Морфогенез и его регуляция в культуре эпидермальных клеток человека

В литературе имеются указания на то, что волосяной фолликул является источником мезенхимных стволовых клеток (МСК), которые участвуют в восстановлении дермы при ее повреждении (Jahoda & Reynolds, 2001). Мы исследовали экспрессию поверхностных маркеров клеток ДП, клеток стромы жировой ткани и постнатальных фибробластов дермы. Маркеры СD49d, CD105 и STRO-1 являются характерными для клеток стромы жировой ткани. CD105 и STRO-1 являются поверхностными маркерами мезенхимных стволовых клеток из костного мозга. Анализ экспрессии данных маркеров показал, что клетки ДП экспрессируют CD49d на том же уровне, что и клетки стромы жировой ткани, однако уровень экспрессии CD105 и STRO-1 - ниже. Фибробласты дермы имеют низкий уровень экспрессии CD49d, единичные клетки в популяции экспрессируют STRO-1 и не экспрессируют CD105. Таким образом, клетки ДП и клетки стромы жировой ткани обладают схожим фенотипом.

Мы исследовали потенции клеток ДП человека дифференцироваться в клетки костной и жировой ткани, а также в нейральном направлении при культивировании в индукционных средах. Отложение липидных капель в цитоплазме и экспрессию лептина (маркер зрелых адипоцитов) наблюдали только в 20-30% клеток ДП (Рис. 10а). Адипогенная дифференцировка клеток ДП была менее выражена по сравнению с клетками стромы жировой ткани. Спонтанную дифференцировку клеток ДП не наблюдали. Для определения способности клеток ДП дифференцироваться в клетки костной ткани при культивировании в индукционной среде исследовали уровень экспрессии молекулярных маркеров остеогенеза, в частности, остеопонтина (Рис. 10б). На 21 сутки в клетках ДП обнаруживали экспрессию этих маркеров на уровне, сопоставимом с клетками стромы жировой ткани. Постнатальные фибробласты не обладали такими свойствами. В контрольной среде небольшое количество клеток ДП спонтанно дифференцировались в клетки костной ткани. Остеогенная дифференцировка подтверждалась окраской клеток ализариновым красным. В индукционной среде наблюдали дифференцировку ДП в нейральном направлении (Рис. 10в).

В экспериментах по трансплантации клеток ДП в кожу человека была обнаружена способность этих клеток стимулировать ангиогенез (Рис. 11).

Рис. 11. Стимуляция ангиогенеза клетками дермальной папиллы человека. Схема эксперимента.

При культивировании клетки ДП теряют способность индуцировать фолликулогенез. В связи с этим данные клетки являются очень удобной моделью для исследования изменений в транскрипции генов, а также поисков сигнальных систем и групп генов, ответственных за уникальную способность клеток ДП индуцировать эпидермальный морфогенез. Совместно с В.В. Ашапкиным (НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского, МГУ), была проанализирована транскрипция (концентрации мРНК) генов, составляющих «сердцевину» транскрипционного статуса клеток ДП. Целью этого исследования было выяснить, как изменяется уровень транскрипции каждого из этих генов при культивировании клеток ДП и при их индуцированной дифференцировке в остеобласты.

При культивировании клеток ДП в стандартных условиях в 3-6 раз возрастает уровень транскрипции генов BMP6, FGFR1 и NDP, в 1,4-2 раза - генов FGFR2, ALX4, NOG, SOX, HHIP, HEY1, WIF1, LTBP1 и PRSS12. Уровень транскрипции генов ALPL, FGF10 и TWIST1, наоборот, заметно (в 2-5 раз) уменьшается (Таблица 1). Уровень транскрипции остальных генов варьирует в небольших пределах. Все перечисленные гены кодируют белки, так или иначе, связанные с передачей сигналов и регуляцией базовых клеточных процессов. При индуцированной дифференцировке клеток ДП в остеобласты в 2-3 раза возрастает уровень транскрипции трех генов, FGFR2, TWIST1 и CRABP1, и в 1,3-1,5 раза - генов SOSTDC1, GDF10 и CRABP2. Уровень транскрипции генов ALPL, BMP4, FGF7, FGFR1, ALX4, SOX, HEY1, WIF1 и NDP уменьшается в 1,5-2 раза.

