Размещено на http://www.allbest.ru/

[Введите текст]

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ БИОЛОГО-ПОЧВЕННЫЙ ИНСТИТУТ

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ

ОШСКИЙ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ЭНТОМОПАТОГЕННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ НЕПАРНОГО ШЕЛКОПРЯДА (LYMANTRIA DISPAR L.) В ОРЕХОВО-ПЛОДОВЫХ ЛЕСАХ КЫРГЫЗСТАНА

Тешебаева Зулумкан Абдыманаповна

03.02.08 - экология

03.02.04 - зоология

Бишкек - 2012

Работа выполнена на кафедре экологии и охраны окружающей среды Ошского технологического университета и в лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук (г. Новосибирск).

Научные руководители: академик НАН КР, доктор биологических наук, профессор

Токторалиев Биймырза Айтиевич доктор биологических наук, профессор

Глупов Виктор Вячеславович

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Канаев Ашимхан Токтасынович кандидат биологических наук, доцент Заводчикова Раиса Емельяновна

Ведущие (оппонирующие) организации: ТОО «Казахский научно-исследовательский институт защиты и карантина растений»

Республика Казахстан, 483117, Алматинская область, Карасайский район, с. Рахат Лаборатория защиты растений Ботанического сада Уральского отделения РАН Россия, 620134, Екатеринбург, Билимбаевская, 32-А

Защита диссертации состоится «_____»____________2012 г. в____часов на заседании Межведомственного диссертационного совета

Д.03.11.036 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора (кандидата) наук при Биолого-почвенном институте Национальной академии наук Кыргызской Республики (соучредитель: Ошский технологический университет Министерства образования и науки Кыргызской Республики), по адресу: 720071, г. Бишкек, проспект Чуй, 265.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке Национальной академии наук Кыргызской Республики по адресу: 720071, г. Бишкек, проспект Чуй, 265а.

Ученый секретарь Межведомственного диссертационного совета,

к.б.н., с.н.с.С.Л. Приходько

РЕЗЮМЕ

кандидатской диссертации

Тешебаевой Зулумкан Абдыманаповны

на тему: “Энтомопатогенные микроорганизмы непарного шелкопряда (Lymantria dispar L.) в орехово-плодовых лесах Кыргызстана”, представленной на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальностям: 03.02.08 - экология и 03.02.04 - зоология

Ключевые слова: энтомопатогенные микроорганизмы, бактерии Bacillus thuringiensis, вирус ядерного полиэдроза, биопрепараты.

Объект исследования: непарный шелкопряд, лесные насекомые и их патогены, почва орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

Методы исследования: Экологические, биологические, микробиоло-гические, лесозащитные.

Цель исследования: Изучение энтомопатогенных микроорганизмов в популяциях непарного шелкопряда орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

Полученные результаты и новизна: Впервые проведено комплексное исследование по энтомопатогенным микроорганизмам непарного шелкопряда в условиях орехово-плодовых лесов Кыргызстана. Показано распространение и значимость бактерий из группы Bacillus thuringiensis, в структуре спорообразующих бактерий рода Bacillus Сohn в почвах орехово-плодовых лесов Кыргызстана. Выявлено, что они являются типичными представителями почвенной микрофлоры, наряду с такими бациллами как B. cereus, B. subtilis. Пространственная встречаемость их достигала 80% (в черно - коричневых почвах), а временная - 100%.

Отобраны высоковирулентные штаммы бактерий Bacillus thuringiensis (H5ab и H3abc) и вируса ядерного полиэдроза по отношению к гусеницам непарного шелкопряда. Выделено более 100 штаммов бактерий Bt, дана характеристика 9 подвидам Bacillus thuringiensis, из которых 3 подвида Bacillus thuringiensis впервые отмечается автором в условиях орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

Рекомендации по использованию: Определена роль выделенных энтомопатогенов в снижении численности непарного шелкопряда и предложены наиболее перспективные биологические методы борьбы.

Отобранные высоковирулентные штаммы бактерий группы Bacillus thuringiensis (штаммы 10 и 57 (H3abc); 112, 15 (H5ab) и штамм 11 вируса ядерного полиэдроза из семейства Baculoviridae оказались 1,8-2 раза активнее контрольных штаммов из коллекции института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН и рекомендованы для наработки и производства биопрепаратов, предназначенных для защиты орехово-плодовых лесов от вредителей.

КОРУТУНДУСУ

Аныктама с?зд?р?: энтомопатогендик микроорганизмдер, Bacillus thuringiensis бактериялары, ядролук полиэдроза вирусу, биопрепараттар.

Изилд??н?н обьектиси: жубайсыз жибек курт, жубайсыз жибек куртунун патогендери, Кыргызстан м?м?-жемиш жа?гак токойлорунун курт-кумурскалары, жа?гак -жемиш токойлорунун топурагы.

Изилд?? усулдары: Экологиялык, токойду коргоо, биологиялык жана микробиологиялык.

Изилд??н?н максаты: Кыргызстандагы м?м?-жемиш жа?гак токойлорундагы жубайсыз жибек куртунун энтомопатогендик микроорганизмдерин изилд?? жана окуп ?йр?н?? болуп эсептелинет.

Алынган жыйынтыктар жана жанылыктар: Кыргызстандагы м?м?- жемиш жа?гак токойлорунун шартында жубайсыз жибек куртунун энтомопатогендик микроорганизмдери боюнча биринчи жолу комплекст?? изилд??с? ж?рг?з?лд?. Кыргызстандагы м?м?-жемиш жа?гак токойлорунун жер кыртышындагы Bacillus Cohn жаатындагы талаш-тартышты т?зг?н бактериялардын т?з?л?шунд?г? Bacillus thuringiensis тайпасындагы бактериялардын жайылышы к?рс?т?лг?н. Алар кадимки эле B. cereus, B. subtilis бациллалары катарындагы жер кыртышынын ?к?лд?р? экендиги айкындалган. Алардын аймактык кездеш??с? 80 пайызга (кара-к?р?? жер кыртышында), убактылуу 100 пайызга жеткен.

