Сохранение биоразнообразия и практическое использование растений рода Scutellaria методами биотехнологии

Глава 1. Обзор литературы.

Представлен обзор литературы о практическом значении растений рода Scutellaria, актуальности сохранения растительного разнообразия шлемников в условиях банков гермоплазмы. Дан анализ современных методов и подходов в области применения методов in vitro для получения тканевых культур с целью изучения процессов накопления вторичных метаболитов и последующего использования перспективных штаммов в качестве сырья для производства лекарственных препаратов.

Последовательность работ по сохранению, изучению и выявлению практической ценности растительного разнообразия эндемиков и хозяйственно-ценных видов шлемников методами биотехнологии можно представить в виде следующей схемы:

Рис. 1

Глава 2. Материалы и методы исследования.

Предобработка семян и морфометрия проводились согласно общепринятым методам с учетом ключевых элементов стандартов генетических банков (Методические указания по семеноведению интродуцентов, 1980; FAO/IPGRI, 1994; Technical Information Sheet #4, 2008).

Закладка семян для хранения в криобанке проводилась при двух низкотемпературных режимах: неглубокое замораживание при -20єС и при -196єС (жидкий азот). Определение всхожести семян, заложенных на хранение в жидкий азот, проводилось после 1 месяца хранения; всхожесть семян, хранившихся при температуре -20єС, определялась после 4 месяцев хранения.

Стерилизацию семян проводили по общепринятой методике (Калинин Ф.Л. и др., 1980). Для преодоления состояния покоя семян использовался метод стратификации (Николаева М.Г. и др., 1985).

Проводили подбор питательных сред для микроразмножения (Калинин Ф.Л. и др., 1980) с добавлением фитогормонов разного типа в различных концентрациях (Умралина А.Р. и др., 2008).

Для получения искусственных семян использовался метод инкапсулирования (Redenbaugh K. et al., 1986). В качестве эксплантов служили растения не прошедшие и прошедшие холодовую закалку при +3-5°С (Adriani M. et al., 2000). Для регенерации растений проводили проращивание искусственных семян в стерильных и полустерильных условиях в почву.

Линии гермоплазмы выделялись из растений, проросших из отдельного семени. Полученные линии клонально размножались в отдельных сосудах. В процессе микроразмножения оценивался характер роста линий по 5-балльной шкале (Murch S.J. et al. 2004).

Определяли динамику накопления биомассы проростков в условиях in vitro. По каждому варианту измерялись сырая и воздушно-сухая биомасса и определялся ростовой индекс.

Суммарное содержание флавоноидов в нативных растениях, линиях гермоплазмы определялось спектрофотометрическим методом (Беликов В.В., 1990). Процентное содержание вычисляли по рутину-стандарту. Антиоксидантная активность определялась по методике, описанной в изобретении Максимовой Т.В. и др. (2001 г). Антиоксидантную активность выражали в мг кверцетина на г сухого вещества.

Статистическую обработку экспериментальных данных проводили по общепринятой методике (Лакин Г.Ф., 1990). Результаты экспериментов были обработаны с помощью программы Microsoft Excel.

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Описание объекта исследований.

Объектами исследований служили растения рода Scutellaria, произрастающие на территории Кыргызстана. Всего было изучено 15 видов, собранных из разных регионов - из них 7 видов эндемики, 1 суб-эндемик и 7 - хозяйственно-ценные виды.

Растительный материал представлен семенами и нативными растениями, которые были собраны в 2005-2010 гг. д.б.н. Г.А. Лазьковым для банка семян дикорастущей флоры Кыргызстана при Институте биотехнологии НАН КР.

Были определены морфометрические характеристики семян. После подготовки семена были заложены на хранение в банк семян при двух низкотемпературных режимах: при -20°С в морозильную камеру и при -196°С в сосуд Дьюара (жидкий азот).

3.2. Определение параметров хранения семян - всхожесть семян до и после хранения в жидком азоте и при низкотемпературном хранении (-20єС).

Для изучения влияния низких температур на жизнеспособность семян растений рода Scutellaria нами была определена контрольная всхожесть семян и всхожесть после хранения в жидком азоте и при -20°С пяти видов шлемника: S. adenostegia, S. andrachnoides, S. comosa, S. lanipes и S. pycnoclada.

Исходная всхожесть у всех видов не превышала 50%. После замораживания в жидком азоте всхожесть семян превысила контрольную у видов S. adenostegia, S. pycnoclada и S. comosa. Всхожесть семян S. andrachnoides и S. lanipes, прошедших замораживание в жидком азоте, осталась на уровне контрольной. Всхожесть семян после хранения при -20°C была ниже контрольной за исключением S. adenostegia (табл. 1).