Таблица 1. Уровни транскрипции генов в клетках ДП первого (ДП0) и седьмого (ДП7) пассажей

В последующем было проведено более обширное исследование уровней транскрипции генов в этих клетках в масштабах целого транскриптома на геномном анализаторе компании Иллюмина. Общее число активно транскрибируемых генов, транскрипция которых при культивировании клеток заметно повышается, весьма значительно, поэтому для дальнейшего рассмотрения мы выбрали только те из них, транскрипция которых увеличивается в 3 или более раз. Таких генов оказалось около 70. Большинство генов, транскрипция которых при культивировании клеток ДП заметно повышается, кодируют белки цитоскелета и межклеточного матрикса, участвующие в процессах клеточной адгезии, межклеточных контактах, регуляции пролиферации, дифференцировки, апоптозе, миграции клеток, явлениях эндо- и экзоцитоза и т.п. Почти столь же обширна группа генов, кодирующих белки, участвующие в работе различных сигнальных систем. Несколько меньше в этой категории генов, кодирующих белки-регуляторы экспрессии других генов и клеточного цикла. Интересно, что аналогичные категории преобладают и среди генов, транскрипция которых при культивировании уменьшается, хотя общее их число примерно в два раза меньше.

Полученные результаты показывают, что при культивировании стволовых клеток в неиндуцирующих условиях происходят спонтанные эпигенетические процессы, заметно изменяющие их внутренние свойства. Культура клеток ДП дает уникальную возможность сопоставления этих процессов и изменения функциональной активности клеток.

3.5.4-. Разработка модели эпидермального морфогенеза

Клетки дермальной папиллы индуцируют эпидермальный морфогенез in vitro.

На основании разработанной модели исследования миграции эпидермальных кератиноцитов по трехмерному коллагеновому гелю был разработан метод изучения эпидермального морфогенеза в культуре (Рис. 12).

Клетки ДП помещали в коллагеновый гель, а сверху на коллагеновый гель высевали пассированные кератиноциты. В качестве контроля использовали коллагеновый гель, содержащий фибробласты человека.

Через 10 дней в присутствии клеток ДП кератиноциты мигрировали в коллагеновый гель и формировали тубулярные выросты (ТВ). При этом происходила контракция верхнего слоя коллагенового геля кератиноцитами, что облегчало наблюдение за клетками. Постнатальные фибробласты не вызывали миграции кератиноцитов внутрь геля и формирования ТВ. Использование в эксперименте среды, кондиционированной клетками ДП, показало, что индукция тубулогенеза происходит в среде кондиционированной клетками ДП. Поэтому в дальнейшем в качестве индуктивного сигнала использовали кондиционированную среду. Такая система дала возможность оценивать и анализировать получаемые выросты, поскольку ТВ формировались в горизонтальном направлении, а использование кондиционированной среды позволило избежать сильной контракции геля, вызываемой клетками ДП. При помещении кератиноцитов в колагеновый гель и культивировании их в среде, кондиционированной клетками ДП, мы наблюдали формирование ТВ различной формы. ТВ начинают формироваться через 4-5 дней после посадки, и к 10-14 суткам достигают в среднем 1-2 мм.

Рис. 12. Модель изучения эпидермального морфогенеза в культуре

Электронно-микроскопическое исследование показало, что ТВ состоят из клеток различной степени дифференцировки. На срезе одного уровня можно найти молодые клетки, зрелые, содержащие кератогиалиновые зёрна в цитоплазме, и отмирающие, с разрушающимися ядром и клеточными мембранами. При этом наблюдалась закономерность распределения клеток, имеющих разную степень дифференцировки. Ближе к центру располагались молодые кератиноциты, а зрелые и отмирающие - на периферии. При панорамной реконструкции одного из срезов было отмечено спиральное расположение клеток. По крупным межклеточным пространствам и наличию многочисленных выростов и ворсинок можно судить о том, что клетки находятся в движении.

