Гистофизиология местного иммунитета дыхательных путей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Гистофизиология местного иммунитета дыхательных путей

Голохваст Кирилл Сергеевич

кандидат биологических наук

зав. лабораторией актуальных проблем

взаимодействия природных и

технических систем Дальневосточного

Государственного Технического Университета.

Чайка В. В., соискатель.

Как известно, при охлаждении происходит усиление процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ), нарушение координации компонентов антиоксидантной системы (АОС). Угнетение практически всех клеток организма при усилении ПОЛ обусловлено снижением в них активности окислительно-восстановительных и повышением активности гидролитических ферментов, развитием тканевой гипоксии, снижением энергетических ресурсов (АТФ), нарушением регуляторных внутриклеточных механизмов (дефицит цАМФ и цГМФ) (Калинина и др., 2001). гистофизиологический иммунитет дыхательный

Последнее время при поиске новых криопротекторов исследователи все больше уделяют внимание искусственно синтезированным веществам с выраженным восстановительным эффектом. Католит - это электро-химически активированный водный раствор NaCl, имеющий выраженный восстановительный эффект (Бахир и др., 1981- 2001; Леднев, 1996; Киселев, 1997; Широносов, 1997, 2001, 2002; Гапееев и др., 2000; Воейков, 2001; Резункова, 2003). Католиту, кроме этого, также приписывается большое количество разнообразных биологических эффектов.

Целью нашего исследования было определить гистофизиологическое состояние системы местного иммунитета дыхательных путей при охлаждении и коррекции этого состояния с помощью ингаляции ЭХА-растворов.

Материалы и методы.

В качестве экспериментальных животных были взяты беспородные белые крысы. Все животные были разделены на 4 групп по 20 особей:

1)«Контроль» - интактные животные;

2)«Холод» - охлаждаемые животные;

3)«Католит» - животные, которым ингаляционно вводился католит;

4)«Католит+холод» - охлаждаемые животные, которым ингаляционно вводился католит.

Производили препарирование, бронхоальвеолярный смыв у лабораторных животных, забор материала для исследования, окраску и приготовление мазков для световой микроскопии. Аналитическими методами стали качественное описание, морфометрия и статистический анализ.

Экспериментальное охлаждение проводилось с целью вызвать воспаление дыхательных путей. Для этого использовалась климатическая камера “ILKA” (Feutron, ГДР), где при соблюдении адекватных условий влажности и вентиляции задавалась температура -15⁰С, равная температуре холодового наркоза и очень немного превышающая величину биологического нуля для крыс (Ишимова, 1980). Охлаждение проводилось в течение 15 сут по 3 ч в день. Контрольные животные находились при температуре + 20 …+22⁰С.

Электрохимически-активированный раствор (католит) брался с рН 10,0, ОВП = 800 мВ (определялось pH-метром и ОВП-метром фирмы “Hanna”, Германия). Вырабатывался католит в установке СТЭЛ-10Н-120-01 путем мембранной электрохимической обработкой раствора хлорида натрия в питьевой воде. Раствор представляет собой бесцветную прозрачную жидкость с запахом хлора, содержащую высокоактивные кислородные соединения хлора и др. (сертификат соответствия на установки типа СТЭЛ, выданный Госстандартом России в 1994 году, N 00370039). Лабораторным животным проводилось ингалирование с помощью ультразвукового портативного ингалятора УП-0,25 “АРСА” в закрытой клетке. После опытных мероприятий (в соответствии с Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных от 12.08.77) забирался материал для исследования. Окраска мазков производилась азур II-эозином по Романовскому-Гимза. Для светооптической морфометрии использовался микроскоп “Биолам” (ЛОМО, Россия), для фотосъемки - “Microphot FXA” (Nikon, Япония).

