Морфологические и цитохимические особенности клеток крови морских млекопитающих в связи с адаптацией к среде обитания

Одинаковый уровень фагоцитарных показателей нейтрофилов у взрослых тюленей и щенков и более низкое число эстеразоположительных лимфоцитов у последних можно рассматривать как свидетельство того, что система фагоцитоза у детенышей тюленей, завершивших ювенильную линьку, находится на более высокой стадии зрелости, чем система специфического иммунитета.

Таблица 6 - Показатели фагоцитарной активности лейкоцитов гренландских тюленей (M±m, в скобках - пределы колебания показателей)

Группы	ФЧ	ФИ
тюленей	Спонт.	Стимул.	ИС1, %	Спонт.	Стимул.	ИС2, %
Взрослые, n = 6	58.5±6.7 (32-74)	68.34±5.8 (41-80)	17.7 (0-25.4)	18.2±1.4 (14.2-23.5)	22.7±2.3 (14.2-31.6)	25.0 (0-54.1)
Серки, n = 10	61.3±4.4 (36-86)	70.6±4.5 (58-86)	15.1 (0-72.6)	13.7±1.6 (8.7-26.5)	16.2±1.8 (10.0-25.5)	18.3 (0-31.2)
Заморыши, n = 10	49.5±5.0 (30-68)	56.2±5.4 (29-79)	13.5 (0-45.7)	16.0±1.6 (10.4-24.7)	20.6±2.0 (13.5-31.5)	28.2 (0-110)

Примечание. ФЧ - фагоцитарное число, % фагоцитирующих нейтрофилов; ФИ - фагоцитарный индекс, среднее число поглощенных частиц латекса на 1 нейтрофил;. ИС - индекс стимуляции продигиозаном.



4.3 Детеныши тюленя хохлача

Хохлачам свойствен ряд особенностей, отличающих их от настоящих тюленей других видов. К ним относятся: ювенильная линька во время внутриутробного развития, самый короткий среди млекопитающих период лактации (около 4-х дней), раннее половое созревание - самки хохлача становятся половозрелыми в 2-3 года (Бурдин и др., 2009). Это позволяет также ожидать у этих тюленей более быстрого постнатального развития различных систем организма, включая систему кроветворения.

Однако это предположение не подтвердилось. Очевидно, клеточный состав крови детенышей тюленей определяется другими, более значимыми факторами. У всех исследованных животных встречаются юные формы клеток - метамиелоциты, оксифильные нормоциты (предшественники эритроцитов, содержащие ядро) и ретикулоциты (эритроциты с остатками ядер). В значительном количестве присутствуют палочкоядерные (низкодифференцированные) формы лейкоцитов - в среднем 11.1±1.2%, что больше, чем у щенков гренландского и серого тюленей в данный возрастной период (3.8±0.3 и 1.6±0.3%, соответственно). Число лимфоцитов выше числа сегментоядерных нейтрофилов (табл. 7).

Средняя величина ЯОРAg/Я у гренландских тюленей и хохлачей возраста 1-1.5 мес. различается незначительно (0.095±0.001 и 0.099±0.001, соответственно) у серого тюленя она гораздо выше (0.122±0.001). Однако число клеток с четырьмя районами организаторов ядрышка у хохлача - 3.8%, а у представителей других исследованных нами в данном отношении видов тюленей они встречаются очень редко (0-0.5%). Среднее число ЯОРAg в одном лимфоците у тюленей одинакового возраста (1-1.5 мес.) составило: 1.29±0.05 (гренландский тюлень); 1.31±0.05 (серый тюлень); 1.91±0.08 (хохлач).

Согласно полученным результатам, изменения в составе лейкоцитарной формулы крови у хохлача, серого и гренландского тюленей подчинены ряду общих закономерностей. Так, высокое содержание нейтрофилов в крови новорожденных сменяется уменьшением его в первые дни или месяцы жизни и нарастанием их числа в более позднем возрасте.

Таблица 7 Лейкоцитарная формула крови хохлачей различных возрастных групп (M±m)

	Типы лейкоцитов, %
Группы тюленей	Ю	П	С	Э	Б	М	Л
1*, ? 4 дня n = 9	н.д.	58±8	4±3	0	10±4	27±8
2**, 1-1.5 мес., n=13	0.4±0.2	11.1±1.2	37.9±2.2	7.5±1.6	1.9±0.4	3.5±0.8	37.7±2.4
3*, взрослые самцы, n=5	н.д.	79±3.0	7±2	2±1	3±2	10±3
4*, взрослые самки, n=6	н.д.	76±2	6±2	3±2	8±3	9±3

Примечание.* Залив Св. Лаврентия, 11-13 марта 2001г. (по: Boily et al., 2006); ** Гренландское море 25 апреля - 3 мая 2009г. (собственные данные).

Для новорожденных и взрослых тюленей хохлача характерен нейтрофильный профиль крови. После завершения молочного вскармливания происходит уменьшение относительного числа сегментоядерных нейтрофилов и повышение - лимфоцитов, т.е. "физиологический перекрест" лейкоцитарной формулы крови. Это явление отмечено нами у "бельков" гренландского тюленя, т.е. детенышей, питающихся молоком матери. У серых тюленей он установлен в возрасте 1-1.5 месяцев (т.е., после завершения молочного питания). Щенки же гренландского тюленя после завершения молочного кормления и ювенильной линьки уже имеют нейтрофильный профиль крови. Высокий уровень сегментоядерных нейтрофилов в первые дни и месяцы жизни обусловлен поступлением с молоком матери гормонов и рассматривается как приспособление, обеспечивающее неспецифическую защиту организма от инфекций в раннем онтогенезе. Повышение же относительного числа лимфоцитов связывают с интенсивной пролиферацией лимфоидных клеток развивающейся системы специфического иммунитета. Синтез белка в клетках формирующейся системы иммунитета детенышей тюленей более интенсивен, чем у взрослых, что проявляется в большем числе ЯОР циркулирующих лимфоцитов. Видовой и, возможно, индивидуальный уровень параметров активности ядрышек устанавливается лишь при половом созревании (раздел 5.3).

