Морфологическая вариабельность гипоталамуса в обеспечении конституциональной стресс-реактивности

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ВАРИАБЕЛЬНОСТЬ ГИПОТАЛАМУСА В ОБЕСПЕЧЕНИИ КОНСТИТУЦИОНАЛЬНОЙ СТРЕСС-РЕАКТИВНОСТИ

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Потанин Михаил Борисович

Волгоград 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Волгоградский государственный медицинский университет Росздрава»

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Капитонова Марина Юрьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Хлопонин Петр Андреевич

доктор медицинских наук, профессор Швалев Вадим Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Ямщиков Николай Васильевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М.Сеченова Росздрава»

Защита состоится «_____» _________________ 2008 года в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 208.008.01 при Волгоградском государственном медицинском университете по адресу: 400131, г. Волгоград, пл. Павших борцов, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке Волгоградского государственного медицинского университета.

Автореферат разослан «___» ___________ 2008 года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета,

доктор медицинских наук Н.В. Григорьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность.

Стремительно нарастающий темп урбанической жизни, информационная перегрузка, скученность населения, возрастающая роль фактора общения в обеспечении социального статуса, нарастание доли ксенобиотиков в питании и окружающей бытовой среде современного человека - вот далеко не полный перечень факторов, определяющих возрастание роли стресса в патологии [Селье Г., 1960, 1982; Судаков К.В., 1997, 2002; Крыжановский Г.Н., 1999, 2004; Пшенникова М.Г., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Глазачев О.С., 2006; Oliver G., Wardle J., 1999; Bell M.E. et al., 2002; Sivukhina E.V. et al., 2006; Gibson L.E., 2006].

С момента публикации Г.Селье в 1936 году статьи «Синдром, вызываемый разными повреждающими агентами», теория стресса прочно вошла в арсенал медицины. На настоящий момент в теории стресса раскрыто немало клеточных и молекулярных механизмов, определяющих его основную динамику и органопатологию, как в остром, так и хроническом варианте развития стрессорной реакции. Определен спектр стресс-активирующих и лимитирующих медиаторов, а также ульцирогенные, кардиотропные, иммуномодулирующие, эндокринные и поведенческие эффекты развития стрессорных реакций [Малышев И.Ю., Манухина Е.Б., 1998; Котов А.В., 1999; Судаков К.В., 2003; Devries A.C., et al., 1997; Berridge M.J., et al., 1998; Hamano H., et al., 2002; Dube L, et al., 2005; Wu Y.H. et al., 2006; Stone EA, et al., 2006; McCormick CM, et al., 2007].

В то же время, даже при ярко выраженных социальных и природных катастрофах тяжесть стрессорной реакции становится фатальной и определяет течение и прогноз болезней лишь примерно у трети лиц, в то время как примерно 20-25% людей при воздействиях тех же факторов практически не реализуют стресс-индуцированную патологию [Анохина И.П., 1997, 2002; Бадыштов Б.А., 1998; Соколова Е.Б., с соавт., 2000; Судаков К.В., Юматов Е.А., 2001; Bremner J.D., et al., 1996; Kelley A.E., Berridge K.C., 2002; Pecoraro N., et al., 2004; Dallman M.F., et al., 2005]. Изучение этой проблемы можно проводить с различных позиций. Сейчас уже известно немало генетических особенностей, определяющих уровень реактивности при стрессе и чувствительности к действию стрессорных факторов, причем два этих свойства не могут рассматриваться как полностью генетически сопряженные [Середенин С.Б., с соавт., 2000; Анохин К.В., Судаков К.В., 2003; Маркина Н.В., с соавт., 2003; Bartolomucci A., et al., 2003; Simpkiss J.L., Devine D.P., 2003; McGill, et al., 2006; Centeno M.L. et al., 2007; Goto S., et al., 2007; Ulrich-Lai Y.M. et al., 2007].

Помимо генетической детерминированности, одну из составляющих стресс-реактивности следует искать в морфофункциональных особенностях основных структур, отвечающих за регуляцию отношений организма с внешней средой в целом - прежде всего в организации церебральных структур [Пшенникова М.Г., с соавт., 2000; Yehuda R., et al., 1991; Avishai-Eliner S., et al., 2001; Morin SM, et al., 2001; Krady J.K., et al., 2002; Bluthe R.M., et al., 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Inoue K., et al., 2003; Dallman M.F., et al., 2004; Badowska-Szalewska E., et al., 2006; Girotti M., et al., 2006].

Отечественными исследователями были раскрыты фундаментальные закономерности организации различных структур головного мозга при конституциональных фенотипах, связанных с высоким риском таких распространенных заболеваний как ишемическая болезнь сердца и алкоголизм. Расширены представления о структурных основах реагирования головного мозга на стресс, определяющих общую неспецифическую реактивность организма и, в итоге, нейроиммуно-эндокринные взаимодействия и органопатологию стрессовой реакции [Писарев В.Б. с соавт., 1990, 2006; Баннов А.Н., 1994; Ерофеев А.Ю., 1995; Смирнов А.В., 1998, 2005; Гуров Д.Ю., 1999, 2005; Фролов В.И., 2004; Капитонова М.Ю. с соавт., 2005, 2007; Морозова З.Ч., 2006; Загребин В.Л., 2007].

За рубежом многими учеными также демонстрировалась важная роль гипоталамуса в акцепции, трансформации и регулировании силы ответной реакции на стрессовые воздействия [Calogero A.E., 1995; Stratakis C.A., Chrousos G.P., 1998; Thompson R.H., Swanson L.W., 2003; Okere C.O., Waterhouse B.D., 2004; Kwon M.S., et al., 2006; Ostrander M.M., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Kiss A., 2007; Lowry C.A., et al., 2007].

