Морфофункциональная характеристика эпителиев при воздействии пептидного морфогена гидры

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Введение

Эндогенные регуляторные олигопептиды участвуют в различных проявлениях морфогенеза, влияя на течение жизненно важных процессов в организме человека и животных [Ашмарин И.П., Обухова Н.Ф., 1986, 1994; Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., 1996; Тимошин С.С., 2001; Brain S.D., Cox H.M., 2006; Varela N. et al., 2007; Tabata T., Takei Y., 2004]. Одним из активно изучаемых веществ этой группы является древний в филогенетическом отношении ундекапептид, первоначально выделенный из организма пресноводного кишечнополостного животного гидры (Hydra attenuata, современное название - Hydra vulgaris) и поэтому названный пептидным морфогеном гидры - ПМГ [Schaller H.С., 1973; Schaller H.С. et al., 1984]. Строение молекулы ПМГ де-тально изучено, она и ряд аналогов синтезированы в лабораторных условиях [Рубина А.Ю., 1992; Birr C., et al., 1981, Bodenmuller H. et al., 1987; Sakura N. et al., 1987; Schaller H.C., Bodenmuller H., 1981].

ПМГ обнаружен в тканях представителей различных классов, включая беспозвоночных, позвоночных животных [Балобанова Э.Ф., Крещенко Н.Д., 1988; Милосердов Ю.В., 1988; Тирас Х.П., 1988, Fuentes E.J. et al., 1993] и человека [Вараксин А.А. и др., 1987; Трясучева И.Г. и др., 1990; Bodenmuller H. et al., 1980; Sakura H. et al., 1991; Schaller H.C. et al., 1988]. Выделены и охарактеризо-ваны рецепторы ПМГ в тканях животных и человека [Christians S. et al., 1993; Hampe W. et al. 1999, 2000; Jacobsen L. et al., 1996; Kanaki T. et al., 1998; Neubauer K.H. et al., 1990]. ПМГ отнесен к нейропептидам, покольку он влияет рост и дифференцировку нейронов [Чимитдоржиев Ж.Ж., 2001; Kajiwara S., Sato T., 1986; Niemann S., Schaller H.C., 1996; Quach T.T. et al., 1992], а его содержание наиболее высоко в клетках и органах нервной системы как в норме, так и при патологических состояниях, включая опухоли [Вараксин А.А. и др., 1987; Трясучева И.Г. и др., 1990; Ekman R. et al., 1990;.Schaller H.C. et al., 1988; Schawaller M. et al., 1988; Winnikes M. et al., 1992].

В экспериментальных исследованиях установлено влияние ПМГ на органы и клетки сердечно-сосудистой, эндокринной, дыхательной, пищеварительной, репродуктивной систем и кожи [Виноградов В.А. и др., 1987; Ганьчева Е.А. и др., 1997; Казимирский А.Н., 1985; Кривошеев О.Г. и др., 1985; Лебедько О.А., Тимошин С.С., 1994, Лебедько О.А. и др, 1997, 2000; Мурзина Н.Б. и др., 1991; Сазонова Е.Н. и др. 1997; Слепушкин, и др., 1989; Спевак С.Е. и др., 1988; Тимошин С.С. и др., 1997, 1998; Федосеев В.А и др., 1993; Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990, 1991, 1997].

Между тем, основная часть морфологических исследований посвящена авторадиографическому изучению влияния ПМГ на активность пролиферации клеток. В этих исследованиях дается лишь общая усредненная оценка изучаемого процесса и не описываются его особенности в различных участках тканей и органов. Влияние ПМГ на структурные и метаболические характеристики тканей остается мало изученным.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить структурно-функциональные изменения эпителия различных органов (роговица, язык, пищевод, щитовидная железа) при воздействии пептидного морфогена гидры.

ЗАДАЧИ, определяющие достижение поставленной цели:

1. Гистологическая и морфометрическая оценка влияния пептидного морфогена гидры на структуру эпителиальных тканей различных органов: роговицы, языка, пищевода, щитовидной железы;

2. Характеристика метаболических изменений, вызываемых пептидным морфогеном гидры, в эпителиях указанных органов при использовании гисто-химических методов выявления ферментов с количественной цитофотометрической оценкой;

3. Изучение изменений пролиферативной активности эпителиев при воздействии пептидного морфогена гидры с использованием метода авторадиографии.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ. В проведенной работе при изучении эпителиев различных органов подтверждено ранее установленное стимулирующее влияние ПМГ на пролиферацию эпителиальных клеток. Выявлены не описанные особенности митогенного эффекта ПМГ на эпителиоциты, расположенные в различных топографических зонах в пределах единого эпителиального пласта в одном органе (периферия и центральные участки в роговице, дорсальная и вентральная поверхности языка, эпителий нитевидных сосочков и между сосочками на дорсальной поверхности языка).

Получены новые данные о влиянии ПМГ на архитектонику эпителиального пласта и соотношение толщины слоев в эпителиях различных органов, неодинаково выраженные в конкретных топографических зонах. При количественном анализе гистоэнзимологических характеристик эпителиев выявлено ранее не описанное стимулирующее влияние ПМГ на метаболическую активность покровных и железистых эпителиев, неодинаково выраженное в отдельных топографических зонах органов и слоях многослойных эпителиев. Впервые установлено, что под влиянием ПМГ существенно усиливается гетероморфия и гистоэнзимологическая неоднородность эпителиев.

