Свободнорадикальные процессы и антиоксидантная защита разных отделов центральной нервной системы на этапах постнатального онтогенеза белых крыс в норме и при действии промышленных серосодержащих поллютантов

Размещено на http://www.allbest.ru/

Свободнорадикальные процессы и антиоксидантная защита разных отделов центральной нервной системы на этапах постнатального онтогенеза белых крыс в норме и при действии промышленных серосодержащих поллютантов

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

МАЖИТОВА Марина Владимировна

Астрахань 2012

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханский государственный университет»

Научный консультант Теплый Давид Львович доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты Сердюков Василий Гаврилович доктор биологических наук, профессор

Анищенко Татьяна Григорьевна доктор биологических наук, профессор

Котельников Андрей Вячеславович доктор биологических наук, доцент

Ведущая организация Институт эволюционной физиологии и биохимии им И.М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится « 29 » февраля 2012 года в 14.00 часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.009.01 при Астраханском государственном университете по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Астраханского государственного университета

Автореферат разослан « ____ » ____________ 20____ года.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Ю.В. Нестеров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Ткань мозга характеризуется интенсивной генерацией активных форм кислорода в биоэнергетических и специфических нейрохимических процессах. Это создает благоприятные условия для окисления мембранных липидов, белков и нуклеиновых кислот. Продукты перекисного окисления липидов, к которым нервная ткань наиболее чувствительна, являются важным звеном регуляции функциональной активности нервной системы и имеют большое значение в формировании приспособительных реакций на уровне клетки (Флеров М.А. и др., 2000). Однако активация свободнорадикальных процессов существенно модифицирует функциональное состояние нейронов и может привести к их гибели (Ерин А.Н. и др., 1994). В этих условиях накопление продуктов ПОЛ и перекисного окисления белков повышает проницаемость мембран для ионов, что приводит к интенсификации синтеза Са²⁺ -зависимых протеаз и липаз, приводящих к гибели нервных клеток. Безусловно, этот механизм носит универсальный характер, однако в разных отделах мозга он может происходить по-разному, что определяется как структурной, так и функциональной гетерогенностью разных отделов мозга. Это, в свою очередь, предполагает необходимость адекватного для каждого из отделов мозга уровня свободнорадикальных процессов и соответствующей антиоксидантной защиты.

Исследования многих авторов указывают на тканевую специфику уровня свободных радикалов и эндогенных антиоксидантов в головном мозге у плодов (Прокопенко В.М.и др., 1995), однако без дифференцировки по отделам мозга, или указывают на особенности про- и антиоксидантной системы коры больших полушарий без указания на возрастные особенности (Райзе Т.Е. и др., 1994). Другие исследователи характеризуют особенности интенсификации свободнорадикальных процессов и ослабление антиоксидантной системы мозга и других функциональных систем организма при старении, аргументируя концепцию свободнорадикального окислени при старении Хармана-Эмануэля (Кольтовер В.К. 2000; Болдырев А.А. 2001, Хавинсов В.Х. и др. 2003, Коркушко О.В. и др., 2010).

Таким образом, налицо фрагментарность данных о возрастной динамике системы свободных радикалов и уровня антиоксидантов центральной нервной системы без дифференцировки на разные отделы мозга. Имеющиеся многочисленные данные выполнены, к тому же, с использованием разных методических подходов и на разных экспериментальных моделях.

Отмечается особое внимание исследователей на состояние системы про- и антиоксидантов мозга на этапе возрастной инволюции, особенно в связи с возрастной патологией мозга. Старение затрагивает все органические структуры организма человека.

Между тем знание основных промежуточных этапов формирования интенсивности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты представляет не только несомненный теоретический, но и практический интерес с учетом роли этих процессов в нормальном и патологическом формировании и функционировании разных отделов центральной нервной системы, сопровождающихся развитием окислительного стресса.

Учитывая, что неблагоприятные факторы окружающей среды, способствующие развитию окислительного стресса такие как ионизирующая и ультрафиолетовая радиация, гипо- и гипероксия, загрязненность атмосферного воздуха, воды и пищи вредными химическими веществами, канцерогенами играют не последнюю роль в процессах старения, результаты исследований могут послужить основой для существенного углубления механизмов формирования возрастных особенностей свободнорадикальных процессов и системы эндогенных антиоксидантов во всех отделах мозга на разных этапах постнатального онтогенеза.