Увеличение всхожести после замораживания в жидком азоте можно объяснить тем, что при криоконсервации и последующем оттаивании происходит разрушение семенной оболочки, которая при обычных условиях задерживает прорастание (Pritchard H.W. et al., 1988; Shibata T. et al., 1995). При хранении при -20°C некоторые метаболические процессы замедляются, и соответственно происходит медленное старение семян.

У семян был широкий диапазон периода прорастания, что может быть обусловлено географическими и экологическими условиями их формирования (Ткаченко К.Г., 1998; Воронкова Н.М. и др., 2003), видовыми особенностями, качеством и внутривидовой неоднородностью семян, а также условиями хранения при низких температурах, когда у семян происходит перестройка в типах и глубине покоя.

Результаты показывают, что наиболее высокая всхожесть наблюдается у семян, хранившихся в жидком азоте (-196°C) В то же время длительное хранение семян в этом режиме требует значительных трудовых и экономических затрат. С этой точки зрения более предпочтительным для долговременного хранения представляется замораживание при -20°C, этот режим рекомендуется Международным советом ботанических садов (Laliberte B., 1997, Rao N.K. et al.; 2006).

Таблица 1 - Всхожесть семян после низкотемпературного хранения

3.3. Микроразмножение растений рода Scutellaria. Оптимизация питательной среды для микроразмножения. Объектом исследований являлись следующие виды: S. adenostegia, S. andrachnoides, S. comosa, S. lanipes и S. pycnoclada.

Для микроразмножения шлемников нами были испытаны среды Мурасиге и Скуга (MS, Murashige T. and Skoog F., 1962) и Гамборга (B5, Gamborg O.L., 1968) с добавлением фитогормонов в различных концентрациях и сочетаниях.

Мериклоны всех видов шлемников образуют хорошо выраженные междоузлия, поэтому для их размножения мы применяли метод микрочеренкования.

При культивировании на среде MS лучше всех испытуемых шлемников развивались растения S. andrachnoides. На среде MS без фитогормонов черенки этого вида укоренялись, но формировались тонкие побеги. На среде MS с добавлением 1,0 мг/л ИУК побеги образовывались хорошие, все укоренялись, формировался каллус. При добавлении 1,0 мг/л ИМК образовывались мощные пучки светлых корней, также в месте соприкосновения стебля со средой формировался каллус. Сравнение фитогормонов ауксинового типа ИУК и ИМК показало, что наиболее эффективным в условиях in vitro является гормон ИМК.

Влияние веществ цитокининового типа - БАП (0,1мг/л) и кинетина (0,1мг/л) изучалось только со средой MS. На средах с гормонами цитокининового типа - БАП (0,1мг/л) и кинетином (0,1мг/л) черенки не давали корней, но на них кроме основных побегов образовывалось много дополнительных в вариантах с БАП более 10 на черенок, в вариантах с кинетином по 5-6 побегов. Последующее культивирование их на среде В5, содержащей 0,25мг/л ИМК, обеспечивало высокий процент укоренившихся растений. Такое двухэтапное выращивание предлагается применять при необходимости ускоренного микроразмножения уникальных генотипов шлемника.

Растения S. lanipes оказались более чувствительными к среде MS. На среде без гормонов формировались более тонкие побеги, каллус не образовывался. На среде с 1,0 мг/л ИМК побеги удлинялись и укоренялись, формировался каллус, который затем темнел.

Наиболее чувствительными к среде MS были растения видов S. adenostegia, S. comosa и S. pycnoclada. Рост черенков этих видов и формирование корней на среде MS без фитогормонов не наблюдался. Формировалась значительная масса каллуса. Добавление 1,0 мг/л ИМК индуцировало слабое удлинение стеблей и корней, формировался каллус.

На среде В5 без фитогормонов черенки всех пяти видов хорошо развивались, но формирование корней было слабое. Добавление 1,0 мг/л ИМК способствовало удлинению побегов и росту корней, а также образованию каллуса. Дальнейшее снижение концентрации ИМК (0,5 мг/л и 0,25 мг/л) сохраняло характер роста органов и снижало образование каллуса. Наиболее оптимальной оказалась концентрация 0,25 мг/л, при которой наблюдался энергичный рост стеблей и корней и наименее выраженное образование каллуса.

Результаты наших исследований показывают, что все испытанные виды шлемников могут успешно размножаться в культуре in vitro. Наиболее оптимальной для культивирования растений рода Scutellaria в условиях in vitro оказалась среда В5 с добавлением 0,25 г/л ИМК.

