Каннабиноидная регуляция в центральной нервной системе виноградной улитки

2424

Размещено на http://www.allbest.ru/

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ИНСТИТУТ ВЫСШЕЙ НЕРВНОЙ ДЕЯТЕЛЬНОСТИ И

НЕЙРОФИЗИОЛОГИИ РАН

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

03.00.13- физиология человека и животных

КАННАБИНОИДНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ В ЦЕНТРАЛЬНОЙ НЕРВНОЙ СИСТЕМЕ ВИНОГРАДНОЙ УЛИТКИ

Лемак Мария Степановна

Москва 2009

Работа выполнена в лаборатории клеточной нейробиологии обучения (заведующий - доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан) в Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (директор института -- доктор биологических наук, профессор П.М. Балабан).

Научный руководитель:

доктор биологических наук П.М. Балабан

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Е.Е. Воронежская____________________

кандидат биологических наук А.В. Шевелкин ___________________

Ведущее учреждение: __Биологический ф-т МГУ им. М.В. Ломоносова

Защита состоится ____17____декабря_____ 2009 г. в _14___ часов на заседании специализированного ученого совета (Д-003.10.01) при Институте высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН (г. Москва, ул. Бутлерова, 5а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИВНДиНФ РАН.

Автореферат разослан ___________ 2009 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор биологических наук В.В. Раевский

1. Общая характеристика работы

нервный окрашивание улитка каннабиноидный

Актуальность проблемы

В настоящее время механизмы эндоканнабиноидной регуляции синаптической передачи, обнаруженной относительно недавно в центральной нервной системе млекопитающих, подвергаются активному изучению. Сейчас является общепризнанным, что эндоканнабиноидная система играет важную роль в процессах обучения, памяти, пищевом и оборонительном поведении, нейропротекции (Kano, 2009). Открытие каждой новой медиаторной системы поднимает вопрос о ее эволюционном происхождении. Древность происхождения и распространение среди широкого числа таксонов может свидетельствовать о фундаментальной важности и универсальности данного механизма передачи сигнала в нервной системе. Таким образом, необходимо исследовать составляющие эндоканнабиноидной системы и их структурные и функциональные особенности у различных видов не-млекопитающих позвоночных и беспозвоночных животных. Современные генетические исследования показали, что рецепторы, гомологичные каннабиноидным рецепторам (СВ-рецепторам) млекопитающих, найдены у всех классов не-млекопитающих позвоночных и имеют высокую степень сходства с человеческим СВ1-рецептором (Egertova, 2001). Среди беспозвоночных животных элементы эндоканнабиноидной системы описаны у кишечнополостных, иглокожих, двустворчатых моллюсков, плоских и кольчатых червей, но отсутствуют у насекомых и круглых червей (Salzet, 2000; McPartland, 2003; Egertova, 2005). Несмотря на то, что у беспозвоночных найдены эндоканнабиноидные лиганды, ферменты гидролиза каннабиноидов и, в ряде случаев, СВ1-подобные рецепторы, а также показано влияние экзогенных каннабиноидов на пищевое поведение гидры и оборонительное поведение планарий, очень мало известно о нейрофизиологических механизмах действия каннабиноидной системы у беспозвоночных животных. С этой точки зрения актуальным является исследование физиологической роли каннабиноидов в регуляции эффективности нервных связей у брюхоногих моллюсков, которые давно используются в качестве модельных объектов в нейрофизиологии для изучения корреляций между целостным поведением и контролирующими его нервными сетями (Gover & Abrams, 2009; Watanabe et al., 2008; Kandel et al., 1995). Одним из ярких примеров подобного использования является анализ нейронной сети, обеспечивающей рефлекс отдергивания жабры у морского моллюска аплизии (Kandel et al., 1995).

Аналогом отдергивания жабры у аплизии является оборонительная реакция улитки Helix ? втягивание головы и щупалец в раковину в ответ на болевой стимул. Сенситизация этого рефлекса коррелирует с длительной фасилитацией входов от кожного нерва на командные нейроны оборонительного поведения ? гигантские идентифицированные нейроны париетальных и плевральных ганглиев, спайковые разряды в которых способны вызвать генерализованную оборонительную реакцию улитки (Balaban & Bravarenko, 1994; Захаров И.С., 1988, Zakharov et al., 1995). Кроме того, в оборонительной нервной сети улитки идентифицированы механосенсорные нейроны, которые образуют моносинаптические входы на командные нейроны оборонительного поведения, являются глутаматергическими и участвуют в формировании оборонительного поведения улитки (Malyshev, 2002; Bravarenko, 2004), что позволяет детально исследовать регуляцию синаптической передачи в отдельных синаптических контактах, контролируя как пре- так и постсинаптический нейроны.

Таким образом, улитка Нelix является очень удобным объектом для исследования роли каннабиноидной системы в регуляции синаптической передачи у беспозвоночных животных.