За рамками этих исследований осталась такая теоретически и практически важная проблема, как определение особенностей стресс-ассоциированных изменений в тех или иных структурах гипоталамуса у животных с доказанной высокой или низкой стресс-реактивностью. Равно не изучались в сравнительном аспекте изменения этих структур при его воспроизведении у животных с диаметрально противоположными уровнями стресс-реактивности.

Получение новых данных в нейроморфологии на современном этапе немыслимо без сопоставления результатов классических методов светооптического исследования, иммуногистохимического выявления специфических молекул-участниц работы головного мозга и данных электронной микроскопии нейронов, нейроглии и других элементов нейронного окружения [Боголепов Н.Н., 2002; Николлс Дж.Г., с соавт., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.Б., 2007; Bonini P., et al., 2004; Gingerich S., Krukoff T.L., et al., 2006; Muramatsu T., et al., 2006; Block M.L., et al., 2007; Ma S., et al., 2007]. С теоретических позиций рассмотрение структур мозга как гистотопографически очерченных ядер и проводников, выделение нейронных модулей и изучение межклеточных отношений в мозге следует рассматривать как взаимодополняющие при выполнении подобного исследования.

С этих позиций актуальным представляется фундаментальное морфофункциональное исследование гипоталамуса как одной из ключевых структур в обеспечении конституционально различной стресс-реактивности.

Цель работы - установить закономерности варьирования отдельных гипоталамических структур у животных с различным уровнем конституциональной стресс-реактивности и уточнить на этой основе участие гипоталамуса в обеспечении силы и выраженности стрессорной реакции.

Задачи исследования.

1. Изучить морфофункциональные различия отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

2. Изучить на иммуногистохимическом и ультрамикроскопическом уровне особенности строения нейронов ядер гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

3. Выявить характер и выраженность стресс-индуцированных изменений в ядрах гипоталамуса, наиболее различающихся у животных с высокой и низкой стресс-реактивностью.

4. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и морфометрии различных структур гипоталамуса.

5. Провести корреляционный анализ связей между показателями стресс-реактивности и стрессорных изменений в гипоталамусе и разработать математическую модель, характеризующую выраженность и характер стрессорных реакций с учетом стресс-реактивности и особенностей строения гипоталамуса на светооптическом и ультрамикроскопическом уровне.

Научная новизна.

На основании сопоставления результатов светооптического, иммуногистохимического, ультрамикроскопического методов исследования и привлечения методов современного математического анализа результатов морфометрии и определения стресс-реактивности получены новые данные о выделении ядер и полей гипоталамуса, наиболее значимых с позиции формирования конституциональной стресс-реактивности. К ним, помимо общепризнанных, впервые отнесены дорсомедиальное ядро, латеральное гипоталамическое поле и два ядра маммилярного комплекса. Показано, что нейроны разных ядер, участвующих в формировании стресс-реактивности, обладают общим ультрамикроскопическим признаком - сравнительно более высоким удельным объемом митохондрий в перикарионах и их более функционально активной организацией. Выявлены как стойкие признаки строения ядер гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью: более плотная упаковка нейронов при относительно малом количестве граничных сосудов и астроглиоцитов, относительно больший процент катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов.

Показаны различия в краниокаудальных и дорсовентральных градиентах строения ядер и полей гипоталамуса как отражения различной конституциональной стресс-реактивности животных.

На основе полученных данных была сформирована теоретическая концепция о фенотипической вариабельности гипоталамуса, которая может рассматриваться как ключевой морфофункциональный субстрат стресс-реактивности. Это подтверждено данными математического анализа с построением адекватной модели взаимоотношений стрессорной афферентации, взаимоотношений между ядрами гипоталамуса с учетом их конституциональных особенностей и параметров последующего стрессорного ответа. стресс реактивность гипоталамус ядро

Научно-практическая значимость.

Полученные данные расширяют имеющиеся представления о структурных основах стрессорной реакции с позиции конституциональной нейроморфологии. Выделение компонента вариабельности в участии отдельных структур гипоталамуса за счет особенностей их строения в итоге существенно проясняет общие различия в выраженности стрессорного ответа у различных организмов на идентичные по характеру и силе воздействия.

Моделирование стресса у животных с конституционально высокой стресс-реактивностью целесообразно для получения наиболее ранней и полной картины стресс-индуцированной патологии при воздействии стрессоров любой силы, в том числе умеренной.

Положения, выносимые на защиту.

1. На ультраструктурном, клеточном и тканевом уровне ядра и поля гипоталамуса (каждое - в разной степени) обладают широкой вариабельностью строения, при этом можно выделить устойчивые наборы признаков, свойственных животным с конституционально высокой и низкой стресс-реактивностью.

2.Особенности исходного строения отдельных ядер и полей гипоталамуса у животных с различной стресс-реактивностью частично определяет характер и выраженность последующих стресс-индуцированных изменений в этих структурах.

3. Особенности строения гипоталамуса и происходящих в нем при стрессе изменений, в свою очередь, определяют общую выраженность и течение стрессорной реакции.

Апробация работы и публикации.

Основные результаты диссертационного исследования докладывались и обсуждались научных сессиях профессорско-преподавательского состава Волгоградского государственного медицинского университета (Волгоград, 1998-2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2004), III Всероссийской научно-практической конференции «Медико-биологические и психолого-педагогические аспекты адаптации человека» (Волгоград, 2004), VII конгрессе Международной ассоциации морфологов (Казань, 2004), V съезде физиологов Сибири (Новосибирск, 2005); Международном конгрессе «Проблемы вегетативной дисрегуляции» (Донецк, 2005); Российской научной конференции с международным участием «Медико-биологические аспекты мультифакториальной патологии» (Курск, 2006); Всероссийской конференции «Новые медицинские технологии» (Волгоград, 2007).

