливало его. Следовательно, обнаруженный нами эффект ТРА на подвижность митохондрий связан именно с увеличением активности РКС.

Протеинкиназа С регулирует связь митохондрий с промежуточными филаментами.

Известно, что активация РКС приводит к различным эффектам, в том числе и к разборке стресс-фибрилл в клетках. Можно было бы предположить, что возрастание подвижности митохондрий после обработки клеток ТРА связанно с перестройками в актиновом цитоскелете. Чтобы это проверить, перед обработкой клеток ТРА мы разрушали F-актин при помощи латрункулина Б. Таким образом, действие ТРА на актиновый цитоскелет было исключено.



Рис. 11 ТРА увеличивает подвижность митохондрий в клетках, с разрушенным F-актином. Относительную подвижность митохондрий в клетках CV-1, обработанных 0.4 мкМ латрункулином Б в течение 20 мин. определяли до или после инкубации с ТРА в концентрации 50 нг/мл в течение 30 мин, p<0,05

Оказалось, что и после того, как в клетках были разобраны актиновые филаменты, относительная подвижность митохондрий в них продолжала возрастать под действием ТРА (рис. 11). Следовательно, активация РКС приводила к нарушению связи митохондрий со структурами, отличными от актинового цитоскелета. Другой возможной мишенью РКС могли быть ПФ. Для того чтобы это проверить, мы решили сравнить действие активации РКС на движение митохондрий в клетках MFT-6 и MFT-16.



Рис. 12 Влияние ТРА на подвижность митохондрий в клетках MFT-6 и MFT-16. В клетках определяли относительную подвижность митохондрий без обработки, или после инкубации с ТРА в концентрации 50 нг/мл в течение 30 мин

Оказалось, что в клетках линии MFT-6 активация РКС приводила к увеличению их подвижности, как и в клетках CV-1 (рис. 10), а в клетках MFT-16 подвижность митохондрий оставалась на прежнем уровне (рис.12). Мы также решили проверить, как изменится транспорт митохондрий в этих клетках при ингибировании РКС. Подавление РКС при помощи BIM в клетках без виментина приводило к незначительному уменьшению относительной подвижности митохондрий в них, по сравнению с эффектом в клетках, содержащих ПФ (MFT-6).

Таким образом, наши данные позволяют предположить, что способность ПФ регулировать подвижность митохондрий в клетке находится под контролем РКС. Стоит отметить, что по литературным данным добавление ТРА не приводит к разрушению промежуточных филаментов. Скорее всего, мишенью РКС является часть молекулы виментина или какой-то компонент, участвующий во взаимодействии митохондрий с ПФ, но не отвечающий за их целостность. Известно довольно много белков, связанных с ПФ и участвующих в их взаимодействии как с другими элементами цитоскелета, так и с некоторыми органеллами (Foisner and Wiche, 1991). Для некоторых из них, как для плектина, показана возможность регуляции их связи с ПФ РКС и другими протеинкиназами (Foisner et al., 1991). Изучение роли таких белков в регуляции подвижности митохондрий задача будущих исследований.

ВЫВОДЫ

1. Определена новая функция фибронектина как регулятора внутриклеточного распределения митохондрий.

2. Показано, что за контроль распределения и формы митохондрий отвечает гепарин-связывающий домен фибронектина.

3. Виментиновые промежуточные филаменты ингибируют движение митохондрий в клетках.

4. Виментиновые промежуточные филаменты обеспечивают взаимодействие митохондрий со структурами актинового цитоскелета.

5. Обнаружено, что взаимодействие митохондрий с виментиновыми промежуточными филаментами находится под контролем протеинкиназы С.

Список опубликованных статей по теме диссертации

1. Некрасова О.Е., Минин Ан.А., Кулик А.В., Минин А.А. Регуляция фибронектином формы и внутриклеточного распределения митохондрий. // Биологические мембраны 2005 Т. 22. №2. С. 105-112.

2. Кулик А.В., Некрасова О.Е., Минин А.А. Фибриллярный актин регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны 2006 Т. 23. №1. С.42-51.

3. Некрасова О.Е., Кулик А.В., Минин А.А. Протеинкиназа С регулирует подвижность митохондрий. // Биологические мембраны 2007. Т.24. №2 С.126-132.

Размещено на Allbest.ru

...