Изучение иммуногенности химерного белка, включающего эпитопы антител, нейтрализующих широкий спектр первичных изолятов ВИЧ-1

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Изучение иммуногенности химерного белка, включающего эпитопы антител, нейтрализующих широкий спектр первичных изолятов ВИЧ-1

Общее число носителей ВИЧ-инфекции в мире на данный момент составляет 36,7 млн. Россия - одна из стран в мире, где число новых заражений ВИЧ-инфекцией и число смертей, связанных с ВИЧ/СПИД, продолжают возрастать. На 31 декабря 2016 года в России официально зарегистрировано 1 114 815 ВИЧ-инфицированных [1].

Вакцины, считаются одним из самых эффективных средств борьбы с инфекционными заболеваниями. Классическим примером может служить вакцина против натуральной оспы человека, которая позволила элиминировать данный вирус из популяции человека. В случае вируса иммунного дефицита человека классические подходы по созданию вакцины, такие как использование аттенуированного или инактивированного вируса оказались не эффективны. В связи с этим, разрабатываются альтернативные технологии создания вакцин. Так, в настоящее время основной концепцией эффективной вакцины против ВИЧ-1 считается создание иммуногена или комбинации иммуногенов, направленных на индукцию в организме антител, способных обеспечить защиту от широкого спектра вариантов первичных изолятов ВИЧ-1 [2, С. 635].

На сегодняшний день на основе репертуара антител ВИЧ-инфицированных пациентов были получены десятки человеческих моноклональных антител (monoclonal antibodies, mAbs), которые могут нейтрализовать широкое разнообразие генетических вариантов ВИЧ-1 [3, С. 138], [4, С. 1097]. Данные широко нейтрализующие антитела (broadly neutralizing antibodies, bnAbs) нацелены на несколько консервативных сайтов уязвимости на поверхности гликопротеина вирусной оболочки [5, C. 382], [6, C. 3]. Одной из таких мишеней является мембрано-проксимальная наружная область (membrane proximal external region, MPER), представляющая собой высококонсервативную область, состоящую из 22 аминокислотных остатков, расположенных на С-конце эктодомена gp41. Считается, что MPER играет решающую роль при слиянии вирусной и клеточной мембран [7, C. 6089], [8, C. 2469]. На MPER нацелены такие bnAbs, как 2F5, Z13e1, 4E10 и 10E8 [9, C. 406], [10, C. 1651]. Среди этих антител, наибольший интерес представляют 4E10 и 10E8, из-за их способности нейтрализовать ~ 98% тестируемых штаммов ВИЧ-1. Структура эпитопов этих антител была точно определена на основе данных рентгеноструктурного анализа и включает аминокислотные остатки (671NWFDITNWLWYIK683) [9, C. 406], [11, C. 1533].

Несмотря на то, что эти эпитопы имеют линейную структуру, попытки разработать вакцину, которая смогла бы индуцировать 4Е10/10E8-подобные bnAbs, оказались безуспешными [12, C. 17], [13 C. 187].

Одной из проблем в индукции нейтрализующих антител к MPER является то, что структура субъединицы gp41 является подвижной, так как данный участок претерпевает структурные изменения при слиянии вирусной и клеточной мембран [14, C. 111]. Таким образом, главной проблемой при разработке вакцины на основе MPER является разработка иммуногенов и / или разработка стратегий вакцинации, которые «заставят» иммунную систему концентрировать гуморальный ответ на область MPER, и также направлять созревание антител таким образом, чтобы зрелые антитела в большей степени связывались с регионами уязвимости.

Нами было решено сконструировать молекулу, на основе белка, позволяющего включать эпитопы MPER при сохранении их структуры в составе белка-носителя (белка-каркаса). Для этого был использован глобулярный белок B. subtilis YkuJ (номер PDB 2FFG.), с известной структурой, конформационная структура концевых участков которого наиболее близка к конформации нативного MPER ВИЧ-1 и позволяет включить одновременно два таких региона. Далее, была спроектирована нуклеотидная последовательность гена, кодирующая химерный рекомбинантный белок YkuJ-MPER. В состав гена YkuJ-MPER были заложены две нуклеотидные консенсусные последовательности MPER ВИЧ-1 субтипа B по N- и C концам. Последовательности MPER были фланкированы уникальными сайтами рестрикции для клонирования гена в составе плазмиды и возможности изменения нуклеотидной последовательности MPER на последовательности других субтипов. Помимо этого, в конструкцию YkuJ-MPER была введена полигистидиновая метка 6xHis, для возможности очищать белок с помощью металл-хелатной хроматографии.

Ген, кодирующий химерный белок YkuJ-MPER, был химически синтезирован и клонирован в составе плазмидного экспрессионного вектора pET21a (Novagen). Полученной плазмидой были трансформированы клетки E. coli штамма BL21 для наработки рекомбинантного белка.