ГЛАВА 5 ИЗМЕНЕНИЯ ГЕМАТОЛОГИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ АДАПТАЦИИ ДЕЛЬФИНОВ И ТЮЛЕНЕЙ К УСЛОВИЯМ НЕВОЛИ

5.1 Особенности состава крови адаптированных и неадаптированных к условиям неволи дельфинов афалин

Лейкограмма афалин, как большинства китообразных, (McNeil, 1975; Monte, Pilleri, 1979) и ряда наземных млекопитающих, имеет гранулоцитарный профиль. Количество эозинофилов высоко, часто превышает относительное число лимфоцитов. Базофилы отсутствуют. Между исследованными группами афалин выявлены различия по числу некоторых типов лейкоцитов (табл. 8). Число лимфоцитов у больных животных ниже, чем у здоровых (p<0.01).

Сравнение по нескольким параметрам свидетельствует о существенных различиях между группами афалин (табл. 9).

Таблица 8 - Лейкоцитарная формула крови афалин (M±m, пределы колебания)

Группы афалин	Типы лейкоцитов, %
	НС	С	Э	Б	М	Л
Здоровые адаптированные	1.4±0.5 0-5.0	49.2±4.5 24.0-71.0	22.2±2.6 9.0-38.0	0	2.4±0.3 0-4.0	24.7±3.5 11.0-48.0
Здоровые неадаптированные	3.3±2.2 0-18.0	51.4±7.8 29.0-86.0	17.8±5.0 0-40.0	0	2.1±0.6 0-4.5	25.5±3.9 8.0-42.0
Больные неадаптированные	3.1±1.1 1-9.0	60.6±5.7 45.0-85.0	20.6±4.5 0.5-36.0	0	1.4±0.5 0-3.5	14.4±2.1 8.5-22.0



Таблица 9 - Параметры суммарных распределений лимфоцитов афалин различных групп по цитохимическим признакам (средняя±стандартная ошибка)

№

Группы дельфинов

НЭ

СДГ

ШИК+

ПН, %

Число гранул

Число гранул

M

V, %

As

Ex

M

V, %

As

Ex

1

Здоровые

31.1

2.72

76.1

1.69

2.52

21.46

45.3

0.88

0.96

26.7

адаптированные

±1.0

±0.05

±1.8

±0.06

±0.11

±0.33

±1.2

±0.08

±0.16

±1.0

2

Здоровые

30.9

1.85

60.2

1.65

2.43

21.25

42.1

0.75

0.42

19.9

неадаптированные

±1.3

±0.03

±1.6

±0.07

±0.14

±0.36

±1.4

±0.10

±0.20

±1.3

3

Больные

36.5

2.04

63.1

1.44

2.13

18.60

54.1

1.31

2.00

22.6

неадаптированные

±1.1

±0.03

±1.3

±0.05

±0.11

±0.32

±1.4

±0.07

±0.15

±1.0

Примечание. ПН - лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М - средняя, V - коэффициент вариации (%), As и Ex - показатели асимметрии и эксцесса, соответственно, ШИК+ - содержащие гликоген лимфоциты (%).

Согласно результатам корреляционного анализа (рис. 10, показаны корреляции, достоверные при P?0.95), наиболее высок уровень скоррелированности характеристик распределения лимфоцитов у здоровых неадаптированных животных. Причем, корреляции (за исключением связи энтропии распределения по активности НЭ и показателя эксцесса по активности СДГ) свидетельствуют об однонаправленности изменений субпопуляционного состава лимфоцитов по активности обоих ферментов. Увеличение среднего числа эстеразоположительных гранул и разнообразия лимфоцитов по этому параметру сопряжено с возрастанием гетерогенности лимфоцитов по активности СДГ (снижается Ex). Сближение субпопуляций с различной активностью ферментов (возрастает Ex), упрощение распределения по активности СДГ (увеличивается R) связано с повышением числа ШИК-положительных лимфоцитов. Знак корреляций соответствует ходу процессов, происходящих при стимуляции лимфоцитов: сначала возрастает активность ферментов лизосом и митохондрий, затем снижается количество гликогена (Хейхоу, Кваглино, 1983

Корреляция Гликоген-СДГ здоровых, здоровых адаптированных и неадаптированных афалин также свидетельствует о зависимости числа гликогенсодержащих лимфоцитов от уровня их разнообразия по активности СДГ: чем он выше (снижаются As, Ex, R), тем ниже содержание ШИК-положительных лимфоцитов. У больных животных существенных корреляций числа ШИК-положительных лимфоцитов и параметров распределения лимфоцитов по активности СДГ не выявлено. Это может быть связано с пониженной эффективностью утилизации гликогена в их клетках, учитывая, что средний уровень активности СДГ у больных афалин снижен.

Рис. 10 Корреляции между параметрами распределений лимфоцитов афалин: ПН - лимфоциты с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу; М - средняя; S - среднеквадратичное отклонение; V - коэффициент вариации; As и Ex - показатели асимметрии и эксцесса, соответственно; H - энтропия; R - информационная избыточность.

Корреляции для всей группы животных слабые (r=0.3-0.4), несмотря на статистическую их достоверность (p<0.05). Исключение составляет связь числа лимфоцитов с парануклеарной эстеразной реакцией (ПН) и ШИК-положительных лимфоцитов (r=0.57). Она значительна также у здоровых адаптированных и больных дельфинов. Это, а также сниженная активность СДГ и повышенный процент ПН лимфоцитов у больных животных может свидетельствовать о низкой метаболической активности ПН лимфоцитов афалин.

