Изучение молочнокислых микроорганизмов, выделенных из кисломолочных продуктов Казахстана

Размещено на http://www.allbest.ru/

Южно-Казахстанский государственный университет им. М. Ауэзова

Изучение молочнокислых микроорганизмов, выделенных из кисломолочных продуктов Казахстана

Конарбаева Зулфия Кемелхановна, докторант кафедры биотехнологии

Республика Казахстан

Введение

Выделение чистых культур молочнокислых бактерий включает ряд этапов: выбор источников, отбор образцов, посев на жидкую питательную среду для обогащения молочнокислой микрофлорой, посев на плотную среду для выделения чистой культуры, пересев чистой культуры (колоний) в стерильное молоко, исследование биологических свойств выделенных штаммов в целях их идентификации и определения производственной ценности. Для выделения молочнокислых бактерий из различных источников рекомендован ряд сред. Это жидкие и агаризованные среды, в их состав входят ингредиенты, богатые аминокислотами и витаминами, томатный сок, дрожжевой экстракт и автолизат, белковые гидролизаты [2].

Материалы и методы

Источниками выделения для мезофильных молочнокислых бактерий являются сырое молоко, производимые в южном регионе Республики Казахстан национальные кисломолочные продукты, в основном слабоскисшийся айран, курт, кумыс, кымыран, каймак, сузбе, а также приготовленные по разным рецептурам коже. Если культуру выделяют из кисломолочных продуктов, то одну каплю продукта вносят бактериологической петлей в стерильное молоко. Посевы термостатируют при 25-30°С до свертывания молока. При выделении мезофильных молочнокислых стрептококков из растительного сырья 1 г пробы растирают в стерильной ступке и готовят разведение 1:10 на физиологическом растворе.

Процесс выделения чистых культур термофильных бактерий аналогичен процессу выделения мезофильных молочнокислых стрептококков. В качестве накопительных культур использовали айран, катык, курт, сузбе и другие национальные продукты. При этом термофильные молочнокислые стрептококки и палочки культивируют при 40-43 °С, за исключением ацидофильной палочки, которую выращивают при 37 °С. После проверки сгустка на типичность органолептических свойств и микрофлоры полученную обогащенную культуру, выращенную на стерильном молоке, высевают на плотную питательную среду (агар с гидролизованным молоком). Посевы термостатируют в течение 48 ч.

Выделенные высокоактивные штаммы микроорганизмов позволят получить закваску с необходимыми пробиотическими свойствами. Предпочтение отдавали тем культурам, которые обладали достаточно высокой активностью сквашивания молока, значительной антагонистической активностью, устойчивостью к антибиотикам. Штаммы молочнокислых бактерий, выделенные из различных источников, микроскопировали и изучали их активность при свертывании молока и органолептические показатели. Для выделения чистой культуры в качестве твердой питательной среды использовали гидролизованное молоко с агаром и среду MRS.

Результаты исследований

В результате проделанной работы из различных национальных молочных продуктов были выделены 207 колоний, из которых в дальнейшем, использовались только 25 колоний, как наиболее часто встречающиеся, следовательно, более адаптированых к местным условиям.

По-видимому, использование молочной продукции южного региона оказало существенное влияние на оптимальный и предельный температурный рост. Среди исследуемых культур преобладают термолабильные и термофильные организмы (SSh-23, АТ-3, IT-2, ТК-23, ZT-27. KL-21, KuA-16, KuS-12).

Выраженная способность к продуцированию молочной кислоты является одним из наиболее известных биологических свойств молочнокислых бактерий, которая рассматривается в качестве одного из основного параметра, характеризующего их биохимическую и антагонистическую активность [1]. Это один из важных факторов антагонизма в отношении других видов микробов. Активность кислотообразования является нормируемым показателем специфической активности лактосодержащих пробиотиков и соответственно критерием отбора штаммов лактобактерий при разработке новых бактерийных препаратов [4].