Цели и задачи исследования

Целью нашей работы являлось подтверждение существования эндогенной каннабиноидной системы в ЦНС брюхоногих моллюсков и ее структурно-функциональное описание. Для достижения данной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать параметры связывания синтетического агониста СВ1-каннабиноидных рецепторов [³H]CP-55,940 в препарате мембран нервной системы улитки Helix lucorum

2. Методом иммуногистохимии исследовать распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС двух видов улиток рода Helix

3. Определить влияние агониста СВ1-рецепторов анандамида и антагониста АМ251 на эффективность возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

4. При использовании анандамида и АМ251 исследовать участие эндоканнабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности связей нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum

Научная новизна

Впервые описано наличие СВ1-подобных рецепторов в нервной системе брюхоногих моллюсков, показано участие эндогенных каннабиноидов в регуляции кратковременной и долговременной пластичности синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения улитки Helix lucorum. Обнаружена новая форма кратковременной пластичности моносинаптической связи между механосенсорными и гигантскими нейронами оборонительного поведения: кратковременное каннабиноид-зависимое подавление возбуждающей передачи в результате низкочастотной стимуляции сенсорных входов (SSE). Показано, что сезонная активность серотонинергической системы является модулирующим фактором при выработке SSE.

Положения, выносимые на защиту

1. В центральной нервной системе наземной улитки Helix lucorum содержатся белки, гомологичные каннабиноидным рецепторам первого типа млекопитающих.

2. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения, снижая эффективность возбуждающей синаптической передачи.

3. Работа каннабиноидной системы подвержена сезонным изменениям и зависит от активности серотонинергической системы.

Апробация работы

Основные материалы диссертации докладывались на VIII Восточно-Европейской конференции Международного общества нейробиологии беспозвоночных в Казани (2006), на XX конгрессе Физиологического общества имени И.П. Павлова (2007 г., Москва), на 11-м симпозиуме ISIN (2007, Тихань, Венгрия), на конференциях молодых ученых ИВНДиНФ РАН (2006, 2008, Москва).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 1 статья в рецензируемом журнале и тезисы 4 докладов на российских и международных конференциях.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, главы с изложением методов исследования, главы результатов и их предварительного обсуждения, общего обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 111 страницах машинописного текста, иллюстрирована 21 рисунком. Список литературы содержит 127 источников.

Наше исследование было проведено на препаратах изолированной центральной нервной системы взрослых виноградных улиток. Взрослые улитки вида Helix lucorum L. были собраны в Крыму и содержались в дальнейшем в лабораторных условиях. Улитки вида Helix aspersa были выращены из яиц, полученных от лабораторной популяции.

Метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением

Препараты изолированной ЦНС гомогенизировали в холодном (4°С) ТМЭ буфере при помощи гомогенизатора Поттера-Эльвейема с тефлоновым пестиком (10 перемещений при 700 оборотах в минуту). Полученную суспензию центрифугировали при 1000 g при 4°С в течение 10 минут, отделяли супернатант и центрифугировали при 18000 g в течение 25 минут. Осадок ресуспендировали в ТМЭ буфере, разделяли на аликвоты и быстро замораживали. Аликвоты препарата мембран хранили в жидком азоте вплоть до дальнейшего использования. Концентрацию общего белка в пробах определяли методом Лоури (Lowry et al., 1951).

Связывание меченого тритием синтетического агониста каннабиноидных рецепторов 1-го типа (СВ1-рецепторов) [³H]CP-55,940 (5-(1,1-диметилгептил)-2-[5-гидрокси-2-(3-гидроксипропил)циклогексил]фенол[боковая цепь-2,3,4-³H(N)]; получен в PerkinElmer Life Sciences, Boston, USA) проводили в 96-луночных фильтровальных планшетах Millipore (GF/B). Фильтры предварительно смачивали в течение 2-х часов при комнатной температуре в 100 мкл HME буфера. Затем фильтры промывали 200 мкл НМЕ буфера и добавляли в лунки пробы и необходимые реагенты. Связывание проводили в течение 60 минут при температуре 30°С, каждая проба содержала 200 мкл НМЕ буфера, 0.1% раствор бычьего сывороточного альбумина, очищенного от жирных кислот (БСА, Acros Organics, Geel, Belgium), 15 мг мембранного белка и радиолиганд [³H]CP-55,940 в возрастающих концентрациях. Неспецифическое связывание определялось при тех же условиях внесением избытка (2 мкМ) немеченого лиганда [3H]CP-55,940 (Sigma, США). Инкубацию прерывали при помощи системы вакуумной мембранной фильтрации Millipore. После окончания инкубации фильтры промывали три раза в 200 мкл НМЕ буфера, содержащего 0.05% БСА, при рН 7.2 и температуре 4°С. Затем фильтры высушивали, помещали в сцинтилляционные пробирки и на следующий день измеряли уровень радиоактивности. Константа диссоциации K_d и количество рецепторов B_max рассчитывали, исходя из параметров кривой насыщения, при помощи программы SigmaPlot (Jandel Scientific, США).

Иммунохимическое окрашивание ЦНС улитки

Препараты изолированной центральной нервной системы с сохраненными щупальцами фиксировали в течение 2-х часов при температуре 4°С, в качестве фиксатора использовали 4% раствор параформальдегида в 0.1 М фосфатном буфере. Затем препараты несколько раз промывали фосфатным буфером. Для иммунохимического окрашивания мы использовали как препараты целой центральной нервной системы (whole-mounts), так и срезы толщиной 10 мкм. Для приготовления срезов препараты после промывки фосфатным буфером проводили по спиртам до ксилола, затем заливали в парапласт и нарезали.

Для иммунохимического окрашивания мы использовали три вида первичных поликлональных антител кролика (АТ) против СВ1-рецепторов млекопитающих: АТ, выработанные к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, AB-9415); АТ, выработанные к начальному участку (1-150 аминокислотный остаток) N-конца СВ1-рецепторов человека (CB1(H-150), Santa Cruz Biotechnology, Inc.); АТ, выработанные к рекомбинантному пептиду, соответствующему первым 77 аминокислотным остаткам крысиного СВ1-рецептора (Anti-CB1(1-77), Сalbiochem). Для всех трех видов антител на мозге крыс была показана иммунореактивность к нейронам, несущим каннабиноидные рецепторы.

