Ксантиноксидаза (КО) участвует в катаболизме пуринов, катализируя превращение гипоксантина в ксантин, а затем в мочевую кислоту. КО присутствуют практически во всех тканях (органах) животного организма. Наивысшей удельной активностью обладают ферменты присутствующие в печени и в молоке животного. Практически вся мочевая кислота в организме образуется именно в печени. Молекулярная масса фермента составляет около 300 кД. Фермент имеет гомодимерную молекулярную структуру. В состав фермента входит кофермент - ФАД, ковалентно связанный с его белковой частью. На каждый мономер приходится одна молекула ФАД. Белковая часть фермента богата цистеином и содержит 60-62 свободные сульфгидрильные (-SH) группы. В структуре КО имеются также железосерные центры, которые представляют собой 2Fe-2S-комплекс [1, С.546]. В состав активного фермента входит молибден, который находится в виде так называемого молибденового кофактора - он связан двумя S-связями с боковой цепью птерина молекулы кофактора [1, С.548], [7, С.532]. Два атома молибдена (Мо) участвуют в переносе электронов в активном центре КО, т.е. активность КО прямо зависит от содержания Мо в молекуле фермента.

В 1980 году, нами было обнаружено, что гомогенная КО молока коровы катализирует восстановление неорганических нитратов и нитритов [2, С.2-3], т.е. ксантиноксидаза восстанавливала нитраты в нитриты (НаР активность). Позднее английские ученые, показали, что конечным продуктом восстановления нитритов (НиР активность) ксантиноксидазой является монооксид азота (NO) [3, С.226]. NO - газ, имеющий безграничный спектр функций в жизнедеятельности млекопитающих. Он участвует во многих физиологических процессах, таких как ингибирование агрегации тромбоцитов, нейротрансмиссия и цитотоксические механизмы иммунной защиты [3, С.225], [4, С.767], [5, С.15]. Установлено, что NO-синтаза (NOS, ЕС 3.14.13.39) участвует в процессе внутриклеточного образования NO в результате ферментативного превращения L-аргинина в L-цитруллин в присутствии O₂ и НАДФН [2, С.1715], [3, С.226], [4, С.770]. Поэтому в настоящее время вызывает особый интерес способность ксантиноксидазы восстанавливать нитраты и нитриты с образованием монооксида азота в организме человека и животных в качестве альтернативы NO-синтазе в анаэробных условиях. Более того, в связи с загрязнением окружающей среды нитратами и нитритами, последние могут попасть в молоко животных посредством питьевой воды. Известно, что нитриты необратимо связываясь с гемоглобином вызывают метгемоглобинемию, а с аминами образуют потенциальные канцерогены - нитрозамины.

В настоящее время ксантиноксидаза в органах лошади недостаточно изучена, а об активностях восстанавливать нитраты и нитриты сведений не найдено. Поэтому, целью настоящей работы была изучение ассоциированных активностей ксантиноксидазы печени (и других внутренних органов) и молока табунных лошадей, основным кормом которых служила трава естественных пастбищ.

Поскольку по понятным причинам одновременное определение активности ксантиноксидазы в молоке и печени одного и того же животного невозможно, активность этого фермента определяли в молоке четырех кобыл 9 - и 10-летних возрастов (по две кобылы) казахской породы типа жабе.100 мл свеженадоенного молока, полученных из различных животных замораживали при - 20^оС. А для определения активности ксантиноксидазы печени проводили поиск нелактирующих кобыл такого же возраста, заранее запланированных для забоя. Образцы печени массой 100 г немедленно замораживали при температуре - 20^оС. Перед определением активности КО образцы печени оттаивали, мелконарезанные куски смешивали в соотношении 1: 10 с холодным 0.1 М натрий-фосфатным буфером (рН 7.5) соответсвенно, содержащим 10 мкМ ЭДТА и 10 мкМ фенилметилсульфонилфторид ("Sigma"). Гомогенат получали тщательным растиранием смеси на фарфоровой ступке. Супернатант получали центрифугированием гомогената печени при 15000 g в течение 20 минут.

Перед термообработкой в молоко добавляли в конечных концентрациях натрий-фосфатный буфер (NaH₂PO₄/Na₂HPO₄), pH 7.5 - 100 мМ, ЭДТА - 10 мкМ, молибдат натрия (Na₂MoO₄) - 2 мМ, цистеин - 2 мМ. А в супернатант печени добавляли такие же концентрации молибдата и цистеина ("Sigma"). Затем молоко и супернатант печени прогревали при температуре 80^оС в течение 5 минут. После охлаждения для определения ферментативных активностей использовали 100 мкл аликвоты молока и супернатанта печени. КО, НаР и НиР активности определяли согласно разработанному методу [2, С.21]. Определение ассоциированных активностей КО молока и печени проводили несколько раз в трех повторностях.

Определение ассоциированных активностей ксантиноксидазы в образцах печени и молока без предварительной обработки показало, что экстракт образцов печени, полученных из кобыл разных возрастов, имел все ассоциированные активности (КО, НаР и НиР) с соответсвующими субстратами без какой-либо предварительной обработки (табл.1). В то же время, в молоке, полученных из кобыл такого же возраста активности ксантиноксидазы не обнаруживаются. Хотя образцы печени и молока были получены не из одного и того же животного, полученные нами результаты позволяют предположить о том, что печень кобыл содержат нормальную активность ксантиноксидазы, а в их молоке ксантиноксидаза неактивна или вообще не синтезируется (табл.1). Во всех 12 образцах молока кобыл, собранных 3 раза в месяц, не были обнаружены ассоциированные активности ксантиноксидазы.

молоко печень кобыла ксантиноксидаза нитратредуктазный

Таблица 1 - Ассоциированные активности ксантиноксидазы в необработанном молоке и в экстракте печени кобылей

Примечание: *КО-активность в наномолях мочевой кислоты/100 мкл/мин; **НаР и НиР активности в наномолях NO₂^-/100 мкл/мин)

Ранее нами было установлено, что после термообработки экстракта зародыша зерна пшеницы при 80^оС в течение 5-7 мин в присутствии 2.0 мМ цистеина и экзогенного молибдата активность ксантиноксидазы повышалась почти в два раза [6, С.1]. Это указывало на содержание в зародыше зерна безмолибденовой популяции молекул этого фермента. Поэтому, мы не исключали существование безмолибденовых форм ксантиноксидазы в молоке кобыл. Первые же эксперименты по термообработке молока кобыл при 80^оС использованием тех же концентрации цистеина и молибдата (оптимальные концентрации) показали, что такая обработка приводит к появлению высокой активности ксантиноксидазы (табл.2).

Таблица 2 - Ассоциированные активности ксантиноксидазы в молоке и в экстракте печени кобылей после термообработки (80^оС) в присутствии цистеина и молибдата