Функционирующий Астраханский газоперерабатывающий завод вносит немалый вклад в общую экологическую обстановку области. Несмотря на то, что серосодержащий газ Астраханского месторождения относится к пульмотоксикантам, многочисленные работы свидетельствуют о наличии его выраженного нейротропного эффекта (Солнышкова Т.Г. 2003). Кроме того, аналогичные газоконденсатные месторождения имеются в Оренбургской области, Казахстане, Канаде, США, Китае. По содержанию сероводорода они уступают Астраханскому. Так содержание сероводорода и меркаптанов в Оренбургском газоконденсатном месторождении доходит до 4,5 %, в то время как в Астраханском - до 25 %.

Учитывая вышесказанное, исследование сдвига антиоксидантной - прооксидантной системы на разных уровнях центральной нервной системы в эксперименте на разнополых молодых и старых животных в условиях хронического воздействия серосодержащим газом, является, несомненно, актуальным направлением не только для Астраханской области, но и для других регионов России и зарубежья.

Цель исследования - определить стационарный уровень свободнорадикальных процессов и антирадикальной защиты в разных отделах мозга на этапах онтогенеза разнополых животных, а также их модуляцию при действии промышленных серосодержащих поллютантов с последующей их коррекцией антиоксидантами.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

Изучить особенности свободнорадикальных процессов в разных отделах центральной нервной системы и плазме крови молодых и старых крыс разного пола.

Изучить изменения физиологической антиоксидантной системы в мозге и плазме крови самцов и самок белых крыс при старении.

Изучить влияние антиоксидантов с разным механизмом действия: б-токоферола и эмоксипина на свободнорадикальные процессы и антиоксидантную защиту в плазме крови и разных отделах головного и спинном мозге молодых и старых белых крыс обоего пола.

Определить уровень ориентировочно-исследовательской реакции интактных самцов и самок белых крыс в двух возрастных группах и его изменение после введения антиоксидантов.

Выяснить возрастные, половые и тканевые особенности уровня свободнорадикальных процессов и эндогенных антиоксидантов при хроническом воздействии (сероводородсодержащий газ Астраханского месторождения) в разных отделах головного и спинном мозге и плазме крови белых крыс.

Изучить возможность корректирующего действия б-токоферола и эмоксипина на поведенческие реакции, молодых и старых белых крыс обоего пола на фоне воздействия сероводородсодержащим газом.

Определить возможность антиоксидантной коррекции свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты в плазме крови и разных отделах головного и спинном мозге самцов и самок белых крыс двух возрастных групп (6 и 24 месяца) при хроническом действии серосодержащего газа.

Научная новизна.

Впервые показано разнонаправленное изменение свободнорадикальных процессов в разных отделах центральной нервной системы у разнополых животных и при старении.

Установлены половые и возрастные особенности поведенческих реакций интактных животных, а также неодинаковое изменение показателей поведения под действием антиоксидантов, серосодержащего газа Астраханского месторождения и их совместного влияния на самцов и самок белых крыс разного возраста.

Впервые проведено сравнительно-физиологическое исследование влияния двух антиоксидантов (б-токоферол и эмоксипин) с разным механизмом действия на показатели свободнорадикальных процессов плазмы крови и разных отделов центральной нервной системы молодых и старых разнополых животных.

Впервые изучено изменение свободнорадикальных процессов и состояния антиоксидантной защиты разных отделах центральной нервной системы под влиянием промышленного природного газа Астраханского месторождения. поллютант мозг животное антиоксидант

Показана возможность коррекции б-токоферолом и эмоксипином смещения равновесий в системе прооксиданты - антиоксиданты в плазме крови и отделах центральной нервной системы, вызванного серосодержащим газом; установлены тканевые, половые и возрастные особенности влияния этих антиоксидантов на изучаемые показатели.

В результате комплексного исследования системы «липопероксидация-антиоксидантная защита» на разных уровнях центральной нервной системы решена проблема интегральной оценки антиоксидантного потенциала экспериментальных животных на этапах постнатального онтогенеза в условиях «нормы» и при действии промышленного природного газа Астраханского месторождения.

Теоретическая и практическая значимость.