Bacillus thuringiensis (H5ab жана H3abc) бактерияларынын жогорку вируленттик штаммы жана жубайсыз жибек куртуна байланыштуу ядролук полиэдроза вирусу далилденилген. Bacillus thuringiensis дин 9 майда турл?р?н? м?н?зд?м? берилген жана Bt бактериясынын 100д?н ашуун штаммы, анын ичинен Bt нын 3 майда т?р? биринчи жолу автор тарабынан Кыргызстандын м?м?- жемиш жа?гак токойлорунан табылган.

Колдонуу боюнча ке?ештер: жубайсыз жибек куртунун санын азайтууда к?рс?т?лг?н энтомопатогендердин ролу аныкталган жана бул аталган зыянкечке каршы к?р?ш??д? к?б?р??к перспективд?? усулдары сунушталган.

Тандалып алынган Bacillus thuringiensis (H5ab жана H3abc) тайпасындагы бактериялардын жогорку вируленттик штаммы жана ядролук полиэдроза вирусу Россиянын илимдер академиясынын Сибирдеги б?л?м?нд?г? систематика жана жаныбарлардын экологиясы институтунун коллекциясындагы текшер?? штаммынан 1,8-2 эсеге активд??р??к болуп чыкты жана алар м?м?-жемиш жа?гак токойлорундагы зыянкечтерге каршы арналган биопрепараттарды иштеп чыгарууга багытталышы м?мк?н.

RESUME

Key words: entomopathogenic microorganisms, bacterium of Bacillus thuringiensis, nucleopolyhedrosis virus (NPV), biopreparation.

Research object: The walnut-fruit of Kyrgyzstan, insects, Lymantria dispar L. and its patogen and also excretion from soil of fungal pathogen.

Research methods: Microbiological, ecological and forest protection.

Research purpose: The purpose of the research is to study entomopathogenic microorganisms of Gypsy moth population (Lymantria dispar L) in the walnut-fruit forests of Kyrgyzstan. Results and novelty: The first time complex research to be carried out on entomopathogenic microorganisms of Gypsy moth (Lymantria dispar L.) in conditions of the walnut-fruit forests of Kyrgyzstan. Spreading of bacterium Bacillus thuringiensis group, in the structure of cryptogenic forming bacterium Bacillus Cohn genus in the soil of walnut-fruit forests was shown, revealing that they are typical representatives of soil microflora parallel such as B. cereus, B. subtilis. Their occurrence area reached 80% (in black-brown soil) and contemporary is 100%.

A high virulence of strain Bacillus thuringiensis (H5ab and H3 abc) and nucleopolyhedrosis virus concerning to the Gypsy moth larvae were revealed.

Characteristics for 9 subgroups of Bacillus thuringiensis were given and revealed more than 100 bacterium strains Bt, 3 subgroups of which were discovered by the author for the first time in the walnut-fruit forests of Kyrgyzstan.

Application for recommendation: Defined possible role of entomopathogenic in decreasing of the gypsy moth population and offered more prospective biological methods against this pest. Selected high virulence bacterium strains from the group of Bacillus thuringiensis (H3ab and H5abc). nucleopolyhedrosis virus turned out 1,8-2 times more active than the control strain from the Institute of Systematic and Animal Ecology of Siberian Branch of Russian Academy of Sciences collection and will be recommended against the walnut-fruit forests' pests.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Насекомые-фитофаги, дающие ежегодные вспышки массового размножения, являются одной из важнейших экологических проблем в лесозащите. Наиболее опасным видом среди насекомых-фитофагов является непарный шелкопряд, повреждающий около 600 видов растений (В.И.Бенкевич,1984).

Широкомасштабные вспышки непарного шелкопряда ежегодно охватывают огромные массивы орехово-плодовых насаждений Кыргызстана. Наиболее важные последствия вспышек проявляются в виде снижения радиального прироста деревьев, урожайности, частичном или сплошном усыхании массивов, подвергнувшихся дефолиации (К.Е.Романенко, 1984; Б.А. Токторалиев, Н.Б. Байдоолотов, А. Токторалиев и др., 1985; Б.А.Токторалиев, Н.Б. Байдоолотов, К.М. Матикеев и др., 1989; К.С.Ашимов, 1989; А.А.Орозумбеков, 2001; А.А.Орозумбеков, В.И.Пономарев, Б.А.Токторалиев, 2002; В.И. Пономарев, А.А. Орозумбеков, Е.М.Андреева и др. 2008).

Основным средством борьбы с непарным шелкопрядом в Кыргызстане остаются химические методы, а также механический сбор яйцекладок. Не обладая избирательностью действия, химические инсектициды вызывают гибель нецелевых, зачастую полезных для экосистемы организмов (энтомофагов, опылителей и др.), особенно, в наших горных лесах, которые относятся к первой категории.

В этой связи возникает острая необходимость в изыскании и получении перспективных штаммов энтомопатогенных бактерий, вирусов и грибов с высокой инсектицидной активностью и в создании на их основе отечественных биологических препаратов, предназначенных против вредителей леса.

Патогены непарного шелкопряда в Кыргызстане практически не изучены, имеющиеся о них сведения носят эпизодический характер. Поэтому определение возможности и путей использования естественных врагов и препаратов на основе микроорганизмов против непарного шелкопряда в системе мероприятий по защите орехово-плодовых лесов приобретает особое значение и актуальность.

Связь темы диссертации с научными программами. Диссертационная работа является одним из направлений научной программы исследований по изучению вредителей и болезней орехово-плодовых лесов Южного Кыргызстана, проводимого сотрудниками кафедры экологии и охраны окружающей среды Ошского технологического университета в рамках проектов по линии Департамента науки, инноваций и научно-технической информации Министерства образования и науки Кыргызской Республики.

Цель исследования. Изучение энтомопатогенных микроорганизмов в популяциях непарного шелкопряда орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

Задачи исследования:

1. Изучить распространение энтомопатогенных микроорганизмов (вирусов, бактерий, грибов) в орехово-плодовых лесах Кыргызстана;

2. Выделить энтомоцидные штаммы бактерий Bacillus thuringiensis, вируса ядерного полиэдроза и энтомопатогенных грибов, а также характеристика высокоактивных штаммов по отношению к непарному шелкопряду;

3. Оценить возможность использования энтомопатогенных микроорга-низмов для контроля численности непарного шелкопряда.

