Размещено на http://www.allbest.ru/

Посвящается моим родителям

Изучение комплекса протеолитических ферментов при воздействии токсикантов различной химической структуры в печени живородки речной

03.02.08 - Экология (биологические науки).

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Конин Дмитрий Николаевич

Москва 2011

Работа выполнена на кафедре органической и биологической химии биолого-химического факультета Московского педагогического государственного университета.

Научный руководитель:

Доктор биологических наук, профессор Коничев Александр Сергеевич

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор Генгин Михаил Трофимович

Кандидат биологических наук, доцент Гераскина Галина Валентиновна

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский городской педагогический университет»

Защита состоится «10» ноября 2011 года в ______ на заседании Диссертационного совета Д.212.155.13. при Московском государственном областном университете по адресу 141014, Московская обл., г. Мытищи, ул. Веры Волошиной, д. 24.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного университета областного университета по адресу: 105005, Москва, ул. Радио, д. 10а

Автореферат разослан «__» октября 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук Т.А. Снисаренко

экотоксикант живородка печень

Актуальность темы. В настоящее время уделяется значительное внимание биохимическому тестированию воздействия различных экотоксикантов на живые организмы [Антонов В.К., 1991; Бондарева Л.А., 2002; Егорова Т.А., 2004]. В свою очередь любые нарушения в жизнедеятельности организма начинаются с изменения присущих ему в норме биохимических процессов. Рост и развитие гидробионтов, и их ответные реакции на воздействие внешней среды опосредуется совокупностью метаболических процессов в их организме. Процессы метаболизма в свою очередь, как известно, контролируются ферментами [Белозерский М.А., Дунаевский Я.Е., 1999; Reich Е., Rifldn D.B., Shaw E., 1975].

Одним из наиболее перспективных приемов индикации загрязнения является изучение реакции на него протеолитических ферментов, как инструментов протеолиза - непременного фундаментального процесса обмена веществ в организме животных, обеспечивающего распад белков, пополняющего аминокислотный фонд клеток, участвующего в росте, делении и гибели клеток [Куцый Н.П., Кузнецова Е.А., Газиев А.И., 1999; Нейфах А.А., Тимофеева М.Я., 1977].

В последние годы был проведен ряд экспериментальных работ, в которых установлено, что моллюски представляют собой весьма перспективный тест-объект изучения воздействия различных групп токсикантов (галогенорганические соединения, фенольные соединения, ионы тяжелых металлов и пр.) на ферментные системы гидробионтов, что может быть использовано для оценки уровня загрязнений водной среды. Соответствующие данные были получены в отношении нуклеаз, фосфатаз и дегидрогеназ [Попов А.П., 2002; Цветков И.Л., 2009]. В тоже время ферменты белкового обмена у гидробионтов мало изучены. Мы продолжили исследование в этом направлении, и основной целью данной работы стала характеристика изменения протеолитической активности ферментов живородки речной Viviparus viviparus под воздействием токсикантов различной химической природы.

Исследование протеолитического комплекса ферментов в печени живородки речной представляет интерес не только для выяснения их роли в процессе токсикации организма загрязнителями антропогенной природы, но важно и в практическом отношении. Однако пептидогидролазы в экологическом аспекте у живородки речной практически не исследованы.

Цели и задачи исследования. Целью работы является исследование протеолитических ферментов в процессе интоксикации в печени живородки речной.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать эндогенный протеолитический комплекс в печени живородки речной и оценить степень его гетерогенности.

2. Изучить состав комплекса пептидогидролаз в печени живородки речной.

3. Проанализировать динамику активности протеолитического комплекса при различной продолжительности воздействия на него экотоксикантов различной химической природы.

4. Изучить структуру комплекса протеолитических ферментов, классовую принадлежность его компонентов.

5. Изучить спектр растворимых белков печени живородки речной в норме и при воздействии экотоксикантов различной химической природы.

Научная новизна работы. Отработаны методы исследования комплекса протеолитических ферментов, предназначенные для используемого тест - объекта живородки речной Viviparus viviparus L.