Перед инкубацией в растворе первичных АТ препараты в течение 2 часов отмывали в блокирующем растворе для предотвращениея неспецифического связывания. Затем препараты инкубировали с первичным АТ, разведенным на блокирующем растворе, в течение 48-72 часов при комнатной температуре. Перед добавлением вторичных АТ препараты тщательно отмывали в блокирующем растворе в течение 6 ч., инкубация с вторичными антителами продолжалась 24-36 часов, после чего препараты снова отмывали блокирующим раствором в течение 6 часов. В качестве вторичных антител мы использовали иммуноглобулины, соединенные с флюоресцентными группами (Alexa, Molecular Probes). После отмывки как целые препараты, так и срезы заключали в заливочную среду Aqua-Poly/Mount (Polysciences, Inc) и исследовали при помощи микроскопа AxioPlan (Zeiss, Germany), снабженного устройством для эпифлюоресцентной микроскопии, камерой Camedia C-4000 (Olympus, США) для ввода данных и программой анализа изображений KS-300.

Для проверки специфичности иммунного окрашивания ставили две серии контрольных экспериментов: в первой серии опускалась стадия обработки первичными АТ; во второй использовался раствор первичных АТ, предварительно истощенный взаимодействием с раствором соответствующего антигена.

Вестерн-блот гибридизационный анализ

Белки денатурировали в стандартном буфере додецилсульфата натрия. Затем образцы прогревали до 95°С в течение 5 минут и электрофоретически разделяли в 12% геле SDS-PAGE с использованием системы Mini-PROTEAN (Bio-Rad, Hercules, CA). После проведение электрофореза белок переносили на PVDF-мембраны. Мембраны блокировали в течение 1 часа 5% раствором обезжиренного молока в Трис-буферном растворе с добавлением Tween (ТБР-Т). Затем на каждую полоску наносили равное количество общего белка (40 мг), и мембраны инкубировали в течение ночи при 4°С с поликлональными АТ кролика, выработанными к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, AB-9415). Затем мембраны инкубировали в течение 1 часа с вторичными АТ, выработанными к IgG кролика, коньюгированными с пероксидазой хрена, в 5% растворе обезжиренного молока в ТБР-Т, при комнатной температуре. Связавшиеся антитела проявляли с помощью набора реагентов хемолюминисценции для Вестерн-блот анализа (Western-blot chemiluminescence reagents kit, Life Science Products, Boston, MA), хемолюминисценцию визуализировали на рентгеновской пленке.

Электрофизиологические эксперименты

После анестезии изотоническим раствором MgCl₂ разбивали раковину животного и закрепляли ногу в восковой ванночке. Затем вскрывали гемоцель и извлекали окологлоточное нервное кольцо, обрезая нервы, идущие к периферии. В сериях экспериментов со стимуляцией сенсорных нервов правый и левый 2-е кожные нервы обрезали как можно дальше от ганглиев. Затем окологлоточное кольцо помещали в заполненную раствором Рингера для холоднокровных препаровальную ванночку, после чего пинцетами снимали соединительнотканные оболочки ганглиев. Активность нейронов регистрировали внутриклеточно по стандартной методике стеклянными микроэлектродами, заполненными 2 М раствором КАц. Сопротивление электродов варьировало от 10 до 50 МОм в зависимости от размера регистрируемых нейронов. Мы регистрировали внутриклеточно возбуждающие постсинаптические потенциалы (ВПСП) гигантских нейронов, участвующих в оборонительном поведении улитки, расположенных как в париетальных (левые и правые Па3, Па2), так и в плевральных (левый и правый Пл1) ганглиях. В качестве тестирующей стимуляции мы использовали как электрическое раздражение 2-го кожного нерва, вызывающее суммарные ВПСП во всех трех типах гигантских нейронов, так и стимуляцию тел плевральных механосенсорных (МС) нейронов, вызывающую моносинаптические ВПСП в основном в Пл1 нейронах, и в некоторых опытах удавалось одновременно зарегистрировать моносинаптические ВПСП в Пл1 и Па3 нейронах.

Мы провели несколько серий экспериментов с различными схемами стимуляции:

1. Только тестирующая стимуляция 2-го кожного нерва или МС нейронов, частота 1/2.5 мин.

2. На фоне тестирующей стимуляции 2-го кожного нерва проводили высокочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва (три пачки стимулов частотой 10 Гц, по 100 стимулов в каждой пачке, интервал между пачками 1 мин, амплитуда стимулов та же, что использовалась для тестирующей стимуляции)

3. На фоне тестирующей стимуляции МС нейронов проводили высокочастотную внутриклеточную активацию постсинаптических нейронов (10 пачек стимулов амплитудой 15 нА частотой 16 Гц, в каждой пачке 100 стимулов, интервал между пачками 10 с).

4. Тестирующая стимуляция МС нейронов, частота 1/30 с. На фоне тестирующей стимуляции на постсинаптический нейрон подавали деполяризующую ступеньку тока, вызывавшую спайковый разряд частотой 12-15 Гц, затем продолжали тестирующую стимуляцию.

5. Тестирующая стимуляция МС нейронов, 1/30 с. Через 5-10 мин от начала стимуляции проводили низкочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва (три пачки стимулов частотой 1 Гц, в каждой пачке 10 стимулов длительностью 3 мс, интервал между пачками 20 с, интенсивность стимуляции в 10 раз превышала интенсивность контрольного подпорогового стимула).