На препаратах идентифицировались клетки. Жизнеспособность клеток выявляли витальной окраской трипановым синим. Подсчет клеток велся по стандартной методике в камере Горяева. Морфометрическое исследование осуществлялось на полуавтоматическом программно-аппаратном комплексе анализа изображения, состоящем из микроскопа “Биолам” с рисовально-проекционным аппаратом РА-7, пантографическогоманипулятора (Жеревчук с соавт., 1996), персонального компьютера со специально созданным программным обеспечением “Морфометр” для морфометрических вычислений (Кудлаев с соавт., 1996; Целуйко, Прокопенко, 2001). Статистическую обработку полученных значений производили с помощи программы Statistica 6.0.

Для более полной оценки физиологического состояния организма мы определяли уровень продуктов ПОЛ в плазме крови и в ткани легких крыс. Для этого в работе использованы следующие биохимические методы.

Приготовление гомогенатов легких.

После забоя животных, вскрывали грудную и брюшную полости, легкие перфузировали 0,15 М раствором KCl, содержащим 5 мМ трис-HClбуфер, рН 7,4. Легкие измельчали ножницами, взвешивали и гомогенизировали в гомогенизаторе Даунса с тем же буфером в соотношении 1:5 в течение 1 мин. Приготовленный гомогенат использовали для определения содержания в нем продуктов ПОЛ и компонентов АОС.

Экстракция липидов из плазмы крови и гомогенатов легких. Липиды из крови и тканей экстрагировали по методу Блайя-Дайера.

Определение церулоплазмина в плазме крови.

Принцип метода основан на окислении р-фенилендиамина при участии церулоплазмина (Колб, Камышников, 1976).

Определение содержания МДА.

МДА определяли в плазме крови и гомогенатах легких по цветной реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) (Бородин, Арчаков, 1987).

Определение диеновых конъюгатов.

0,1 мл спиртового раствора липидов вносили в кювету спектрофотометра СФ-16, в которой находились 2,9 мл абсолютного спирта. Оптическую плотность измеряли при длине волны 233 нм с ходом луча 10 мм.

Для пересчета использовали коэффициент мольной экстинкции 2,2*10^-5 М^-5 см^-5 (Стальная, 1977). Величину диеновых конъюгат выражали в нмолях на г ткани или мл крови.

Определение гидроперекисей липидов.

Количество гидроперекисей липидов определяли на основе их способности окислять ионы Fe ²⁺ с последующей реакцией на Fe ³⁺ с тиоцианатом аммония (Романова, Стальная, 1977).

Определение содержания витамина Е.

Содержание витамина Е определяли в липидных экстрактах из плазмы крови и тканей по цветной реакции с дипиридилом и FeCl₃(Кисилевич, 1972) в модификации М.А. Штарберга (1996).

Результаты и обсуждение.

В группе “Контроль” количество жизнеспособных клеток составило 88,2±4,3%, в группе “Холод” - 61±3,7%, в группе “Католит” - 93,4±4,7%, в группе “Католит+холод” - 85±4,1%.

Макрофаги и лимфоциты в разных группах выявлялись в разных пропорциях. В группе “Контроль” макрофаги составляли 60±3,4%, лимфоциты - 30±1,7%, в группе “Холод” 23±1,6% и 65±3,2% соответственно, в группе “Католит” - 69±3,3% и 23±1,4% соответственно, в группе “Католит+холод” - 58±2,7% и 31±1,5% соответственно.

Удельное количество клеток в группе “Контроль” составило 1,5±0,1*10⁵ в 1 мл, в группе “Холод” - 5,8±0,4*10⁵ в 1 мл, в группе “Католит” 1,55±0,1*10⁵, в группе “Католит+холод” - 2,1±0,15*10⁵.

Биохимические данные для удобства были сведены в две таблицы, приведенные ниже.