Апробация работы осуществлена на совместном заседании кафедр гистологии, цитологии и эмбриологии, патологической анатомии, анатомии человека, судебной медицины Волгоградского государственного медицинского университета 25 апреля 2008 года.

По материалам диссертации опубликованы 26 научных работ, в том числе 9 - в журналах «Морфология», «Морфологические ведомости», «Бюллетень экспериментальной биологии и медицины» и «Вестник Волгоградского государственного медицинского университета», включенных в действующий «Перечень … ВАК» (медицинские науки, редакция апрель 2008).

Реализация и внедрение результатов исследования.

Материалы диссертации внедрены в учебный процесс в Волгоградском государственном медицинском университете, Волгоградском государственном университете, Волгоградской государственной академии физической культуры, Саратовском государственном медицинском университете, Ставропольской государственной медицинской академии, Астраханской государственной медицинской академии. Разработанные и апробированные диагностические методики используются Волгоградского областного патолого-анатомического бюро и Волгоградского научного центра РАМН и администрации Волгоградской области.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 269 страницах машинописного текста, содержит 50 таблиц, иллюстрирована 62 рисунками. Она состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав собственных исследований с их обсуждением, заключения и выводов. Список использованной литературы включает в себя 370 источников: 147 отечественных и 233 зарубежных.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Специфика настоящего исследования потребовала решения нескольких методических задач:

- максимально адекватного выделения животных с доказанными конституциональными особенностями стресс-реактивности без повреждения головного мозга;

- выделение из большого числа нейроморфологических методик доступного и воспроизводимого набора, на основании которого можно описать различия в строении гипоталамуса у выбранных животных с альтернативной стресс-реактивностью;

- выбора метода и интенсивности стрессорного повреждения, при котором уже имеется морфологический субстрат повреждения гипоталамуса, но еще не утрачена его относительная специфичность, позволяющая количественно оценивать различия между группами;

- выбор адекватного математического подхода для описания происходящих событий в виде модели, пригодной для интерпретации выявленных изменений морфологами.

Протокол экспериментов в разделах выбора, содержания животных, моделирования патологических процессов и выведения их из опыта был составлен на основе базисных нормативных документов МЗ РФ, рекомендациями ВОЗ [Червонская Г. П., с соавт., 1998; Zutphen L.F., 1993] и согласован с Локальным независимым этическим комитетом (Протокол №4 от 21 декабря 2004 года).

На основании изложенных принципов после скрининга в основной части работы было проведено сравнительное изучение головного мозга у 20 крыс: по пять в каждой подгруппе в зависимости от стресс-реактивности, вне стресса и после его воспроизведения (табл. 1).

Таблица 1

Общая характеристика материала исследования по сериям

Серии экспериментов	Характеристика серии	Кол-во животных
Скрининговый этап (неинвазивные тесты)
определение уровня общей неспецифической реактивности организма	низкий уровень	18
	средний уровень	91
	высокий уровень	15
определение уровня хемоиндуцированной стресс-реактивности	низкий уровень	20
	средний уровень	82
	высокий уровень	22
Основной этап
интактные животные	высокая реактивность	5
	низкая реактивность	5
Моделирование 24-часового иммобилизационного стресса	высокая реактивность	5
	низкая реактивность	5

Первым тестом для разделения животных на группы было определение универсального критерия стандартизации биомоделей - уровня общей неспецифической реактивности организма. Метод основан на определении болевой (ноцицептивной) чувствительности посредством дозированного электроболевого воздействия [Мулик А.Б., 1993, 2002]. Вторым относительно малоинвазивным тестом стало определение термолабильности животных при действии сверхмалых доз бактериального липополисахарида. Для такого свойства организма предложено соответствующее название - уровень хемоиндуцированной стресс-реактивности [Горизонтов П.Д., 1984]. В результате этого тестирования для исследования было выделено 20 крыс с низким и 22 - с высоким уровнем реактивности.

Сопоставление сочетаемости тестов (конкордантности) показало, что среди 21 животного хотя бы с одним из признаков низкой реактивности у 17 (74%) присутствовали оба признака. Аналогично, среди 22 животных с высоким уровнем хемоиндуцированной стресс-реактивности оказались все 15 животных с высоким уровнем общей неспецифической реактивности организма (конкордантность - 68%).

Для исследования гипоталамуса интактных животных и после воспроизведения стресса из каждой группы крыс отобрано по 10 животных с максимальной экспрессией признаков, то есть минимальным порогом электроболевой вокализации и максимальной термолабильностью - для группы животных с высокой стресс-реактивностью (ВСР) и альтернативными характеристиками - для группы крыс с низкой стресс-реактивностью (НСР).

Стресс моделировали у 5 крыс группы ВСР и у 5 крыс групп НСР путем однократной 24-часовой иммобилизации. С целью верификации стадии стресса проводилось взвешивание органов животных, макро- и микроскопическое исследование желудочно-кишечного тракта, тимуса и надпочечников.

Непосредственно после эвтаназии головной мозг животных извлекали щадящим образом из черепа, помещали в 10%-ный раствор нейтрального забуференного формалина (рН=7,4) на 30 мин, после чего разделяли на 3 блока (А, В и С) фронтальной секцией через точку P₀ по Сентаготаи и тангенциальной - от борозды, разделяющей полушария большого мозга и мозжечка до границы между стволом и промежуточным мозгом на вентральной его поверхности. Материал дофиксировали в течение 24 ч. С фронтальной поверхности блока В и окципитальной поверхности блока А начинали приготовление серийных срезов толщиной 5-7 микрон - 200-240 для блока В и 100-150 - для блока А. Каждый пятый срез наклеивали на предметные стекла в порядке их получения и маркировали. Это позволяло воспроизвести стререометрическую архитектонику гипоталамуса от фронта А1 до Р4,0 в координатах Хорслей-Кларка, то есть целиком [Paxinos G., Watson C., 1986]. Для уточнения расположения ряда объектов и идентификации срезов вне типичных проекций использовали также современные атласы промежуточного мозга: Н.Н. Боголепова с соавт. (2002), Paxinos G., Watson C. (1996) и Swanson L.W. (1998).