В результате выполненных экспериментальных исследований и на основании проведенного теоретического анализа возрастных и половых особенностей свободнорадикальных процессов обоснована значимость поддержания определенного физиологического равновесия в системе прооксиданты - антиоксиданты в плазме крови и на разных уровнях центральной нервной системы разнополых крыс в процессе старения. Учитывая роль свободнорадикальных процессов в нормальном функционировании разных отделов центральной нервной системы, и при развитии окислительного стресса, изучение формирования интенсивности свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты в онтогенезе представляет не только несомненный теоретический, но и практический интерес для формирования представлений о процессах старения и развитии различных свободнорадикальных нарушений под действием неблагопроятных факторов окружающей среды.

Изучено влияние б-токоферола и эмоксипина на свободнорадикальные процессы и уровень эндогенных антиоксидантов плазмы крови и разных отделов центральной нервной системы интактных животных.

Исследованы закономерности изменения поведенческих реакций самцов и самок белых крыс на этапах постнатального онтогенеза под влияние б-токоферола и эмоксипина.

Установлены параметры изменчивости показателей про-, антиоксидантного баланса в плазме крови и на разных уровнях центральной нервной системы на фоне воздействия промышленного природного газа Астраханского месторождения. На основе проведенного анализа и соотнесение показателей свободнорадикального окисления и состояния антиоксидантной защиты в разных отделах головного и спинном мозге предложен способ интегральной оценки степени выраженности влияния промышленного природного газа Астраханского месторождения на изучаемые показатели самцов и самок белых крыс на этапах постнатального онтогенеза.

Выявлена эффективность антиоксидантной коррекции б-токоферолом и эмоксипином свободнорадикальных процессов на фоне воздействия промышленного природного газа Астраханского месторождения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. У крыс разного пола в процессе старения происходит разнонаправленное изменение показателей пероксидации липидов в центральной нервной системе: у самцов - повышение, а у самок - понижение конечных продуктов перекисного окисления липидов. Окислительная модификация белков у крыс обоего пола при старении повышается. Общая антиокислительная активность разных отделов ЦНС старых животных остается на уровне молодых, при неравнозначной модуляции отдельных звеньев эндогенной антиоксидантной системы.

2. Наиболее часто усиление свободнорадикальнх процессов в мозге происходит у самок под действием б -токоферола, нежели эмоксипина. Введение б-токоферола и эмоксипина молодом животным приводит к компенсаторному снижению активности эндогенных антиоксидантов, которое отличается степенью выраженности в разных отделах центральной нервной системы.

3. Хроническое действие серосодержащего газа Астраханского месторождения приводит к усилению свободнорадикальных процессов в ЦНС, что проявилось в росте окислительной модификации белков и, реже, продуктов окисления липидов. Наиболее глубокие нарушения про- антиоксидантного баланса под действием газообразного поллютанта отмечены у старых животных, что, вероятно, связано с истощением антиоксидантного пула, с разной степенью выраженности на разных уровнях ЦНС у 24-х месячных самцов и самок крыс.

4.Антиоксидантная коррекция, примененная на фоне воздействия серосодержащим газом Астраханского месторождения, оказывает наибольший модулирующий эффект на свободорадикальные процессы, протекающие в плазме крови и центральной нервной системе старых животных.

Апробация работы.

Материалы диссертации докладывались и представлялись на Всероссийской конференции «Астраханский край: история и современность» (Астрахань, 1997), II Всероссийской конференции-школе «Высокоре-акционные интермедиаты химических реакций» ChemInt 2007 (Астрахань, Москва, 2007), 6-й Международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань, Москва, 2008), XV Международной научно-практической конференции. «Экология и жизнь» (Пенза, 2008), Всероссийской научно-практической конференции «Инновационные процессы в области химико-педагогического и естественнонаучного образования» (Оренбург, 2009), VII Международной научно-практической конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в системе образования» (Тамбов, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Социально-экономические, валеологические и социокультурные аспекты развития рекреационных территорий Юга России», (Анапа, 2009), V Международной научно-практической конференции «Wschodnia Spolka-2009» (Польша, 2009), IV Всероссийском Съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Саратов, 2009), VI Международной научно-практической конференции ''Veda a technologie: krok do budoucnosti-2010'' (Прага, 2010), научной Международной конференции «Фундаментальные исследования» (Израиль, 2010), научно-практическом Симпозиуме с международным участием «Свободнорадикальная медицина и антиоксидантная терапия» (Волгоград, 2010), III Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека» (Ялта, Украина, 2011), научно-практической конференции «Актуальные проблемы геронтологии и гериатрии» (Санкт-Петербург, 2011), Международной научно-практической конференции «Достижения, инновационные направления развития и проблемы современной медицинской науки, генетики и биотехнологии» (Екатеринбург, 2011), II Всероссийской научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2011).