Научная новизна работы. Данная работа является первым комплексным исследованием по энтомопатогенным микроорганизмам непарного шелкопряда в условиях орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

В условиях юга Кыргызстана естественными регуляторами численности непарного шелкопряда являются вирус ядерного полиэдроза (49%) и бактерии группы Bacillus thuringiensis (31,2%). Энтомопатогенные грибы как Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. и Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown et G.Smith имеют существенно меньшее распространение и поражают насекомых преимущественно во влажных стациях вблизи речек (13%).

Впервые изучено распространение и значимость бактерий из группы Bacillus thuringiensis в структуре спорообразующих бактерий рода Bacillus Сohn в почвах орехово-плодовых лесов юга Кыргызстана. Выявлено, что они являются типичными представителями почвенной микрофлоры, наряду с такими бациллами как B.cereus Frank.-Frank., B. subtilis Cohn, B.megaterium De Bary и B.idosus Burch. Пространственная встречаемость их достигала 80% (в черно-коричневых почвах), а временная 100%. Из этих почв изолировано девять серологических вариантов Bacillus thuringiensis: H1, H2, H3abc, H4ab, H5ab, H8ab, H14, H17, H31. Выделены более 100 штаммов бактерий B. thuringiensis, дана характеристика 9 подвидам Bt, из них 3 подвида Bt: H14, H17, H31 обнаружены впервые автором в лесах Кыргызстана. Отобраны новые отечественные высоковирулентные штаммы бактерий Bacillus thuringiensis (H5ab и H3abc) и вируса ядерного полиэдроза, по отношению к гусеницам непарного шелкопряда.

Практическая значимость полученных результатов. Определена роль выделенных энтомопатогенов в снижении численности непарного шелкопряда и предложены наиболее перспективные биологические методы. Отобраны высокоэффекивные штаммы бактерий Bacillus thuringiensis: штаммы 10 и 57 (H3abc); 112, 15 (H5ab) и штамм 11 вируса ядерного полиэдроза -перспективных для создания на их основе биопрепаратов для контроля численности непарного шелкопряда, биологическая эффективность которых 1,8-2 раза выше контрольных штаммов из коллекции Института систематики и экологии животных Сибирского отделения Российской академии наук. Штаммы внедрены в практику лесозащитных мероприятий по надзору и биологической борьбе с непарным шелкопрядом в поясе орехово-плодовых лесов лесорастительных зон Жалал-Абадской области (акт прилагается).

Показана перспективность и эффективность использования выделенных энтомопатогенов в борьбе с непарным шелкопрядом, что позволит снизить пестицидную нагрузку на биогеоценоз, что особенно важно в горных орехово-плодовых лесах Кыргызстана.

Полученные материалы исследований используются при чтении курсов «Лесная экология и технология защиты леса», «Общая экология» на кафедре экологии и охраны окружающей среды в Ошском технологическом университете и «защита леса», «лесная энтомология» «агроэкология» в Кыргызском национальном аграрном университете им. К.И. Скрябина.

Экономическая значимость полученных результатов. Отобранные высоковирулентные штаммы бактерий группы Bacillus thuringiensis (H5ab и H3abc) и вируса ядерного полиэдроза из семейства Baculoviridae, могут быть использованы для наработки и производства биопрепаратов, предназначенных для защиты орехово-плодовых лесов от вредителей.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

1. Распространение энтомопатогенных микроорганизмов в лесных биоценозах орехово-плодовых лесов Кыргызстана.

2. Болезни непарного шелкопряда и их роль в естественной регуляции численности вредителя.

3. Оценка эффективности отобранных энтомопатогенных микроорганизмов против гусениц непарного шелкопряда и разработка на их основе биопрепаратов для лесозащитных мероприятий.

Личный вклад соискателя. Исследования по экологии и распространению энтомопатогенных микроорганизмов непарного шелкопряда, лесных насекомых и почв орехово-плодовых лесов Южного Кыргызстана проведены соискателем лично.

Апробация результатов диссертации. Основные результаты исследований доложены и обсуждены на Международных конференциях: «Биологическая защита растений и пути ее рационального использования» (Ташкент, 2008), «Актуальные проблемы инженерной техники и современных технологий» (ОшТУ,2008); Республиканской научной конференции «Актуальные проблемы сохранения биоразнообразия Кыргызстана» (ОшГУ, 2009); на межлабораторном семинаре Института систематики и экологии животных Сибирского отделения РАН (Новосибирск, 2009); на расширенном совместном заседании кафедры экологии и охраны окружающей среды и кафедры биологии и биотехнологии Ошского технологического университета (Ош, 2009).

Полнота изложения результатов диссертации в публикациях. По материалам диссертации опубликовано 14 научных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 3-х глав, выводов, практических предложений и списка использованных источников из 226 наименований, в том числе 84 на иностранном языке. Диссертационная работа выполнена в компьютерном исполнении и включает 174 страниц, включая список литературы, имеет 27 таблиц и 22 рисунка.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность академику НАН КР, д.б.н., проф. Токторалиеву Б.А. и д.б.н., профессору Глупову В.В. за руководство научной работой, в.н.с. лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных СО РАН (г. Новосибирск), к.б.н. Ходыреву В.П. за всестороннюю помощь в проведении исследований и консультации на всех этапах выполнения данной работы.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Глава 1. Состояние изученности вопроса. Приводится анализ данных литературы, посвященных изученности вопроса экологии, биологии, распространению и патогенам непарного шелкопряда. Проанализированы работы по бактериальным, вирусным, грибным болезням насекомых, в том числе по болезням непарного шелкопряда и перспективы использования биопрепаратов для контроля численности вредителей леса. Приводится характеристика лесорастительных и почвенно-климатических условий орехово-плодовых лесов.