Часть экспериментов проводили в летний период на фоне подавления функции серотонинергических нейронов. За 2-7 дней до проведения данной серии улиткам вводили в полость тела нейротоксин 5,7-дигидрокситриптамин (5,7-ДГТ, Sigma) в дозе 20 мг/кг массы тела животного. 5,7-ДГТ растворяли в физиологическом растворе Рингера для холоднокровных с 0.1% аскорбиновой кислотой в качестве антиоксиданта.

Регистрация электрофизиологических потенциалов производилась на IBM PC совместимом компьютере, частота дискретизации от 1 до 5 кГц, АЦП -- DIGIDATA 1320 (Axon Instruments). В каждой точке тестирования измеряли пиковые амплитуды ВПСП при помощи программы "Axoscope". Все величины выражали в процентах, за 100% принимали обычно 3-5 стимул до начала воздействия (например, аппликации веществ или тетанизации, в зависимости от эксперимента). Вычисляли средние ± стандартные ошибки средних. Статистическую достоверность различий между группами данных оценивали методом однофакторного дисперсионного анализа (One-way ANOVA) и с помощью критерия суммы рангов Уилкоксона (Wilcoxon rank-sum test) с использованием программы SigmaStat 3.1 (Systat Software, Inc.).

Результаты и предварительное обсуждение

Раздел 1. Каннабиноидные рецепторы в центральной нервной системе виноградной улитки

1.1 Определение специфичности и параметров связывания синтетического агониста каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки

Чтобы выяснить, содержатся ли каннабиноидные рецепторы в нервной ткани улитки, мы применили метод радиолигандного исследования связывания с полным насыщением (см. методы, эксперименты были проведены совместно с М. Ю. Бобровым и сотр. на базе ИБХ РАН). В качестве лиганда использовался неселективный агонист каннабиноидных рецепторов с радиоактивной меткой [³H]CP-55,940.

Анализ кривой насыщения (рис.1) показал, что происходит специфическое связывание агониста с препаратом мембран нервной ткани виноградной улитки. Константа диссоциации К_d равнялась 8.83 ± 1.2 нМ (среднее ± стандартная ошибка), максимальное количество связанного лиганда, отражающее количество рецепторов в пробе, В_max составило 170 ± 13 фМ/мг белка (среднее ± стандартная ошибка). Полученные данные однозначно подтвердили существование мест специфического связывания каннабиноидов в нервной ткани виноградной улитки. Однако параметры связывания показали низкую аффинность рецепторов улитки к агонисту CP-55,940, а также небольшое количество рецепторов по сравнению с мозгом млекопитающих. Так, например, СВ1 рецепторы мозга крыс, по нашим данным, имели К_d связывания [³H]CP-55,940 равную 0.62 нМ и В_max равное 1400 фМ/мг белка. Эти параметры сопоставимы также с результатами, полученными при исследовании связывания в мозге крыс (WA Devane, 1988), в культуре нейронов крысы (Jung M, 1997) и в мозге полосатого данио (zebrafish, Rodriguez-Martin I, 2007). Плотность СВ-рецепторов и их чувствительность к стандартным лигандам у других беспозвоночных, например, гидры (Di Marso, 1999) также существенно ниже, чем у позвоночных животных. Возможно, что эти данные отражают действительное второстепенное значение эндоканнабиноидной системы для нервной деятельности беспозвоночных, но не исключено, что различия вызваны вариациями в строении и чувствительности к лигандам рецепторных белков различных таксономических групп животных.

1.2 Локализация каннабиноидных рецепторов в центральной нервной системе виноградной улитки

В первой серии экспериментов (эксперименты сделаны совместно с Иерусалимским В.Н., лаб. КНО, ИВНДиНФ) мы провели сравнение иммунореактивности к антителам против СВ1-рецепторов у двух видов виноградной улитки: Helix lucorum и Helix aspersa. Окрашивание проводилось как на срезах (H. lucorum n = 7, H. aspersa n = 8), так и на целых препаратах (H. lucorum n = 11, H. aspersa n = 10) центральной нервной системы улитки. Мы использовали три варианта первичных антител к различным участкам эндоканнабиноидных рецепторов человека и крысы (см. Методы). Иммунная реакция на препаратах обоих видов улитки была получена только для поликлональных АТ кролика, выработанных к синтетическому пептиду третьего цитоплазматического домена СВ1-рецепторов человека (Chemicon, AB-9415). Мы обнаружили специфическое окрашивание нейропиля во всех ганглиях ЦНС Helix lucorum. Наиболее интенсивно нейропиль окрашивался в церебральных, буккальных, плевральных и педальных ганглиях. В некоторых ганглиях мы наблюдали отдельные мелкие (5 - 15 мкм) клетки, иммунореактивные к CB1R-антителам. Общая схема локализации иммунореактивных волокон и клеточных тел в ганглиях Helix lucorum показана на рис.2, А. Одиночные иммунореактивные клетки видны в буккальных и педальных ганглиях. Необходимо отметить, что в педальных ганглиях кроме нейропиля симметрично выкрашиваются по одной клетке в ростромедиальных областях, в которых расположены преимущественно серотонинергические нейроны, участвующие в модуляции оборонительного поведения. В каждом из церебральных ганглиев можно видеть по три группы иммунореактивных клеток, а также иммунореактивные волокна в церебро-плевральной коннективе у входа в церебральный ганглий. В висцеральном и правом париетальном ганглиях также находятся три небольших группы иммунореактивных клеток. В плевральном ганглии в основании церебро-плевральной коннективы окрашивается нейропиль, а также некоторое количество мелких неидентифицированных клеток.