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 45 работ, общим объемом 19,25 п.л. (авторский вклад 18,08 п.л.) в том числе монография - 1, статьи в научных изданиях, рекомендованных ВАК для докторских диссертаций - 15, статьи в прочих рецензируемых журналах - 10, статьи в материалах международных научных конференций - 19.

Декларация личного участия автора.

Экспериментальные исследования выполнялись автором лично, либо при его непосредственном участии в коллективных работах. В совместных публикациях вклад автора составил 50-100 %.

Структура и объем диссертации.

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, главы собственного исследования, состоящей из 4 подглав, заключения, выводов и библиографического списка. Диссертация изложена на_277_ страницах, содержит 56 таблицы и 9 рисунков. Список литературы включает 585 источников, в том числе 238 иностранных.

Автор выражает глубокую благодарность д.б.н. профессору Д.Л. Теплому за помощь в выборе актуальных направлений исследований, ценные критические замечания, оказавшие значительное влияние в формирование концептуальной основы исследовательской работы, д.м.н., профессору Н.Н. Тризно за неоценимую методическую помощь в постановке и проведении экспериментального исследования.

МЕТОДЫ И ОРГАНИЗАЦИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

Экспериментальные исследовании были проведены в лаборатории экспериментальной физиологии Астраханского государственного университета, а также на кафедре патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии. Для достижения поставленных целей белые беспородные крысы были разделены на группы (по 10 животных) по половому и возрастному признакам: самцы и самки 6-ти месячного и 24-х месячного возраста. Формировали: контрольные группы (без воздействия) и опытные, получавшие в течение 14 дней перед декапитацией перорально б-токоферол в дозе 1 мг/100 г массы тела; получавшие в течение 14 дней перед декапитацией внутримышечно водный раствор эмоксипина (0,5 мг/100 г массы тела); получавшие ингаляторно серосодержащий газ (ССГ) в дозе 100 мг/м³ по 4 часа в день понедельник-пятница в течении 6 недель. Для изучения антиоксидантной коррекции части животных, получавшим ССГ, в течение 14 дней перед декапитацией вводили б-токоферол, другим группам - эмоксипин по выше указанной схеме. Для ингаляций использовался промышленный природный газ Астраханского месторождения. Все работы с лабораторными крысами проводили в соответствии с принципами биоэтики, согласно принципам гуманного отношения к животным и правилам лабораторной практики (Правила лабораторной практики в РФ, 2003). В день декапитации отбирались самки в фазе диэструса. Очередность фаз контролировали по картине влагалищных мазков (Кабак Я.М., 1968). Для исключения влияния тканевых факторов на изучаемые показатели забор крови осуществляли из нижней полой вены. Далее декапитировали животных. Все операции с лабораторными животными производили после наркотизации этаминалом натрия (40 мг/кг массы тела). Все исследования проводили в плазме крови и отделах мозга: большие полушария, промежуточный мозг, средний мозг, мозжечок, продолговатый мозг, спинной мозг, которые подвергали заморозке при -20 С°. Приготовление гомогенатов осуществляли на холоду непосредственно перед проведением исследований на фосфатном буферном растворе рН=7,45.

Для выявления ориенторовочно-исследовательской активности накануне перед опытом животных всех групп тестировали в «открытом поле» (Буреш Я. и др., 1991). Изменение числа эозинофилов контролировали по методике Ронина В.С. с соавт. (1989). Окислительно-восстановительный потенциал (ОВП) измеряли на иономере И-130. Перекисное окисление липидов оценивали по содержанию продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (ТБК-рп), скорости спонтанного ПОЛ (сп.ПОЛ), скорости индуцированного ПОЛ (Аск.ПОЛ). (Стальная И.Д. и др. 1977). Окислительную модификацию белков (ОМБ) определяли по методике Е.Е. Дубининой с соавт. (1995), уровень метаболитов оксидов азота - по методике В.А. Метельской с соавт. (2005). Общую антиокислительную активность (АОА) оценивали по методике Г.И. Клебанова с соавт (1988). Определяли активности каталазы (Королюк М.А., и др., 1988), супероксиддисмутазы (СОД) (Чевари С. И др. 1984), содержание жирорастворимых витаминов: А, в-каротина, б-токоферола, а также метаболитов б-токоферола - б-токоферилхинона (ТФХ) и оксотокоферола (ОТФ) (Tailor S.L. et all., 1976).