Исследования проводились в орехово-плодовых лесах в Южной части Кыргызстана на западных и юго-западных склонах Ферганского и Чаткальского хребтов Юго-Западного Тянь-Шаня в лесхозах орехово-плодовых лесов Тоскоол-Ата, Урумбаш, Кара-Алма, Гава, Арстанбап-Ата и в Сары-Челекском государственном биосферном заповеднике, а лабораторные исследования проводились на базе лаборатории патологии насекомых Института систематики и экологии животных СО РАН (г. Новосибирск, Россия) и в лаборатории биогеоценологии кафедры «Экологии и охраны окружающей среды» Ошского технологического университета.

Глава 2. Материал и методы исследования. Рассматриваются вопросы экологии, зоологии, микробиологии, в частности методика полевых исследований почвы орехово-плодовых лесов, естественно погибших и больных насекомых в природе, а также обнаруженные энтомопатогены. Сбор естественно погибших насекомых и почвенных образцов проводили в течение 2005-2008 гг. в середине лета (июне-июле) в очагах массового размножения непарного шелкопряда.

Было проанализировано 600 трупов гусениц непарного шелкопряда, 150 трупов лесных насекомых разных отрядов, 450 почвенных образцов.

Диагностику вирусной, бактериальной, грибной и других инфекций у насекомых проводили по внешним признакам и микроскопическому исследованию внутренних органов и тканей с помощью световой и электронной микроскопии общепринятыми стандартными методами. Микробиологический анализ почвенных образцов проводили в пределах основных трех типов почв орехово-плодовых лесов: горные сероземы, горно-лесные коричневые и горно-лесные черно-коричневые. Значимость вида (оценка его типичности и положение в структуре доминирования) относительно других спорообразующих бактерий и грибов оценивали по критерию частоты его встречаемости, на основе схемы (Т.Г. Мирчинг, С.М. Озерская, О.Е. Марфинина, 1982), для почвенных микроорганизмов. Пространственную частоту встречаемости получали отношением числа образцов, в которых вид обнаружен, к общему числу проанализированных образцов (H.D.Tresner, M.P.Bacus, I.T.Curtis, 1954; Т.Г. Мирчинг, 1984).

Проведен отбор почвенных образцов и микробиологический анализ иловых отложений у берегов озера Сары-Челек и мелких водоемов Арстанбап-Атинского лесхоза. Культурально-морфологические свойства бактерий изучали на плотных питательных средах различного состава, выращивая их до полной споруляции в течение 6 суток при 28⁰ С. Способность штаммов Bt продуцировать параспоровые включения, форму и размер кристаллов оценивали с помощью светового микроскопа в фиксированных, окрашенных карболовым эозином препаратах.

Видовой состав спорообразующих бактерий определяли по определителям бактерий (Н.А.Красильников, 1949; Д.Хоулт, 1980). Внутривидовую идентификацию Bt проводили по схеме де Баржак и Фрахон (H. De Barjac, E. Frachon, 1990). Для постановки серологической реакции использовали иммунные сыворотки 1-34 H- антигенов, находящиеся в Институте систематики и экологии животных СО РАН. Видовую принадлежность грибов устанавливали по микроскопическим признакам (А.А.Евлахова, 1974; Э.З. Коваль, 1974; R.A.Humber ,1997; Г.Р. Леднев, Б.А. Борисов, Г.В. Митина, 2003).

Биологическую активность исследуемых культур определяли по стандартным методикам. Биотестирование выделенных штаммов проводили на гусеницах: непарном шелкопряде (Lymantria dispar L.) и большой вощинной моли (Galleria melonella L.). Полученные данные в опытах обрабатывались методом статистики и дисперсионного анализа (Б.А.Доспехов,1985).

Глава 3. Результаты собственных исследований и их обсуждение. Экологическая и лесопатологическая обстановка в орехово-плодовых лесах Кыргызстана. Приводится экологическая обстановка в орехово-плодовых лесах Кыргызстана и лесопатологическое состояние.

В настоящее время одной из основных причин экологического неблагополучного состояния и проблем лесозащиты в орехово-плодовых лесах Кыргызстана является перманентная вспышка непарного шелкопряда. Очаги заражения непарным шелкопрядом в орехово-плодовых лесах ежегодно составляют более 20 тыс. га.

Основными кормовыми растениями и вспышки численности непарного шелкопряда в этих лесах являются: яблоня Киргизов (Malus kirghisorum Theodet. Fed.), яблоня Недзевецкого (Malus niedzweckiana Dick), фисташка настоящая (Pistacia vera L.), орех грецкий (Juglans regia L.), миндаль обыкновенный (Amygdalus communis L.), слива домашняя (Prunus domestica L.), слива растопыренная (Prunus divaricata L.), боярышник туркестанский (Crataegus turkestanica A.Pojark), клен туркестанский (Acer turkestanicum Pach.), тополь белый (Populus alba L). Эти растения наиболее значительно подвергаются дефолиации в результате вспышек численности вредителя. Так, с 2005 по 2008 гг. в исследованных лесхозах уровень дефолиации кормовых растений изменялся от 70% до 100%, а наибольшая плотность гусениц старших возрастов шелкопряда достигала 900 особей на одно дерево. В обследуемых насаждениях в период проведения исследований дефолиация насаждений составила в среднем 70%. Большей частью очаги шелкопряда действовали в лесах, расположенных на высоте от 800 до 1800 м над уровнем моря на склонах юго-восточных, юго-западных, южных и западных ориентаций в насаждениях лесхозов: Тоскоол-Ата, Урумбаш, Кара-Алма, Арстанбап-Ата и Гава. Распространение непарного шелкопряда включало как склоны крутизной 11-35⁰ и более, так и равнинные участки. Выявлено, что крутизна склонов не влияет на образование очагов непарного шелкопряда, и они распространены во всех вертикальных поясах.

Приведенные данные подтверждают исследования Б.А.Токторалиева (1996) о том, что в орехово-плодовых лесах Кыргызстана имеется большое число неблагоприятных экологических факторов, воздействующих на состояние лесных ценозов. В большинстве случаев действует не один, а комплекс факторов. Общей причиной ослабления орехово-плодовых лесов, безусловно, является и несовершенство ведения лесного хозяйства и в частности лесозащитных мероприятий против вредителей, трудности их осуществления в горных условиях. Все это способствует тому, что листогрызущие вредители имеют большие возможности для расселения и размножения в орехово-плодовых лесах.