Передняя гипоталамическая область была нами объединена с иногда описываемой отдельно преоптической областью. В ней выделяли и отдельно изучали строение медиального (POM) и латерального преоптических (POL), перивентрикулярного (PeV), переднего гипоталамического (NAH), супраоптического (SO), супрахиазматического (SCh) и паравентрикулярного (PV) ядер. Помимо ядер, здесь присутствовали и проводники, описанные как элементы нейропиля по различным направлениям и смешанные области, в частности - ретрохиазмалъная (RCA).

В медиальной группе основу вещества гипоталамуса составляли крупные дорсомедиальное (DM) и вентромедиальное (VM) и аркуатное (Arc) ядра. В первом различали дорсальную и вентральную части. Особеннностью этой области было обилие вертикальных и горизонтальных проводников, формирующих в нейропиле ассоциативные связи с другими элементами стресс-системы.

Латеральное гипоталамическое ядро (LH) и серый бугор, составляющие наружную группу ядер гипоталамуса, были представлены скоплениями неплотно расположенных нейронов средних размеров с достаточно большим количеством астроглии и микроглии между ними. Большая масса нейропиля в этой области позволила рассматривать эту зону как единое латеральное гипоталамическое поле (AHL), простирающееся во фронтальных срезах в координатах P1,5-P3,0.

Элементы маммилярного комплекса, то есть заднего гипоталамуса, обнаруживали в сечениях Р3,0 - P4,5 по Сентаготаи и идентифицировали как супрамаммилярное ядро (SuM), дорсальная (PMd) и вентральная (PMv) части премаммилярных ядер, латеральное маммилярное ядро (ML), медиальная (MMm) и латеральная (MMl) части медиального маммилярного ядра. В связи с достаточно однородным строением и непостоянством выявления MMl у крыс последние два объекта были подвергнуты анализу совместно. Среди большого количества проводников в задней гипоталамической области большое внимание уделяли мощному восходящему маммило-таламическому тракту.

Для классического нейрогистологического исследования использовали окрашивание препаратов мозга гематоксилином и эозином, а также по Нисслю.

Морфометрическое исследование было проведено в соответствии с принципами системного количественного анализа [Автандилов Г.Г., 1996, 2002] с использованием автоматического анализатора изображений «Видеотест-Морфо» (СПб, Россия). В каждом ядре раздельно определяли объемную долю нейронов (%), среднее число нейронов в 1 мм³ ткани, средние объемы (СО) перикариона нейронов и нейронного окружения (мкм³), их отношение, а также среднее число граничных нейронов и астроглиоцитов в окружении перикариона нейрона. Выраженность глиальной реакции оценивали по среднему численному соотношению глия/нейрон, среднему размеру ядер глиоцитов и средней суммарной яркости иммунопозитивного материала после окраски на макрофагальный антиген и кислый глиальный протеин.

Результаты при исследовании областей, наиболее «актуальных» по результатам предшествующего анализа, дополняли с помощью оригинального метода радиальной морфометрии, разработанного в Волгоградском научном центре РАМН. После указания границ объекта и его логического центра (им был выбран геометрический центр ядра) программа самостоятельно разбивала объект на выбранное число секторов и зон. Для нейронов нами было эмпирически подобрано 36 секторов и 10 зон - всего 360 участков (рис. 2). В качестве первичного материала получали матрицу секторального и радиального распределения тинкториальной плотности, в качестве окончательного - коэффициенты, характеризующие графическую функцию распределения:

K₁ - тангенс угла подъема кривой в восходящей части графика,

K₁ - тангенс угла снижения кривой в восходящей части графика,

I_m - максимальная интенсивность окраски в кольцевой зоне, усл. ед.,

R - расстояние от центра ядрышка до зоны с I_m

V_m - максимальная вариабельность интенсивности по секторам, усл. ед.

Полученные количественные показатели достаточно полно характеризуют изменения нейронов в динамике повреждения [Новочадов В.В., 2005].

На срезах, окрашенных по Нисслю, определяли степень стрессорного поражения нейронов [Чубинидзе А. И., 1972]. Производился подсчет нейронов коры, которые разделили на 4 группы:

- нейроны нормальные, неизмененные (НН);

- слабоизмененные нейроны (СН) с сохранением ядра, но со структурными или тинкториальными нарушениями компонентов цитоплазмы (острое набухание, гиперхроматоз, хроматолиз, центральная тинкториальная ацидофилия);

- грубо измененные нейроны (ГН) (сморщивание, «тяжелое изменение», гомогенизирующее изменение нейронов, клетки-тени);

- нейроны отсутствующие (ОН).

Степень поражения нейронов вычисляли по формуле: СП=(2ОН+2ГН+СН)x100/2(ГН+ОН+СН+НН) и выражали в процентах. Выделяли 4 степени поражения: легкая (менее 20%), средняя (20-50%), тяжелая (более 50%), распространенный некроз. Исследование проводили в 5 полях зрения на 4 срезах для каждой области ГМ (100-120 измерений на серию).

Иммуногистохимическое исследование производили с использованием следующих моноклональных мышиных антител коммерческими наборами фирмы Dako Cytomation (Дания):

- к макрофагальному антигену, окрашивающий микроглию (HAM-56);

- к кислому глиальному протеину (GFAP);

- к тирозингидроксилазе (TH)

- к глутаматному рецептору (GR-2)

- к нейрональной нитроксидсинтазе (NOS-1);

- к эндотелиальной нитроксидсинтазе (NOS-3).