3.4. Получение «искусственных семян» растений рода Scutellaria

Нами были получены искусственные семена шлемников S. adenostegia, S. andrachnoides, S. comosa, S. lanipes, и S. pycnoclada. Был проведен эксперимент по определению влияния холодовой закалки на выживаемость искусственных семян. После 1 и 2 месяцев хранения искусственных семян, полученных от растений, не прошедших холодовую закалку, образования побегов не наблюдалось ни у одного из пяти видов. Искусственные семена практически полностью развивались в каллус (рис. 2).

Холодовая закалка растений в течение короткого периода (до 6 недель) значительно повышает выживаемость меристем (Stushnoff C., 1987; Brison M. et al., 1995). В нашем опыте образование побегов в контроле у искусственных семян из растений, прошедших холодовую закалку, превышает 50% у видов S. comosa, S. lanipes и S. pycnoclada, а у S. andrachnoides побеги дали все искусственные семена (рис. 3).

Жизнеспособность искусственных семян, хранящихся при низкой температуре, проверялась каждый месяц и оставалась высокой, но в период от 4 до 5 месяцев хранения у них началось формирование этиолированных побегов с редуцированными листьями и корней. После высаживания этих побегов в камере на свету, все они развились в здоровые зеленые растения с развитыми корнями.

Был проведен опыт по высаживанию искусственных семян в полустерильные условия в почву для получения полноценных растений. Посадка в почву незащищенных семян S. andrachnoides и S. lanipes окончилась неудачей, все они заразились и погибли. Мы нанесли второй, защитный слой на искусственные семена перед высаживанием их в почву. При этом была использована среда на основе 100 мл 3% раствора альгината на среде В-5 без гормонов и в нее внесены 150 мг фундазола и 100 мг клафорана. Семена были высажены в горшочки с простерилизованной почвой, смешанной с песком. Растения хорошо развивались в горшочках на почвенном субстрате.

В результате наших исследований были разработаны протоколы получения «искусственных семян» растений рода Scutellaria. Для двух эндемиков S. andrachnoides и S. lanipes разработаны протоколы для последующего перевода искусственных семян в полустерильные условия в почву. Искусственные семена являются удобной формой для хранения генетического материала растений, обмена растительным материалом в научных целях, а также перспективны для реинтродукции эндемиков и редких видов в естественные природные условия.

3.5. Выделение линий гермоплазмы растений рода Scutellaria. Объектами исследования служили два вида шлемников: S. andrachnoides и S. lanipes. Каждая линия гермоплазмы выделялась из растения, полученного от отдельного семени при введении в культуру in vitro.

У S. andrachnoides было получено 14 линий, у S. lanipes - 21 линия. Полученные линии поддерживались в культуре клональным микроразмножением.

При каждом пассаже визуально оценивались скорость и характер роста линий по 5-бальной шкале. Наиболее быстрорастущими линиями S. andrachnoides являлись линии Sa-1, Sa-2, Sa-7 и Sa-11, оцененные в 5 баллов, наиболее медленнорастущими - Sa-4 и Sa-13, имевшие 2 и 1 балл соответственно (рис. 3а). Остальные линии имели среднюю скорость роста.

5-бальную скорость роста линий S. lanipes имели Sl-2 и Sl-5. Линии Sl-3, Sl-6, Sl-13, Sl-15, Sl-16, Sl-17, Sl-20 имели среднюю скорость роста (рис. 3б). Худшие ростовые характеристики имели две линии Sl-8 и Sl-18.

Проростки размножались в культуре для накопления растительного материала с целью последующего проведения анализов на антиоксидантную активность и содержание флавоноидов.

Рис. 4 - Скорость роста линий гермоплазмы S. andrachnoides (а) и S. lanipes (б)

3.6. Проведение сравнительного биохимического тестирования культур in planta и in vitro на содержание флавоноидов и антиоксидантную активность.

3.6.1. Содержание флавоноидов и антиоксидантная активность нативных растений шлемников Кыргызстана. Для сравнительного исследования был проведен анализ нативного растительного материала рода Scutellaria Кыргызстана (рис. 4).

Как показали полученные данные антиоксидантная активность в той или иной степени коррелирует с количеством флавоноидов в растениях. Так, с увеличением содержания флавоноидов в тканях наблюдается повышение относительной антиоксидантной активности. Отдельные различия этих величин, возможно, заключаются в том, что антиоксидантную активность обуславливают и другие физиологически активные соединения.

Сопоставление полученных результатов относительной антиоксидантной активности и суммы флавоноидов нативных растений рода Scutellaria позволяет выделить ряд перспективных для дальнейшего изучения видов - S.knorringiae, S. nepetoides, S. oligodonta, S. mesostegia, S. transilensis.