Распространение энтомопатогенных микроорганизмов в орехово-плодовых лесах Кыргызстана. Приведены основные результаты исследований по экологии распространения энтомопатогенных микроорганизмов в лесах Кыргызстана.

В период наблюдений ежегодно в июне-августе отмечали заболевание и смертность гусениц и куколок непарного шелкопряда различной этиологии. Количество погибших гусениц варьировало от 10 до 30% от общей численности. Смертность гусениц наступала у старших возрастов (IV-VI). В результате индивидуального микробиологического анализа 600 трупов непарного шелкопряда установлено, что естественная смертность насекомых была вызвана бактериальными, вирусными, грибными и смешанными инфекциями (табл.3.2.1).

Таблица 3.2.1- Этиология погибших гусениц непарного шелкопряда в орехово-плодовых лесах Кыргызстана

Лесхозы	Изучено, экз.	Количество гусениц погибших от инфекций, экз.(%)
		вирусной	бактериальной	микозной	смешанной
2005 г.
Тоскоол-Ата	70	31 (44,3)	26 (37,1)	8 (11,4)	5 (7%)
Кара-Алма	120	40 (33,3)	61 (50,8)	13 (10,9)	6 (5%)
2006 г.
Урумбаш	150	90 (60,0)	34 (22,6)	22 (14,7)	4 (2,6%)
Гава	50	31 (62,0)	14 (28)	5 (10,0)	-
Кара-Алма	50	22 (44,0)	10 (20)	11 (22,0)	7 (14%)
2007г.
Урумбаш	35	17 (48,6)	8 (22,8)	5 (14,3)	5 (14,3%)
Кара-Алма	60	28 (46,7)	16 (26,7)	9 (15,0)	7 ( 12%)
Арстанбап-Ата	65	35 (53,8)	18 (27,8)	6 (9,2)	6 (9%)
Итого в %	600	294 (49%)	187 (31,2%)	79 (13,2%)	40 (6,6%)

На основании проведенных исследований установлено, что наибольшее количество зараженных особей погибало от кристаллообразующих бактерий Bacillus thuringiensis (Bt) (31,2%) и вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) (49%). Энтомопатогенные грибы как Beauveria bassiana (Bals.-Criv.) Vuill. и Paecilomyces fumosoroseus (Wize) Brown et G.Smith имеют существенно меньшее распространение и поражают насекомых преимущественно во влажных стациях вблизи речек (13%). Отмечены также смешанные болезни, вызываемые одновременно двумя или несколькими возбудителями: бактериоз с вирозом, микоз с бактериозом и т.д. Процент таких особей составлял 6,6 %. В основном насекомые, погибшие от смешанных инфекций, были поражены ВЯП и кристаллобразующими бактериями Bt.

Встречаемость Bt в трупах непарного шелкопряда. Доля смертности от бактерий составляла за три года наблюдений 31,2%. В то же время возможна и большая доля смертности (более 50%), что отмечено в 2005 г. в Кара-Алминском лесхозе. Идентификация кристаллообразующих бактерий показала, что септицемию непарного шелкопряда вызывали преимущественно два подвида Bacillus thuringiensis (табл.3.2.2.1).

Это подвид galleriae (H5ab), который ежегодно вызывал заболевания гусениц непарного шелкопряда, в пределах от 50,0 до 73,0 %, и подвид kurstaki (3abc), - от 25,0 до 35,3%. В лесхозах Урубмаш и Арстанбап-Ата септицемия гусениц на 14,7-25,0 % была вызвана подвидом toguchini (H31).

Важно отметить, что в рассевах встречались также единичные колонии подвидов thuiringiensis (H1), finitimus (H2), sotto (H4ab), morrisoni (H8), israelensis (H14), tohokuensis (H17) и toguchini (H31). Из рода Bacillus в трупах непарного шелкопряда широко встречается В. cereus Frank.-Frank., В. subtilus Cohn., B. sphaericus Meyer and Neide, реже B. mycoides Flug., B. megaterium De Bary (табл.3.2.2.1).

Таблица 3.2.2.1- Смертность гусениц непарного шелкопряда в природе от сероваров Bacillus thuringiensis

Лесхозы	Год	*	Серовары, количество в %
			H5ab	H3abc	H31	единичные изоляты
Тоскоол-Ата	2005	26	73,0	27,0	-	H17, H31
Кара-Алма		61	70,5	29,5	-	H4ab, Н8, Н31
Урумбаш	2006	34	50,0	35,3	14,7	H1, H4ab,
Гава		14	71,4	28,6	-	H1, H17
Кара-Алма		10	70,0	30,0	-	H14, Н31
Урумбаш	2007	8	50,0	25,0	25,0	H4ab, H8
Кара-Алма		16	68,7	31,3		Н14
Арстанбап-Ата		18	55,6	27,8	16,6	H14, H2

Прим. * - количество гусениц, погибших от B.thuringiensis

Таким образом, при бактериальной эпизоотии непарного шелкопряда в условиях орехово-плодовых лесов нами выделены несколько подвидов Bacillus thuringiensis, причем септицемию вызывали бактерии H5ab, Н3abc, Н31.

Распространение вируса ядерного полиэдроза (ВЯП) в природных популяциях непарного шелкопряда юга Кыргызстана. Микроскопические исследования гомогенатов тела погибших и больных особей непарного шелкопряда показали, что во всех очагах среди больных и погибших насекомых выявлено значительное количество особей (49-63%), в теле которых присутствуют полиэдры ВЯП. Заболевание ядерным полиэдрозом в популяциях непарного шелкопряда часто обусловлено активацией скрытой вирусной инфекцией. Система насекомое-вирус, находится в равновесии до субоптимальных или экстремальных факторов, с их появлением снижается и резистентность насекомого (С.А.Бахвалов, А.В. Ильиных, З.А. Тешебаева, 2007). Можно предположить, что одним из стрессовых факторов, влияющим на активацию вируса в горных орехово-плодовых лесах оказалась высокая степень дефолиации кормовых растений.