Впервые изучено влияние пептидного морфогена гидры на морфофункциональные характеристики эндокринного органа - щитовидной железы. Получены новые данные о его стимулирующем действии на функционально ведущую ткань железы - эпителий, которые свидетельствуют о повышении функциональной активности органа.

ТЕОРЕТИЧЕСКАЯ И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Результаты проведенного исследования представляют теоретический научный интерес, так как они расширяют существенные представления о влиянии на структуру и функции эпителиальных тканей млекопитающих особого класса биологически активных регуляторных молекул - пептидных морфогенов, в частности, одного из наиболее древних в филогенетическом отношении пептидов - ПМГ. Полученные данные указывают на сложную организацию изученных эпителиальных тканей, которая проявляется неодинаковой чувствительностью к воздействию ПМГ топографически различных участков эпителия, расположенных даже в пределах единого пласта в одном органе. Практическое значение полученных данных заключается в возможности разработки фармакологических препаратов на основе пептидного морфогена гидры (или его аналогов) для использования с целью стимуляции регенерации эпителиальных тканей, заживления ран и лечения хронических заболеваний.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ:

1. В покровных многослойных эпителиях роговицы, языка и пищевода при воздействии ПМГ наблюдается увеличении толщины эпителиального пласта: в роговице отмечено ее нарастание от периферии к центру, в языке - на дорсальной поверхности в области между сосочками и на вентральной поверхности, в пищеводе - значимое увеличение толщины всего эпителиального пласта.

2. В железистом эпителии щитовидной железы введение ПМГ вызывало увеличение относительного содержания эпителия при снижении относительного содержания коллоида. Показатель степени фолликулярной организации щитовидной железы не изменился, а показатель активности - увеличился.

3. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы при воздействии ПМГ выявлено увеличение всех показателей, характеризующих пролиферативную активность - митотического индекса, индекса меченых ядер и интенсивности метки, выраженность которого зависит от топографических особенностей эпителия.

4. В эпителиях роговицы, языка, пищевода и щитовидной железы ПМГ вызывает усиление метаболической активности, неодинаково выраженное в отдельных слоях и топографических зонах эпителиального пласта.

1. Материал и методы исследования

Опыты поставлены на 94 нелинейных взрослых мышах-самцах (питомник «Рапполово») с массой тела 2025 г и 35 нелинейных взрослых крысахсамках (питомник Дальневосточного государственного медицинского университета) с массой тела 100120 г. Животным экспериментальных групп ПМГ вводили внутрибрюшинно 5кратно с интервалом 24 ч из расчета 100 мкг на 1 кг массы тела [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991]. Препарат синтезирован в Лаборатории синтеза пептидов Института экспериментальной кардиологии Российского Кардиологического научнопроизводственного комплекса Росздрава (Москва) и любезно предоставлен для проведения экспериментов руководителем лаборатории к.х.н. Ж.Д. Беспаловой. Животным контрольных групп с той же кратностью вводили стерильный изотонический раствор натрия хлорида. Животных умерщвляли декапитацией под лёгким эфирным наркозом через 24 ч после очередной инъекции ПМГ. Содержание животных, проведение экспериментов и выведение животных из эксперимента осуществляли в соответствии с приказом Минздрава СССР №755 от 1997г, а также правилами, утверждёнными этическим комитетом СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова. Для авторадиографического исследования крысам за 1 ч до забоя однократно внутрибрюшинно вводили 3Нтимидин с удельной активностью 84 Ки/моль в дозе 0,6 мкКи/г. Животным на поверхность роговицы дополнительно наносили 5 мкКи 3Нтимидина трижды в течение часа с интервалом в 20 мин [Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1991].

Гистологическое исследование роговицы, языка, пищевода, щитовидной железы проводили на серийных срезах, визуально оценивая общее состояние органов с учетом конкретных топографических зон: толщину эпителиального пласта, соотношение его слоев, тинкториальные характеристики, форму и взаимное расположение эпителиоцитов, их ядерно-цитоплазматическое соотношение, состояние ядерного аппарата, выраженность гетероморфии.

Морфометрическое исследование многослойных плоских эпителиев роговицы, языка и пищевода включало определение общей толщины эпителиального пласта и толщины отдельных его слоев [Автандилов Г.Г., 1990] с помощью линейного окулярного микрометра при увеличении 630. На поперечных срезах щитовидной железы проводили стереологическую оценку относительных объемов, занимаемых в органе эпителием (Е), в том числе его фолликулярным (Еf), интерфолликулярным (Ei) компонентами и коллоидом (С). На основании этих результатов определяли соотношения Еf/Ei и Е/С - показатели фолликулярной организации и активности щитовидной железы, соответственно. Измерения выполняли стереологическим методом точечного счета с тестсеткой окулярного микрометра с 25 точками; в ходе исследования учитывали данные, полученные при регистрации 1000 точек. [Быков В.Л., 1979]. Митотическую активность эпителиоцитов исследовали на тотальном препарате роговицы, а также на поперечных срезах роговицы, языка, пищевода и долей щитовидной железы. Оценивали митотический индекс, просматривая в среднем не менее 3000 клеток у каждой мыши на 5 срезах.