Расположение иммунореактивных к каннабиноидным рецепторам волокон и клеток на препаратах улитки Helix aspersa сходно с препаратами H. lucorum, например, паттерны окрашивания церебральных ганглиев полностью совпадали у обоих видов. Однако, у H. aspersa совершенно не окрашивались буккальные ганглии, отсутствовали иммунореактивные тела клеток в плевральных ганглиях и в ростромедиальной области педальных ганглиев. Интересно, что у взрослых улиток H. aspersa, в отличие от вида H. lucorum, в париетальных ганглиях окрашивались тела неидентифицированных крупных нейронов, соседствующих с гигантскими нейронами оборонительного поведения, и отростки этих нейронов, которые распространялись в плевральные и висцеральные ганглии, а также в анальный, интестинальный и паллиальный нервы.

Насколько известно из литературы, до сих пор не было данных, указывающих на возможность функциональных изменений распределения каннабиноидных рецепторов в мозге. Сейчас общепринятым фактом является, что повышение уровня внутриклеточного Са²⁺ активирует эндоканнабиноидную систему, в частности, инициирует синтез и выделение эндоканнабиноидов (Cadas H, di Tomaso E, 1997).

Мы решили проверить возможность влияния уровня внутриклеточного кальция на распределение каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки. В одной из серий экспериментов иммунохимическое окрашивание части препаратов улиток вида H. lucorum проводилось после аппликации кофеина, неспецифического агониста рианодиновых рецепторов, который легко проникает в клетки и вызывает резкое увеличение концентрации внутриклеточного кальция (Albrecht MA, Colegrove SL, 2002). После воздействия кофеином в концентрации 10^-4 М в плевральном ганглии появлялось некоторое количество иммунореактивных тел клеток, отростки которых в основном оставались в этом же ганглии (рис.2, Б). Тела гигантских нейронов оборонительного поведения в плевральных и париетальных ганглиях оставались неокрашенными, однако, появлялась сеть нейритов, оплетающих тело гигантского интернейрона плеврального ганглия, участвующего в оборонительной реакции в ответ на раздражение головы и щупалец улитки (рис.2, В). Кроме того, в правом париетальном ганглии появлялись две группы неидентифицированных иммунореактивных тел нейронов, дающих отростки в паллидарные нервы. Иммунореактивность отростков и тел нервных клеток вблизи гигантского оборонительного интернейрона плеврального ганглия позволила предположить вовлеченность эндоканнабиноидов в регуляцию функциональной активности синаптических связей, участвующих в реализации оборонительного поведения.

1.3 Проверка специфичности иммуногистохимического окрашивания с помощью вестерн-блот анализа

При проведении вестерн-блот анализа для сравнения были взяты препараты мембран мозга крысы и цитозольная фракция печени крысы. На рис.3 хорошо видно, что на препаратах ЦНС улитки и мозга крысы антителами к CВ1-рецепторам окрашивается единственная полоса белка, молекулярный вес которого около 63-64 kDa, что хорошо совпадает с характеристиками гликозилированной формы СВ-рецептора млекопитающих. В то же время на препарате печени крысы (контроль) не наблюдалось специфического связывания антител к каннабиноидным рецепторам. Таким образом, полученные результаты подтверждают существование в ЦНС виноградной улитки белка, специфически узнаваемого антителами к каннабиноидному рецептору млекопитающих.

Раздел 2. Функциональная роль каннабиноидных рецепторов в ЦНС улитки

2.1 Влияние анандамида, синтетического агониста каннабиноидных рецепторов, на эффективность синаптической передачи

Для проверки гипотезы о функциональной активности CВ-рецепторов в нейронной сети, вовлеченной в оборонительное поведение улитки, мы использовали аппликацию синтетического агониста СВ-рецепторов анандамида в концентрации 10^-5 М, которая вызывала статистически достоверное снижение амплитуды ВПСП относительно контроля: так, до аппликации анандамида средняя амплитуда ВПСП составляла 91.5 ± 3% (n = 7) и соответственно 96.5 ± 3% (n = 6) в контрольных экспериментах, амплитуда через 10 мин после аплликации равнялась 69 ± 7% (n = 7) и соответственно 89.5 ± 5% (n = 6) в контрольных экспериментах (p < 0.05, везде указано среднее ± стандартная ошибка), рис.4 А, Г.

В следующей серии экспериментов мы тестировали влияние анандамида на суммарные ВПСП, вызванные стимуляцией 2-го кожного нерва, в состав которого входят отростки МС нейронов. Частота тестирующей стимуляции также составляла 1 раз в 2.5 мин. В некоторых экспериментах (n = 6 в контроле и n = 5 в опытах с анандамидом) мы регистрировали суммарные ВПСП одновременно в Пл1 и Па3 нейронах. Аппликация анандамида в той же концентрации вызывала достоверное снижение суммарных ВПСП в Пл1 нейроне (рис.4Б, Д). Однако в париетальных нейронах Па3 и Па2 амплитуда суммарных ВПСП не изменялась после аппликации анандамида (рис.4 В).