Выбор двух последних антигенов был обусловлен тем, что по современными данным, именно дисбаланс нитроксидсинтаз становится ключевым стартовым механизмом повреждений в центральной нервной системе при стрессе [Han H.S.,et al., 2002; Kotake Y., et al. 2002].

Визуализацию проводили с помощью непрямого иммунопероксидазного метода с высокотемпературной и ферментной демаскировкой антигенов. Экспрессию оценивали по разделению нейронов на классы в зависимости от степени экспрессии иммунопозитивного материала по оптической плотности выделенных масок: негативные, слабопозитивные, позитивные и гиперэкспрессирующие с выражением доли каждого класса в процентах. Соотношение экспрессий определяли через их удельные яркости в сопоставимых областях ГМ на серийных срезах, обработанных на одном предметном стекле. Для достоверности полученных результатов применяли позитивные и негативные контроли антигенов, а также негативные контроли антител [Петров С.В., Райхлин Н.Т., 2004; Kelman Z., 1997; Rosa M.A., et al. 2000; Paunesku T. et al., 2001].

Для электронно-микроскопического исследования животных подвергли эвтаназии путем внутривенной инфузии 4%-ного раствора параформа на 0,1 М какодилатном буфере (суправитальной фиксации) под нембуталовым наркозом. Дофиксацию кусочков размером 1 мм³ производили в течение 12 часов в 4%-ном растворе параформа на 0,1М какодилатном буфере с последующей постфиксацией в течение 2 часов в 1% растворе тетраокиси осмия в 0,1М какодилатном буфере (pH=7,4) при температуре +4^оС [12]. После промывки в нескольких порциях раствора какодилатного буфера материал подвергали дегидратации в спиртах возрастающей концентрации и заливали в смесь эпона и аралдита. Ультратонкие срезы толщиной 50-90 нм получали на ультрамикротомах LKB- 8800 и монтировали на медные сетки. После контрастирования в 2,5% растворе уранилацетата на 50^о этаноле в течение 40 минут и 0,3 % растворе цитрата свинца в течение 20 минут срезы изучались в электронном микроскопе Tesla BS-540 при ускоряющем напряжении 60 кВ. Документирование производили с использованием фотопластинок «Для ядерных исследований». Электронные микрофотограммы изготавливали на фотографической черно-белой бумаге «Унибром 160 БП».

Сканированные ультрамикрофотографии анализировали в программе AM Lab Hesperus v3.0 beta. В качестве показателей для структурного анализа использовались такие показатели, как объемная доля митохондрий в перикарионе, отношение яркостей эухроматин/гетерохроматин, эухроматин/матрикс цитоплазмы, матрикс митохондрий/матрикс цитоплазмы и матрикс цитоплазмы/содержимое синаптосом в трехмерной системе координат RGB. Также анализировали фактор формы кариолеммы, наружной мембраны митохондрий, показатель выраженности крист митохондрий.

Вариационно-статистическую обработку результатов проводили в среде электронных таблиц MS Excel. Она была проведена общепринятыми для медико-биологических исследований методами (расчет средней арифметической величины, среднего квадратичного отклонения, ошибки репрезентативности для каждого параметра в исследуемых группах животных, сравнение средних значений по критерию Стьюдента с достоверностью различий. Затем, руководствуясь закономерностями, принятыми для медико-биологических исследований (объем выборок, характер распределения, непараметрические критерии), оценивали достоверность различий выборок. Корреляционный анализ проводился методом простых парных корреляций Спирмена [Зайцев В.М., с соавт., 2003; Петри А., Сабин К., 2003; Новиков Д.А., Новочадов В.В., 2005].

СОБСТВЕННЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В преоптической области у животных с высокой стресс-реактивностью для POM характерно более редкое расположение относительно крупных нейронов с большим объемом окружения и количеством граничных астроглиоцитов; в PeV выявляются более мелкие, но плотнее расположенные нейроны с большим числом граничных нейронов и малым представительством микроглии, а строение POL не отличалось от такового у животных с низкой стресс-реактивностью. Полученные данные в целом свидетельствуют о неоднородности строения ядер преоптической группы переднего гипоталамуса в срезе конституциональной реактивности.

В собственно переднем гипоталамусе для крыс с высокой стресс-реактивностью были характерны относительно более крупные размеры нейронов, их ядер и нейронного окружения (более всего - для SCh). Но для SCh характерна более высокая ОД нейронов, а для SO и PV - относительно более низкая. Интересно, что в триггерном ядре стресса - паравентрикулярном - отличия между группами интактных крыс были минимально выражены. Животные с высокой стресс-реактивностью имеют в передней гипоталамической области меньшее представительство астро- и микроглии (SCh < PV < SO) и неодинаково выраженное, но относительно высокие экспрессии нитроксидсинтаз (максимальные - в SO), рис. 1.

Исследования, проведенные в медиальной и латеральной гипоталамической области у интактных животных с различной стресс-реактивностью, выявили существование целого ряда существенных отличий различий только в двух ядрах - дорсомедиальном и аркуатном, а также в латеральной гипоталамической области. Они касались как показателей размерности ядер и отдельных структур, так и сложности их организации.

Супраоптическое ядро

Супрахиазматическое ядро



Паравентрикулярное ядро

Рис. 1 Особенности строения ядер передней гипоталамической области крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных

Принципиальные различия в отношении дорсомедиального и вентромедиального ядра гипоталамуса (первое имеет яркие отличия, зависящие от стресс-реактивности, второе - практически отличий не имеет) может иметь ключевое значение в участии этой области гипоталамуса при развитии стресса. Также удалось показать, что нейроны аркуатного и дорсомедиального ядер гипоталамуса обладают общей особенностью у крыс с высокой стресс-реактивностью. Она заключается в более высоком представительстве катехоламинергических и глутаматцептивных нейронов, что определяет для этих ядер повышенную роль в модуляции силы и продолжительности стрессовой реакции (рис. 2).