Гистохимическое исследование. На криостатных срезах материала, замороженного в жидком азоте, толщиной 10 мкм выявляли ряд ферментов, характеризующих метаболическую активность эпителиоцитов изучаемых органов: НАДН-диафоразу, сукцинат (СДГ) и лактатдегидрогеназу (ЛДГ). Активность ферментов оценивали цитоплазме клеток эпителия на спектроцитофотометре плаг-методом при увеличении 280, площади зонда 0,785 мкм2 и длине волны 545 нм, выражая результаты в относительных единицах оптической плотности (D) [Агроскин Л.С., Папаян Г.В., 1977; Быков В.Л., 1979]. Для многослойных эпителиев измерения проводили, учитывая по 100 клеток в базальном и шиповатом слоях на каждом из 5 срезов. Замеры D в щитовидной железе проводили в 100 тироцитах, исследуя по два тироцита в каждом фолликуле, расположенных друг против друга.

Авторадиографическое исследование проводили на парафиновых срезах толщиной 67 мкм. Для этого срезы тканей роговицы и языка депарафинировали и покрывали фотоэмульсией НИИХИМФОТО, после экспозиции препараты обрабатывали проявителем D19, фиксировали 33% раствором тиосульфата натрия, промывали водой и окрашивали гематоксилином ЛиллиМайера. Подсчитывали индекс меченых ядер (ИМЯ), который определяли как соотношение меченых ядер, над которыми было не менее 5 зерен серебра, к общему количеству ядер [Епифанова О.И. и др., 1977]. Определение ИМЯ проводили на основании просмотра не менее 3000 клеток у каждого животного. Интенсивность метки, (ИМ) отражающую скорость синтеза ДНК, оценивали путем подсчета зерен серебра над 25 мечеными ядрами. Подсчет производили в генеративных зонах исследуемых тканей [Хомичук А.Ю., 1995] при увеличении 630.

Статистическая обработка количественных данных проведена с использованием программного пакета Statistica for Windows V6.0. Для каждого показателя определяли среднее значение и ошибку средней арифметической; различия величин показателей оценивали с помощью критерия Стьюдента, считая их значимыми при Р<0,05.

2. Результаты исследования и их обсуждение

Изменение структурно-функциональных показателей эпителия роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры. Гистологическое строение многослойного плоского неороговевающего эпителия роговицы исследованных животных, а также данные о ее толщине у животных контрольной группы полностью соответствуют приведенным в литературе [Collinson J.M. et al., 2004; Gipson I.K., Sugrue I.P., 1994]. Средняя толщина эпителия роговицы мышей составляет 30,2 ± 0,09 мкм, она выше в центральных участках роговицы (33,1 ± 0,17 мкм) по сравнению с периферическими (25,4 ± 0,23 мкм).

При введении ПМГ происходило выявляемое визуально и подтвержденное морфометрическим исследованием увеличение толщины эпителиального пласта (в среднем на 40%), преимущественно за счет 2-кратного утолщения шиповатого слоя (с 15,1 ± 0,07 до 30,3 ± 0,12 мкм), что указывает на увеличение пула дифференцирующихся клеток. В центральных участках роговицы нарастание толщины эпителия было более выраженным (в 1,6 раза), чем в периферических (в 1,2 раза), тем самым, введение ПМГ вызывало усиление имеющейся в норме зональной гетероморфии ткани. Гетероморфия является характерным признаком архитектоники роговицы, закономерности которой описываются так называемой «X-Y-Zгипотезой» [Thoft R.A., 1983], и, вероятно, служит отражением расположения генеративных зон эпителия в наиболее периферических участках и центростремительного перемещения клеток, которое сочетается с их вертикальной миграцией [Димент А.В., Лебедева Г.С., 1973; Cotsarelis G. et al., 1989; Haddad A., 2000].

Нарастание толщины пласта эпителия связано с усилением митотической активности в ответ на введение ПМГ, которое зарегистрировано нами как на гистологических срезах и тотальных препаратах при проведении подсчета митозов, так и методом авторадиографии. МИ значимо увеличивался в среднем с 10,1 ± 0,08 до 13 ± 0,19‰. При этом в центральных участках роговицы он возрастал менее резко (в 1,2 раза с 9,5 ± 0,09 до 11,4 ± 0,15‰), чем периферических (в 1,5 раза с 10,2± 0,22 до 15,3± 0,07‰). ИМЯ в роговице крысы после введения ПМГ значимо увеличивался в 1,3 раза с (9,7 ± 0,27 до 12,9 ± 0,65‰), ИМ также значимо увеличивалась в 1,3 раза (с 13,8 ± 0,11до 17,6 ± 0,18).

Полученные нами данные согласуются со сведениями об общем стимулирующем влиянии ПМГ на процессы пролиферации в эпителии роговицы [Тимошин С.С. и др.1997; Хомичук А.Ю., Тимошин С.С., 1990; 1991]. Вместе с тем, нами впервые отмечены топографические различия, связанные с зональностью роговицы. Поскольку описанный эффект наблюдался нами и другими авторами в роговице мышей и крыс, очевидно, что он не является видоспецифичным.

При гистохимическом исследовании все изученные ферменты (НАДНдиафораза, СДГ, ЛДГ) выявлены в клетках эпителия роговицы у животных как контрольной, так и экспериментальной группы. Они определяются во всех слоях эпителия, однако визуально не удавалось отметить какихлибо различий в активности ферментов ни между базальным и шиповатым слоями, ни в отдельных топографических зонах (центр - периферия роговицы).