Увеличение силы корреляций между показателями активности гидролаз и дегидрогеназ лимфоцитов выявлено при аутоиммунных и некоторых профессиональных заболеваниях (Соколов и др., 1975; Робинсон и др., 1986). В то же время, установлено, что животные, отличающиеся высоким уровнем корреляций энзиматических характеристик лимфоцитов, выживают после введения стафилококкового токсина (Катосова и др., 1975). Возрастание силы корреляций метаболических параметров лимфоцитов происходит в ранние сроки после введения антигена при экспериментальной иммунизации (Михайлова и др., 1972). В первые месяцы неволи у дельфинов из-за резкого увеличения обсемененности их микроорганизмами развивается состояние, рассматривающееся как предболезнь (Биркун, 1986). Согласно представленным результатам, оно характеризуется значительными сдвигами в системе иммунитета, проявляющимися в усилении сопряженности процессов активации ферментов лизосом и митохондрий и утилизации гликогена в лимфоцитах. Однако у дельфинов в неволе, в среде с высоким содержанием микроорганизмов, при неблагоприятном влиянии других факторов (стресс, гиподинамия, корм, отличающийся от природного), процессы иммуногенеза часто оказываются недостаточно эффективными.

Выявленные особенности состава лимфоцитов крови по цитохимическим признакам могут быть использованы для контроля течения процесса адаптации дельфинов к условиям неволи и его коррекции препаратами, влияющими на функции и метаболизм лимфоидных клеток. При этом показателем уровня адаптации является степень приближения значений цитохимических параметров и корреляций между ними у адаптирующихся животных к таковым у здоровых адаптированных дельфинов.

5.2 Начальный этап адаптации гренландских тюленей к условиям неволи

Период адаптации морских млекопитающих после отлова и помещения их в неволю может длиться от нескольких недель до нескольких месяцев (Белькович, Гуревич, 1971; Ridgway, 1972; Asper, 1975). Первые недели после отлова считают критическими и во многом определяющими выживаемость и дальнейшую жизнь животных в неволе (Ridgway, 1972).

Общее число лейкоцитов у щенков тюленей в течение периода наблюдения варьировало незначительно: 8.2±1.1, 7.5±1.6 и 7.9±1.3 тыс./мкл (3-й, 10-й и 18-й дни в неволе, соответственно). Процент же лимфоцитов достоверно (р<0.05) упал к третьему дню, а к 18-му снизился в 3 раза по сравнению с контролем (12 интактных щенков такого же возраста, 1-1.5 мес.) и величиной этого показателя у взрослых животных. Достоверное снижение числа эозинофилов наблюдалось в 10-й день (рис. 17). Такие же сдвиги в лейкоцитарной формуле крови происходили у сивучей при адаптации к неволе (Занина, Занин, 1990) и 20-дневном голодании (Коваль Е.З. и др., 1986). Неадаптированные к неволе афалины в первые 3 недели после отлова также имели сниженный уровень лимфоцитов по сравнению с адаптированными здоровыми дельфинами (9.50±4.48% против 20..25±2.42%) (Соколова, 2004). В третий и десятый дни снизился уровень гликогена, а наиболее резкое падение числа эстеразоположительных лимфоцитов отмечено в 10 день (рис. 11).



Рис. 11 Изменения показателей лейкоцитов щенков гренландских тюленей в первые дни содержания в океанариуме: Нф - нейтрофилы; НЭ - эстеразоположительные лимфоциты; Гл - гликоген в лейкоцитах (усл. ед.); Лф - лимфоциты; Эф - эозинофилы.

После того, как щенки начали активно питаться, привыкли к ваннам, в которых они находились, и присутствию людей (18 день пребывания в океанариуме), значения среднего уровня гликогена и числа эстеразоположительных (НЭ+) лимфоцитов восстановились до исходных величин.

Анализ состава лимфоцитов по размеру, форме и числу эстеразоположительных гранул показал, что в первые дни пребывания в океанариуме у щенков существенно (p<0.01) снизилось число клеток с парануклеарным типом реакции, достигнув величины взрослых животных (табл. 10).

Таблица 10 - Показатели активности неспецифической эстеразы и организаторов ядрышка гренландских тюленей

Показатель	Группы животных, периоды исследования
	Контроль	3-й день	10-й день	18-й день	Взрослые
ПН	52.7±2.0	26.5±2.5	34.2±2.4	24.4±6.5	14.9±2.2
ЭГ	4.10±0.27	3.33±0.21	3.04±0.15	3.14±0.26	3.19±0.22
As	0.867±0.071	0.936±0.087	0.792±0.087	0.861±0.087	1.379±0.077
Ex	0.639±0.141	0.600±0.173	0.529±0.173	0.971±0.173	1.998±0.155
ЯОРAg	1.25±0.02	1.45±0.04	1.36±0.06	1.37±0.06	1.17±0.06

Примечание. ПН - число лимфоцитов (%) с парануклеарной реакцией на НЭ; ЭГ - среднее число эстеразоположительных гранул в 1 лимфоците;; As Ex - показатели асимметрии и эксцесса распределения по числу НЭ+ гранул; ЯОРAg - среднее число окрашенных серебром ЯОР.

В это же время (3-й день в неволе) увеличилась активность организаторов ядрышка, а число эстеразоположительных гранул, отражающее уровень активности лизосомного аппарата клетки, снизилось. Впоследствии рассматриваемые показатели не отличались (p>0.05) от показателей взрослых тюленей, за исключением повысившегося в 10-й день процента ПН лимфоцитов.