Охарактеризован комплекс протеолитических ферментов, участвующих во внутриклеточной деструкции белков в диапазоне рН от 2,2 до 9,6 в печени живородки речной Viviparus viviparus L.

Впервые исследована динамика активности протеолитического комплекса ферментов в норме и при различных концентрациях экотоксикантов основных групп загрязнителей, при различной продолжительности воздействия на него экотоксикантов различной химической природы.

Проведен ингибиторный анализ активности протеиназ и установлена структура комплекса протеолитических ферментов.

Практическое значение работы. Полученные данные о высокой активности и многокомпонентности протеолитических ферментов в печени живородки речной свидетельствуют о фундаментальной роли пептидогидролаз в обменных процессах белков при токсикации организма гидробионта.

Анализ полученных данных позволяет конкретизировать данные о биохимических функциях исследованных пептидогидролаз в процессе токсикации живородки речной.

Установлена взаимосвязь между уровнем активности протеиназ в печени моллюска в норме и при отравлении, что в перспективе позволит использовать их в качестве биохимического теста для фиксирования уровня загрязнения окружающей среды.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на научных сессиях по итогам научно-исследовательской работы МПГУ в 2004-2011 году, а так же на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии» в 2008 году и VI Симпозиуме химии протеолитических ферментов в 2007 году.

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 9 печатных работах из них 3 - в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о протеолитических ферментах у моллюсков, описание материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 41 рисунок. Список цитируемой литературы включает в себя 125 названия, из которых 43 на иностранных языках.

Биологический материал. Моллюсков собирали в прибрежной зоне реки Вязь в районе деревни Тишково Московской области и транспортировали в лабораторию в сосудах, заполненных взятой из реки водой. Собранные животные (150-200 особей) до опыта культивировались в аквариуме объемом 60 литров, содержащим лабораторные и взятые из реки растения нескольких видов, таких как Elodea сanadensis, Vallisneria spiralis, Lemna trisulca. Воду в аквариуме периодически подменивали на 1/3 объема водопроводной водой, отстоянной в течение трех суток. При необходимости животных подкармливали листьями одуванчика, капусты, салата, как это рекомендуется для лабораторного содержания моллюсков.

Токсикологическому эксперименту во всех случаях предшествовал период акклимации, характеризующийся стабилизацией значений внешних факторов. Моллюсков содержали при умеренном освещении, ежедневной двадцатичасовой аэрации воды и регулярной, раз в трое суток, подмене воды в течение одного месяца. Этого времени, по литературным данным, вполне достаточно для стабилизации физиолого-биохимических процессов в организме культивируемых гидробионтов. [Браун А.Д., Моженок Т.П., 1987; Егорова Т.А., 2004; Коничев А.С., Попов А.П., Цветков И.Л., 2007].

Ввиду малых величин предельно-допустимых концентраций (ПДК) поллютантов, готовили их более концентрированные (матричные) растворы, разбавлением которых получали необходимые для опыта концентрации растворенного в воде токсического вещества [Грушко Я.М, 1982]. По окончании периода акклимации экспериментальных моллюсков подвергали воздействию различных токсических веществ. (Таб. 1-2)

Таблица 1 Использованные в работе токсиканты

Примечание: 1 - лимитирующий признак вредности (ЛПВ) для воды водоемов, имеющих рыбохозяйственное значение; 2 - ЛПВ для воды водных объектов хозяйственно-питьевого и культурно-бытового водопользования; ЛПВ: токс. - токсикологический, рыб. хоз. - рыбохозяйственный, общесан. - общесанитарный, сан.- токс. - санитарно-токсикологический, орг. - органолептический. * металлы использовались в виде солей: CuCl₂ · 2H₂O, CuSO₄ · 5H₂O, ZnSO₄ · 7H₂O, FeSO₄ · 7H₂O, CdCl₂ · 2 Ѕ H₂O; ** для поверхностно-активных веществ.