При воздействии ПМГ цитофотометрическая оценка гистохимических реакций выявила нарастание средней активности НАДНдиафоразы (в 1,3 раза) и СДГ (в 1,6 раза) в цитоплазме клеток, что свидетельствует о стимулирующем влиянии ПМГ на окислительновосстановительные процессы в эпителии роговицы. Активность ЛДГ не менялась. Ранее отмечено, что высокая активность СДГ и других дегидрогеназ характеризуют нормальный метаболизм этой ткани, а ее снижение служит показателем повреждения [Cejkova J. et al., 1992; Salla S. et al., 1995; Feng Y. et al., 2004]. Поскольку ЛДГ рассматривается как маркер дифференцировки эпителия роговицы [HernandezQuintero M. et al., 2002], можно предположить, что отсутствие изменений ее активности при введении ПМГ обусловлено высоким уровнем его дифференцировки или значением устойчивой активность ЛДГ в поддержании тканевого гомеостаза.

При введении ПМГ выявлены ранее отсутствовавшие различия активности ферментов в отдельных топографических зонах с ее нарастанием от центра к периферии роговицы. Так, активность НАДНдиафоразы у мышей контрольной группы значимо не различается в центральной и периферической зонах, а после введения ПМГ эти различия становились значимыми и достигали 1,5 раза Аналогичным образом, различия активности СДГ достигают 1,6 раза. Указанные различия не выявлены для ЛДГ.

Дифференциальная оценка эффекта ПМГ с учетом различных слоев эпителия показала, что его действие значимо для активности НАДН-диафоразы в базальном слое, СДГ - в базальном и шиповатом слоях. Влияние ПМГ на активность ЛДГ во всех слоях эпителия по отношению к таковой в контрольной группе не выявлено. Между тем, количественная оценка гистохимических реакций обнаружила также различия активности всех исследованных ферментов между слоями эпителия (базальным и шиповатым), которые отсутствовали в контрольной группе. После введения ПМГ соотношение активности ферментов в базальном и шиповатом слоях составило 1,6, 1,4 и 2,0 для НАДН-диафоразы, СДГ и ЛДГ соответственно.

В целом, на основании полученных данных можно заключить, что ПМГ вызывал усиление метаболической активности в эпителии роговицы, которое было выраженным примерно в равной степени для СДГ и НАДН-диафоразы и практически не проявлялось в отношении ЛДГ. Этот эффект может являться частично следствием нарастания митотической активности, что согласуется с нашими данными о ее максимальной выраженности в периферических отделах роговицы - участке с наиболее активной пролиферацией клеток. Однако выявление эффекта ПМГ в шиповатом слое указывает на его способность активировать метаболизм дифференцированных клеток. Характерным следствием воздействия ПМГ явилось возрастание гисто-энзимологической неоднородности с появлением различий в активности ферментов между зонами и слоями внутри пласта.

Изменение структурно-функциональных показателей эпителия языка при воздействии пептидного морфогена гидры. Эпителий языка у исследованных животных имеет типичную структуру, характерную для этой ткани у мышей и крыс [Мамонтов С.Г., 1968; Рыбаков В.П., 1984; Hill M.W., 1988; Loe H. et al., 1972; Maier H. et al., 1994; Schroeder H.E., 1981, 1987]. Он обладает структурными различиями на различных поверхностях. На вентральной поверхности он многослойный плоский ороговевающий со сравнительно тонким роговым слоем, под ним располагается собственная пластинка слизистой оболочки со слабо выраженным папиллярным слоем. На дорсальной поверхности языка в средней части органа эпителий имеет различное строение в области нитевидных сосочков и расположенных между ними интерпапиллярных зон. Нитевидные сосочки языка имеют вид асимметричных заостренных пирамидных структур и образованы первичными и вторичными выпячиваниями собственной пластинки [Kobayashi K. et al., 2001, 2004], покрытыми многослойным плоским ороговевающим эпителием; его роговой слой распределен неравномерно по поверхности сосочков, преобладая на их выпуклой стороне. Показатели толщины эпителиального пласта у мышей контрольной группы (41,2 ± 0,23; 42,0 0,17 и 57,1 ± 0,31 мкм на дорсальной поверхности в области сосочков, между ними и на вентральной поверхности соответственно) примерно совпадают с описанными в литературе [Hill M.W., 1988; Hill M.W. et al., 1981].В целом, полное (хотя и неодинаково выраженное) ороговение эпителия языка во всех его участках отражает особенности питания грызунов и является дополнительным защитным приспособлением, препятствующим повреждению этой ткани грубой пищей [Быков В.Л., 1996,1997; Schroeder H.E.,1981; Dale B.A. et al., 1990].

После введения ПМГ структура эпителия языка на обеих поверхностях, в целом, не менялась по сравнению с таковой в контрольной группе. Однако, как показало визуальное исследование, подтвержденное данными морфометрии, толщина эпителия увеличивалась (преимущественно за счет шиповатого слоя) на вентральной поверхности языка (в 1,8 раза), на дорсальной - между сосочками (в 1,4 раза). В области сосочков значимых изменений этого показателя не отмечено.

Нарастание толщины эпителия в языке рассматривают как приспособительный механизм, который в сочетании с повышенной скоростью обновления эпителия усиливает его барьерные свойства и препятствует проникновению в эпителий микробов, их продуктов, а также аллергенов, мутагенов и канцерогенов [Быков В.Л., 1996, 1997; Cameron I.L., 1966; Dale B.A. et al., 1990; Goldberg M., 1993; Hill M.W., 1988; Hill M.W. et al., 1981; Schroeder H.E., 1981; Ten Cate A.R., 1994]. Напротив, истончение эпителия рассматривается как неблагоприятный признак, вследствие которого эпителий и подлежащие ткани подвергаются усиленному воздействию повреждающих веществ, в частности, канцерогенов [Maier H. et al., 1994].