Изучение экспрессии кератина 10 (К10) показало, в растущем крае доля К10⁺-клеток мала, а в средней части выростов дифференцированные кератиноциты распределяются по периферии (Рис. 13). При изучении экспрессии К19 какой-либо закономерности в распределении К19⁺-клеток обнаружено не было. Экспрессия кератина 14 была выявлена в клетках ведущего края эпидермального выроста.

Фолликулогенез de novo во взрослом эпидермисе может происходить по-разному (Inamatsu et al., 2006). При рекомбинации взрослого эпидермиса с эмбриональными дермальными конденсатами и последующей трансплантацией бестимусным мышам фолликулы формируются с прохождением стадии плакоды, т.е. с полной рекапитуляцией эмбрионального фолликулогенеза. Рекомбинация эпидермиса с ДП из взрослой кожи также приводит к формированию фолликулов, но образования плакод не наблюдается. В этом случае фолликулы образуются за счет активной пролиферации и миграции эпидермальных клеток в дерму, т.е. фолликул сразу оказывается на стадии анагена. Мы полагаем, что именно такие события имитирует наша модель. Несомненно, она является удобным инструментом для изучения сигнальных путей, вовлеченных в фолликулогенез и факторов, которые могут на него влиять.

Роль факторов роста и некоторых сигнальных путей в морфогенезе кератиноцитов человека in vitro

В контрольной среде, не содержащей факторов роста, ТВ не образовывались. При добавлении в среду EGF и фактора роста кератиноцитов (KGF) был отмечен активный рост ТВ. Их форма и размеры были схожи со структурами, образующимися при культивировании в среде, кондиционированной клетками ДП. При этом формирование ТВ в этих двух вариантах опытов началось позже (на 5-6 сут) и продолжалось дольше, чем в опытах с кондиционированной клетками ДП средой и фактором роста гепатоцитов (HGF) (новые выросты образовывались и на 10-14 сут).

Как известно, эти факторы стимулируют митотическую активность и миграцию эпидермальных клеток. EGF in vivo продуцируется фибробластами кожи. Он стимулирует пролиферацию культуры кератиноцитов и усиливает миграцию краевых клеток в колониях (Barrandon, Green, 1987). Ранее мы продемонстрировали в модели заживления раны в культуре, что EGF значительно сокращает время эпителизации. KGF синтезируется фибробластами дермы и, попадая в эпидермис, активирует ряд генов, которые прямо или косвенно влияют на пролиферацию, дифференцировку и миграцию кератиноцитов. Синтез KGF значительно усиливается в процессе эпителизации ран (Marchese et al., 1995). Стимуляция пролиферации и миграции кератиноцитов под действием EGF и KGF, вероятно, вносит существенный вклад в инициацию тубулярных структур в использованной нами модели.

Инсулиноподобный фактор роста и основной фактор роста фибробластов индуцировали незначительное число ТВ. При добавлении HGF в среду культивирования наблюдали самые протяженные и ветвящиеся ТВ. Известно, что HGF индуцирует инвазию кератиноцитов в дерму и участвует в морфогенезе и регуляции роста волосяного фолликула в органотипической культуре клеток мыши (Lindner et al., 2000), однако индукция морфогенеза в культуре кератиноцитов человека HGF была показана впервые.

Следует, однако, отметить, что не все из изученных факторов постоянно присутствуют в микроокружении волосяного фолликула in vivo (Botckkarev and Paus, 2003). Кроме того, как было отмечено выше, существует большое количество других регуляторов морфогенеза. Изменение спектра факторов, а также инициация их синтеза в клетках мезенхимного компартмента являются компонентами регуляторного механизма, обеспечивающего формирование волосяного фолликула из эмбрионального эпидермиса в онтогенезе, а также смену фаз роста и дегенерации волосяного фолликула на протяжении жизни организма.