Таким образом, агонист каннабиноидных рецепторов вызывает небольшое по величине, но достоверное синапс-специфическое снижение амплитуды возбуждающих ВПСП как чисто глутаматергической природы, так и смешанных ВПСП. Полученные результаты согласуются с описанными выше данными о невысокой плотности и чувствительности к стандартным агонистам каннабиноидных рецепторов виноградной улитки. Кроме того, иммуногистохимическое окрашивание показало, что в исследуемой области иммунореактивность к антителам против человеческих СВ1-рецепторов значительно усиливается в активированном кофеином препарате. Возможно, что в оборонительной микросети виноградной улитки эндоканнабиноидная регуляция "включается" только при повышении общей активности сети.

2.2 Влияние анандамида на долговременную фасилитацию глутаматергических входов

Ритмическая стимуляция ипсилатерального кожного нерва обычно приводит к постепенному снижению амплитуды суммарных ВПСП в гигантских интернейронах (Балабан, Захаров, 1992). Однако высокочастотная тетанизация того же нерва вызывала долговременную фасилитацию - значительное (более 200% в отдельных связях) увеличение амплитуды ВПСП, которое сохраняется в течение 1 - 2 часов после тетанизации. Непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП увеличивалась в среднем на 60% (от 90 ± 3% до 153.6 ± 9%, р < 0.001) в Па3 нейронах, и примерно на 110% (от 90 ± 4% до 200 ± 26%, р < 0.001) в Пл1 нейронах, как показано на рис.6 А, белые точки.

В некоторых экспериментах тетанизацию проводили на фоне преинкубации с анандамидом (концентрация 5*10^-6 М). Мы обнаружили, что анандамид вызывает тенденцию к снижению начальной величины фасилитации в Пл1 нейронах и достоверно уменьшает длительность фасилитации в этих нейронах (рис.5 А, черные точки: непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП в среднем увеличивалась на 65% (от 92.5 ± 4% до 169 ± 11.5%), не отличается от контроля, р = 0.34, однако через 30 мин после тетанизации амплитуда ВПСП опускается до начального уровня и ее величина достоверно ниже контрольной, р < 0.01). Интересно, что в данной серии экспериментов преинкубация с анандамидом снижала начальный размер и длительность фасилитации также и в Па3 нейронах (рис.5 Б, черные точки: непосредственно после тетанизации амплитуда ВПСП увеличивалась на 35% (от 84 ± 3% до 120 ± 7%), что достоверно ниже, чем в контроле, р < 0.001, амплитуда ВПСП падала ниже начального уровня уже через 30 мин после тетанизации и была достоверно ниже, чем в контроле, р < 0.05). Таким образом, мы можем заключить, что каннабиноиды могут участвовать в регуляции долговременной пластичности в оборонительной нейрональной сети виноградной улитки. Интересно, что в данном случае длительная фасилитация подавлялась и в париетальных, и в плевральных гигантских нейронах. Известно, что в формировании длительной фасилитации задействованы также серотонинергические нейроны педальных ганглиев (Balaban et al., 2004). Возможно, что в данном случае эффект анандамида реализовывался не напрямую через подавление пресинаптических входов от механосенсорных нейронов, а путем снижения активности серотонинергических нейронов.

2.3 Действие селективного блокатора каннабиноидных рецепторов АМ251 на эффективность синаптической передачи

Ранее было показано, что синтез и выделение эндоканнабиноидов в мозге млекопитающих происходят только в ответ на возрастание нейрональной или синаптической активности (Piomelli, 2003). Для проверки гипотезы о существовании тонической модуляции эндоканнабиноидами синаптической передачи между МС нейронами и Пл1 нейроном мы апплицировали синтетический антагонист СВ1-рецепторов АМ251 в концентрации 2*10^-5 М непосредственно в чашку с препаратом. Мы обнаружили слабое увеличение амплитуды ВПСП, которое не было достоверным и не отличалось от изменений, вызываемых аппликацией растворителя без антагониста в контрольных экспериментах.

Таким образом, мы можем предположить, что при фоновой активности данного синаптического контакта не происходит постоянного выделения эндоканнабиноидов.

В следующей серии экспериментов мы апплицировали АМ251 в той же концентрации спустя 10 мин после предварительной внутриклеточной активации плеврального нейрона Пл1. В качестве активирующего воздействия мы использовали высокочастотную внутриклеточную тетанизацию. Сама по себе такая активация не вызывала заметных изменений в амплитуде ВПСП, однако через 10-15 мин после добавления антагониста CB1-рецепторов амплитуда ВПСП возрастала примерно на 20% относительно контрольного уровня (p < 0.05). Полученные данные свидетельствуют, что при внутриклеточной активации Пл1 нейрона выделяются эндоканнабиноиды, снижающие эффективность глутаматергических моносинаптических контактов между МС и Пл1 нейронами.

Раздел 3. Участие эндогенных каннабиноидов в кратковременной пластичности синаптической передачи

В предыдущих сериях экспериментов мы использовали тестирующую стимуляцию пресинаптического нейрона, подававшуюся с частотой 0.0066 Гц (межстимульный интервал 2.5 мин). При этой частоте наблюдается небольшая скорость привыкания ВПСП в постсинаптическом нейроне, средняя амплитуда ответа на 10 стимул (через 25 мин от начала стимуляции) составляла 66 ± 5%, за 100% принята амплитуда ответа на первый стимул, однако теряется информация о событиях, длящихся менее нескольких минут. Как было показано ранее (Wilson RI, 2001; Ohno-Shosaku T, 2002), эндоканнабиноидная система участвует в кратковременной регуляции как возбуждающей, так и тормозной передачи. Для исследования этих феноменов мы увеличили частоту тестирующей стимуляции в 5 раз (до 0.033 Гц, межстимульный интервал 30 с), но при этом увеличивалалась и скорость привыкания ВПСП в гигантских интернейронах, средняя амплитуда ответа на 10 стимул (через 5 мин от начала стимуляции) составляла 46 ± 11%, за 100% принята амплитуда ответа на первый стимул. Тем не менее, примерно к 7 - 10 стимулу величина ВПСП практически выходила на плато. Для исследования кратковременной пластичности мы подбирали синаптические контакты, в которых амплитуда моносинаптических ВПСП изначально была достаточно большой (3 - 6 мВ), и начинали регистрацию, когда амплитуда ВПСП падала до 1.5 -3 мВ.