Утолщение эпителия при введении ПМГ является прямым следствием нарастания пролиферативной активности его клеток. У мышей контрольной группы митотическая активность эпителия на дорсальной поверхности языка (3,2 ± 0,26 и 2,9 ± 0,38‰ - в области сосочков и между ними соответственно) и на его вентральной поверхности (3,0 ± 0,18‰), по нашим данным, значимо не различается и лежит в пределах величин, описанных в литературе [Мамонтов С.Г., 1968; Радивоз М.И. и др., 1991, Рыбаков В.П., 1984; Тимошин С.С., Жданова Т.Ф., 1987; Cameron I.L., 1966; Hill M.W., 1988; Hill M.W. et al., 1981].

После введения ПМГ нарастание митотической активности было особенно выраженным на вентральной поверхности языка, где этот показатель увеличился в 1,7 раза по сравнению с таковым в контроле, менее существенное увеличение отмечено на дорсальной поверхности между сосочками (в 1,5 раза), тогда как в области сосочков статистически значимые изменения активности пролиферации отсутствовали. Полученные данные полностью согласуются с результатами авторадиографического анализа: у крыс после введения ПМГ значимо в 1,3 раза возросло количество ДНКсинтезирующих клеток в эпителии (увеличение ИМЯ с 9,04 ± 0,55‰ до 11,8 ± 0,42‰) на вентральной поверхности языка (дорсальная не исследовалась). При этом ИМ увеличился в 1,2 раза (с 16,4 ± 0,37 до 19,7 ± 0,98).

Полученные нами данные о стимулирующем влиянии ПМГ на пролиферативную активность эпителия языка согласуются с результатами других исследователей [Лебедько О.А., Тимошин С.С., 1994; Лебедько О.А. и др, 1997; Сазонова Е.Н. и др. 1997; Хомичук А.Ю., С.С. Тимошин, 1990], которые, однако, изучали эту ткань без учета ее топографических особенностей в органе. Между тем, эпителий различных топографических зон языка существенно различается не только своим строением, выраженностью гетероморфии, но и клеточной кинетикой, а также биоритмическими характеристиками [Kellett M. et al., 1989; Potten C.S. et al., 2002]. В этой связи интересно, что, по нашим данным, до введения ПМГ митотическая активность клеток в базальном слое эпителия языка значимо не различалась во всех трех изученных локализациях, однако после введения ПМГ она увеличивалась неравномерно, в результате чего через 1 сутки после заключительной инъекции она оказывалась более высокой на вентральной поверхности, чем на дорсальной. Таким образом, под влиянием ПМГ заметно усиливалась гетероморфия эпителия языка.

Данные количественного гистохимического анализа подтверждают выводы о стимулирующем влиянии ПМГ на эпителий языка, поскольку они свидетельствуют о повышении активности всех изученных ферментов. Последнее выражено неодинаково в зависимости от топографических зон языка: оно более выражено на вентральной поверхности (в 1,9-2,4 раза для разных ферментов), а на дорсальной поверхности отмечено лишь в участках эпителия между сосочками языка (в 1,5-1,8 раза). В области сосочков изменения отсутствовали.

Воздействие ПМГ приводило не только к общему повышению метаболической активности ткани, но и к появлению ранее отсутствовавших топографических гистоэнзимологических различий: активность НАДН-диафоразы и ЛДГ в эпителии, расположенном на вентральной поверхности языка, стала значимо превышать таковую на дорсальной (в 1,7 и 1,8 и раза соответственно). Вызванное введением ПМГ повышение активности ферментов не может быть отражением лишь усиленной пролиферации, так оно происходило не только в базальном, но и в шиповатом слое, содержащем преимущественно дифференцирующиеся клетки.

Изменение структурно-функциональных показателей эпителия пищевода при воздействии пептидного морфогена гидры. Многослойный плоский ороговевающий эпителий пищевода мышей контрольной группы имеет типичное строение, характерное для грызунов, в частности, для исследованного вида. Ороговение этого эпителия определяются свойственным данному виду характером питания [Бажанов А.Н., 1978; Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006; Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006; Leblond C.P et al., 1964; Oliveira J.A. et al., 1990; Schonnagel B., 2005]. Граница между эпителием и подлежащей собственной пластинкой слизистой оболочки сравнительно ровная, соединительнотканные сосочки, вдающиеся в эпителий, выражены слабо, поэтому существенные колебания толщины эпителия в различных участках отсутствуют. По данным морфометрическогo исследования, толщины эпителиального пласта у животных контрольной группы составляет 58,1 ± 1,13 мкм, а его базального, шиповатого и рогового слоев - 4,8 ± 0,07, 36,3 ± 0,21 и 15,5 ± 0,33 мкм соответственно. Эти величины лежат в пределах, которые описаны у взрослых мышей [Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006; Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006; Schonnagel B., 2005].