Мы предприняли попытку определить активацию некоторых сигнальных путей при воздействии факторов клеток дермальной папиллы на эпидермальные клетки. Для этого кератиноциты культивировали в среде, кондиционированной клетками ДП и в контрольной среде. Методом ПЦР в реальном времени определяли экспрессию кератина 17, LEF1, Shh и Wnt10b. Результаты исследований показали, что под действием кондиционированной клетками ДП среды повышается экспрессия генов Shh и Wnt10b, однако абсолютные значения невелики. Экспрессия LEF1 и К19 изменялась разнонаправлено. Несомненно, дальнейшие исследования на основе созданной модели позволят получить ценные данные о регуляции индукции фолликулогенеза у человека. Открываются перспективы по поиску агентов, эффективно регулирующих этот процесс.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработка методов культивирования клеток способствовала значительному прогрессу в клеточной биологии. При культивировании часть характеристик клетки сильно изменяется. Однако по мере развития техники культивирования, клетка in vitro стала отдельным биологическим объектом и все шире применяется в медицине и биотехнологии. Задача стоит в управлении свойствами культивируемых клеток: обнаружении закономерностей поведения клеток в культуре, поиске тех элементов, которые аналогичны их поведению в организме и определении факторов, которые могут модулировать поведение клеток. Особенно актуально это в отношении клеток человека. Представленная работа демонстрирует, что в культуре клеток кожи человека возможна реконструкция ключевых моментов начальных этапов морфогенеза - компактизация клеток, миграция, дифференцировка и формирование многоклеточных трехмерных структур в матриксе. Во многом, эти события отражают внутренние, присущие кератиноцитам свойства, а для реализации некоторых из них необходимо присутствие компетентных мезенхимных клеток.

Кожа - легкодоступный источник двух основных типов клеток (эпителиальных и мезенхимных). Мы показали, что эпидермальные стволовые клетки в культуре сохраняются. На основании проведенных нами исследований можно также с уверенностью заключить, что волосяной фолликул кожи человека является источником специализированных мультипотентных стволовых клеток. Мы продемонстрировали, что клетки ДП волосяного фолликула могут быть эффективно выделены, культивированы и использованы для моделирования эпидермального морфогенеза у человека, изучения эпигенетических изменений, происходящих в клетках, в том числе стволовых, в процессе культивирования, а также, вероятно, в прикладных исследованиях, направленных на реконструкцию волосяного фолликула и/или стимуляцию собственных фолликулов, разработку новых способов лечения алопеции, тестирование лекарственных препаратов.

Кожа - первый после костного мозга орган, подвергшийся тканеинженерной (клеточной) реконструкции. Представленная работа обосновывает возможность реконструкции в культуре не только эпидермального пласта, но и сложно устроенной структурно-функциональной единицы кожи человека, включающей волосяные фолликулы и другие придатки кожи. Проведенные исследования позволяют воспользоваться свойствами клеток кожи и особенностями их поведения в культуре для моделирования фундаментальных процессов морфогенеза и тканевого гомеостаза, а также для создания новых технологий регенерационной медицины.

Выводы

1. Кератиноциты in vitro сохраняют способность к образованию гистотипических структур, сходных с межфолликулярным эпидермисом. Они обладают пролиферативной активностью и формируют кластеры, аналогичные структурно-функциональным единицам эпидермиса in vivo.

2. Для коллективной миграции кластеров эпидермальных клеток на плоском субстрате in vitro характерна зависимость от пролиферации отдельных клеток: на ведущем крае мигрирующего кластера находятся клетки, обладающие высокой пролиферативной активностью; миграция эпидермального пласта in vitro осуществляется за счет кооперативной миграционной активности первых нескольких рядов клеток. Существует базальный уровень миграции, не зависимый от подавления пролиферации и действия факторов роста и обеспечивающий быстрый ответ клеток эпидермиса на появление свободного края.