Таблица 1. Биохимические показатели ПОЛ в плазме крови во всех экспериментальных группах

Таблица 2. Биохимические показатели ПОЛ в гомогенате легких во всех экспериментальных группах

В группе “Католит” количество жизнеспособных клеток (93,4%) достоверно не отличается от результатов в группе “Контроль” (88,2%). При световой микроскопии клетки в группе “Католит” также не отличались от клеток группы “Контроль”. Удельное количество клеток в группах “Католит” и “Контроль” достоверно не различается (1,55*10⁵ и 1,5*10⁵ в 1 мл соответственно). Клеточный состав БАЛ в группе “Католит” (69% макрофагов и 23% лимфоцитов), который мы определили, также достоверно не отличался от группы “Контроль” - 60% макрофагов и 30% лимфоцитов. Таким образом, католит не оказывает негативных эффектов на численность и состав клеток системы местного иммунитета нижних дыхательных путей крыс. гистофизиологический иммунитет дыхательный

В группе “Католит” по сравнению с группой “Контроль” у макрофагов наблюдалось увеличение округлости на 20%, увеличение округлости ядра на 3,3%, увеличение длины на 2%, уменьшение длины ядра на 2%, увеличение площади на 4%, увеличение площади ядра на 8%. У лимфоцитов группы “Католит” по сравнению с группой “Контроль” было выявлено увеличение округлости лимфоцитов на 41%, уменьшение длины лимфоцита на 3%, увеличение площади лимфоцитов на 3,6%, увеличение площади ядра лимфоцитов на 4,5%, увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения у лимфоцитов на 54%.

В биохимическом анализе плазмы крови при сравнении групп “Католит” и “Контроль” наблюдается достоверное снижение количества МДА на 21,2% и тенденция к увеличению количества витамина Е на 15%. В ткани легких зафиксировано снижение уровня гидроперекисей на 20%. Все это свидетельствует об антиоксидантной активности католита в норме на уровне организма и отсутствии прооксидантного эффекта.

Как мы видим, механизм действия католита на живую систему оказался похожим на действие антиоксидантов. Вследствие сильной восстановительной (электрондонорной) активности, католит обладает способностью отдавать свободные электроны окисленным соединениям, в том числе свободным радикалам (Кирпичников, 1986; Бахир и др., 1999). Вообще, роль антиоксидантов видится много богаче, чем в рамках традиционных представлений. Конечно, они предотвращают неспецифические химические реакции повреждения биомакромолекул при избыточной продукции кислородных радикалов. Но их главная функция - организация и обеспечение процессов с участием активных форм кислорода, которые являются мощными внутриклеточными активаторами (Прилуцкий и др., 1997; Леонов, 1999). Под воздействием католита ОВП биологических жидкостей сдвигается в сторону донорно-акцепторных значений. Это влечет за собой увеличение активности биоантиоксидантов, стабилизацию клеточных мембран, усиление неспецифического иммунитета и повышение резистентности организма к радиоактивному облучению и токсинам.

В группе “Католит+холод” данные о содержании жизнеспособных клеток (85%) достоверно выше результатов в группе “Холод” (61%) и уже не отличаются достоверно от данных в группе “Контроль” (88,2%). Таким образом, уже по одному этому показателю католит является явным защитным фактором для клеток БАЛ. Если сравнивать удельное количество клеток в группе “Католит+холод” (2,1*10⁵ в 1 мл) с данными в группах “Контроль” (1,5*10⁵ в 1 мл) и “Холод” (5,8*10⁵ в 1 мл), а также относительное количество макрофагов и лимфоцитов в группах “Католит+холод” (58% макрофагов и 31% лимфоцитов), “Контроль” (60% и 30% соответственно) и “Холод” (23% и 65% соответственно), то, как и в случае с цеолитом, можно сделать вывод о существенной компенсации повреждающего действия холода применением ингаляций католита. Действительно, в группе животных “Католит+холод” зарегистрировано уменьшение в 2,7 раза, то есть существенная нормализация, удельного количества клеток в БАЛ по сравнению с группой “Холод”. Причем, если в группе “Холод” мы наблюдали инвертирование результатов относительного количества макрофагов и лимфоцитов по сравнению с контрольной группой, то в группе “Католит+холод” было отмечено преобладание макрофагов, и их пропорция с лимфоцитами не отличалась от нормы. Это можно объяснить нормализующим влиянием католита на функциональную способность макрофагов при повреждающем действии холода, что было отмечено и выше при действии цеолитов Вангинского месторождения.