3.6.2. Содержание флавоноидов и антиоксидантная активность растений шлемников in vitro. После накопления достаточного количества растительного материала in vitro, было проведено сравнительное исследование содержания флавоноидов и антиоксидантной активности в нативных растениях и полученных методом in vitro 5 видов шлемников (табл. 2).

Таблица 2 - Антиоксидантная активность и сумма флавоноидов нативных растений и растений in vitro рода Scutellaria

Рис. 4 - Сумма флавоноидов и антиоксидантная активность нативных растений рода Scutellaria Кыргызстана

Содержание флавоноидов и антиоксидантная активность нативных растений были выше, чем стерильных проростков. Несмотря на это, преимущество применения методов in vitro заключается в том, что с помощью микроразмножения можно получать растительный материал в короткие сроки, тем самым исключая необходимость сбора растений в природе.

3.6.3. Содержание флавоноидов и антиоксидантная активность линий гермоплазмы растений рода Scutellaria. Было проведено сравнение линий гермоплазмы видов S. andrachnoides и S. lanipes. Маркерами служили скорость роста, суммарное содержание флавоноидов и антиоксидантная активность. Для сравнения продуктивности линии были сгруппированы по ростовым характеристикам.

Линии гермоплазмы обоих видов имели заметные различия по всем параметрам. У линий S. andrachnoides самые низкие показатели имела линия Sa-4. Наиболее интересной представляется линия Sa-14, имеющая при высокой концентрации флавоноидов и высокий антиоксидантный потенциал, как в надземной части, так и в корнях (рис. 6).

а)

б)

Рис. 6 - Антиоксидантная активность и суммарное содержание флавоноидов в надземной части (а) и корнях (б) линий S. Andrachnoides

У S. lanipes наиболее высокие показатели содержания флавоноидов и антиоксидантной активности надземной части были у линии Sl-1, в корнях у линий Sl-11 и Sl-15 (рис. 7).

В целом корни линий обоих видов имели более высокие показатели содержания флавоноидов и антиоксидантной активности по сравнению с надземной частью.

Определенной зависимости биохимических характеристик от скорости роста не наблюдается, во всех группах есть линии, накапливающие как высокие, так и низкие концентрации флавоноидов и имеющие различную антиоксидантную активность.

а)

б)

Рис. 7 - Антиоксидантная активность и суммарное содержание флавоноидов в надземной части (а) и корнях (б) S. lanipes

Таким образом, в результате наших исследований были получены линии гермоплазмы двух видов шлемников, отличающиеся по своим морфологическим и биохимическим характеристикам. Отбор линий гермоплазмы является одним из этапов в получении культур, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить основой для получения лекарственного сырья.

3.7. Накопление биомассы проростков в условиях in vitro.

Для получения достаточного количества биомассы с целью получения биоактивных вторичных соединений используется метод накопительного культивирования. С этой целью был проведен эксперимент по определению динамики накопления биомассы в культуре in vitro вида S. comosa.

В первую неделю после посадки растения находились в лаг-фазе, а, начиная со второй недели, переходили в фазу экспоненциального роста (рис. 7). К 6-й неделе растения переходят в фазу замедления роста. К этому моменту растения достигают наиболее высокого ростового индекса, который составляет 15,0±3,0 (P<0,01) (табл. 3).

Данные опыта показывают, что накопление биомассы в наблюдаемый период времени не имеет экспоненциальный характер в отличие от роста растений, что подтверждается наложением на график накопления биомассы линии тренда степенного типа (рис. 8).

Таблица 3 - Индекс накопления биомассы растений вида S. comosa

После измерения сырой массы растения были высушены и была подсчитана воздушно-сухая масса растений (табл. 4).

В первые две недели роста процент воздушно-сухой массы оставался на относительно неизменном уровне - 8,8-9,0%, начиная с 3-й недели он начал повышаться, и к 5-6 неделе достиг уровня 9,8-9,9%, что на 1,0-,1,1% выше по сравнению с первоначальным значением. По-видимому, разница в процентном содержании воздушно-сухого вещества объясняется тем, что при посадке эксплантов на новый субстрат они входят в лаг-фазу адаптации к новой среде, когда происходит перестройка в обмене веществ и клетки вакуолизированы в большей степени.

Таким образом, исследование динамики роста культуры in vitro на примере вида S. comosa показало, что при культивировании на агаризованной среде растения к 6-й неделе истощают субстрат и достигают наибольшего ростового индекса и входят в стадию, оптимальную для пересаживания на свежую питательную среду.