Статистическая обработка полученных данных производилась с использованием программы «EXCEL». Для оценки вариационных рядов и достоверности результатов исследования использовали показатели: М - средняя арифметическая величина; д - среднее квадратичное отклонение; С - коэффициент вариации; m - средняя ошибка для средней арифметической. Достоверность различий двух средних или относительных величин определяли с помощью критерия t Стьюдента. Уровень значимости Р=0,05, рекомендованный для биологических и медицинских исследований, определялся при t=2,10 (n?10).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ

1. Изучение половых и возрастных особенностей свободноради-кальных процессов и антиоксидантной защиты плазмы крови и разных отделов центральной нервной системы белых крыс

Учитывая разнородность экспериментальных результатов, представленных в литературе, а также наличие половых различий в антиоксидантной защите и особую роль свободных радикалов при старении, для достижения поставленных целей были изучены особенности протекания свободнорадикальных процессов и антиоксидантной защиты в половом и возрастном аспекте у интактных животных.

При сравнении показателей пероксидации липидов и белков в плазме крови обращает на себя внимание факт, что содержание ТБК-рп (P<0,05) и содержание окисленной модификации белков (P<0,05) у молодых самок имеет более низкие значения по сравнению с самцами того же возраста, в то время как скорость аскорбатзависимого ПОЛ у молодых самок, напротив, значимо выше и составляет 61,22±3,061 нмоль/ч (P<0,01 в сравнении с самцами).

С возрастом у самцов и самок произошло увеличение всех показателей ПОЛ и содержания окисленных белков (P<0,05 - P<0,001). Однако, несмотря на рост этих показателей у животных обоего пола, у старых самцов это увеличение произошло в большей степени и превысило таковые самок в старшей возрастной группе. Так у самцов ОМБ с возрастом увеличилось с 0,54±0,016 до 0,98±0,034 мкмоль/мг белка (P<0,001 по сравнению с молодыми самцами), а у самок - с 0,48±0,017 до 0,69±0,027 мкмоль/мг белка (P<0,001 по сравнению с молодыми самками).

Полученные результаты свидетельствуют также о половых различиях в содержании метаболитов NO в плазме крови у животных двух возрастных групп. У молодых самок этот показатель в плазме крови составил 78,35±5,103 мкмоль, что в 2,6 раза больше, чем у молодых самцов. Однако, с возрастом картина меняется на противоположную в ходе снижения уровня метаболитов NO у самок, и повышения - у самцов и в плазме старых самцов содержание конечных продуктов окисления NO превысило этот же показатель старых самок на 24 %. Исследования О.В. Семячкиной-Глушковской с соавт. (2008) показали, что гонадоэктомия сопровождалась существенным снижением базальной продукции NO у самок, но не у самцов. Поэтому в нашем случае, вероятно, уменьшение содержания конечных метаболитов NO у самок с возрастом связано со снижением уровня гормонов, в том числе и эстрогенов.

В плазме старых самцов и самок, нами обнаружено, что содержание ТБК-рп, скорость спонтанного ПОЛ, уровень ОМБ у самок по прежнему остается более низким, чем у самцов, а уровень NO метаболитов значимо снижается как по сравнению с молодыми самками (P<0,05), так и по сравнению с самцами той же возрастной группы (P<0,05).

Полученные данные свидетельствуют о более высокой (на 24 %) АОА плазмы крови молодых самок, которая хоть и снижается с возрастом с 72,14±2,597 % до 63,90±2,636 % (P<0,05), но остается значительно выше, чем у самцов той же возрастной группы (P<0,001). Несмотря на то, что активность каталазы имеет примерно одинаковое значение у молодых самцов (31,06±1,74 у.е./мг белка) и самок (28,34±1,73 у.е./мг белка), в ходе старения активность этого фермента увеличилась и в плазме крови самцов (на 16 %) и в плазме крови самок (на 20,5 %). Такое повышение активности каталазы с возрастом может быть как результатом снижения прочности эритроцитарной мембраны, что привело к повышению концентрации каталазы в плазме крови, так и иметь компенсаторную направленность на фоне снижения АОА плазмы крови с возрастом. СОД имеет неодинаковую активность как у животных разного пола, так и у разновозрастных крыс. Так, активность СОД молодых самок превышает таковую самцов на 76,8 % и, хотя снижается с возрастом на 30,8 %, но остается по-прежнему выше, чем у старых самцов.