У макрофагов в группе “Католит+холод” по сравнению с группой “Контроль” наблюдалось увеличение округлости на 5,2%, уменьшение длины клетки на 6,6%, , уменьшение длины ядра на 12,5%, уменьшение площади клетки на 3%, уменьшение площади ядра на 12,5%, уменьшение ядерно-цитоплазматического соотношения на 5%. Все эти изменения были статистически не значимы. Морфологически макрофаги группы “Католит+холод” мало чем отличались от макрофагов контрольной группы. В цитоплазме некоторых отмечены вакуоли, в которых предположительно некоторое время может находиться католит. Некоторое уменьшение длины и площади ядра может объясняться угнетающим действием холода, хотя в целом морфометрические показатели в группе “Католит+холод” были очень близки к контрольным. При сравнении макрофагов групп “Католит+холод” и “Холод” мы выявили следующее: снижение округлости клетки на 9% в группе “Католит+холод”, увеличение округлости ядра на 6%, увеличение длины клетки на 12%, увеличение длины ядра на 6%, увеличение площади клетки на 17,8%, увеличение площади ядра почти в 1,5 раза (на 51%), увеличение ядерно-цитоплазматического соотношения. Эти данные позволяют предположить, что при холодовом воздействии влияние католита на макрофаги проявляется в усиление ядерных функций.

У лимфоцитов группы “Католит+холод” по сравнению с группой “Контроль” было выявлено уменьшение округлости клетки на 3,3%, уменьшение округлости ядра на 7,5%, увеличение длины ядра на 6,4%, увеличение площади клетки на 5,7%. Из этого следует, что лимфоциты в этой экспериментальной группе морфометрически практически не отличались от лимфоцитов в группе “Контроль”. При сравнении лимфоцитов групп “Католит+холод” и “Холод” мы выявили следующее: снижение округлости лимфоцита на 3,3%, увеличение длины лимфоцитов на 7%, увеличение длины ядра на 2,3%, уменьшение площади клетки на 8%, уменьшение площади ядра на 5%. Из этого можно сделать вывод о несущественном влияние католита на лимфоциты нижних дыхательных путей как в норме, так и при холодовом воздействие.

В биохимическом анализе плазмы крови группы “Католит+холод” по сравнению с группой “Холод” наблюдается увеличение уровня церулоплазмина на 36%, снижение количества диеновых конъюгат на 38%, снижение количества МДА на 52%, уменьшение уровня гидроперекисей на 33%, повышение количества витамина Е на 33,3%. Все данные в группе “Католит+холод” достоверно не отличались от контрольной группы.

В ткани легких наблюдается аналогичная картина. Содержание церулоплазмина в группе “Католит+холод” по сравнению с группой “Холод” увеличилось на 37%, диеновых конъюгат уменьшилось на 23%, количество МДА снизилось на 31%, уровень гидроперекисей уменьшился на 24%, количество витамина Е увеличилось на 16,5%. Все показатели вернулись к значениям нормы и статистически не отличались от них.

При подведении итогов становится очевидным, что католит обладает сильной восстановительной активностью. При действии холода и коррекции активации ПОЛ католитом уровни диеновых конъюгат, МДА, гидроперекисей, церулоплазмина и витамина Е не отличаются от контрольной группы. МДА является конечным продуктом ПОЛ, то есть диеновые конъюгаты и гидроперекиси постепенно превращаются в МДА, и по его накоплению судят о компенсации процесса антиоксидантной системой (Штарберг, 1996; Штарберг, 1997). Из этого можно сделать вывод, что католит при действии холода полностью компенсирует отрицательные стороны холодового воздействия в течение 15 дней. А накопление диеновых конъюгат и гидроперекисей при холодовом воздействие, которое оказывают повреждающее действие на систему местного иммунитета, происходит постоянно (Кодинцев, 2000; Tseluyko et al., 2000). Кроме этого при действии холода и католита практически не страдает антиоксидантная защита: уровень витамина Е и церулоплазмина не отличается от контрольной группы.