Селекцию новых штаммов, в дальнейшем планируемые использовать как пробиотики, проводили по таким параметрам как продолжительность свертывания и кислотообразующая активность. Штаммы, титруемая кислотность которых колеблется в пределах 20-80°Т, считаются неактивными, а те у которых этот параметр свыше 120°Т высокоактивными [7].

Полученные в результате экспериментальных работ данные свидетельствуют о хорошей кислотообразующей способности у большинства исследуемых штаммов. молочнокислый пробиотический мезофильный

Несмотря на то, что именно воздействие молочной кислоты рассматривают как выраженное бактерицидное свойство, однако, по мнению многих авторов полной аналогии между интенсивностью кислотообразования и антагонистической активностью молочнокислых бактерий не происходит [1; 5].

В таблице 1 представлены данные об основных культуральных и физиологических свойствах выделенных штаммов.

Таблица 1. Основные культуральные и физиологические свойства выделенных штаммов.

Устойчивость выделенных штаммов к желчи является косвенным показателем жизнеспособности клеток, которая возможно обеспечит их поступление в кишечную зону и реализацию пробиотических их свойств. Это связано с тем, что пробиотик, прежде чем достигнуть толстого кишечника, должен выжить при проходе через желудок. Неблагоприятное действие желудочного сока является основным барьером, который необходимо преодолеть выделенным и вносимым бактериям. Среди молочнокислых бактерий наиболее кислотоустойчивыми являются лактобактерии, которые обладают достаточной степенью резистентности к кислому содержимому желудка [3, 6]. Наибольшее содержание микроорганизмов наблюдается в толстой кишке. Здесь их концентрация достигает 10¹⁰-10¹¹ и более на 1 г содержимого.

Нами были проведены эксперименты по определению устойчивости выделенных штаммов к соляной кислоте. В жидкую среду MRS, засеянную тестируемыми бактериями, вносили соляную кислоту, устанавливая значения рН от 4,5 до 6,5. Установлено, что значительное количество выделенных культур обладают достаточной устойчивостью к кислой среде. Лишь отдельные культуры, такие как СС-2, СPz-1 показали низкий рост при внесении соляной кислоты.

Устойчивость к низким значениям рН - одна из основных характеристик для пробиотических бактерий [10]. Бактерии вместе с пищей попадают в неблагоприятные для них условия желудка. Хотя подавляющие условия желудка вызваны pH близкой к 1,5, в большинстве случаев, в лабораторных условиях in vitro выбирают обычно pH 3.

Рисунок 1 показывает способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (pH 3).

Рис. 1. Способность молочнокислых бактерий выживать в кислой среде (pH 3).

Следующие штаммы SSh-23, Sha-2, IT-2, CC-2, KK-31, SSa-1, KuA-16 и K-3 показывают значительную устойчивость к низким рН. Данные штаммы не только устойчивы к кислой среде, но и способны к дальнейшему росту и размножению. Некоторые штаммы обладают более низкой способностью к развитию в кислой среде, однако необходимо отметить, что выращенные культуры, в целом, показывают хорошую устойчивость к низким рН.

Желудок и верхняя часть тонкой кишки почти свободны от бактерий, так как бактерии, поступившие извне с пищей, почти полностью уничтожаются соляной кислотой, содержащейся в желудочном соке. Одним из основных требований к современному пробиотическому препарату, является его устойчивость к действию желчи и желудочного сока.

Желчь выделяется в тонкой кишке и присутствие желчи создает неблагоприятные условия для большинства бактерий. Желчные соли уменьшают выживание бактерий, поскольку взаимодействуют с клеточной мембраной бактерий, в которой основные компоненты - липиды и жирные кислоты. Блокирующее воздействие отрицательно влияет на проницаемость клетки [8].

Суточная культура была внесена нами в среду бульона MRS, содержащую концентрат желчи 0,3% и 0,5%. Бактериальный рост анализировался путем подсчета жизнеспособных колоний после 0, 2 и 4 часа культивирования и при дальнейшем инокулировании в агаризованную среду при 37^oC в течении 48 часов. 0,1 мл раствора, который содержал определенный, ранее выделенный штамм был добавлен в 10 мл бульона MRS, затем был инокулирован 24 часа при 37^oC.