Таблица 2 Галогенорганические токсиканты, использованные в работе

Примечание: то же, что к табл.1

Основные методы исследования. Для биохимического анализа из отдельных органов исследуемых животных готовили водно-солевые экстракты. У моллюсков путем вивисекции извлекали печень (гепатопанкреас), промывали ее 0,15М NaCl и растирали в охлажденной льдом фарфоровой ступке в течение 5мин с кварцевым песком. В качестве экстрагирующей жидкости использовали 0,15М раствор NaCl, прибавляемый в десятикратном по отношению к навеске ткани объеме. Растворы, содержащие однородную среду, получали, объединяя органы от 5 особей, что, согласно результатам специальных исследований по биохимическому тестированию, существенно снижает коэффициент вариации показателей ферментативной активности [Попов А.П., Цветков И.Л., Коничев А.С., 2006; Юровицкий Ю.Г., Сидоров В.С., 1993].

Полученные экстракты, для отделения не растворившегося материала очищали центрифугированием при 10000g (4C) в течение 30мин на рефрижераторной центрифуге К-24. Супернатанты декантировали и хранили при -10C.

В полученных экстрактах определяли содержание белка по методу Лоури и активность ферментов, которую выражали в стандартных единицах активности - Е или единицах удельной активности - Е/мг белка. Ферментативную активность у опытных животных оценивали по отношению к контрольным и выражали в процентах. Все измерения производили в 3 - 6 повторностях, статистическую достоверность результатов оценивали с вероятностью 0,95 (в некоторых специально указанных случаях - 0,99) [Клунова С.М., Ярыгин Д.В. , 2001; Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В., 1987; Anson M.L., 1939].

Протеолитическую активность определяли по стандартным методикам [Клунова С.М., Ярыгин Д.В. , 2001; Клунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В.,1987; Anson M.L., 1939], отрабатывая оптимальные условия опытным путем (рН инкубационной среды, время инкубации, содержание белка в пробе и количество вносимого субстрата). Исходя из выявленных оптимальных параметров, использованная нами методика приобрела следующий вид: 0,3мл разбавленного в 10-15 раз белкового экстракта печени моллюсков инкубировали с 0,05мл раствора субстрата (1%-ный раствор гемоглобина), 0,1мл дистиллированной воды и 0,55мл 0,05М фосфатно-цитратного буфера (рН = 3,2) в течение 1ч при 37С. Реакцию останавливали добавлением 0,24мл холодного 10%-ого раствора трихлоруксусной кислоты. Пробы помещали на 20мин в холодильник для формирования осадка, который отделяли центрифугированием при 8000g в течение 15мин. Далее к 0,4мл супернатанта добавляли 0,8мл 0,1М NaOH и 0,36мл 1н реактива Фолина. Измеряли оптическую плотность супернатантов при 750нм против контроля, в который 0,2мл экстракта вносили после раствора трихлоруксусной кислоты. За единицу активности принимали такую каталитическую активность, которая вызывает увеличение оптической плотности при 750нм на 1 единицу в течение 1ч при данных условиях реакции.

Электрофорез (ЭФ) проводили в полиакриламидном геле (ПААГ) по методике Вебера и Осборна, усовершенствованной Лэмли в 1970 году. В работе использовали прибор для ЭФ в вертикальных колонках ПААГ диаметром 4мм и длинной 8см. ПААГ готовили из стандартных растворов реактивов для ЭФ. При определение молекулярных масс субъединиц белков концентрация ПААГ составляла 10%, содержащем 0,1% ДДС-Na. В качестве электродного буфера использовали раствор 0,1М трис-глициновый буфер, рН 8,3; 0,1% ДДС-Na.

По окончании ЭФ гелевые колонки переносили в стеклянные пробирки и заливали фиксирующим раствором (ТХУ, изопропанол, дистиллированная вода в соотношении 2:1:1), выдерживали в нем 2-3ч при комнатной температуре. Белки на колонках окрашивали 0,1%-ым раствором кумасси G-250 1ч при 37С, промывали колонки дистиллированной водой и отмывали в растворе: 96%-ный этанол, ледяная уксусная кислота, дистиллированная вода в соотношении 15:6:40 для удаления несвязавшегося красителя.