Экспрессию гена, кодирующего белок-иммуноген, оценивали с помощью электрофоретического разделения лизата клеток E.coli BL21/ pYkuJ-MPER в 15% полиакриламидном геле (ПААГ) по стандартной методике, описанной Лэммли [15, C. 680]. Анализ электрофореграммы показал наличие полосы, по подвижности соответствующей теоретически рассчитанной молекулярной массе рекомбинантного белка YkuJ-MPER.

Очистку рекомбинантного белка YkuJ-MPER проводили с помощью металл-хелатной хроматографии. Было установлено, что белок находится в нерастворимой фракции, поэтому его выделяли и очищали из дебриса (осадок, формируемый в результате центрифугирования суспензии гомогенизированных клеток и содержащий полуразрушенные клетки). Для этого биомассу бактериальных клеток E. coli BL21/pYkuJ-MPER после индукции 1М ИПТГ дезинтегрировали с помощью ультразвукового дезинтегратора, клеточный дебрис отделяли от растворимой фракции с помощью центрифугирования. Полученный дебрис растворяли в 8 М мочевине, после чего наносили на хроматографическую колонку, содержащую Ni-агарозу, отмывали от не связавшихся примесных белков и элюировали с помощью буфера, содержащего 0.5 М имидазол. Рефолдинг белка, связавшегося с металл-хелатным сорбентом, проводили диализом против физиологического раствора.

Для подтверждения связывания белка YkuJ-MPER с моноклональными антителами, такими как 2F5, 4Е10 и 10E8, проводили вестерн-блот анализ. Он подтвердил, что эпитопы в составе химерного белка YkuJ-MPER распознаются МКА 2F5, 4Е10 и 10E8.

Для анализа иммуногенности химерного белка, очищенным препаратом YkuJ-MPER были иммунизированы мыши линии BALB/c и беспородные кролики. Степень очистки YkuJ-MPER используемого для иммунизации контролировали с помощью электрофореза в 15% ПААГ. В конечном препарате чистота белка составляла более 98% (рис. 1).

Рис. 1. Очищенный препарат белка YkuJ-MPER для иммунизации. 1 - Компонент вакцины КомбиВИЧвак белок TBI, 2 - Препарат белка YkuJ-MPER, 3 - маркер молекулярной массы (14, 25, 45 и 66 кДа)

антитело иммунодефицит белок вирус

Для иммунизации были отобраны 20 мышей линии BALB/c - 10 из которых были трехкратно иммунизированы внутримышечно по схеме: первая иммунизация - 50 мкг препарата (на одну мышь) с полным адъювантом Фрейнда, вторая иммунизация - 50 мкг препарата с неполным адъювантом Фрейнда, третья иммунизация - 100 мкг чистым белком. Иммунизация проводилась с интервалом 2 недели. Второй группе мышей в количестве 10 особей служащей в качестве отрицательного контроля - вводился физиологический раствор, по той же схеме. По этой же схеме были иммунизированы два беспородных кролика, количество вводимого иммуногена было увеличено до 500 мкг на особь, в качестве отрицательного контроля служила сыворотка этих же кроликов взятая перед иммунизацией. Все животные содержались в питомнике согласно правилам лабораторной практики и получали должный уход.

Полученные сыворотки лабораторных животных после иммунизации были протестированы в иммуноферментном анализе для оценки иммуногенности химерного белка YkuJ-MPER [16, C. 134]. Было показано, что антитела из сывороток иммунизированных животных специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком YkuJ-MPER. Титр сывороток иммунизированных животных в обоих случаях составил более 1:3 миллионов (рис. 2).

Рис. 2. Результаты иммуноферментного анализа

В качестве антигена был сорбирован белок YkuJ-MPER. Синяя линия - отрицательный контроль (сыворотки мышей, иммунизированных физиологическим раствором); красная линия - сыворотки мышей, иммунизированных белком-иммуногеном YkuJ-MPER; зеленая линия - отрицательный контроль (сыворотки кроликов, взятые до иммунизации); голубая линия - сыворотки кроликов, иммунизированных белком-иммуногеном YkuJ-MPER; оранжевая линия - контроль коньюгата.

Таким образом, в ходе данного исследования проведен теоретический дизайн химерного белка-иммуногена, на основе белка B. subtilis YkuJ, и участка MPER gp41 ВИЧ-1. Получена генетическая конструкция, кодирующая химерный белок YkuJ-MPER, и рекомбинантный штамм E. coli BL21/pYkuJ-MPER, продуцирующий белок-иммуноген YkuJ-MPER. Проанализированы биохимические и иммуногенные свойства химерного белка YkuJ-MPER. С помощью иммуноблоттинга было показано, что эпитопы широконейтрализующих антител в составе YkuJ-MPER распознаются соответствующими МКА. Проведена оценка иммуногенности рекомбинантного белка YkuJ-MPER путем иммунизации лабораторных животных и оценка специфической активности полученных сывороток в ИФА. Показано, что химерный белок YkuJ-MPER не токсичен для животных и что антитела из сывороток иммунизированных животных специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком YkuJ-MPER.