3.1 Вызванное деполяризацией подавление возбуждения

Одним из многократно описанных механизмов действия эндоканнабиноидов является так называемое вызванное деполяризацией подавление возбуждения (DSE: depolarization induced suppression of excitation), которое заключается в индукции синтеза эндогенных каннабиноидов в постсинаптической терминали в ответ на кратковременную (1-5 с) деполяризацию постсинаптического нейрона, и затем также кратковременном (порядка нескольких минут) ретроградном подавлении активности возбуждающих, обычно глутаматергических, входов (Kreitzer, 2001; Straiker, 2005; Chiu, 2008; ). В следующей серии экспериментов мы проверили, реализуется ли данный механизм кратковременной пластичности в моносинаптических контактах между нейронами, участвующими в оборонительном поведении улитки. Мы стимулировали с частотой 0.033 Гц механосенсорные нейроны плеврального ганглия, и регистрировали ВПСП в Пл1 нейроне, как описано выше. Через 5-10 мин от начала тестирующей стимуляции между стимулами в постсинаптический нейрон через второй электрод подавали ступеньку тока + 10 нА, длительностью 15 с, которая вызывала деполяризацию Пл1 нейрона на 20-30 мВ и спайковый разряд частотой 12-15 Гц. Затем продолжали регистрацию тестирующих ВПСП. Однако, против ожиданий, такая деполяризация постсинаптического нейрона вызывала незначительное, статистически недостоверное снижение амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне (рис.6 А). Таким образом, мы можем заключить, что в данных синаптических контактах механизм DSE не участвует в регуляции эффективности синаптической передачи.

3.2 Синаптически вызванное подавление возбуждения

Мы обнаружили, что низкочастотная тетанизация 2-го кожного нерва, содержащего в том числе и отростки МС нейронов, вызывает кратковременное, продолжительностью около 2 мин, снижение амплитуды моносинаптических ВПСП в Пл1 нейроне (рис.6 Б, белые точки). В то же время амплитуда моносинаптических ВПСП, вызванных стимуляцией того же самого пресинаптического МС нейрона и зарегистрированных в Па3 нейроне, не изменяется. Для проверки гипотезы об участии СВ-рецепторов в данной форме пластичности, в некоторых экспериментах кожный нерв тетанизировали на фоне преинкубации с блокатором СВ1-рецепторов АМ251 в концентрации 2х10^-5 М. В этом случае низкочастотная тетанизация не вызывала снижения амплитуды ВПСП в Пл1 нейроне (рис.6 Б, черные точки). При снижении концентрации АМ251 в два раза (до 10^-5 М) в существенно меньшей степени блокирует снижение амплитуды ВПСП после низкочастотной тетанизации (рис. 6 Б, серые точки). Полученные данные свидетельствуют об участии эндогенных каннабиноидов в кратковременной синапс-специфической регуляции глутаматергической моносинаптической связи между МС нейронами плеврального ганглия и Пл1 нейроном. Мы можем предположить, что найденный нами феномен является аналогом обнаруженного в мозжечке крыс синаптически вызванного подавления возбуждения (synaptically evoked suppression of excitation, SSE; Beierlein, 2006).

3.3 Сезонная выраженность SSE в моносинаптических связях механосенсорных и гигантского плевральных нейронов

При исследовании SSE мы обнаружили, что за тетанизацией кожного нерва не всегда следует кратковременная депрессия ВПСП, зарегистрированных в Пл1 нейроне. В предыдущих работах в нашей лаборатории было показано, что долговременная пластичность афферентных входов на гигантские нейроны плевральных и париетальных ганглиев может зависеть от сезона (Malyshev, 1998). Мы проверили, не распространяется ли эта зависимость и на кратковременные пластические изменения. Как оказалось, SSE удавалось вызвать только в экспериментах, проведенных в осенне-зимний сезон (рис. 7, белые точки). В весенне-летних экспериментах в среднем амплитуда ВПСП не изменялась в течение первой минуты после тетанизации, а затем появлялась тенденция к возрастанию амплитуды ответов.

Таким образом, наши данные показали, что появление кратковременной каннабиноид-зависимой депрессии моносинаптических входов Пл1 нейрона коррелирует с осенне-зимним периодом. Возможно, такая связь обусловлена взаимодействием между серотонинергической и эндоканнабиноидной системами в ЦНС виноградной улитки.