Рисунок 2 показывает выживание молочнокислых бактерий в среде содержащей 0,3 % и 0,5% желчных солей.

а) б)

Рис. 2. Выживание молочнокислых бактерий в среде, содержащей а) 0,3% желчных солей, б) 0,5% желчных солей.

Наиболее устойчивыми к кислой среде оказались штаммы KSh-12, ZT-27, KK-31, Spa-1, SSa-1, KuA-16, K-3.

Средняя концентрация желчи в кишечнике - 0,3% и время нахождения пищи в тонкой кишке приблизительно 4 часа [9]. Проведенные опыты показывают значительную устойчивость выделенных культур к действию желчи.

В ходе изучения морфологических признаков мы убедились, что клетки всех исследуемых культур были неподвижны, не содержали спор, окрашивались положительно по Граму и были каталазонегативны. По этим признакам они являются типичными представителями семейства молочнокислых бактерий.

Приведенные морфологические и культуральные свойства молочнокислых бактерий использовали для их идентификации. Способность молочнокислых бактерий к сбраживанию углеводов сильно варьирует при изменении условий культивирования, но данный признак можно рассматривать как вспомогательный при их идентификации, поэтому у выделенных микроорганизмов была изучена и сбраживаемая углеводная способность.

В соответствии с определителем Bergey выделенные молочнокислые бактерии были отнесены к роду Streptococcus и Lactobacterium. Изученные культуральные и морфологические признаки клеток дали возможность определить видовую принадлежность исследуемых штаммов: из 25 штаммов 5 штаммов являются представителями Lac lactis; к S. thermophilus относятся 6 штаммов; к L. аcidophilus относятся 5 представителей; к представителям Lbm. bulgaricus мы отнесли 5 выделенных штаммов. Две культуры были отнесены к Lbm. рlantarum и два выделенных штамма к Lbm. Casei.

Литература

1. Глушанова Н.А., Блинова А.И., Бахаева В.В. Об антагонизме пробиотических лактобацилл // Эпидемиология и инфекционные болезни. - 2004. - № 6. - С. 37-39.

2. Гудкова М.Я. Технология бифидосодержащих молочных продуктов: Автореф. дис. канд. техн. наук. - Л., 2006, 16 с.

3. Ленцнер А.А., Микельсаар М.Э., Воронина М.Н. О количественном составе микрофлоры кала здоровых взрослых при обычном питании // 16 научная сессия ин-та питания АМН СССР: Тез. докл. - М., 1966. - С. 153-154.

4. Лиходед В.Г., Бондаренко В.М. Антиэндотоксиновый иммунитет в регуляции численности эшерихиозной микрофлоры кишечника. Медицина, 2007. - 216 с.

5. Тюрин М.В. Антибиотикорезистентность и антагонистическая активность лактобацилл: дис. … канд. мед. наук. - М., 1990. - 146 с.

6. Чернякова В.И., Смирнова Т.В. Влияние желчи на интестинальные аэробные бактерии // Врач. дело. - 1978. - № 10. - С. 87-91.

7. Эйсфельд Д.А. Биологическая характеристика производственных штаммов лактобактерий: дисс…. канд. биол. наук. - 2002. - 129 с.

8. Gilliland, S.E, Staley, T.E., and Bush, L.J. 1984. Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct. J. Dairy Sci. 67: 3045-3051.

9. Prasad, R.; Sankhyan, S. K.; Karim, S. A., 1998. Growth performance of broiler rabbits fed on diets containing various types of protein supplements. Indian J. Anim. Prod. Manage., 14 (4): 227-230.

10. Saarela M., Mogensen G., Fonden R., Matto J. and Matilla S. T. 2000. Probiotic bacteria: Safety, functional and technological properties. Journal of Biotechnology 84: 197-215.

Размещено на Allbest.ru