В качестве ингибиторов протеиназ нами были использованы: пепстатин (на аспартильные протеиназы), п-хлормеркурийбензоат (ПХМБ - на тиоловые протеиназы), фенилметилсульфонилфторид (ФМСФ - на сериновые протеиназы), этилендиаминтетраацетат (ЭДТА - на металлопротеиназы).

Результаты и их обсуждение.

На начальном этапе работы основной задачей стала оценка чувствительности ферментных систем выбранного тест - объекта к токсическому воздействию. С этой целью был проведен ряд токсикологических экспериментов с использованием тяжелых металлов.

В результате было установлено, что ионы Pb²⁺, Cd²⁺, Fe²⁺ и Сu²⁺ вызывают незначительное уменьшение суммарной активности к 48ч экспозиции с последующим увеличением к 72ч. Исключение составляет лишь опыт ионами Cu²⁺ (1 ПДК) где наблюдается обратная картина. Удельная активность при 1 ПДК для всех ионов тяжелых металлов - уменьшается, тогда, как при более высокой концентрации токсикантов она либо увеличивается (Pb²⁺), либо изменяется скачкообразно (Hg²⁺), возрастая к 48 часам и уменьшаясь к 72. Катионы кадмия, меди, железа и свинца не оказывают сильного воздействия на комплекс протеолитических ферментов (Рис. 1), что подтверждается анализом зон протеолитической активности методом энзим - электрофореза в ПААГе. (Рис.2)

Рис. 1 Влияние ионов тяжелых металлов на активность протеиназ, в % по отношению к контролю, активность которого принята за 100% (Экспозиция 72 ч)

Рис. 2 Схема энзим - электрофореграмм протеолитической активности белков печени моллюсков в контроле и при воздействии ионов металлов (Экспозиция 48ч): I - 1 ПДК, II - 10 ПДК, К-контроль; 1, 2, 3 - зоны активности протеиназ

На следующем этапе эксперимента мы изучали воздействие хлорорганических соединений на активность протеаз живородки речной. Моллюсков подвергали воздействию хлорорганических соединений с концентрацией в 1 ПДК и 10 ПДК на протяжении 24, 48 и 72ч.

Проведенные определения показали, что в ряде вариантов опытов под влиянием хлорорганических токсикантов наблюдается повышение удельной активности протеаз в печени моллюсков. Так при концентрации 1 ПДК (24ч экспозиции) наблюдался резкий рост протеолитической активности, что, видимо, связано с попыткой организма адаптироваться к токсикантам, но в дальнейшем (48ч экспозиции) активность резко падала, а к 72ч экспозиции падала до минимальных значений, что, вероятно, свидетельствует об отравлении моллюсков.

В дальнейшем мы исследовали влияние галогенопроизводных ароматических соединений на активность протеаз живородки речной. Моллюсков подвергали затравке в растворах хлорбензола, бромбензола и йодбензола с концентрацией в 1 ПДК и 10 ПДК на протяжении 24, 48 и 72ч.

Проведенные эксперименты показали, что при низких концентрациях токсикантов (1 ПДК) активность ферментов возрастала на 21-30% к 24ч и 27-40% к 48ч, что, вероятно, связано с процессом адаптации. Как и в ряде других опытов, описанных выше, более продолжительное воздействие повлекло резкое снижение активности протеолитических ферментов (43-65%), подтверждая, вероятно, неспособность ферментной системы моллюсков приспособиться к данным токсикантам. (Рис. 3)

Рис. 3 Влияние хлорбензола (10 ПДК) на протеолитическую активность экстрактов печени живородки речной

При более высоких концентрациях (10 ПДК) мы наблюдали снижение активности протеаз на этапе 24ч экспозиции на 14-17%, а на более поздних этапах активность продолжала снижаться, достигая минимальных значений через 3 суток.

Следующей частью нашего исследования стало определение воздействия фенола и бензина на активность протеаз живородки речной. Проведенные определения в случае фенола показали увеличение удельной активности в интервале от 3-х до 24ч экспозиции. В дальнейшем уровень удельной активности снижался к 48ч экспозиции, к 72 часам оставался практически не изменялся, оставаясь на низких значениях. (Рис. 4)

Рис. 4 Влияние фенола и бензина на удельную активность экстрактов печени живородки речной, за 100% принята активность у контрольных моллюсков

В этом варианте опыта большинство (70%) моллюсков погибало к 72ч экспозиции, чему предшествовали необратимые изменения в их морфологических признаках.