Большое количество погибших от вирусной инфекции насекомых свидетельствует, что вирус ядерного полиэдроза оказывает важное влияние на динамику численности непарного шелкопряда, являясь одним из решающих факторов деградации очагов массового размножения.

Распространение энтомопатогенных грибов в популяциях лесных насекомых и в почвах орехово-плодовых лесов Кыргызстана. Анализ культур, выделенных из собранных образцов показал, что они относятся в основном к гифомицетам. В частности были выделены изоляты представителей родов: Beauveria, Paecilomyces, Isarэa, Alternaria, Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Helminthosporium, Macrosporium, Trichoderma (Deuteromycota: Hyphomycetales).

Погибшие от микоза насекомые относились к отрядам Lepidoptera и Coleoptera. Найденные единичные трупы Сосcinella septempunctata были поражены Beauveria bassiana (Bals.) Vuill и Paecilomyces fumosoroseus(Wize) Brown et G. Smith, а также многочисленные трупы листоеда Agelastica alni Baly (имаго, более 300 шт.) были поражены грибом B. bassiana, а единичные экземпляры этого же вида насекомых поражались Tolyipocladium sp. и Penicillium sp.

Анализ структуры видового состава выделенных грибов показал, что в микобиоте трупов вредителей насекомых из известных энтомопатогенных грибов доминируют B. bassiana, Paecilomyces fumosoroseus, Paecilomyces sp., Tolyipocladium sp. и Isaria farinose (Holmsk.) Fr. Смертность насекомых от энтомопатогенных грибов наблюдалось в основном на энзоотическом уровне. В частности, в микофлоре трупов непарного шелкопряда виды энтомопатогенных грибов составили - 29%, а сапрофитных - 71%.

Грибные инфекции в популяции непарного шелкопряда за три года составили в среднем - 13,2%. Максимальный показатель смертности от микозов (22%) отмечен в 2006 г. в Урумбашском лесхозе.

Проведенные исследования показали, что в условиях орехово-плодовых лесов непарный шелкопряд из энтомопатогенных грибов чаще поражался грибами B. bassiana, реже Paecilomyces sp. и I.farinosa . Из сапрофитных грибов в микофлоре трупов встречались грибы из родов Alternaria, Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Macrosporium.

Видовой состав грибов горных черно-коричневых почв наиболее разнообразен, чем горно-лесных и темных сероземных. Было установлено, что микроскопические грибы родов Aspergillus, Alternaria, Fusarium, Penicillium, Macrosporium доминировали во всех типах почв. По пространственной встречаемости они относятся к типичным частным, так как встречаемость этих грибов превышала 30% изученных образцов. Значительно реже выделялись из почв Beauveria bassiana, Paecilomyces sp., Tolyipocladium sp., Cephalosporium sp., Verticillium sp., Trichoderma lignorum, Helmendhosporum sp., которые при ежегодном выделении отмечались как типичные редкие.

Таким образом, доминировали из сапрофитных грибов как в микофлоре погибших насекомых, так и в почвах представители из родов Aspergillus, Alternaria, Penicillium.

Распространение бактерий рода Bacillus Сohn в лесных насекомых орехово-плодовых лесов юга Кыргызстана. Как показали исследования, Bacillus thuringiensis встречается не только в организме непарного шелкопряда, но и других видах лесных насекомых орехово-плодовых лесов.

Большинство погибших насекомых относилось к отряду Coleoptera, реже встречались Orthoptеra, Odonata. Из погибших жуков и имаго прямокрылых выделены кристаллообразующие и спорообразующие бактерии. Из жуков Сopris minutes L. выделяли B. ssp. kurstaki, из Cetonia aurata L. - B. toguchini, из колорадского жука-штаммы B.morisoni var.tenetbrionis, а из ряда видов жесткокрылых насекомых в массе выделялись B.pumilus и B. cereus. Из личинок прямокрылых выделялся подвид Bt.ssp.tohokuensis, B.subtillus, B. cereus.

Кроме основной патогенной микрофлоры многие виды жесткокрылых насекомых были носителями подвидов кристаллообразующих бактерий. Единичные находки подвидов galleriae (H5), tohokuensis (H17), kurstaki (H3abc), toguchini (H31) отмечены у жесткокрылых насекомых, смертность насекомых от кристаллообразующих бактерий наблюдалось на энзоотическом уровне.

Насекомые различных систематических групп являются бациллоносителями Bt, В. cereus и других бактерий. Кроме B.thuringiensis септицемию у насекомых вызывали так называемые потенциальные патогены родов Bacillus. Весьма актуальным является отбор культур с наибольшей биологической активностью для контроля численности фитофагов.

Распространение Bacillus thuringiensis в структуре сообщества спорообразующих бактерий рода Bacillus Сohn в почвах орехово-плодовых лесов юга Кыргызстана. В табл. 3.4.1 представлены результаты пространственной и временной частоты встречаемости спорообразующих бактерий в течение 2005-2007 гг. в зависимости от типов почв.

Таблица 3.4.1- Структура сообщества спорообразующих бактерий в почвах орехово-плодовых лесов Кыргызстана