Литература

1. Активированные вещества. Некоторые вопросы теории и практики / В.М. Бахир, А.Р. Атаджанов, У.Д. Мамаджанов, С.А. Алехин, Н.А. Мариампольский, А.Х. Наджимитдинов // Изв. АН УзССР. Сер. техн. наук. - 1981. - № 5. - С. 68-72.

2. Бахир В.М. Физическая природа явлений активации веществ / В.М. Бахир, Л.Е. Спектор, У.Д. Мамаджанов // Изв. АН УзССР, Сер.техн. наук, 1983. - № 1. - С. 60-64.

3. Бахир В.М. Электрохимическая активация / В.М. Бахир - М.: ВНИИИ мед. техники, 1992. - 657 c.

4. Бахир В.М. Медико-технические системы и технологии для синтеза электрохимически активированных растворов / В.М. Бахир - М.: ВНИИИМТ, 1998. - 66 с.

5. Электрохимическая активация: история, состояние, перспективы / В.М. Бахир, Ю.Г. Задорожний, Б.И. Леонов, С.А. Паничева, В.И. Прилуцкий, О.И. Сухова - М.: ВНИИИМТ, 1999. - 256 с.

6. Бахир В.М. Современные технические электрохимические системы для обеззараживания, очистки и активирования воды / В.М. Бахир - М.: ВНИИИМТ, 1999. - 84 с.

7. Электрохимическая активация: очистка воды и получение полезных растворов / В.М. Бахир, Ю.Г. Задорожний, Б.И. Леонов, С.А. Паничева, В.И. Прилуцкий - М.: ВНИИИМТ, 2001. - 176 с.

8. Бородин Е.А. Стабилизация и реактивация цитохрома P-450 фосфатидилхолином при перекисном окислении липидов / Е.А. Бородин, А.И. Арчаков // Биологические мембраны. - 1987. - №7. - С. 719 - 728.

9. Воейков В.Л. АФК - фундамент метаболизма / В.Л. Воейков, В.В. Колдунов, Д.С. Кононов // Ж. физ. химии, 2001. - № 75. - С. 1579-1585.

10. Гапеев А. Б. Роль формы сигнала в рецепции слабых низкочастотных полей мембраносвязанными системами клетки / А. Б. Гапеев, Н. К. Чемерис // Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, II Междун. конгресс. Сб. труд. - Петербург, 2000. - С. 8-12.

11. Жеревчук Г.Н. Манипулятор для компьютерной пантографии к рисовальному прибору Аббе / Г.Н. Жеревчук, С.В. Зиновьев, А.В. Прокопенко // Рац. предл. №12 (1074). - Амур. гос. мед. акад. - Благовещенск, 1996.

12. Ишимова Л.М. Болезнетворные действия факторов внешней среды / Л.М. Ишимова, А.Д. Адо, Г.А. Ерзина, И.П. Гаранина и др. // Патологическая физиология. - М.: Медицина, 1980. - 520 с.

13. Калинина Е.П. Клинико-иммунологические механизмы формирования бронхолегочной патологии в семье/ Е.П. Калинина, Н.С. Журавская, Т.И. Виткина, С.А. Геронина // Бюл. физиол. и патол. дыхания. - 2001. - Вып. 9. - С. 10-14.

14. О природе электрохимической активации сред / П.А. Кирпичников, В.М. Бахир, П.У. Гамер, Г.А. Добреньков, А.Г. Лиакумович, Б.С. Фридман, С.И. Агаджанян // Докл. АН СССР, 1986. - Т. 286. - № 3. - С. 663-666.

15. Киселев Б.И. Метод адаптивного лечения (искусственный источник биополя в медицине) / Б.И. Киселев // С.-Петербург: Изд-во "Комплекс", 1997. - вып. 1. - 9 с.