Наиболее вероятной причиной резкого падения числа НЭ+ лимфоцитов был стресс, развившийся после транспортировки и помещения животных в ванны. Об этом свидетельствует повышение концентрации глюкозы в плазме крови, сопровождавшее снижение числа эозинофилов (Ерохина, Кавцевич, 1998). При стрессе часть зрелых, дифференцированных Т-лимфоцитов мигрирует в костный мозг, и в популяции клеток крови увеличивается число незрелых, не завершивших дифференцировку лимфоцитов (Юшков и др., 1999). При общей тенденции - снижении числа эстеразоположительных лимфоцитов к 10-му дню пребывания в неволе с последующим его повышением в 18-й день, выявились также индивидуальные особенности изменений этого показателя. В частности, у 2-х тюленей отмечено последовательное возрастание процента Э+ лимфоцитов.

5.3 Изменения цитологических и цитохимических параметров крови гренландских тюленей при длительном содержании в неволе

4 щенка-сеголетка гренландского тюленя в возрасте 3.5-4 месяца, мигрировавшие в Кандалакшский залив, были доставлены в океанариум для длительного содержания и исследования. Некоторые гематологические показатели щенков выходили за пределы возрастной "нормы", предложенной Ф.Р. Энгельгардтом (Engelhardt, 1979). Наиболее существенные отклонения наблюдались у тюленей №2 и №3. Особенно значительным было повышение у них скорости оседания эритроцитов (32-55 мм/час), что могло свидетельствовать о наличии патологического (вероятно, воспалительного) процесса. Кроме того, эти тюлени отличались сниженным числом эритроцитов.

Согласно результатам биохимических исследований (Кавцевич, Ерохина, 2003), у всех животных также было повышено, по сравнению с возрастной нормой, содержание глюкозы, что является одним из показателей стресс-реакции; нарушен минеральный обмен. У щенка № 2, несмотря на нормальную упитанность, наблюдался дисбаланс обмена белка. Оценка состояния животных осложнялась наличием у них гельминтоза (ленточные и круглые черви в желудочно-кишечном тракте).

В результате последующих анализов клеточного состава крови найдено, что наиболее значительно в период наблюдения изменялось абсолютное число эозинофилов (рис. 12).

Рис. 12. Динамика изменения числа эозинофилов у щенков гренландского тюленя.

Длительное содержание животных в контролируемых условиях позволило проследить динамику показателей лейкоцитарной формулы (рис. 13).

Обращает на себя внимание резкое разделение обследованных животных на две группы по характеру динамики лимфоцитов и нейтрофилов. В одну группу вошли тюлени №1 и №2 (успешно прошедшие период адаптации), во вторую - №3 и №4 (погибшие через 18 и 34 месяца пребывания в неволе, соответственно).

Таким образом, динамика клеточного состава крови в течение периода наблюдения у экспериментальных животных резко различается по соотношению уровня лимфоцитов и нейтрофилов. У погибших в разное время тюленей №3 и №4 не наблюдался так называемый "физиологический перекрест", являющийся характерной возрастной особенностью клеточного состава крови млекопитающих. Это позволяет предполагать, что утрата упомянутых выше характерных особенностей может рассматриваться как показатель снижения уровня жизнеспособности детенышей тюленей.

По данным биохимического анализа крови, период реабилитации у щенков гренландского тюленя составил более 3-х месяцев (Кавцевич, Ерохина, 2003, 2009). После года пребывания в неволе отмечена утрата резких индивидуальных различий в биохимическом статусе животных, что, видимо, обусловлено одинаковыми и комфортными по сравнению с природной средой условиями жизни (отсутствие врагов, регулярное кормление, уход, ветеринарное обеспечение).



Рис. 13. Динамика изменения соотношения лейкоцитов различных типов у щенков гренландских тюленей. Ю, П, С - юные, палочкоядерные и сегментоядерные нейтрофилы, Э - эозинофилы; Б - базофилы; М - моноциты; Л - лимфоциты, соответственно.

В первые месяцы после отлова и помещения в океанариум у животных наблюдались значительные колебания среднего числа ЯОРAg. Далее, по мере взросления тюленей, колебания снизились, и оно приблизилось к уровню взрослых (рис. 14).

Рис. 14. Возрастные изменения числа ЯОРAg в лимфоцитах щенков гренландских тюленей, адаптирующихся к условиям неволи.

Видовой и индивидуальный уровень параметров активности ядрышек устанавливается, вероятно, при половом созревании, которое начинается у гренландских тюленей в 3-4 года.

Стабилизация числа больших гранулярных лимфоцитов и общего числа лейкоцитов произошла в тот же период, что и изменение активности ядрышек (рис. 15). Однако это снижение числа БГЛ, по-видимому, связанное с развитием у молодых тюленей системы специфического иммунитета, у взрослых половозрелых особей 10-15 лет вновь сменяется его повышением (табл. 11).

Что касается числа эстеразоположительных лимфоцитов, большинство из которых являются, предположительно, Т-клетками, то оно изменялось иначе, чем предыдущие 3 показателя. После 9-ти месяцев пребывания в неволе произошло падение ниже исходного уровня, а затем - подъем до уровня, приближающемуся к таковому взрослых животных.

Рис. 15 Динамика изменения числа БГЛ и лейкоцитов.

Таблица 11 - Число БГЛ (% от общего числа лимфоцитов) у гренландских тюленей разного возраста

№	Группы тюленей	M±m
1	Бельки, 1 нед. (n=38)	6.7±0.5
2	Серки, 1.5 мес., n=27	18.0±1.2
3	Серки-"заморыши", 1.5 мес., n=36	19.1±1.3
4	Серки-мигранты, 3-4 мес., n=6	8.6±1.4
5	Взрослые животные, n=10	13.9±1.7

Таким образом, при адаптации изучаемых видов морских млекопитающих к условиям неволи происходят существенные изменения в соотношении лейкоцитов различных типов и в структуре популяции лимфоцитов периферической крови по цитохимическим признакам. Колебания клеточного состава крови у детенышей тюленей зависят от возраста и индивидуальных особенностей состояния животных. Наиболее значительны они в первые недели и месяцы неволи, когда животные подвергаются воздействию стресса, а через10-12 месяцев стабилизируются.