В связи с тем, что при старении общая АОА плазмы крови снижается, а активность антиоксидантных ферментов увеличивается (каталаза) можно заключить, что с возрастом в плазме крови животных увеличивается роль ферментативной антиоксидантной системы в регуляции СРО.

В эксперименте нами обнаружен более высокий уровень витамина А (P<0,001) в плазме крови у молодых самок и в-каротина (P<0,01) и б-токоферола (P<0,01) - у стареющих самок по сравнению с самцами. В то же время уровень в-каротина (P<0,001) и б-токоферилхинона (P<0,001) у молодых самок был значимо ниже в плазме крови, чем у самцов-ровесников.

Сравнивая полученные данные об изменениях с возрастом концентрации б-токоферола и его димеров в плазме крови белых крыс обоего пола можно отметить, что эти изменения однонаправлены и хорошо согласуются между собой. Все три показателя и у самцов и у самок с возрастом снизились, что, по-видимому, и повлияло на уровень АОА, который снизился у старых животных обоего пола.

Таким образом, в плазме крови на фоне снижения общей антиокислительной активности происходит усиление свободнорадикальных процессов у животных обоего пола.

В больших полушариях (БП) у молодых самок обнаружен более высокий уровень ТБК-рп (P<0,05), сп.ПОЛ (P<0,001), уровня NO (P<0,001), чем у самцов, что говорит о более высоком уровне протекания радикальных метаболических процессов. С другой стороны уровень АОА, активности каталазы и СОД самок не отличался от таковых самцов, а Аск.ПОЛ оказался значимо ниже (P<0,05). Также, у самок обнаружен более низкий уровень ОМБ (P<0,001). При исследовании содержания жирорастворимых витаминов в БП установлено, что у молодых самок уровень витамина А (P<0,001), в-каротина (P<0,01) и б-токоферола (P<0,001) значимо выше, нежели у самцов. Полученные результаты позволяют заключить, что антиоксидантный пул больших полушарий у молодых самок белых крыс имеет иной качественный и количественный состав, чем у самцов и, несмотря на более высокий уровень свободнорадикальных процессов по некоторым показателям ПОЛ, позволяет сдерживать развитие процесса при его индукции аскорбатом.

С возрастом у самцов и самок в БП происходит разнонаправленное изменение содержания ТБК-рп. Так, у старых самцов этот показатель возрос на 37,8 %, а у старых самок снизился почти в 2 раза. С другой стороны Аск.ПОЛ снижается у животных обоего пола с 110,03 ± 9,33 до 55,39±4,915 нмоль/ч у самцов (P<0,001), и с 82,58±4,763 до 68,16±2,726 нмоль/ч у самок (P<0,05), а сп.ПОЛ только у самок (P<0,05). Уровень ОМБ значимо возрос только у самцов и составил 0,71±0,021 мкмоль/мг белка. Активность каталазы (самцы P<0,001, самки P<0,01 в сравнении с молодыми) и СОД (самцы P<0,001, самки P<0,05 в сравнении с молодыми) в БП оказались достоверно ниже у старых животных, чем у молодых, причем у самцов эти изменения выражены в большей степени, по сравнению с самками.

При изучении неферментного антиоксидантного звена у самцов с возрастом зафиксировано снижение содержания в-каротина (P<0,01), б-токоферола (P<0,001), б-ТФХ (P<0,01) и ОТФ (P<0,01) до значений 0,11±0,009 мкмоль/1г ткани, 0,31±0,025 мкмоль/1г ткани, 1,07±0,055 ед. оп. пл./1г ткани, 0,48±0,024 мкмоль/1г ткани соответственно. У самок возрастные изменения содержания жирорастворимых витаминов в больших полушариях происходит более полого, чем у самцов, что выражается в снижении уровня меньшего количества показателей, а именно в-каротина (P<0,01), б-токоферилхинона (P<0,01) и оксотокоферола (P<0,05).