Следующий этап исследования был посвящен изучению гетерогенности протеолитических ферментов исследованных нами моллюсков. Для этого мы испытали воздействие специфических ингибиторов различных протеиназ (ФМСФ, ПХМБ, пепстатина и ЭДТА) на протеолитическую активность в печени моллюсков. Полученные данные указывают на различное представительство аспартильных, тиоловых, сериновых и металлопротеиназ в комплексе протеолитических ферментов изученного вида моллюсков. (Таб. 3)

Таблица 3 Влияние ингибиторов на активность протеолитических ферментов в печени живородки речной

В соответствии с полученным данными можно предположить структуру исследуемого комплекса протеиназ, представленную на рисунке 5.

Рис. 5 Состав комплекса протеолитических ферментов живородки речной, определенный по результатам ингибиторного анализа: 1 - Аспартильные протеиназы, 2 - Тиоловые протеиназы, 3 - Сериновые протеиназы, 4 - Металлопротеиназы

Рис. 6 Фотографии электрофореграмм белкового спектра печени моллюсков в контроле и при воздействии ионов кадмия (10 ПДК): А - контроль, Б - Cd²⁺ (10 ПДК). 1,… 19 - номер фракции

Заключительная часть работы посвящена изучению спектра полипептидов в печени моллюсков в норме и при токсическом воздействии. У контрольных моллюсков методом электрофореза с ДДС-Nа нами были обнаружены 19 белковых фракций. Определение спектра полипептидов в печени моллюсков, подвергшихся воздействию токсикантов позволило зафиксировать распад ряда полипептидов, что соотносится с падением концентрации белка в печени при длительном воздействии ионов кадмия (10 ПДК). Не были обнаружены высокомолекулярные белки и два низкомолекулярных белка. Подобная картина обнаружена и при воздействии других токсикантов снижающих количество белка в пробах (ионы ртути, хлорорганические соединения, фенол). (Рис. 6)

В дальнейшем мы использовали маркерные белки с известными значениями молекулярных масс с целью определения молекулярных масс белков печени живородки речной. Смесь маркеров состояла из: DNP-L-аланина (Mr=225Да), миоглобина (Mr=17800Да), бычьего сывороточного альбумина (Mr=67000Да) и ферритина из селезенки лошади (Mr=450000Да) (Protein Molecular Weight Standards, Kit MS II, SERVA). (Таб. 4)

Таблица 4 Значения молекулярных масс белков печени живородки речной (А- контроль, Б - опыт Cd²⁺)

Полученные данные указывают на то, что воздействие испытанных токсикантов приводит к распаду ряда высокомолекулярных белков на фоне возрастания активности протеиназ. При этом существенно возрастает количество пептидов с молекулярной массой около 870Да. Таким образом, выявлено влияние токсикантов на изменение наборов белков печени моллюсков, связанного с повышением активности протеолитических ферментов.

Выводы.

1. Воздействие in vivo различных токсикантов (тяжелые металлы, фенол, бензин, галогенпроизводные бензола, алифатических углеводородов) вызывает в различной степени выраженные изменения активности протеолитических ферментов в печени живородки речной. Эти изменения имеют фазный характер, совпадающий со стадиями адаптационного синдрома, и однотипны в отношении различных представителей одной группы загрязняющих веществ, что свидетельствует о развитии в организме моллюсков процессов неспецифической адаптации.

2. Под влиянием ионов тяжелых металлов (1ПДК) происходит уменьшение удельной активности протеиназ в печени моллюсков, а при высокой концентрации токсикантов (10ПДК) - увеличение.

3. Под влиянием хлорорганических токсикантов наблюдается повышение удельной активности протеиназ в печени моллюсков (1ПДК, 24ч экспозиции), но в дальнейшем (48ч экспозиции) происходит уменьшение активности.