У животных, получавших ПМГ, структура эпителия, в целом, не изменялась, однако толщина эпителиального пласта значимо увеличилась в 1,4 раза, шиповатого слоя - в 1,7 раза, базального - в 1,3 раза по сравнению с аналогичными показателями в контроле. Толщина зернистого и рогового слоев после введения ПМГ значимо не изменялась. Описанные изменения типичны для реакции пищевода и других многослойных эпителиев на факторы, которые вызывают усиленный рост этой ткани [Black D.D et al., 1990; Bove M., et al., 2005; Farrell C.L et al., 1999; Geboes K., Desmet V., 1978; Juhl C.O. et al., 1995; Oliveira J.A. et al., 1990; Seefeld U. et al., 1977]. Разрастание эпителия пищевода в условиях повреждения с увеличением толщины служит одной из его главных защитных реакций [Быков В.Л., Исеева Е.А., 2006; Livstone E.M. et al., 1977]. Увеличение толщины эпителия с (преимущественным за счет шиповатого слоя) после воздействия ПМГ указывают на стимуляцию пролиферации эпителия и увеличение популяции дифференцирующихся клеток.

Эти результаты согласуются с обнаруженным нами увеличением митотической активности в эпителии в 1,4 раза (с 16,5 ± 0,46 ‰ в контрольной группе до 23,1 ± 0,27 ‰). Величины показателей митотической активности, а также данные о преимущественной локализации пролиферирующих клеток в базальном слое эпителия пищевода мышей согласуются с данными литературы [Исеева Е.А., Быков В.Л., 2006; Рыбаков В.П., Романов Ю.А., 1989; Duan H. et al., 1993].

При проведении гистохимического исследования у животных контрольной группы НАДНдиафораза, СДГ, ЛДГ выявлены во всех слоях эпителия, кроме рогового, что согласуется с данными, представленными в литературе [Исеева Е.А., Быков В.Л.. 2006; DeLahunta A., 1965]. Введение ПМГ не меняло характера распределения продуктов гистохимических реакций в клетках эпителия пищевода, однако вызывало нарастание активности НАДНдиафоразы и СДГ в базальном (в 1,6 и 1,4 раза) и шиповатом слоях (в 1,3 и 1,5 раза) и ЛДГ - в шиповатом слое (в 1,4 раза).

Характерной особенностью метаболической реакции эпителиоцитов на ПМГ служит появление различий в активности ферментов между слоями эпителия, которые отсутствовали в контрольной группе. Так, после введения ПМГ появились значимые различия в активности НАДНдиафоразы и ЛДГ между базальным и шиповатым слоями (при соотношениях 1,3 и 1,36).

Увеличение активности изученных ферментов в эпителии пищевода после введения ПМГ, вероятно, частично обусловлено нарастанием пролиферативной активности, что согласуется с повышением активности гистохимических реакций в базальном слое, где сосредоточен основной пул пролиферирующих клеток. Вместе с тем, ПМГ вызывает нарастание активности исследованных ферментов и в шиповатом слое - зоне дифференцирующихся клеток. Таким образом, в целом, стимулирующее влияние ПМГ на эпителий пищевода проявляется усилением его пролиферации и метаболической активацией при неравномерной реакции отдельных его слоев и усилении структурной и функциональной неоднородности ткани.

Изменения структурно-функциональных показателей эпителия щитовидной железы при воздействии пептидного морфогена гидры. Щитовидная железа мышей контрольной группы имеет типичное фолликулярное строение и состоит из функционально ведущего эпителиального компонента - продуцента тиреоидных гормонов, представленного фолликулярным и интерфолликуляным эпителием, коллоида (тиреоглобулина), который является секреторным продуктом тиреоидного эпителия, и стромой, содержащей сосуды и нервы [Быков В.Л., 1979, 2001]. При использованной стандартной гистологической окраске еще один функционально важный компонент щитовидной железы - С (парафолликулярные) клетки, продуцирующие кальцитонин, - не выявляется, однако в связи с незначительным объемом, который они занимают в железе [Petko M. et al., 1976; Conde E. et al., 1991], их включение в состав объема тиреоидного эпителия не может существенно повлиять на точность измерений.

По данным стереологического анализа, у животных контрольной группы средние относительные объемы (волюметрические фракции), занимаемые в железе фолликулярным и интерфолликулярным эпителием, а также коллоидом составляют 25,9 ± 1,12, 13,5 ± 0,97 и 32,0± 1,08% соответственно. Соотношения фолликулярного и интерфолликулярного эпителия (показатель степени организации эпителия в фолликулы) и эпителия (всего) и коллоида (показатель активности щитовидной железы) составляют соответственно 1,9 ± 0,05 и 1,2 ± 0,13. Указанные выше показатели находятся в пределах величин, описанных в литературе [Быков В.Л. 1976, 1979, 2001; Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2004; Delverdier M. et al., 2001; Malendowicz L.K., Woznicki G., 1986].

Введение ПМГ, в целом, не приводило к резким изменениям в фолликулярной организации и структурно-функциональной зональности долей щитовидной железы. Между тем, по данным морфометрического анализа, ПМГ вызывал почти 2кратное увеличение относительного объема тиреоидного эпителия при одновременном снижении волюметрической фракции коллоида в 1,4 раза. Эти сдвиги указывают на усиление процессов резорбции тиреоидного коллоида, т.е. на повышение функциональной активности щитовидной железы в целом, поскольку активация резорбции коррелирует с повышенной секрецией тиреоидных гормонов [Быков В.Л., 1979; Хмельницкий О.К., 1993]. Соотношение волюметрических фракций тиреоидного эпителия и коллоида после введения ПМГ увеличивалось в 2,7 раза, а фолликулярного и интерфолликулярного эпителия - значимо не менялось.