Глава 6 ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ И ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ РАЗЛИЧНЫХ ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИХ И ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ ФАКТОРОВ

6.1 Отравление обыкновенных морских свиней нефтепродуктами

Мы проводили наблюдения за четырьмя взрослыми самцами обыкновенной морской свиньи, находившимися в воде, загрязненной мазутом. После 6 дней пребывания в загрязненной воде погиб первый дельфин, остальные - через 7, 9 и 10 суток. На третий день наблюдения у трех дельфинов в 1.5-2 раза повысилось общее содержание лейкоцитов, у одного - скорость оседания эритроцитов, т. е. появились признаки острого воспалительного процесса. У одного из дельфинов более чем в 2 раза возросло количество лимфоцитов. В день, предшествовавший гибели, отклонения были наиболее значительными: снизилось количество эозинофилов, что является одним из признаков развития стресс-реакции, у трех дельфинов повысилось число "юных", низкодифференцированных нейтрофилов. Соотношение лимфоцитов с различным числом эстеразоположительных гранул достоверно изменилось на третий день наблюдения у всех четверых животных (рис. 22). Причем у двух дельфинов уже на второй день значительно повысилось число клеток, содержащих 3 и более гранул. Дельфины, лимфоциты которых проявили более раннюю и сильную реакцию, прожили несколько дольше других.

За день до гибели форма распределения лимфоцитов отличалась от исходной наиболее значительно. Более половины лимфоцитов составили клетки с одной эстеразоположительной гранулой. При этом содержание лимфоцитов с парануклеарной реакцией на неспецифическую эстеразу, низкодифференцированных клеток, не несущих рецепторов Т- или В-лимфоцитов (Соколов, Иванова, 1982), изменялось мало (28.7±2.6, 32.5±2.8 и 31.1±2.2 в разные периоды, соответственно) Таким образом, быстрое (в течение нескольких дней) снижение числа эстеразоположительных гранул свидетельствовало о неспособности лимфоидной системы (и, вероятно, других систем организма) активно реагировать на раздражение.

6.2 Беременность у афалин

В течение 17 месяцев мы наблюдали четырех самок дельфинов-афалин, две из которых были беременны, две - здоровы и небеременны. У одной из беременных имелись, кроме того, симптомы инфекции (примесь гноя в моче). Наличие беременности в период исследования было подтверждено ретроспективно, после рождения доношенных детенышей, учитывая, что ее продолжительность у афалин равна 12 месяцам (Ожаровская, 1982).

Содержание лимфоцитов с "парануклеарным" типом эстеразной реакции было значительно, в 2-2.5 раза, повышено у беременных самок, по сравнению с небеременными, в течение всего срока беременности. Значения этого показателя до наступления беременности составляли у них 31.0 и 33.0%. Число эстеразоположительных гранул у беременной здоровой было снижено, а у беременной больной не отличалось от уровня здоровых (табл. 12).

Таблица 12 - Показатели активности неспецифической эстеразы в лимфоцитах беременных и небеременных самок дельфинов афалин

Показатели	№6, небеременная здоровая n=12	№29, небеременная здоровая, n=11	№13, беременная здоровая, n=13	№28., беременная больная, n=10
ПН лимфоциты, %	21.1±1.2	27.8±1.4	64.6±1.4	51.3±1.6
Число гранул в 1 лимфоците	2.77±0.06	2.91±0.06	2.14±0.06	2.71±0.06



Согласно современным представлениям, беременность рассматривается как имплантация генетически чужеродного материала в организм матери. Она сопровождается повышением концентрации ингибиторов пролиферации и дифференцировки лимфоцитов, что приводит к снижению количества иммунокомпетентных клеток. Поэтому повышение числа ПН лимфоцитов при беременности можно считать дополнительным свидетельством того, что и у морских млекопитающих они - низкодифференцированные клетки.

6.3 Изменения клеточного состава крови при инфекционных заболеваниях у гренландского тюленя и белух

В 1986г. в океанариум ММБИ из Архангельска (СевПИНРО) были доставлены 4 щенка гренландского тюленя. По заключению ветеринарного врача, у одного из них началась пневмония. В последующие 10 дней был проведен курс лечения.

Из показателей общего анализа крови наиболее велики в динамике лечения заболевания были колебания общее количество лейкоцитов (табл. 13). При выздоровлении тюленя заметно изменилась лейкоцитарная формула: стало меньше нейтрофилов с несегментированным ядром (низкодифференцированных) и значительно больше эозинофилов. Последнее является, наиболее вероятно, следствием длительного применения высоких доз антибиотиков.

Таблица 13 - Показатели общего анализа крови гренландского тюленя, переболевшего пневмонией

Период	Гемоглобин, г/л	Эритроциты, 106/мкл	Лейкоциты, 103/мкл	Н, %	Э,%	Б,%	М,%	Л,%
				несегм.	сегм.
29 июня, лечение	224.0	4.2	30.2	5.5	63.0	3.5	0	7.0	21.0
15 июля, лечение	228.0	4.6	7.4	3.0	60.5	2.0	0.5	6.0	28.0
5 ноября, выздоровление	222.0	5.2	22.6	1.5	53.5	19.5	0	4.0	21.5



Соотношение групп лимфоцитов с различной активностью неспецифической эстеразы в ходе лечения существенно изменялось. При выздоровлении распределение лимфоцитов по числу эстеразоположительных гранул приобрело асимметричную форму, характерную для здоровых дельфинов и тюленей. Наибольшее среднее число гранул в реакции на неспецифическую эстеразу (5.93±0.30) отмечено 29 июня, в начале лечения, в остальные сроки оно было достоверно ниже (р<0.01). Согласно данным литературы, высокое число эстеразоположительных гранул в активной фазе заболевания отражает возрастание числа и изменение локализации лизосом при стимуляции лимфоцитов. Устойчивое снижение этого показателя и приближение формы распределения лимфоцитов к свойственной здоровым тюленям следует считать, согласно приведенным данным, прогностически благоприятными признаками.