Список литературы

1. Федеральный научно-методический Центр по профилактике и борьбе со СПИДом [Электронный ресурс]. - URL: http://www.hivrussia.ru/ (дата обращения: 20.07.2017).

2. Burton D.R. Broadly neutralizing antibodies to HIV and their role in vaccine design / Burton D.R., Hangartner L. // Annual review of immunology. - 2016. - V. 34. - P.635-659. doi: 10.1146/annurev-immunol-041015-055515.

3. Huang J. Broad and potent HIV-1 neutralization by a human antibody that binds the gp41-gp120 interface / Huang J., Kang B.H., Pancera M. et al. // Nature. - 2014. - V. 515. - P. 138-142. doi: 10.1038/nature13601.

4. Pejchal R. A potent and broad neutralizing antibody recognizes and penetrates the HIV glycan shield / Pejchal R., Doores K.J., Walker L.M. et al. // Science. - 2011. - V. 334. - P. 1097-1103. doi: 10.1126/science.1213256.

5. Georgiev I.S. Elicitation of HIV-1 - neutralizing antibodies against the CD4-binding site / Georgiev I.S., Gordon Joyce M., Zhou T., Kwong P.D. // Current Opinion in HIV and AIDS. - 2013. - V. 8. - P. 382-392. doi: 10.1097/COH.0b013e328363a90e.

6. Haynes B.F. Progress in HIV-1 vaccine development / Haynes B.F., Moody M.A., Alam M. et al. // Journal of Allergy and Clinical Immunology. - 2014. - V. 134. - P. 3-10. doi: 10.1016/j.jaci.2014.04.025.

7. Muсoz-Barroso I. Role of the membrane-proximal domain in the initial stages of human immunodeficiency virus type 1 envelope glycoprotein-mediated membrane fusion / Muсoz-Barroso I., Salzwedel K., Hunter E., Blumenthal R. // Journal of Virology. - 1999. - V. 73. - P. 6089-6092.

8. Salzwedel K. A conserved tryptophan-rich motif in the membrane-proximal region of the human immunodeficiency virus type 1 gp41 ectodomain is important for Env-mediated fusion and virus infectivity / Salzwedel K., West J.T., Hunter E. // Journal of Virology. - 1999. - V. - P. 2469-2480.

9. Huang J. Broad and potent neutralization of HIV-1 by a gp41-specific human antibody / Huang J., Ofek G., Laub L., Louder M.K. et al. // Nature. - 2012. - V. 491. - №7424. - P. 406-412. doi: 10.1038/nature11544.

10. Purtscher M. A broadly neutralizing human monoclonal antibody against gp41 of human immunodeficiency virus type 1 / Purtscher M., Trkola A., Gruber G. et al. // AIDS Research and Human Retroviruses. - 1994. - V. 10. - P. 1651-1658. doi: 10.1089/aid.1994.10.1651.

11. Cardoso R.M.F. Structural basis of enhanced binding of extended and helically constrained peptide epitopes of the broadly neutralizing HIV-1 antibody 4E10 / Cardoso R.M.F., Brunel F.M., Ferguson S. et al. // Journal of Molecular Biology. - 2007. - V. 365. - P. 1533-1544. doi:10.1016/j.jmb.2006.10.088.

12. Banerjee S. Modulating immunogenic properties of HIV-1 gp41 membrane-proximal external region by destabilizing sixhelix bundle structure / Banerjee S., Shi H., Habte H.H., Qin Y., Cho M.W. // Virology. - 2016. - V. - P. 17-26. doi: 10.1016/j.virol.2016.01.002.

13. Habte H.H. Immunogenic properties of a trimeric gp41-based immunogen containing an exposed membrane-proximal external region / Habte H.H., Banerjee S., Shi H., Qin Y., Cho M.W. // Virology. - 2015. - V. 486. - P. 187-197. doi: 10.1016/j.virol.2015.09.010.

14. Melikyan G.B. Common principles and intermediates of viral protein-mediated fusion: the HIV-1 paradigm / Melikyan G.B. // Retrovirology. - 2015. V. 5. - P. 111. doi: 10.1186/1742-4690-5-111.

15. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / Laemmli U.K. // Nature. - 1970. - V. 227. - P. 680-685. doi: 10.1038/227680a0.

16. Егоров А.М. Теория и практика иммуноферментного анализа / А.М. Егоров. - М.: Высшая школа, 1991. - 288 с.

Размещено на Allbest.ru