Тип почвы	Пространственная частота встречаемости (%) по годам
	Вид бактерий	2005	*	2006	*	2007	*
Горные темные сероземы	B.cereus	48.6	ТЧ	35,7	ТЧ	33,5	ТЧ
	B.idosus	12,4	ТР	39.3	ТЧ	28,0	ТР
	B.pumilus	26,7	ТР	16,6	ТР	14,5	ТР
	B.megaterium	47,6	ТЧ	44,7	ТЧ	32.1	ТЧ
	B.mycoides	9,0	ТР	32,0	ТЧ	15,8	ТР
	B.subtilis	64,5	ТД	76,3	ТД	68,6	ТД
	B.thuringiensis	35,5	ТЧ	40,0	ТЧ	32,6	ТЧ
Горные лесные коричневые	B.cereus	46,5	ТЧ	42,6	ТЧ	64,3	ТД
	B.idosus	21,7	ТР	16,3	ТР	37,4	ТЧ
	B.megaterium	24,2	ТР	20,6	ТР	28,3	ТР
	B.subtilis	32,0	ТЧ	39,4	ТЧ	42,7	ТЧ
	B.thuringiensis	37,5	ТЧ	43,5	ТЧ	34,7	ТЧ
Горные лесные черно- коричневые	B.cereus	39,5	ТЧ	34,8	ТЧ	14,8	ТР
	B.сirculans	14,5	ТР	23,0	ТР	36,8	ТЧ
	B.idosus	64,5	ТД	77,6	ТД	63,7	ТД
	B.laterosporus	35,8	ТЧ	27,3	ТР	36,6	ТЧ
	B.megaterium	85,8	ТД	76,7	ТД	80,5	ТД
	B.mycoides	37,9	ТЧ	27,4	ТР	32,1	ТЧ
	B.pumilus	30,2	ТЧ	32,3	ТЧ	34,7	ТЧ
	B.subtilis	73,7	ТД	6,95	ТД	63,7	ТД
	B.thuringiensis	80,0	ТД	64,8	ТД	75,6	ТД

Прим. * - значимость вида по результатам анализа 450 почвенных образцов; ТЧ - типичный частный вид; ТД - типичный доминирующий вид; ТР - типичный редкий вид.

Для горных темных сероземов B. subtilis Cohn. является типичным доминирующим, частота пространственной встречаемости в течение трех лет варьировала от 64,5% до 76,3%. По пространственной встречаемости B. cereus Frank.-Frank., B. megaterium De Bary и B. thuringiensis относятся к типичным частным, так как встречаемость этих бактерий превышала 30% изученных образцов. В этом типе почв B. pumilus Meyer and Gott., B. mycoides Flug. и B. idosus Burch. при ежегодном выделении отмечались как типичные частные или типичные редкие.

В горных лесных коричневых почвах типичными доминантами являются B. cereus, B. subtilis. Кристаллообразующие бактерии группы B. thuringiensis, как и в серых почвах, отнесены к типичным частным. Бактерии B. idosus представлены, как типичный частный вид. В изученных образцах не выделялись B. mycoides, B. pumilus.

Для горных лесных черно-коричневых почв типичными доминирующими являются B. subtilis, B. idosus, B. megaterium, B. thuringiensis. Пространственная встречаемость этих бактерий превышала 60% от изучаемых образцов почвы.

Частота встречаемости кристаллобразующих бактерий у них была самая высокая (64.0-80,0%) по сравнению с серой и лесной коричневой. В то же время пространственная встречаемость B. cereus отмечалась как типичный частный вид, так и типичный редкий вид. Бациллы B. mycoides, B. pumilus и B. circulans Jordan встречались преимущественно как типичные частные, а B. laterosporus Laubach - как типичный редкий вид.

Все виды бацилл, представленные в таб.3.4.1 изолируются из горных почв ежегодно, то есть временная (годовая) встречаемость составляла 100%.

Численность спорообразующих бактерий для черно - коричневых почв была в среднем 6 х 10⁴, лесных коричневых 1,8 х 10⁴ и в сероземах 2,5 х 10⁴ КОЕ на 1 г почвы.

Таким образом, исходя из пространственной и временной встречаемости, в структуре спорообразующих бактерий горных лесных типов почв значимость видов не одинаковая. В структуре наиболее типичных бацилл как B. cereus, B. subtilis, B. megaterium, B. idosus и других кристаллообразующие бактерии B.thuringiensis представлены также как типичные. Несмотря на широкое распространение B. thuringiensis в изучаемых почвах их обилие невелико и достигало 0,5 % для темных сероземов и коричневых почв и 1% от численности почвенных бацилл.

Из горных темных сероземов было изолировано - 8, из лесных коричневых - 7 и черно-коричневых - 9 подвидов B. thuringiensis. Во всех типах почв наиболее распространенными и обильными оказались три серологических варианта: H14, H17 и H31.

Из образцов почв, взятых по берегам водоемов, идентифицировано три вида спорообразующих бактерий: B. cereus, B. subtilis и B. idosus с вариацией численности соответственно от 4,8 до 29 тыс./г, от 2 до 17,7 тыс./г и от 0,9 до 10,5 тыс./г почвы. Самая большая плотность B. thuringiensis отмечена в илистых отложениях богатых микроэлементами и органикой, по берегам некоторых мелких водоемов, примыкающих к оз. Сары-Челек, где их численность достигает соответственно 12,6 и 18% от общей численности споровых бактерий.

В образцах из почвенного ила изолировано три серологических варианта B. thuringiensis, доминировали H14, при чем их численность достигала 18% от общей численности бацилл.

Типичными представителями темных сероземов, коричневых и черно-корничневых почв являются преимущественно B.subtilis, B.cereus, B. megaterium и B.idosus. Находясь в комплексе этих гетеротрофных бацилл, кристаллообразующие бактерии являются типичными частными или типичными доминирующими. Горные лесные черно-коричневые почвы более благоприятны для развития спорообразующих бактерий, в том числе и для B.thuringiensis, по сравнению с темными сероземами и коричневыми почвами.

Из почв орехово-плодовых лесов выделено 9 серологических вариантов кристаллообразующих бактерий (табл.3.4.2).

Таблица 3.4.2 -Изоляты Bacillus thuringiensis в горных почвах юга Кыргызстана

Тип почв	Год	Серологические варианты B.thuringiensis, количество изолятов
		H1	H2	H3abc	H4ab	H5ab	H8ab	H14	H14*	H17	H31
Темные сероземы	2005	0	1	0	1	4	0	3	16	20	6
	2006	0	0	3	2	1	0	5	19	13	1
	2007	0	0	0	0	1	0	4	14	9	2
Лесные коричневые	2005	0	0	2	0	3	0	5	9	26	15
	2006	0	0	0	1	6	0	8	5	6	14
	2007	0	0	5	1	4	0	3	11	27	9
Лесные черно-ко- ричневые	2005	2	1	3	1	5	2	26	7	31	11
	2006	1	1	8	2	3	0	19	12	26	9
	2007	0	1	1	1	8	2	10	23	9	15
Изолятов всего	3	4	22	9	35	4	83	116	167	82

Прим. * - морфологический вариант с ромбическими кристаллами

Исходя из пространственной и временной встречаемости, при наличии благоприятных условий B. thuringiensis не только может длительно сохраняться в почвах, но и размножаться там, как гетеротрофы.