Таким образом, у старых животных половые различия в больших полушариях проявились в более низком уровне ТБК-рп (P<0,001), ОМБ (P<0,001) и б-окоферилхинона (P<0,05), а также в более высоком уровне скорости аскорбатзависимого ПОЛ (P<0,05), NO-метаболитов (P<0,001), ОВП (P<0,001), активности СОД (P<0,001), витамина А (P<0,001), в-каротина (P<0,001), б-токоферола (P<0,001) и АОА у самок(P<0,05), чем у самцов.

Несмотря на то, что активность основных антиоксидантов в БП снижается, АОА уменьшилась незначительно: у самцов на 17 %, а у самок всего лишь на 4 %, Это позволяет предположить, что буферная емкость ткани, сдерживающая СРО не исчерпана и разнонаправленные изменения в активности отдельных звеньев антиоксидантной системы у животных разного пола носят компенсаторный характер и позволяют сохранить уровень общей антиокислительной активности ткани больших полушарий.

В промежуточном мозге (ПМ) у интактных животных половые различия проявились в более высоком уровне ТБК-рп (P<0,01), сп. ПОЛ (P<0,001), уровня метаболитов NO (P<0,001) и в более низкой скорости Аск.ПОЛ (P<0,001) и ОВП (P<0,001) у молодых самок, чем у самцов.

С возрастом у самцов значимо увеличился уровень ТБК-рп (P<0,001), скорость спонтанного ПОЛ (P<0,001), содержание продуктов ОМБ (P<0,05), NО-метаболитов (P<0,001). У старых самцов оказались достоверно ниже Аск.ПОЛ (P<0,001), ОВП (P<0,001), активности каталазы (P<0,001) и СОД (P<0,001) по сравнению с молодыми животными. У самок второй возрастной группы имело противоположное по сравнению с самцами изменение некоторых показателей. Все три показателя ПОЛ у самок с возрастом снизились (P<0,01 - P<0,001) и оказались достоверно ниже, чем у самцов-ровесников (P<0,01 - P<0,001). С другой стороны у них же показатель ОВП и активность каталазы значимо не изменились, но стали выше, чем у самцов той же возрастной группы. Об усилении с возрастом процессов окислительной деструкции в промежуточном мозге свидетельствует увеличение содержания окисленных белов у животных обоего пола.

При изучении уровня жирорастворимых антиоксидантов в промежуточном мозге отмечено снижение их с возрастом и у самцов, и у самок. Однако, несмотря на это, у старых самок содержание витамина А, в-каротина и б-токоферола составило 0,041±0,002, 0,39±0,016 и 1,589±0,092 мкмоль/1г ткани соответственно, превысив эти же показатели старых самцов.

В среднем мозге (СР) у молодых самок обнаружен более высокие уровни сп.ПОЛ (P<0,001) и NО (P<0,001) и более высокая скорость Аск.ПОЛ (P<0,001). Половые отличия антиоксидантной системы проявились в более высоком содержании витамина А (P<0,001), в-каротина (P<0,001) и одного из метаболитов б-токоферола -- ОТФ (P<0,01). Все остальные изучаемые показатели не имели различий между группами животных разного пола.

В процессе старения отмечено увеличение на 28 % уровня ТБК-рп, в 2,1 раза сп.ПОЛ, на 19,8 % NО-метаболитов, а также снижение ОВП (P<0,001) и Аск.ПОЛ (P<0,001) у самцов. У старых самок же оказались достоверно ниже по сравнению с молодыми только сп.ПОЛ (P<0,001) и Аск. ПОЛ (P<0,001). В ходе старения содержание жирорастворимых антиоксидантов значимо снизилось у животных обоего пола, при неизменном уровне АОА ткани СР.

При сравнении изучаемых показателей в СР у старых самцов и самок имели место половые различия, которые проявились в более низких значениях уровня ТБК-рп (P<0,01), сп.ПОЛ (P<0,001) и более высокие значения уровня NО (P<0,001) и ОВП (P<0,05), уровня витамина А (P<0,001), в-каротина (P<0,001) и ОТФ (P<0,001) у самок.

Результаты исследования уровня свободнорадикальных процессов и антирадикальной защиты в мозжечке (МЧ) свидетельствуют о более низкой скорости Аск.ПОЛ (P<0,001), превышении на 63,6 % уровня метаболитов NО и почти в 2 раза ОВП у молодых самок, по сравнению с самцами той же возрастной группы. Также половые различия у молодых животных проявились в повышенном содержании всех определяемых (кроме б-ТФХ) неферментных антиоксидантов у самок.