4. При низких концентрациях галогенароматических соединений (1ПДК) активность протеиназ возрастала на 21-30% к 24ч и 27-40% к 48ч, что вероятно связано с процессом адаптации организмов к изменяющимся условиям окружающей среды. При более высоких концентрациях (10ПДК) происходит снижение активности протеиназ через 24ч экспозиции на 14-17%. На более поздних этапах экспозиции активность продолжала снижаться на 94-98% по отношению к контролю.

5. Фенол и бензин оказывают наиболее существенное воздействие на активность комплекса протеолитических ферментов. Выявлено увеличение активности на отрезке от 1ч к 24ч экспозиции с последующим резким снижением активности к 48-72ч, при этом большинство (70%) моллюсков погибает после 72ч воздействия данных токсикантов.

6. Впервые методом электрофореза с ДДС-Na исследован белковый спектр печени моллюсков и определены молекулярные массы их полипептидных цепей, которые варьируют от 560Да до 533кДа. Под влиянием Cd²⁺ (10ПДК) на фоне увеличения протеолитической активности происходит распад полипептидов с молекулярными массами 375-512кДа и одновременно увеличивается число пептидов с массой около 960Да, что свидетельствует о распаде высокомолекулярных белков.

7. Разработан метод выявления протеолитической активности белков гепатопанкреаса после электрофореза в ПААГе. Высокая электрофоретическая подвижность белков, обладающих протеиназной активностью, свидетельствует об их небольшой молекулярной массе. В контроле выявлены 3 зоны активности, а под влиянием Hg²⁺, происходит исчезновение одной из зон, обладающей наименьшей электрофоретической подвижностью.

8. Впервые охарактеризованы степени ингибирования для различных подклассов протеиназ, что позволяет определить состав комплекса протеолитических ферментов в печени исследованного вида моллюсков: аспартильные протеиназы ? 52%, металлопротеиназы ? 32%, сериновые протеиназы ? 12% и тиоловые протеиназы ? 4%.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы

Статьи и журналы из перечня ВАК:

1. Конин Д.Н. Влияние ингибиторов на протеолитические ферменты печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2010. - М.: МГОУ - №1. - С. 33-35.

2. Конин Д.Н., Коничев А.С. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2007. - М.: МГОУ - №1. - С. 3-6.

3. Конин Д.Н., Коничев А.С., Селедкин А.Ю. Влияние хлорорганических соединений на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Вестник МГОУ. Серия «Естественные науки». - 2007. - М.: МГОУ - №2. - С. 3-7.

Материалы конференций:

4. Конин Д.Н. Влияние фенола на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. // Актуальные проблемы биоэкологи. Сборник материалов Международной научно-практической конференции. - 2008. - М.: МГОУ. - С. 61.

5. Конин Д.Н. Влияние ионов тяжелых металлов на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus viviparus L. // тез. докладов к VI симпозиуму: Химия протеолитических ферментов. М., ИБХ РАН, 2007. С. 123.

6. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Иванов В.Г., Коничев А.С. Влияние хлорпроизводных метана на множественные формы гидролаз живородки речной. // Научные труды МПГУ, Серия «Естественные науки». - 2004. - М.: Прометей. С. 335-337.

7. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Иванов В.Г., Коничев А.С. Влияние бензилхлорида на активность некоторых литических ферментов печени живородки речной. // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Институт биологии Карельского НЦ РАН, - 2004. - Петрозаводск: - С.68.

8. Конин Д.Н., Гаверова Ю.Г., Гева О.Н., Иванов В.Г., Коничев А.С. Воздействие экотоксикантов - хлорпроизводных метана на множественные формы некоторых гидролаз и дегидрогеназ живородки речной. // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Институт биологии Карельского НЦ РАН, - 2004. - Петрозаводск: - С.54.

9. Конин Д.Н. Влияние бензина на протеолитическую активность в печени моллюсков Viviparus Viviparus L. // Образование и наука для устойчивого развития. Сборник материалов Межвузовской научно-практическая конференции и научной школы для молодых ученых и студентов. - 2011. - М.: РХТУ. - С. 103-106.

Размещено на Allbest.ru