Число лимфоцитов с парануклеарной эстеразной реакцией (ПН) при выздоровлении возросло в 3 раза, превысив уровень здоровых щенков 1.5-месячного возраста (более 50%). Процент ПН лимфоцитов у взрослых гренландских тюленей значительно ниже (14.9±2.2%). Наблюдавшееся после заболевания повышение числа ПН клеток может быть обусловлено и супрессией активно развивавшихся в период заболевания гуморальных иммунологических реакций, и возрастанием количества предшественников зрелых Т-лимфоцитов в связи с прекращением интенсивной антигенной стимуляции системы иммунитета возбудителями заболевания.

В Мурманском морском биологическом институте (поселок Дальние Зеленцы) содержались две самки белухи в возрасте 2 и 5 лет. Одна из белух (более молодая) была явно больна (обширные поражения кожи на спинной стороне тела, гнилостный запах и выделения из дыхала). У второй самки признаком заболевания было искривление хвостового стебля, являющееся симптомом глубокой инфекционной патологии (Томилин, Близнюк, 1981). Скорость оседания эритроцитов составляла 43 и 40 мм/час.

В мазках крови белух была повышена численность лимфоцитов с высокой активностью неспецифической эстеразы, часто встречались клетки с признаками активации, имеющие светлое ядро и многочисленные эстеразоположительные гранулы. Среднее число гранул было очень высоким - 7.28±0.37 и 6.20±0.31.

Распределения лимфоцитов белух по числу эстеразоположительных гранул симметричны (у здоровых тюленей и дельфинов они асимметричны, сдвинуты влево). Такие признаки характерны для афалин с гнойно-септическими заболеваниями (Колесса и др., 1986). У афалин распределение лимфоцитов с описанными чертами также соответствовало крайне тяжелому состоянию, предшествовавшему гибели животных.

6.4 Изменения клеточного состава крови у афалин при иммунизации

Иммунизировали двух самок, содержавшихся в океанариуме 6 лет. Ни микобактерии туберкулеза, ни антитела против них у афалин не выявлены (Денисенко, Соколова, 2002; Розанова и др., 2006; Романов и др., 2006). Поэтому, иммунный ответ на введение БЦЖ у дельфинов является первичным. Через 7 месяцев после иммунизации БЦЖ производили вакцинацию стандартной вакциной против рожи свиней (ВР-2). У исследованных животных ее повторяли каждые 6 мес., и иммунный ответ на ВР-2 - вторичный.

Через 11 месяцев после иммунизации БЦЖ одна из самок (№17) родила доношенного живого детеныша. Таким образом, первая иммунизация состоялась на первом месяце беременности, вторая - на седьмом.

Исходное количество лейкоцитов было близким у обоих животных как при первой, так и при второй иммунизации и находилось в пределах, установленных для здоровых адаптированных к неволе афалин (7-10 тыс./мкл). Однако после введения БЦЖ оно оставалось на одинаковом уровне в течение 3-х дней, а введение вакцины ВР-2 вызвало на 3-й день заметный лейкоцитоз у обоих афалин, причем, более сильный у самки №17 (беременной). Сильная лейкоцитарная реакция на БЦЖ наблюдалась у одной из самок лишь на 7-й день, что по-видимому, является следствием большей продолжительности индукционного периода при первичном иммунном ответе.

Заметны различия между беременной и небеременной афалинами как при первичном, так и при вторичном иммунном ответе. Сравнения по комплексу из семи параметров позволило выявить особенности реагирования животных и в 1-м, и во 2-м эксперименте. Причем, по изменениям параметров в первые дни после иммунизации можно судить о характере их изменений в дальнейшем.



ВЫВОДЫ

1. Комплексный анализ клеточного состава крови свидетельствует о существовании у дельфинов и тюленей особенностей системы крови, обусловленных водным образом жизни.

2. Для дельфинов и тюленей характерен нейтрофильный профиль лейкоцитарной формулы крови. Гренландскому и серому тюленям и морскому зайцу свойственны особенности дифференцировки клеток миелоидного ряда, проявляющиеся в морфологии ядра и цитоплазмы части гранулоцитов. Взрослые гренландские тюлени отличаются высоким уровнем эозинофилов - до 36%, в среднем - 19.3%.

3. К возрастным особенностям клеточного состава крови тюленей относится уравнивание числа лимфоцитов и нейтрофилов - физиологический перекрест лейкоцитарной формулы крови. Это явление отмечается у гренландского тюленя в более ранние сроки постнатального онтогенеза, чем у серого тюленя и тюленя хохлача. Его наличие или отсутствие может служить признаком, позволяющим судить о жизнеспособности детенышей тюленей.

4. У всех исследованных видов морских млекопитающих выявлены лимфоциты, сходные с Т-лимфоцитами-супрессорами, нулевыми лимфоцитами и Т-клетками-киллерами по парануклеарно локализованным скоплениям окрашенного продукта цитохимической реакции на неспецифическую эстеразу. Возрастание их числа у дельфинов сопряжено с увеличением числа гликогенсодержащих лимфоцитов и снижением активности сукцинатдегидрогеназы лимфоцитов.

5. На ранних этапах процесса адаптпции тюленей к условиям неволи в соотношении различных типов лейкоцитов и структуре популяции лимфоцитов крови происходят сдвиги, отражающие снижение уровня резистентности в специфическом и неспецифическом звеньях иммунитета. Процесс адаптации длится не менее одного года, имеются индивидуальные сроки стабилизации клеточного состава крови.