Вентромедиальное ядро

Дорсомедиальное ядро

Рис. 2 Особенности строения ядер медиальной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных

Большая сложность организации латеральной гипоталамической области (но не серого бугра) является одним из доказательств большего значения внешних связей гипоталамуса с таламусом и фронтальными областями коры головного мозга в обеспечении высокой стресс-реактивности в сравнении с нервными связями между ядрами гипоталамуса (рис. 3).

Более сложное строение нейропиля было характерно для ретрохиазмальной и латеральной гипоталамической области животных с высокой стресс-реактивностью.

Аркуатное ядро

Латеральное гипоталамическое ядро

Рис. 3 Особенности строения ядер латеральной группы гипоталамуса крыс, связанные с высокой стресс-реактивностью. Обобщенные признаки, за единицу принято значение показателя в альтернативной группе животных

На уровне маммилярного комплекса показана максимальная вариабельность строения SuM и PMv, для которых были характерны более плотная нейронная упаковка, относительно большие размеры нейронов и их ядер, большое количество микроглии.

Математический анализ методом определения асимметрии выборок, цензурированных по признаку реактивности, выявил многочисленные «сцепления» данных показателей строения нейронов и их окружения со стресс-реактивностью животных. Практически те же показатели выявлялись как связанные с реактивностью при корреляционном анализе.

Обобщая представления о строении ядер у интактных животных, мы предположили их реакцию при стрессе с учетом строения нейронов, их окружения, астроглиального и микроглиального представительства, картирования ряда изученных медиаторов, а для SO и SCh - ультрамикроскопического строения. Все исследованные ядра гипоталамуса были разделены на пять групп (рис. 4).

«слабые» ядра с низкой потенциальной резистентностью - POM	практические не зависящие от реактивности - POL, VM, PMd и ML	«слабые» ядра с высокой потенциальной резистентностью - PeV и SO
«сильные» ядра с низкой потенциальной резистентностью - PV и DM	«сильные» ядра с высокой потенциальной резистентностью - SCh, ARC, SuM, и PMv

Рис. 4 Распределение вариабельных ядер гипоталамуса у крыс с высокой стресс-реактивностью на основании математического анализа

1. К «сильным» ядрам с потенциально высокой устойчивостью к стрессорному повреждению у животных с высокой стресс-реактивностью отнесены супрахиазматическое, аркуатное, супрамамиллярное и вентральная часть премамиллярного ядра.

2. «Сильными», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессорному повреждению для животных ВСР группы были признаны триггерные ядра стресса - паравентрикулярное и дорсомедиальное.

3. К «слабым» структурам, но с высокой резистентностью к повреждению были отнесены супраоптическое и перивентрикулярное ядро.

4. Медиальное преоптическое ядро было единственным, расцененным как «слабое» с низкой резистентностью.

5. Латеральное преоптическое ядро, вентромедиальное ядро, медиальная часть премамиллярного ядра и латеральное мамиллярное ядро - ядра, строение и резистентность которых к повреждению от стресс-реактивности практически не зависели.

Безусловно, проводя такое разделение, мы отдавали себе отчет в том, что при развитии стресса на реальные изменения в ядре будет оказывать влияние не только особенности его нейронного окружения или устройства самих нейронов, но также общая и специфическая функциональная нагруженность в реализации работы стрессорной системы.

Подобный анализ возможен только в сопоставлении изменений по отдельным ядрам применительно к их установленной функции, рецепторному аппарату, медиаторному представительству и вовлеченности в развитие стрессорных реакций.

В преоптической зоне гипоталамуса, помимо развитого нейропиля, определялись три основных ядра, из которых максимально вариабельным от стресс-реактивности оказалось POM. Эта структура связана с терморегуляцией и участвует в регуляции секреции половых гормонов, сексуального поведения, имеет выраженные различия у самцов и самок [Yoshida K. et al., 2002; Lowry C.A. et al., 2007]. Предполагается также участие этой зоны и в интеграции импульсов сердечно-сосудистой системы [Акмаев И.Г., 2003; Ахмадеев А.В., Калимуллина Л.В., 2006], реакциях гипоталамуса на хроническую эндогенную интоксикацию [Фролов В.И., 2004].

На основе нашего анализа POM интактных животных было отнесено к «слабым» ядрам с низкой резистентностью. Это определялось относительно меньшими размерами перикарионов и ядер нейронов, менее плотной их упаковкой в ядре с относительно малым количеством граничных клеток и относительно низким микроглиальным представительством. В POM животных ВСР группы определялся относительно высокий исходный уровень экспрессии нейрональной нитроксидсинтазы.

В то же время, при стрессе это ядро оказалось поврежденным в относительно малой степени (около 5,0%), причем в равной степени в группах с различной стресс-реактивностью. Аналогичные факты были выявлены и при последующем анализе строения ядра после стресса.

По-видимому, POM не относится к ядрам, в значительной степени включающимся в реализацию стресс-системы, в связи с чем его изменения в нашей модели стресса оказываются менее ожидаемых и в малой степени зависят от стресс-реактивности. Определенную роль в этом может играть и общая картина защитного торможения, описанная для стресса в отношении преоптических структур в целом [Crowder R.J., Freeman R.S., 1998; Stone E.A., et al., 2006], равно как и относительно умеренная реализации сосудистых нарушений за счет активации нитроксидсинтаз и ФНО-зависимого апоптоза нейронов [Куликов В.П. с соавт., 2005; Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Schuler M., Green D.R., 2001; Schultz D.R., Harrington W.J.Jr., 2003; Mattson M.P., Kroemer G., 2003 ].

