Бактерия A. salmonicida является возбудителем фурункулеза (аэромоноза) рыб не только представителей семейства лососевых, но и других семейств. Фурункулез-это высококонтагиозная болезнь, протекающая остро, подостро и хронически. Зараженные рыбы с открытыми ранами являются источниками распространения A. salmonicida. В связи с высокой плотностью выращивания рыбы в хозяйствах, эта болезнь быстро распространяется с высоким процентом летальности [1, С.136].

Согласно Инструкции о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090 Диагноз на фурункулез устанавливают на основании эпизоотических данных, клинических признаков, патологоанатомических изменений, результатов бактериологического исследования и положительной биопробы, которое занимает до 10 дней [2].

Нами была разработана бактериологическая схема выделения и идентификации данного вида микроорганизма, включающая специальные среды - жидкую накопительную среду A. Sl.1-УГСХА, плотную селективную среду A. Sl.2-УГСХА и ряд бактериологических тестов, которая позволяет сократить время на исследование до 84 ч.

При конструировании питательных сред подбор питательных веществ осуществлялся экспериментальным путем. В результате исследований жидкая среда A. Sl.1-УГСХА имеет следующий состав: вода дистиллированная - 1000 мл, K₂HPO₄ - 1г, MgSO₄ - 0,2 г, NaCl - 5г, пептон - 5 г, бромтимоловый синий - 0,03 г, глюкоза - 5 г, BaCl₂ - 2 г. pH готовой среды накопления = 7,1. Способ приготовления - в дистиллированную воду добавляют пептон, минеральные соли, глюкозу, бромтимоловый синий. Среду доводят до полного растворения частиц, разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 0,5 атм в течение 20 минут. Готовая среда прозрачная, травянисто-зеленого цвета.

Нами была разработана плотная дифференциально-диагностическая среда A. Sl.2-УГСХА следующего состава - вода дистиллированная - 1000 мл, агар - 15 г, пептон - 5 г, дрожжевой экстракт - 3 г, MgSO_{4 -} 0,2 г, K₂HPO₄ - 1 г, глюкоза - 5 г, конго-рот - 3 г. Концентрацию указанных компонентов также была подобрана экспериментальным путем.

Способ приготовления - все компоненты смешивали и доводили до кипения. Затем автоклавировали в течение 20 минут при 112° С. pH готовой среды накопления - 7,1. Готовая среда - насыщенного красного цвета.

С целью определения специфичности, разработанных нами сред накопления, был проведен контрольный посев бактерий-ассоциантов других видов и родов. Посевы культивировали в термостате в течение 24 ч. при Т - 28єС: A. salmonicida АТСС 33658, Ps. putida №12633, Ps. fluorescens №13525, Y.ruckeri №6, Y. enterocolitica; при Т - 37 єС: Ps. aeruginosa №128, A. hydrophilaATCC 49140, A. sobria ATCC 9071, A. caveae ATCC 12633, P. mirabilis №523, Kl. pneumonia №4463, E. coli №4 (табл.1).

бактериологическая схема штамм бактерия

Таблица 1 - Определение специфичности жидкой среды накопления A. Sl.1-УГСХА и дифференциально-диагностической среды A. Sl.2-УГСХА

Этапы исследования по разработанной нами схеме.

Исследуемую пробу воды в количестве 1 мл вносят в накопительную среду A. Sl.1 - УГСХА объемом 4-5 мл и помещают в термостат на 18 ч при температуре 28°С. На жидкой накопительной среде бактерии рода Aeromonas дают положительную реакцию, характеризующуюся изменением цвета среды с зеленого на желтый, а также помутнением субстрата и образованием осадка. Затем из жидкой среды накопления, бактериологической петлей делается посев на плотную дифференциально-диагностическую среду A. Sl.2-УГСХА и инкубируются 18 ч при температуре 28єС.

На среде A. Sl.2-УГСХА бактерии A. salmonicida образуют колонии округлой формы, размером 0,5-1 мм черного цвета, цвет среды вокруг колоний также чернеет.

Выросшие на селективной среде A. Sl.2-УГСХА колонии параллельно исследуют по тестам - на желатиназную активность, наличие нитратредуктазы, подвижность, OF-тест, а также пересевают отдельно стоящие колонии на МПА для последующего определения окраски по Граму и микроскопии, наличия каталазной и оксидазной активности.

Производят окраску по Граму и микроскопию. Клетки A. salmonicida выявляются как грамотрицательные палочки.

Для определения ферментов оксидазы и каталазы производят посев выросших на среде A. Sl.2-УГСХА колоний на чашки Петри с мясопептонным агаром. После инкубирования при 28єС в течение 18 ч на поверхность выросших на мясопептонном агаре колоний наносят 1% раствор 2-N-диметилпарафенилендиамина для определения оксидазы и 3% раствор перекиси водорода для определения каталазы. A. salmonicida является оксидазоположительной (покраснение реактива в течение 20 сек) и каталазоположительной (образование пузырьков газа).

Определяют подвижность методом укола в столбик застывшего 0,3% мясопептонного агара. После инкубирования в течение 18 ч при 28єС проводят учет результатов. Бактерии A. salmonicidaнеподвижны (наличие роста микроорганизмов на полужидком агаре только по линии укола). Исследуют способность восстанавливать нитраты в нитриты. Для этого производят посев при помощи бактериологической петли в МПБ с нитратом калия. После инкубирования при 28єС 18 ч в пробирки добавляют реактив - дистиллированная вода с крахмалом и йодистым калием и 10% водный раствор хлористоводородной кислоты. В результате происходит темно-синее окрашивание среды, т.к. A. salmonicida способна к нитратредуктазе.

Уколом производится посев в пробирки с тестом на наличие желатиназы. После инкубирования в течение 18 ч при 28єС проводят учет результатов. Бактерии A. sаlmonicida разжижают желатин (среда в засеянной пробирке жидкая, в контрольной пробирке среда загустевает).

Для исследования способности микроорганизмов к ферментации глюкозы в аэробных и анаэробных условиях готовят среду Хью-Лейфсона. После инкубирования 24-48 ч при Т=28єС проводят учет результатов, A. salmonicida способна к ферментации глюкозы как в аэробных, так и в анаэробных условиях (изменение цвета в пробирках с зеленого на желтый как в аэробных условиях, так и в анаэробных условиях).

В результате использования данной схемы при исследовании 97 проб воды из объектов водной среды г. Ульяновска и Ульяновской области нами было выделено 17 штаммов A. salmonicida.

Список литературы

1. Головина, Н.А. Ихтиопатология / Н.А. Головина, Ю.А. Стрелков, В.Н. Воронин, П.П. Головин, Е.Б. Евдокимова, Л.Н. Юхименко. Под ред. Н.А. Головиной, О.Н. Бауера. - М.: Мир, 2003. - 448 с.: ил.

2. Инструкция о мероприятиях по профилактике и мерам борьбы с фурункулезом лососевых рыб от 26.11.1997 №13-4-4/1090. - URL: http://www.cap.ru/home/65/aris/bd/vetzac/document/402.html (дата обращения: 28.03.2017).

Размещено на Allbest.ru