Активация тиреоидного эпителия под влиянием ПМГ, выявленная в проведенном исследовании, сочеталась с выраженной статистически значимой митогенной реакцией (МИ нарастал в 1,6 раза с 0,81± 0,07 до 1,32 ± 0,15 ‰). Полученные в нашем исследовании данные об уровне митотической активности в эпителии щитовидной железы лежат в пределах величин, приведенных в работах различных авторов. [Павлов А.В. 1992; Павлов А.В., Антипанова Е.М., 1988; Романов Ю.А., Степанова Л.И., 1974; Bybee A., Tuffery A.R., 1989; Conde E. et al., 1992; Kimura T. et al., 2001]. Нарастание пролиферативной активности тироцитов обычно сочетается с усилением функциональной активности щитовидной железы, что отмечено и в проведенном нами исследовании.

Гистохимическое исследование выявило высокую активность НАДН-диафоразы, СДГ, ЛДГ в цитоплазме тироцитов, что согласуется с результатами ранее выполненных работ [Быков В.Л., 1976; Клечиков В.З., Плинер Л.И., 1974; Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2001; Arvy L., 1971; Lindsay S., Jenks P.R., 1961].

Характер распределения продуктов реакций в тироцитах не менялся под влиянием ПМГ, однако уже при визуальной оценке отмечалось нарастание активности изученных ферментов. Описанный эффект подтвержден результатами цитофотометрического анализа, которое выявило статистически значимое увеличение интенсивности гистохимических реакций, максимально выраженное для НАДНдиафоразы (в 1,7 раза), умеренно - для ЛДГ (в 1,5 раза) и минимально - для СДГ (в 1,3 раза). Нарастание активности исследованных ферментов указывает на стимулирующее влияние ПМГ на метаболизм и функцию тиреоидного эпителия [Быков В.Л.,1976; Клечиков В.З., Плинер Л.И., 1974; Юкина Г.Ю., Быков В.Л., 2001; Arvy L., 1971; Lindsay S., Jenks P.R., 1961].

Таким образом, в целом полученные морфометрические и гистохимические данные свидетельствуют об активации тиреоидного эпителия и железы под действием ПМГ. Эти выводы согласуются со сведениями об усиленной секреции тиреоидных гормонов у животных, получавших ПМГ [Мурзина Н.Б. и др., 1991], а также о том, что введение ПМГ нивелирует угнетающее влияние стресса на уровни тиреотропного и тиреоидных гормонов [Тимошин С.С. и др., 1997]. Морфофункциональных исследований влияния ПМГ на тиреоидный эпителий или щитовидную железу в целом ранее не проводили. Описанное действие ПМГ может объясняться как его прямым влиянием на тироциты, так и влиянием, опосредованным через гипофиз, о чем говорит зарегистрированное ранее воздействие ПМГ на уровни ТТГ.

ПМГ, вероятно, является одним из элементов сложной регуляторной системы нейропептидов, которая контролирует различные функции клеток щитовидной железы - пролиферацию, дифференцировку, функциональную активность, опухолевый рост [Costamagna M.E. et al., 2002; Lenziardi M. et al., 1995; Paez Pereda M. et al., 2000; Raspe E. et al., 1991;Tseng Y.C. et al., 1993; Tsuzaki S., Moses A.C., 1990]. При анализе влияния ПМГ и других нейропептидов на активность тиреоидного эпителия следует учитывать, что гормоны щитовидной железы, в свою очередь, воздействуют на синтез некоторых нейропептидов [Fullerton M.J. et al., 1990], а также оказывают существенное регуляторное влияние на разнообразные функции организма: созревание и дифференцировку клеток и тканей, секрецию факторов роста, гормонов и цитокинов, активность метаболизма и др. [Harvey C.B., Williams G.R., 2002; Hulbert A.J., 2000].

Заключение

ВЫВОДЫ.

1. По данным гистологического, морфометрического, количественного гистохимического и авторадиографического исследования, пептидный морфоген гидры оказывает стимулирующее воздействие на покровные (роговица, язык, пищевод) и железистый (щитовидная железа) эпителии, усиливая их пролиферативную и метаболическую активность, увеличивая толщину эпителиальных пластов и изменяя их цитоархитектонику. Указанные реакции неодинаково выражены в различных эпителиях, а также их отдельных слоях и топографических зонах. Под влиянием пептидного морфогена гидры существенно усиливается гетероморфия и гистоэнзимологическая неоднородность эпителиев.

2. В многослойном плоском неороговевающем эпителии роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры происходит увеличение толщины эпителиального пласта (преимущественно за счет шиповатого слоя), которое более выражено в центральной зоне роговицы. Отмечено усиление ДНКсинтезирующей и митотической активности эпителиоцитов, более значительное в периферической зоне роговицы. Пептидный морфоген индуцирует повышение активности НАДН-диафоразы (в базальном слое эпителия) и СДГ (в базальном и шиповатом слоях), которая нарастает от центра к периферии роговицы, не оказывая влияния на активность ЛДГ. Следствием воздействия морфогена явилось возрастание гистоэнзимологической неоднородности с появлением различий в активности ферментов между зонами и слоями внутри пласта.