Перивентрикулярное ядро гипоталамуса у животных с высокой стресс-реактивностью было нами отнесено к «слабым», но с высокой резистентностью к повреждению. Этот прогноз полностью подтвердился. Степень повреждения нейронов в PeV была чуть более 5% в ВСР группе, более 11% - в НСР группе. Изменения других показателей, в том числе незначительная активация нитроксидсинтаз, хорошо согласуются с известными из литературы сведениями об относительно малом участии PeV в стрессорной реакции, умеренной выраженности ФНО-зависимого апоптоза при стрессе [Меньшанов П.Н. с соавт., 2007; Figueiredo H.F. et al., 2003; Badowska-Szalewska E., et al., 2006]. Локальное повреждение PeV способно предотвратить стрессорное ограничение секреции тиротропного гормона и гормона роста [Лычкова А.Э., Смирнов В.М., 2002; Campbell R.E. et al., 2003].

Таким образом, мы подтвердили предположение о том, что у животных с высокой конституциональной стресс-реактивностью имеется исходно большая вероятность стрессорного повреждения POM, тогда как PeV повреждается в меньшей степени и обладает высокой резистентностью к повреждению.

Супраоптическое ядро рассматривается как наиболее поражаемое ядро при хроническом стрессе самой разной этиологии [Писарев В.Б., 1990; Писарев В.Б., с соавт., 1998, 2006; Фролов В.И., 2004]. Нейроэндокринные клетки SO и PV являются источниками кортиколиберина, тиролиберина и ряда других нейрогормонов, непосредственно вовлекающихся в стартовые (триггерные) механизмы стресса [Казакова с Т.Б. соавт., 2000; Рыбникова Е.А. с соавт., 2001; Вашадзе Ш.В., 2006; Jorgensen H. et al., 2003; Inoue T. et al., 2004].

В отношении этой структуры анализ выявил несколько противоречивых данных. С одной стороны, при стрессе данное ядро у крыс с высокой стресс-реактивностью повреждалось сильнее, ОД нейронов в SO у животных ВСР группы уменьшалась на 22,3%, тогда как в НСР группе - только на 14%. Изменение размеров нейронов, сложности их окружения и количества нейроглии в принципе свидетельствовали, что SO ядро является «сильным звеном» главным образом у крыс с низкой конституциональной стресс-реактивностью. В то же время существенные различия в экспрессии нитроксидсинтаз, отсутствие существенных корреляционных доказательств между степенью повреждения и другими морфометрическими показателями не позволили считать резистентность этого ядра сниженной. В итоге SO у животных с высокой стресс-реактивностью следовало отнести к группе «слабых» ядер с высокой резистентностью к повреждению.

При ультрамикроскопическом исследовании были выявлены еще несколько особенностей SO у крыс с высоким уровнем стресс-реактивности: относительно более высокий удельный объем митохондрий в перикарионах с их более функционально активной организацией.

Исходя из ключевых функций SO, результаты нашего анализа можно интерпретировать следующим образом.

1. Супраоптическое ядро способно к медленноволновой секреции кортиколиберина, является основным продуцентом вазопрессина. Продукцию окситоцина и половых стероидов следует отнести скорее к минорным функциям ядра [Patel K.P., et al., 2000; Nomura M. et al., 2003]. Наряду с прямым своим действием, вазопрессин и окситоцин через местные механизмы модулируют секрецию кортиколиберина и запуск секреции АКТГ [Sun Y. et al., 2001; Wotjak C.T. et al., 2002].

2. При стрессе в SO происходит резкое уменьшение секреции вазопрессина, и данный эффект нередко приводит к развитию сосудистого коллапса с переходом в шоковое состояние [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Giusti-Paiva A., et al., 2002]. Подъем синтеза и секреции кортиколиберина начинается не сразу после стресса, а через 6-12 часов, обеспечивая закрепление и определенную пролонгацию стрессовой реакции. Синтез окситоцина при стрессе в SO практически не меняется, а половых стероидов (что не столь существенно для гормонального пула в целом) - снижается [Berciano M.T. et al., 2002].

3. Следовательно, у животных с высокой стресс-реактивностью за счет существования особенностей строения SO в полной мере не обеспечивается адекватное развитие второй, более медленной волны выброса кортиколиберина и соответствующих колебаний секреции стресс-лимитирующих гормонов. Это и придает стрессу скоротечность и остроту, выдаваемую по внешним признакам за «высокую» реактивность.

Супрахиазматическое ядро было отнесено нами к сильным ядрам с потенциально высокой устойчивостью к повреждению.

Наличие в SCh интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 мы рассматриваем в качестве одной из ключевых характеристик, связанных с конституциональной стресс-реактивностью.

В нейронах SCh крыс ВСР группы также выявлено преобладание гетерохроматина, преимущественно рядом с ядерной оболочкой, отсутствие инвагинаций кариолеммы и высокая электронная плотность кариоплазмы. Для них характерно обилие органелл в цитоплазме перикариона, мономорфность митохондрий и относительно малая плотность их матрикса. В своей совокупности эти особенности также рассматривались как субстрат большей функциональной активности и лабильности SCh у животных с высокой стресс-реактивностью.

При стрессе в SCh развивались относительно малые изменения, и минимальные - у животных с высокой стресс-реактивностью. Наличие в SCh стрессированных крыс ВСР группы относительно небольшого прироста NOS-1-позитивных нейронов и умеренный коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его резистентности к стрессорному повреждению. Электронно-микроскопическое исследование нейронов выявило сохранение структуры ядерного хроматина и кариолеммы, небольшое увеличение числа митохондрий без структурных особенностей в них. В перинуклеарной области части нейронов наблюдалась отчетливая вакуолизация, но мембранные органеллы были многочисленны и структурно не повреждены.

Гуморальная активность SCh многообразна - это секреция вазопрессина, окситоцина, опиатов, гонадолиберина, бомбезина [Владимиров С.В., Угрюмов М.В., 1995; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].