6. В состав популяции лимфоцитов периферической крови афалин входят 2 неравные по объему группы клеток. Численно преобладает субпопуляция с относительно низкой активностью НЭ, СДГ, НАДНр и НАДФНр. НАДФН-тетразолий редуктаза играет роль признака-индикатора в комплексе цитохимических реакций, включающем определение активности НЭ, СДГ, НАДНр, НАДФНр и содержания нуклеиновых кислот. Корреляции между характеристиками распределения лимфоцитов по этим цитохимическим признакам отражают ход внутриклеточных метаболических процессов.

7. Здоровые и больные, адаптированные и неадаптированные к неволе афалины различаются формой распределения лимфоцитов по активности НЭ и СДГ, силой и направленностью корреляций между параметрами распределения лимфоцитов по активности НЭ и СДГ и числом гликогенсодержащих лимфоцитов. Эти различия могут быть использованы для оценки течения периода адаптации к условиям неволи и отбора наиболее адаптированных особей.



ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Публикации в журналах из перечня ВАК

1. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. Состав и свойства белков сыворотки крови щенков гренландского тюленя Pagophilus groenlandica в период адаптации к неволе // Ж. эвол. биохимии и физиологии. 1998. Т. 34, № 6. С. 654-660.

2. Кавцевич Н.Н. Клеточный состав крови гренландских тюленей различного возраста // Доклады Академии наук. 2001. Т. 380, №2. С. 280-282.

3. Кавцевич Н.Н. Особенности клеточного состава крови гренландских тюленей (Pagophilus groenlandicus) различного возраста // Зоологический журнал. 2003. Т. 82, № 6. С. 758-761.

4. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. Чувствительность эритроцитов морских млекопитающих к осмотическому шоку // Вет. практика, 2007, №3 (38). С. 60-63.

5. Кавцевич Н.Н., Матишов Г.Г., Кондаков А.А. Под дождем в полярную ночь на Айновых островах // Природа. 2007, № 7. С. 74-78.

6. Кавцевич Н.Н., Юрко А.С. Активность организаторов ядрышка в лимфоцитах гренландских тюленей разного возраста // Доклады АН. 2007. Т.416, №5. С. 706-708.

7. Войнов В.Б., Кавцевич Н.Н., Михайлюк А.Л., Зотов А.С. Поведенческие и физиологические признаки адаптации серых и гренландских тюленей к ныряющему образу жизни // Доклады АН. 2008. Т. 420, №2. С.271-274.

8. Войнов В.Б., Синютин С.А, Синютин А.С., Кавцевич Н.Н., Зотов А.С. Средства и способ исследования поведения и физиологии морских млекопитающих // Бюлл. эксп. биол. и мед. 2008. Т. 145, №3. С. 248-250.

9. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. К вопросу об оценке жизнеспособности щенков тюленей по некоторым параметрам крови // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2009, № 3. С. 3-8.

10. Кавцевич Н.Н., Минзюк Т.В. Клеточный состав крови серых тюленей различного возраста // Доклады АН. 2010. Т.432, №. 4. С. 552-555.

11. Минзюк Т.В., Кавцевич Н.Н. Новые данные о клеточном составе крови тюленя хохлача // Доклады АН. 2010. Т.435, № 5. С. 714-717.

12. Кавцевич Н.Н., Минзюк Т.В. Лейкоцитарные индексы и активность организаторов ядрышка лимфоцитов щенков серых тюленей // Вестник ЮНЦ. 2010. Т. 6, № 4. С. 76-83.

13. Кавцевич Н.Н. Гематологические показатели обыкновенных морских свиней при отравлении нефтепродуктами // Известия Самарского научного центра РАН. 2011, № 4 (в печати).

14. Кавцевич Н.Н. Цитохимические особенности лимфоцитов крови дельфинов афалин при содержании в неволе // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2011, № 3 (в печати).

15. Кавцевич Н.Н., Минзюк Т.В. Особенности клеточного состава крови серых тюленей (Halihoerus grypus) разного возраста // Зоол. журн. 2011, № 9 (в печати).

Публикации в других изданиях

16. Кавцевич Н.Н. Субпопуляции лимфоцитов крови черноморской афалины с различными цитохимическими характеристиками // Материалы I съезда анатомов, гистологов и эмбриологов Белоруссии. Минск, 1984. С.81.

17. Кавцевич Н.Н. Гетерогенность лимфоцитов крови черноморской афалины по цитохимическим признакам // Морфогенез органов и регулирующих систем в норме и эксперименте: Сб.тр. Минского гос. мед. ин-та. Минск, 1985. С. 135-138.

18. Мишин В.Л., Кавцевич Н.Н., Кочетков Н.В. Содержание в неволе некоторых видов морских млекопитающих Арктики. Изд. КФ АН СССР, Апатиты, 1987. 70 с.

19. Мишин В.Л., Елфимова Т.Б., Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. Особенности полноценного жизнеобеспечения настоящих тюленей в неволе // Содержание в неволе и обучение ластоногих северного региона. Апатиты, 1992. С. 12-60.

20. Кавцевич Н.Н. Некоторые результаты исследования лейкоцитов морских млекопитающих // Эколого-физиологические исследования млекопитающих северных морей. Апатиты, 1992. С. 8-19.

21. Кавцевич Н.Н., Мишин В.Л., Ерохина И.А. Результаты обследования гренландского тюленя беломорской популяции в 1991-1992гг. Апатиты: КНЦ РАН, 1993. 19 с.

22. Кавцевич Н.Н. Вариабельность цитологических параметров крови гренландских тюленей беломорской популяции // Арктические моря: биоиндикация состояния среды, биотестирование и технология деструкции загрязнений. Апатиты: КНЦ РАН, 1993. С. 109-116.

23. Kavtsevich N.N., Yerokhina I.A. Biochemical and cytochemical features of harp seal blood // Abstr. Rep. Int. Symp. on Mar. Mamm., Tromsш, Norway, 1994. P. 93.

24. Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. Биохимические и цитологические исследования морских млекопитающих в Арктике. Апатиты: КНЦ РАН, 1996. 169 с.

25. Kavtsevich N.N. Morphological and cytochemical features of marine mammal blood // J. of Morphology, 1997. V.232, N3. P. 122.

26. Kavtsevich N.N. Some cytochemical features of marine mammal lymphocytes // Abstr. Euro-Amer. Mammal Congr., Santiago de Compostela, 19-24 July, 1998. Santiago de Compostela, 1998. P. 199.

27. Yerokhina I.A., Kavtsevich N.N. On haematological indicators of arctic pinnipeds populations state // Abstr. Euro-Amer. Mammal Congr., Santiago de Compostela, 19-24 July, 1998. Santiago de Compostela, 1998. P. 203.

28. Мишин В.Л., Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. Контроль функционального состояния морских млекопитающих в аквакомплексах // Адаптация и эволюция живого населения полярных морей в условиях океанического перигляциала. Апатиты: КНЦ РАН. 1999. С. 357-377.

29. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. Методические аспекты оценки здоровья морских млекопитающих // Оптимизация использования морских биоресурсов и комплексное управление прибрежной зоной Баренцева моря. Мурманск, 1999. С. 31-33.

30. Кавцевич Н.Н. Гематологические показатели обыкновенных морских свиней при отравлении нефтепродуктами // Морские млекопитающие Голарктики. Матер. Междунар. конф. Архангельск, 21-23 сентября 2000г. Архангельск, 2000. С. 146-149.

31. Кавцевич Н.Н. Морфологические и некоторые цитохимические особенности крови гренландских тюленей разного возраста // Морские млекопитающие Голарктики. Матер.. Междунар. конф. Архангельск, 21-23 сентября 2000г. Архангельск, 2000. С. 150-154.

32. Кавцевич Н.Н. Морфологическое и цитохимическое исследование крови // Гренландский тюлень (современный статус вида и его роль в функционировании экосистем Белого и Баренцева морей). Мурманск, 2001. С. 48-72.

33. Кавцевич Н.Н. Параметры клеток крови щенков гренландского тюленя при адаптации к условиям неволи // Гренландский тюлень (современный статус вида и его роль в функционировании экосистем Белого и Баренцева морей). Мурманск, 2001. С. 127-133.

34. Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. Некоторые особенности состава крови щенков гренландского тюленя, совершающих аномальные миграции // Современные проблемы физиологии и экологии морских животных. Апатиты: Изд. КНЦ РАН, 2003. С. 174-185.

35. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. О возможности применения гематологических данных в мониторинге популяций ластоногих // Ученые записки Тернопольского национального педагогического университета. Серия: Биология. 2005. № 4 (27). С. 82-83.

36. Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А., Юрко А.С. Параметры крови морских млекопитающих в системе биоиндикации состояния окружающей среды // Современное состояние экосистем Кольского полуострова. Мурманск: ЦНТИ, 2005. С. 103-122.

37. Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. "Физиологический перекрест" лейкоцитарной формулы крови - показатель жизнеспособности щенков тюленей? // Морские млекопитающие Голарктики: Сб. науч. тр. СПб., 2006. С. 230-234.

38. Юрко А.С., Кавцевич Н.Н. Районы организаторов ядрышка гренландских тюленей разного возраста // Морские млекопитающие Голарктики: Сб. науч. тр. СПб., 2006. С. 576-580.

39. Кавцевич Н.Н., Ерохина И.А. Войнов В.Б. Оценка и контроль физиологических и функциональных параметров ластоногих // Экспериментальные исследования морских млекопитающих в условиях Кольского залива. Апатиты: Изд. КНЦ РАН, 2007.С. 125-161.

40. Кавцевич Н.Н., Минзюк Т.В. Некоторые морфологические и цитохимические особенности крови щенков серого тюленя // Биология: Теория, практика, эксперимент: Матер. междунар. науч. конф. В 2-х кн. Саранск: ООО "Бьюти", 2008. Кн. 2. С. 167-171.

41. Минзюк Т.В., Кавцевич Н.Н. Содержание больших гранулярных лимфоцитов у гренландских тюленей разного возраста // Современные проблемы и методы экологической физиологии и патологии млекопитающих, введенных в зоокультуру. Матер. 4 междун. симп. Петрозаводск, 2009. С. 181-186.

42. Кавцевич Н.Н., Минзюк Т.В. Выявление миелопероксидазы в лейкоцитах серых тюленей // Пробл. изуч. и охр. животного мира на Севере. Матер. всеросс. конф. Сыктывкар, 2009. С. 327-328.

43. Минзюк Т.В., Кавцевич Н.Н. Морфометрия районов организаторов ядрышка лимфоцитов серых тюленей // Пробл. изуч. и охр. животного мира на Севере. Матер. всеросс. конф. Сыктывкар, 2009. С. 332-333.

44. Ерохина И.А., Кавцевич Н.Н. Проблема охраны здоровья морских млекопитающих // Соврем. научно-практ. достижения в ветеринарии. Сб. статей Междунар. конф. 15-16 апреля 2010г. Киров. 2010. С. 73-76.

45. Минзюк Т.В., Кавцевич Н.Н. Морфологические особенности лейкоцитов щенков тюленя-хохлача // Соврем. научно-практ. достижения в ветеринарии. Сб. статей Междунар. конф. 15-16 апреля 2010г. Киров. 2010. С. 122-124.

46. Минзюк Т.В., Кавцевич Н.Н. Клеточный состав крови щенков тюленя хохлача (Cystophora cristata Erxleben, 1777) // Морские млекопитающие Голарктики. Сб. научн. тр. по материалам VI междунар. конф. Калининград, 11-15 октября 2010г. Калининград. 2010. С. 397-401.

Размещено на Allbest.ru

...