3. Многослойный плоский ороговевающий эпителий языка после введения пептидного морфогена гидры утолщается (преимущественно за счет шиповатого слоя) - максимально на вентральной поверхности, а также на дорсальной поверхности между нитевидными сосочками языка в отсутствие значимой реакциии в области нитевидных сосочков. После введения морфогена нарастает ДНКсинтезирующая и митотическая активность эпителиоцитов; последняя наиболее высока на вентральной поверхности языка, менее выражена в эпителии между сосочками и не меняется в области сосочков. Активность СДГ, ЛДГ и НАДНдиафоразы более резко нарастает в эпителии вентральной поверхности языка и на дорсальной поверхности между сосочками языка; в области сосочков изменения активности ЛДГ и СДГ менее выражены, а НАДНдиафоразы - отсутствуют. Под влиянием пептидного морфогена возникают различия в активности НАДНдиафоразы и ЛДГ в эпителии, расположенном на вентральной и дорсальной поверхностях языка.

4. Многослойный плоский ороговевающий эпителий пищевода под действием пептидного морфогена гидры утолщается (преимущественно за счет шиповатого слоя), что сочетается с увеличением его митотической активности. Морфоген вызывает также повышение активности исследованных ферментов: НАДН-диафоразы и СДГ - в базальном и шиповатом слоях, а ЛДГ - в шиповатом слое. При этом под влиянием морфогена появляются различия в активности ферментов между базальным и шиповатым слоями эпителия, которые отсутствовали в контрольной группе.

5. В щитовидной железе введение пептидного морфогена гидры вызывает значительное увеличение относительного объема (волюметрической фракции) тиреоидного эпителия при одновременном снижении относительного объема его секреторного продукта - интрафолликулярного коллоида, что приводит к резкому увеличению их соотношения, которое служит показателем активности щитовидной железы. Соотношение волюметрических фракций фолликулярного и интерфолликулярного эпителия (показатель степени фолликулярной организации железы) значимо не менялось. Морфоген вызывает также значимое нарастание пролиферативной активности тироцитов и увеличение активности ферментов НАДН-диафоразы, СДГ и ЛДГ в их цитоплазме.

Практические рекомендации.

Выявленное стимулирующее влияние пептидного морфогена гидры на пролиферативную и метаболическую активность эпителиев может лежать в основе разработки средств для стимуляции регенерации эпителиев после их повреждения. Напротив, блокирование действия пептидного морфогена гидры с помощью его антагонистов может препятствовать избыточное разрастание эпителия, например, при гиперпластических процессах и опухолевом росте. Сведения о влиянии пептидного морфогена гидры на морфофункциональное состояние эпителия различных органов целесообразно использовать в учебном процесс на кафедрах гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии и патологической физиологии.

Литература

1. Кулаева В.В., Лебедько О.А., Рубина А.Ю. и др. Влияние пептидного морфогена гидры на поддержание структурного гомеостаза в норме и при стрессе // Тезисы II съезда физиологов Сибири и Дальнего Востока. - Новосибирск: Изд-во НГМИ, 1995. - С. 242.

2. Быков В.Л., Кулаева В.В. Гистохимическая характеристика эпителия ро-говицы при введении пептидного морфогена гидры // Бабухинские чтения в Ор-ле. Материалы 5 Всероссийской конференции. - М.: Изд-во ЗАО «Ретиноиды», 2006. - С. 67-68.

3. Быков В.Л., Кулаева В.В. Влияние пептидного морфогена гидры на структурно-метаболические характеристики в эпителиальной ткани роговицы // Материалы II Международного эмбриологического симпозиума «Югра-Эмбрио - 2006». Научный вестник Ханты-Мансийского Государственного медицинского института. 2006. - №2. - С. 27 - 28.

4. Кулаева В.В., Быков В.Л. Топографические особенности изменения эпителия языка после введения пептидного морфогена гидры: морфометрическая характеристика // Морфология. - 2006. - Т. 129, вып. 4. - С.72.

5. Кулаева В.В., Быков В.Л. Реакция эпителия на пептидный морфоген гидры: гистологический и количественный гистоэнзимологический анализ // В кн.: Современные проблемы морфологии - СПб: Изд-во СПб., отд. ВНОАГЭ. - 2006. - вып. 1. - C. 58 - 59.

6. Кулаева В.В., Быков В.Л. Гистоэнзимологическая характеристика эпи-телия роговицы при воздействии пептидного морфогена гидры // В кн.: Акту-альные вопросы эволюционной, возрастной и экологической морфологии. -Белгород: Изд-во БелГУ. - 2006. - C. 95.

7. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическая и гистохимическая оценка изменений эпителия пищевода при воздействии пептидного морфогена гидры // В. кн. Актуальные проблемы морфологии. - Минск: Изд-во БГМУ. - 2006. - С. 89 - 90.

8. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическая и гистохимическая характеристика эпителия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфо-логия. - 2006. - Т. 129, вып.5. - С. 56.

9. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфометрическое и гистохимическое исследование эпителия роговицы при введении пептидного морфогена гидры // В. кн.: Актуальные вопросы современной морфологии и физиологии. - СПб: Изд-во ДЕАН. - 2007. - С. 255 - 256.

10. Кулаева В.В., Быков В.Л. Количественный анализ структурных и метаболических изменений эпителия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфология. - 2007. - Т. 131, вып. 3. - C. 78.

11. Кулаева В.В., Быков В.Л. Морфофункциональная характеристика эпителия языка при введении пептидного морфогена гидры // Морфология. - 2007. - Т. 131, вып. 3. - С. 41 - 44.

Размещено на Allbest.ru