3.4 Зависимость выраженности SSE в моносинаптических связях механосенсорных и Пл1 нейронов от уровня серотонина

Было показано, что одним из важных модуляторных факторов в нервной системе улитки, участвующих в том числе и в сезонных изменениях, является серотонин (Hiripi et al., 1973; Zakharov et al., 1995; Grinkevich et al., 2000; Solntseva et al., 2008). Кроме того, известно, что модуляторные серотонинергические нейроны как получают афферентные входы через 2-й кожный нерв, тетанизация которого вызывает SSE, так и сами дают отростки в этот нерв. Чтобы проверить возможную связь появления SSE со степенью активации серотонинергической системы, мы провели летнюю серию экспериментов на препаратах с фармакологически поврежденными серотонинсодержащими нейронами. За 2-7 дней до приготовления препарата улиткам вводили нейротоксин 5,7-диокситриптамин (5,7-ДГТ), который отличается от серотонина наличием одной дополнительной гидроксильной группы и вызывает подавление синтеза серотонина, а также обратимую деградацию терминалей серотонинергических нейронов, что ведет к снижению уровня серотонина в нервной системе и подавлению подкрепляющей функции серотонинергической системы улитки (Baumgarten et al., 1987). Мы обнаружили, что через 3-4 дня после введения 5,7-ДГТ в ответ на тетанизацию кожного нерва вырабатывается SSE, параметры которого совпадают с параметрами SSE, наблюдавшимися в осенне-зимний период (рис. 7, серые точки). Через 5-7 дней после введения 5,7-ДГТ, когда предположительно начиналось восстановление поврежденных серотонинергических терминалей (Vehovsky et al., 1988) в ЦНС, уменьшалась величина и длительность депрессия ВПСП, и затем амплитуда ВПСП не только возвращалась к базовому уровню, но и показывала тенденцию к дальнейшей потенциации (рис. 7, черные точки).

Был проведен один дополнительный зимний эксперимент, в котором тетанизацию нерва проводили через 30 мин после аппликации серотонина в концентрации 10^-6 М. В этом случае мы наблюдали кратковременное возрастание амплитуды ВПСП (рис.7, черные треугольники).

Таким образом, при низкой активности серотонинергической системы в ответ на низкочастотную тетанизацию 2-го кожного нерва возникает кратковременная депрессия моносинаптических возбуждающих входов на гигантский плевральный нейрон улитки. Увеличение уровня серотонина в ЦНС снижает этот эффект и даже приводит к появлению кратковременной потенциации.

Выводы

1. В ЦНС брюхоногого моллюска Helix lucorum существуют СВ1-подобные рецепторные белки, специфически связывающие каннабиноидные лиганды. По молекулярному весу эти белки соответствуют гликозилированной форме СВ1-рецептора крысы, и специфически узнаваемые антителами, выработанными против человеческого СВ1-рецептора.

2. Полученное методом иммуногистохимии распределение СВ1-подобных рецепторов в ЦНС сходно у двух близких видов улиток рода Helix и позволяет предположить участие каннабиноидных рецепторов в регуляции пищевого и оборонительного поведения улитки.

3. Впервые показана возможность функциональных изменений распределения СВ1-подобных рецепторов в ЦНС моллюсков.

4. Агонист каннабиноидных рецепторов анандамид вызывает синапс-специфическое снижение эффективности, возбуждающей синаптической передачи в нейронной сети, опосредующей оборонительное поведение виноградной улитки.

5. Аппликация блокатора СВ1-рецепторов АМ251 не вызывает изменений эффективности синаптической передачи между механосенсорными и гигантскими плевральными нейронами, что свидетельствует об отсутствии тонического выделения эндоканнабиноидов в данных синаптических контактах.

6. Эндоканнабиноиды участвуют в регуляции долговременной пластичности связей в нейронной сети оборонительного поведения.

7. Низкочастотная тетанизация кожного нерва вызывает каннабиноид-зависимую, кратковременную, синапс-специфическую депрессию синаптической передачи от механосенсорных нейронов плеврального ганглия к Пл1 нейрону.

8. Выработка каннабиноид-зависимой и синапс-специфической депрессии синаптической передачи в нейронной сети оборонительного поведения виноградной улитки возможна только в осенне-зимний период и зависит от уровня активности серотонинергической системы.

Список публикаций по теме диссертации

1. Lemak M.S., Bravarenko N.I., Bobrov M.Y., Bezuglov V.V., Ierusalimsky V.N., Malyshev A.Y., Storozhuk M.V., Balaban P.M. Cannabinoid regulation in identified synapse of terrestrial snail. Eur J Neurosci. 2007 Dec; 26(11):3207-14.

2. Влияние эндоканнабиноидов на глутаматэргическую синаптическую передачу в ЦНС виноградной улитки Helix lucorum. Лемак М.С., Малышев А.Ю., Балабан П.М., Научная конференция молодых ученых ИВНДиНФ РАН, 2008, Москва

3. Endocannabinoids depress excitation of synaptic transmission in terrestrial snail Helix lucorum in the activity-depended manner. Lemak M.S., Malyshev A.Yu., Balaban P.M.; 11th ISIN Symposium on Invertebrate Neurobiology, 2007 August 25-29, Tihany, Hungary

4. Эндоканнабиноиды снижают эффективность возбуждающей синаптической передачи в ЦНС наземного моллюска Нelix lucorum. Лемак М.С., Малышев А. Ю., Балабан П.М.; XX конгресс Физиологического общества имени И.П. Павлова, 04-08 июня, 2007 г., Москва

5. Endocannabinoids modulate the efficacy of the exitatory monosynaptic connection in the terrestrial snail Helix lucorum. Lemak M.S., Malyshev A.Yu., Balaban P.M.; VIII East European Conference of the International Society of Invertebrate Neurobiology, 2006 September 13-17, Kazan.

Размещено на Allbest.ru