Проведенная работа по изучению накопления биомассы в условиях in vitro предоставляет возможность получения селективного растительного материала в короткие сроки для его последующего изучения. Главной целью таких биотехнологий является получение растительной биомассы, выращенной в контролируемых условиях.

Рис. 8 - График роста растений S. comosa, см

Рис. 9 - График накопления биомассы растений S. comosa, г

Таблица 4 - Сырая и воздушно-сухая масса растений вида S. comosa, г

Выводы

1. С целью сохранения в семенном банке растений рода Scutellaria разработаны протоколы криосохранения семян при двух низкотемпературных условиях (-20єС и в жидком азоте при - 196 єС).

2. Разработан метод ускоренного микроразмножения уникальных генотипов шлемника, включающий двухэтапное выращивание. На первом этапе растения культивируются на среде Мурасиге и Скуга с гормонами цитокининового типа, на втором этапе экспланты пересаживаются на среду Гамборга с гормонами ауксинового типа. Получены линии гермоплазмы двух эндемичных видов S. andrachnoides и S. lanipes, отличающиеся по своим морфологическим и биохимическим характеристикам.

3. Впервые разработаны протоколы получения «искусственных семян» шлемников, а также перевода эндемичных видов S. andrachnoides и S. lanipes в полустерильные условия в почву, что является эффективным альтернативным методом сохранения генетического разнообразия и размножения эндемиков, редких и коммерчески ценных видов.

4.. Проведена биохимическая оценка нативных растений и линий гермоплазмы шлемников на содержание флавоноидов и антиоксидантную активность. Выделены перспективные виды шлемников для дальнейшего изучения. Линии гермоплазмы, имеющие среднюю скорость роста, имеют более высокие концентрации флавоноидов и антиоксидантную активность. Отбор линий гермоплазмы по биологическим тестам является одним из этапов в получении культур, в которых содержание вторичных продуктов достаточно велико, чтобы служить лекарственным сырьем.

5. Определена динамика накопления биомассы шлемников в культуре in vitro на примере вида S. comosa. При культивировании растения, начиная со 2-й недели, входят в фазу экспоненциального роста и к 6-й неделе истощают субстрат и входят в фазу замедления роста. За это время достигается 15-ти кратное увеличение биомассы.

Список опубликованных работ по теме диссертации

1. Создание банка долговременного хранения семян эндемичных, редких и хозяйственно ценных видов на примере растений рода Scutellaria [Текст] / [Т.П. Чернышева, Г.П. Пиндюрина, Б.А. Асанакунов и др.] // Вестник КАУ. - 2008. - №3(11). - С. 116-119.

2. Асанакунов Б.А. Влияние низкотемпературных режимов хранения на всхожесть семян растений рода Scutellaria [Текст] / Б.А. Асанакунов // Сб. материалов межд. конф. «Биосферные территории Центральной Азии как природное наследие», г. Чолпон-Ата, 2009 г. - С. 160-162.

3. Асанакунов Б.А. Накопление биомассы растений вида Scutellaria comosa в условиях стерильной культуры in vitro [Текст]/ Б.А. Асанакунов // Вестник КАУ. - 2009. - №4(15). - С. 36-39.

4. Асанакунов Б.А. Применение низкотемпературного замораживания для долговременного хранения семян дикорастущей флоры Кыргызстана на примере растений рода Scutellaria [Текст] / Старт в науку. Материалы научно-практ. конф. - Бишкек, 2009 г. - С. 8-9.

5. Флавоноиды и антиоксидантная активность некоторых растений рода Scutellaria [Текст] / [Б.А. Асанакунов, И.В. Бабченко, Р.А. Алфимова и др.] // Вестник КГУ им. Арабаева. - 2010. - Вып. 17. - С. 139-145.

6. Асанакунов Б.А. Получение искусственных семян растений рода Scutellaria методом инкапсулирования [Текст] / Б.А. Асанакунов // Вестник КазНУ им. Аль-Фараби. Серия Биологическая - 2011. - №1(47). - С. 15-18.

7. Поддержание в контролируемых условиях (in vitro) ювенильных растений как способ сохранения эндемиков и редких видов растений Кыргызстана и возможности их использования для биотехнологических разработок [Текст] / [А.Р. Умралина, Т.П. Чернышева, Б.А. Асанакунов и др.] // Инновационные биотехнологии в странах ЕврАзЭС. Материалы Межд. научно-практ. конф. - Минск, 2011 г. С. 90-104.

8. Выделение линий гермоплазмы растений рода Scutellaria [Текст] / [Т.П. Чернышева, И.В. Бабченко, Б.А. Асанакунов и др.] // Известия НАН КР. - 2011. - №3. - С. 65-68.