Изучение энтомоцидных штаммов микроорганизмов выделенных в лесах Кыргызстана. Для изучения взяты штаммы, выделенные в орехово-плодовых лесах Кыргызстана следующих подвидов Bacillus thuringiensis: Bt spp. kurstaki (Н3abc); Bt spp. dendrolimus (Н4ab); Bacillus thuringiensis subsp. galleriae (Н5ab); Bt spp. tenebrionis (morrisoni) (H8ab); Bt ssp. israelensis (H14); Bt subsp.toguchini (Н31).

Для выделения бактериальных культур с высокой продуктивностью спор и кристаллов и высокой вирулентностью провели отбор штаммов, изолированных из почвы и насекомых на питательных средах «А» и «РПА».

Результаты по определению особенностей морфологии колоний, скорости их роста, споро- и кристаллообразования показали, что на «РПА» наблюдается задержка роста споро-и кристаллообразования подвидов Bt. Оптимальной средой для споро-и кристаллообразования Bt является среда «А»; на этой среде процент кристаллообразования наибольший, но при отборе штаммов с высокой продуктивностью спор и кристаллов и высокой вирулентностью лучше всего эксперименты проводить на обеих средах. На «РПА» при рассеве четко наблюдалось S-формы, которые при рассеве на среде «А» не всегда выявляются, в S -формах споро-и кристаллообразование идет медленно, кристаллы мельче и образуются в меньшем количестве. Результаты показали, что высоковирулентные штаммы бактерий Bt (биологическая активность до 100%) на первые сутки инкубирования показали массовое формирование спор и кристаллов, и начало высыпания кристаллов до 5%, на четвертые сутки процент споро-кристаллообразования достигало до 99%.

Установлено, что и из почвы можно изолировать штаммы с высокой продуктивностью спор и кристаллов, и высокой вирулентностью, которые при инкубировании на двух средах дают полное высыпание кристаллов и спор (до 99%). Таким образом, из патологического материала отобраны культуры с высокой продуктивностью споро-кристаллического комплекса, которые сохраняли структуру колоний в R-форме при пересевах. Это белые, бело-серые колонии с зернистой поверхностью, которые мы взяли для биотестирования непарного шелкопряда и других насекомых: штаммы 15, 112, 116 Bacillus thuringiensis subsp. galleriae (Н5ab), выделенные из Lymantria dispar L; штаммы 160, выделенные из почвы; штаммы 10, 57, 3 подвида kurstaki, выделенные из непарного шелкопряда и Calosoma sycophanta L. и штамм 30 подвида sotto(4ab) выделенный из Lymantria dispar L.

Кристаллообразующие штаммы Bt продуцировали параспоровые включения бипирамидальной, ромбовидной, округлой, квадратной формы, бесформенные и нетипичной формы. Размеры кристаллов значительно варьировали. Штаммы одного подвида могли продуцировать разные по форме и размерам кристаллы с разной специфичностью.

С иммунными сыворотками для подвидов thuringiensis, finitimus, kurstaki, dendrolimus, galleriae, tenebrionis (morrisoni), israelensis, tohokuensis, toguchini нами поставлена реакция агглютинации. Все изолированные из насекомых и почвы культуры агглютинировали с типовыми иммунными сыворотками для подвидов kurstaki, thuringiensis, finitimus, dendrolimus, galleriae, tenebrionis (morrisoni), israelensis, tohokuensis, toguchini.

Структура и состав дельта-эндотоксина Bt. Структуру белка кристаллов изучали с помощью электрофореза методом SDS-PAGE в геле (рис.3.5.2). Хотя штаммы 1, 10, 57 были выделенны из различных источников: насекомых (красотела пахучего, найденного в лесхозе Кара-Алма, непарного шелкопряда из Урумбашского лесхоза) и почвы, собранной в лесхозе Тоскоол- Ата, они имели одинаковый белковый профиль, который совпадал с белковым профилем типового штамма Bt ssp. kurstaki кристовара К-1. У всех этих штаммов присутствовало два белка молекулярной массой 130 и 65 кДа.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20

Рис. 3.5.2 Электрофорез кристаллов культур B. thuringiensis

1 - типовой штамм Z-52 (Bacillus thuringiensis var.kurstaki) - продуцент лепидоцида; 2-штамм 10; 3-штамм 15; 4- штамм 485; 5- штамм 218; 6- штамм 3; 7- штамм 127; 8- штамм С5к25; 9- штамм Сч21; 10- штамм 133; 11- штамм 57; 12- штамм 1; 13- штамм 30; 14- штамм 112; 15- штамм 6; 16- штамм 160; 17- штамм С3к30; 18- штамм С1к2; 19- штамм А38; 20- штамм С1К3.

Известно, что штаммы серовара H4ab по биохимическим свойствам разделяются на биовары sotto и dendrolimus. Возможно, штаммы С5к25 из почвы Арстанбап-Ата и штамма 30 из непарного шелкопряда лесхоза Тоскоол-Ата относились к разным биоварам. Электрофоретический анализ выявил у этих штаммов мажорный белок порядка 135 кДа, а минорные белки различались. Штаммы 15 и 112, выделенные из гусениц непарного шелкопряда, найденных в лесхозе Кара-Алма и лесничестве Урумбаш, по серологическим свойствам были отнесены к штаммам Bt ssp. galleriae. Оба штамма имели мажорный белок порядка 135 кДа, однако белковые профили минорных белков различались как по составу, так и по молекулярной массе. Показано, что штаммы данного подвида разделяются на несколько морфовариантов, которые различаются по ряду физиолого-биохимических свойств, продуктивности и инсектицидности (Л.И. Бурцева, 1987; Л.И. Бурцева, М.В. Штерншис, Г.В. Калмыкова, 2001). Возможно, выделенные культуры и относятся к разным морфоварам.

Белковый ...