3. На модели эпителизации коллагенового геля выявлена морфогенетическая роль мезенхимных клеток. При миграции эпидермальных кератиноцитов человека в коллагеновом геле происходит образование тубулярных структур. Этот морфогенетический процесс сходен с ранними стадиями развития волосяного фолликула. Предложенная модель может служить для определения морфогенетического потенциала клеток in vitro.

4. Мезенхимные стволовые клетки, находящиеся в волосяном сосочке (дермальной папилле) волосяного фолликула, в культуре индуцируют эпидермальный морфогенез. Факторы роста HGF, EGF и KGF могут частично заменить указанное действие клеток дермальной папиллы.

5. Культивируемые клетки дермальной папиллы обладают свойством дифференцироваться в остеогенном, нейрогенном, и, в меньшей степени, адипогенном направлениях. Они способны реорганизовывать внеклеточный матрикс, стимулировать ангиогенез, формировать псевдопапиллы.

6. В процессе культивирования клеток дермальной папиллы человека происходит значительное повышение уровня транскрипции генов BMP6, FGFR1 и NDP и понижение уровня транскрипции генов ALPL, FGF10 и TWIST1.

7. Культивированные клетки волосяного фолликула человека могут быть использованы для разработки новых технологий для регенеративной медицины как легкодоступный источник клеток, обладающих широкими дифференцировочными и функциональными возможностями для стимуляции эпителизации, ангиогенеза и фолликулогенеза.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах

1. Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Терских В.В. Моделирование регенерации эпидермиса in vitro: совместное действие сыворотки и эпидермального фактора роста // Онтогенез. 1994. Т. 25. №3. С. 74-79.

2. Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Гусев С.А., Повалий Т.М., Терских В.В. Альфа-фетопротеин подавляет пролиферацию кератиноцитов in vitro // Известия РАН. Серия биол. 1996. №1. С. 117-120.

3. Воротеляк Е.А., Леонова О.Г., Шинин В.В., Васильев А.В., Терских В.В. Рост эпидермальных кератиноцитов человека на коллагеновом геле // Доклады Академии Наук. 1999. Т. 369. № 5. С. 695-697.

4. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев А.В., Терских В.В. Моделирование процесса миграции эпидермальных кератиноцитов человека по трехмерному коллагеновому гелю // Известия РАН. Серия биол. 2002. №1. С. 30-37.

5. Воротеляк Е.А., Шихвердиева А.Ш., Васильев А.В., Терских В.В. Фибробласты стимулируют эпителизацию коллагенового геля // Известия РАН. Серия биол. 2002. №4. С. 421-426.

6. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Структурно-функциональные единицы эпидермиса // Известия РАН. Серия биол. 2003. №6. С. 645-649.

7. Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Крохина Т.Б., Цитрин Е.Б., Терских В.В., Хрущов Н.Г. Нестинположительные клетки базального слоя эпидермиса человека в культуре // Доклады Академии наук. 2004. Т. 394. С. 555-557.

8. Воротеляк Е.А., Цитрин Е.Б., Васильев А.В., Терских В.В. Кератиноциты человека, длительно сохраняющие метку в культуре // Доклады Академии наук. 2005. Т. 402. № 3, С. 418-420.

9. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Васильев А.В., Терских В.В. Организация популяции кератиноцитов в культуре in vitro // Известия РАН. Серия биол. 2005. №6. С. 645-649.

10. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки: эволюция концепции // Вестник дерматологии и венерологии. 2005. № 2. С. 4-8.

11. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Стволовые клетки и структура эпидермиса // Вестник дерматологии и венерологии. 2005. № 3. С. 11-15.

12. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Васильев А.В., Терских В.В. Экспрессия кератина 19 в культуре эпидермальных кератиноцитов человека // Доклады Академии наук. 2006. Т. 408. №6. С. 835-837.

13. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Ниши стволовых клеток // Известия РАН. Серия биол. 2007. № 3. С. 261-272.

14. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Ткаченко С.Б., Васильев А.В., Терских В.В. Экспрессия и функция гена р63 в эпителиальных клетках // Известия РАН. Серия биол. 2007. № 4. С. 389-393.

15. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Поляризация и асимметричное деление стволовых клеток // Цитология. 2007. Т. 49. № 11. С. 933-938.

16. Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Ткаченко С.Б., Васильев А.В., Терских В.В. Пролиферация кератин 19-положительных эпидермальных кератиноцитов человека in vitro // Доклады Академии наук. 2007. Т. 416. №4. С. 555-557.

17. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Сохранение генетической информации в стволовых клетках // Генетика. 2008 Т. 44, № 3. С. 305-308.

18. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. SP-фенотип стволовых клеток // Известия РАН. Серия биол. 2008. №5. С. 517-521.

19. Васильев А.В., Воротеляк Е.А., Киселев И.В., Терских В.В. Реконструкция эпителиальных тканей с использованием клеточных технологий // Вестник РАМН. 2008. №2. С. 45- 53.

20. Киселева Е.В., Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Воложин А.И., Васильев А.В., Терских В.В. Сравнение дифференцировочных потенций фибробластоподобных клеток стромы костного мозга, жировой ткани, волосяного сосочка и фибробластов дермы человека // Цитология. 2009. Т. 51. №1. С. 12-19.

21. Гнедева К.Ю., Чермных Э.С., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Влияние факторов роста на морфогенез кератиноцитов человека in vitro // Известия РАН. Серия биол. 2009. №3. С. 368-372.

22. Воротеляк Е.А., Терских В.В., Стволовые клетки эпителиальных тканей // В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. М.А. Пальцева. Москва. «Медицина» «Шико». 2009. С. 53-74.

23. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Микроокружение стволовых клеток // В кн.: Биология стволовых клеток и клеточные технологии. Под ред. М.А. Пальцева. Москва. «Медицина» «Шико». 2009. С. 44-66.

24. Терских В.В., Воротеляк Е.А., Васильев А.В. Самоподдержание стволовых клеток // Actae Natura. 2009. №2 C. 67-72.

25. Терских В.В., Васильев А.В., Воротеляк Е.А. Самоподдержание стволовых клеток: роль асимметричного деления // Известия РАН. Серия биол. 2009. №5. С 509-514.

26. Terskikh V. V., Vasiliev V. A., and Vorotelyak E. A. Daughter Cells Self-Renew through Asymmetric Division // In: Daughter Cell, Ed. A. Hitomi and M. Katoaka, Nova Science Publishers Inc. 2010. Р. 267-282.

27. Chermnykh E.S., Vorotelyak E.A., Gnedeva K.Y., Moldaver M.V., Yegorov Y.E., Vasiliev A.V. and Terskikh V.V. Dermal papilla cells induce keratinocyte tubulogenesis in culture // Histochemistry and Cell Biology. 2010. V. 133, Issue 5. P. 567-576.

28. Чермных Э.С., Радюхина Н.В., Руткевич П.Н., Шевелев А.Я., Власик Т.Н., Воротеляк Е.А., Васильев А.В., Терских В.В. Культивированные клетки волосяного фолликула человека способны встраиваться в структуру кожи in vivo // Цитология. 2010. Т. 52. №3. С. 219-224.

29. Гнедева К.Ю., Воротеляк Е.А., Терских А.В., Васильев А.В, Терских В.В. Дифференцировочный и морфогенетический потенциал клеток дермальной папиллы крысы // Известия РАН. Серия биол. 2011. № 6. С. 653-658.

30. Terskikh V.V., Vasiliev A.V., Vorotelyak E.A. Label retaining cells and cutaneous stem cells // Stem Cell Review and Reports. 2011. DOI: 10.1007/s12015-011-9299-6.

Патент

E. Vorotelyak, A. Vasiliev, E. Chermnykh, N. Tankovich. Angiogenically induced transplants and methods for their use and manufacture. - US20090148416.