16. Кисилевич Р.Ж. Определение витамина Е в сыворотке крови / Р.Ж. Кисилевич, С.И. Скварко // Лаб. дело. - 1972. - №8. - С. 473 - 475.

17. Кодинцев В.В. Защитные свойства антиоксиданта эмоксипина при холодовом воздействии: Автореф. дисс …канд. мед. наук / В.В. Кодинцев. - Владивосток, 2000. - 24 с.

18. Колб В.Г. Клиническая биохимия / В.Г. Колб, В.С. Камышников. - Минск, 1976. - 312 с.

19. Кудлаев А.А. Программа для ЭВМ - система количественного анализа изображений “Морфометр”. - М.: ЦНИИГАиК, 1991.

20. Леднев В.В. Биоэффекты слабых комбинированных, постоянных и переменных магнитных полей / В.В. Леднев // Биофизика, 1996. - т.41. - вып.1. - С. 224-232.

21. Леонов Б.И. Физико-химические аспекты биологического действия электрохимически активированной воды / Б.И. Леонов, В.И. Прилуцкий, В.М. Бахир. - М.: ВНИИИМТ, 1999. - 244 с.

22. Прилуцкий В.И. Электрохимически активированная вода: аномальные свойства, механизм биологического действия / В.И. Прилуцкий, В.М. Бахир. - М.: ВНИИИМТ, 1997.- 228 с.

23. Резункова О. П. Биофизический механизм воздействия миллиметровых излучений на биологические процессы / О. П. Резункова // Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине, III Междун. Конгресс, Избр. труды. -- Петербург, 2003. - С. 35-38.

24. Романова Л.А. Метод определения гидроперекисей липидов с помощью тиоционата аммония / Л.А. Романова, И.Д. Стальная // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С. 64 - 66.

25. Стальная Е.А. Метод определения диеновой конъюгации ненасыщенных высших жирных кислот // Современные методы в биохимии. - М.: Медицина, 1977. - С.63-64.

26. Целуйко С.С. Системный анализ компенсаторно-приспособительных реакций в легких / С.С. Целуйко, А.В. Прокопенко. - Благовещенск, 2001. - 124 с.

27. Широносов В.Г. Физические основы резонансной активации воды / В.Г. Широносов // 1-й Междун. симпозиум "Электрохимическая активация в медицине, сельском хозяйстве, промышленности", сб. докл. - М.: ВНИИМТ АО НПО "Экран", 1997. - с. 220-221.

28. Широносов В.Г. Резонанс в физике, химии и биологии / В.Г. Широносов // Ижевск: Изд-во "Удмуртский университет", 2001. - 92 c.

29. Широносов В.Г. Биологические свойства активированной воды / В.Г. Широносов, С. Г. Меньшикова, Е. В. Широносов // III Междун. симпозиум "Электрохимическая активация в медицине, сельском хозяйстве, промышленности", сб. докл. - М.: ВНИИМТ АО НПО "Экран", 2002. - с. 120-123.

30. Штарберг М.А. Антиокислительные свойства комбинированных препаратов фосфолипидов с производными малоновой и тиобарбитуровой кислот: Дисс. … канд. мед. наук / М.А. Штарберг. - Благовещенск, 1996. - 178 с.

31. Штарберг С.А. Влияние комбинированного воздействия производных тиобарбитуровой кислоты и низкоэнергетического лазерного излучения на перекисное окисление липидов: Автореф. дисс… канд. мед. наук / С.А. Штарберг. - Томск, 1997. - 24 с.

32. Cellular protective mechanisms of the respiratory system at the cold exposure effects of antioxidant and laser irradiation / S.S. Tseluyko, V.A. Dorovskikh, E.A. Borodin, N.P. Krasavina, S.W. Zinoview // The 8th international Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange.- Blagoveshchensk, 2000.- P. 97.

Размещено на Allbest.ru