Сопоставление этих особенностей SCh у интактных животных и стресс-индуцированных изменений позволило с функциональным предназначением ядра позволило сделать следующее логическое построение.

1. SCh является центром циркадианных ритмов, которое воспроизводится даже на удаленных из организма плоскостных срезах-культурах гипоталамуса, содержащих данное ядро. Важным входом этого ядра является проекция глаза, после разрушения SCh у крыс теряется способность настраивать эндогенный ритм на частоту чередования свет/темнота [Николс Дж. Г., 2003; Васильев Ю.Г., с соавт., 2003; Калинкин М.Н., с соавт., 2004; Chan R.K. et al., 1993; Carloni S. et al., 2004].

2. При стрессе и шоке с сохранением активности SCh связывают основные механизмы резистентности. Происходит учащение спонтанной импульсации нейронов SCH, не связанных с суточной активностью, секреция коритиколиберина и окситоцина при этом увеличивается, гонадолиберина и опиоидов - уменьшается [Демко П.С. с соавт., 2002; Кузнецов И.Э., 2003; Sharkey J. et al., 2000; Fonnum F., Lock E.A., 2004; Slikker W.Jr. et al., 2005].

3. Следовательно, наличие сильного относительно мало повреждаемого SCh у животных с высокой стресс-реактивностью способно модулировать триггерные эффекты стресса, тонически повышая активность многих структур ЦНС и более жестко блокируя основные гормональные оси, затормаживаемые при остром стрессе (половых гормонов, гормона роста и др.). Этим и достигается более очерченная яркая картина стрессовой реакции у животных с высокой стресс-реактивностью.

Наконец, паравентрикулярное ядро занимало в наших исследованиях особое место. Детально изученное, оно справедливо называется ключевым триггерным ядром стресса. В первую фазу стресса оно выбрасывает большие количества кортиколиберина, оказывающего дальнейшее влияние на деятельность симпатико-адреналовой системы и, соответственно, изменение коронарного кровотока, артериального давления, частоты сердечных сокращений, сосудистой проницаемости [Кузнецов И.Э., 2003; Хитров Н.К., Салтыков А.Б., 2003; Куликов В.П. с соавт., 2005; Писарев В.Б. с соавт., 2006; М.Ю.Капитонова с соавт., 2008]. Известно, что при стрессе кортиколиберин может непосредственно использоваться в ткани гипоталамуса в качестве нейротрансмиттера для модуляции высших поведенческих реакций [Shumake J. et al., 2001; Boutahricht M. et al. 2005].

У интактных животных мы не выявили существенных особенностей строения самих нейронов PV в связи со стресс-реактивностью. В то же время, на один нейрон в PV животных ВСР группы приходилось в среднем меньше граничных нейронов и астроглиоцитов, в сравнении с аналогичными показателями в НСР группе. Мы предположили, что стресс-реактивность определяется на уровне гипоталамуса не столько филогенетически закрепленным для данного вида строением PV, сколько особенностями относительно молодых в филогенетическом отношении ядер с модулирующим в отношении стрессовой реакции действием, а также сложностью организации внутригипоталамических связей (нейропиля).

В то же время, наличие в PV интактных крыс ВСР группы относительно более высокого процента NOS-1-позитивных нейронов и малый коэффициент NOS-1/NOS-3 свидетельствовали о его более высокой реактивности при развитии стресса. На основании математического анализа связей со стресс-реактивностью PV было отнесено к «сильным», но со сниженной потенциальной резистентностью к стрессу.

Действительно, при моделировании стресса у животных ВСР группы мы обнаружили большую степень поражения нейронов (25,6% против 13,8% в НСР группе). ОД нейронов в PV у животных с высокой стресс-реактивностью уменьшалась почти вдвое, а в НСР группе - только на 37%, аналогично более интенсивные изменения были определены и для размеров ядер нейронов, прироста коэффициента окружение/нейрон и микроглиальной реакции.

При сопоставлении полученных данных о строении интактного PV в связи со стресс-реактивностью и его стресс-индуцированных изменений, мы построили следующее логическое заключение.

1. Основной функцией PV является секреция окситоцина и вазопрессина крупноклеточной частью нейронов, мелкоклеточная часть ядра модулирует эти функции и секретирует кортиколиберин [Акмаев И.Г., 2001; Евсеев В.А., с соавт. 2001; Stern J.E., Zhang W., 2003]. Кроме этого, в PV происходит синтез эндорфинов, ангиотензина, соматостатина, соматолиберина и пролактолиберина [Campbell R.E. et al., 2003]. Ассоциативные нейроны PV имеют в основном пептидергическую природу и обеспечивают взаимодействие пулов основных клеток-гормонопродуцентов, и на местном уровне акцептируют результат [Сивухина Е.В. с соавт., 2003; Лискина Е.Б., 2003; Кузнецов И.Э., 2003; Kc P. et al. 2002; Figueiredo H.F. et al., 2003; Jingyi M.A. et al., 1994; Jorgensen H. et al., 2003; Nomura M. et al., 2003; Dallman M.F. et al., 2005].

2. PV непосредственно участвует в запуске стрессовых реакций. Выброс кортиколиберина и молекулярные изменения в нейронах PV показаны уже спустя несколько секунд от начала стрессорного повреждения - раньше всех других изменений секреции в ЦНС [Корнева Е.А., 2000; Суворов Н.Ф., Шуваев В.Т., 2002; Reyes T.M. et al., 2003; Campbell R.E. et al., 2003; Girotti M. et al., 2006; McCormick C.M. et al., 2007]. Нейроны PV, синтезирующие вазопрессин и соматостатин, также являются стресс-реактивными с ответом на стрессорное раздражение через 3-6 мин от его начала [Kc P. et al. 2002; Girotti M. et al., 2006; Dallman M.F. et al., 2005].

...