С возрастом в МЧ у самок произошло значимое снижение всех трех показателей ПОЛ, которые при этом стали ниже, чем у старых самцов. Продукты ОМБ увеличились у крыс обоего пола, а уровень NО-метаболитов у самок хотя и снизился до 40,11 ± 1,203 мкмоль, но остался также как и у молодых животных выше, чем у самцов. Если в группе молодых животных половых различий в активности СОД не зафиксировано, то у стареющих самок этот показатель превышает таковой самцов на 19 %. В ходе старения содержание витаминов-антиоксидантов снизилось у животных обоего пола. Однако более резкое снижение произошло у самцов, нежели у самок, что проявилось в изменении большего количества показателей с большей степенью достоверности. В результате у старых самок уровень витамина А превысил таковой старых самцов в 2 раза, в-каротина -- в 1,8 раз, б-токоферола -- в 1,7 раз, б-токоферилхинона в 1,4 раза.

В продолговатом мозге (ПД) в группах молодых животных имеет место более высокий уровень ТБК-рп (3,754 ± 0,293 нмоль/0,5г ткани, P<0,01 в сравнении с самцами), сп.ПОЛ (32,864 ± 1,616 нмоль/ч, P<0,001 в сравнении с самцами), ОМБ (0,51 ± 0,013 мкмоль/мг белка, P<0,01 в сравнении с самцами), NO (62,38 ± 2,807 мкмоль, P<0,001 в сравнении с самцами) у самок, чем у самцов.

С возрастом у самок происходит снижение всех изучаемых характеристик ПОЛ. Уровень NO-метаболитов, как и в других изучаемых отделах, оказался достоверно ниже у самок старшей возрастной группы (51,17 ± 2,047 мкмоль), по сравнению с молодыми самками (62,38 ± 2,807 мкмоль). Несмотря на снижение этого показателя с возрастом, у самок уровень NO по-прежнему выше, чем у самцов в старшей возрастной группе (P<0,01). У самцов в ПД с возрастом достоверно снизились лишь Аск.ПОЛ (P<0,001), ОВП (P<0,05), а уровень NO увеличился на 42,8 %.

Таким образом у животных старшей возрастной группы в ПД половые отличия проявились по иному, нежели у молодых животных. У 24х-месячных самок уровень ТБК-рп (P<0,01), сп.ПОЛ (P<0,05), оказались ниже, а содержание ОМБ (P<0,05), уровень NO-метаболитов (P<0,05) и ОВП (P<0,05) достоверно выше, чем у самцов той же возрастной группы.

В спинном мозге (СП) достоверные половые различия изучаемых характеристик СРО у молодых животных отсутствуют. Однако с возрастом у самцов и самок происходит разнонаправленное изменение некоторых изучаемых показателей, что может косвенно говорить о разном антиоксидантном статусе и его качественном и количественном изменении в спинном мозге при старении у животных разного пола. У старых самок же все три показателя ПОЛ оказались достоверно ниже (P<0,01 - P<0,001), чем у молодых самок. В результате у животных старшей возрастной группы обнаружены следующие половые различия в СП: уровень ТБК-рп в 2 раза, скорость сп.ПОЛ в 3 раза, а Аск.ПОЛ на 34 % ниже у самок, чем у самцов. Активность ферментных и содержание неферментных антиоксидантов самцов и самок находится примерно на одинаковом уровне. Однако показатель ОВП в СП самок оказался значимо выше, чем у самцов.

Таким образом, при сравнении изучаемых показателей в плазме крови и в разных отделах ЦНС обнаружены половые различия, которые в большей степени проявились в плазме крови, больших полушариях, промежуточном и среднем мозге, мозжечке и в меньшей степени продолговатом мозге молодых животных. В спинном мозге молодых животных половых различий не обнаружено, что, по-видимому, связано с тем, что спинной мозг является наиболее старым в филогенетическом плане отделом.

При сравнении тканевых особенностей обнаружено, что у молодых животных уровень ТБК-рп значимо различается в изучаемых отделах мозга (рис.1). Так у молодых самцов и самок этот показатель значимо выше в БП, нежели в других отделах мозга. У самцов старшей возрастной группы произошло увеличение этого показателя, который стал еще более значимо превышать значения уровня ТБК-рп в других отделах мозга.

У самок по мере взросления, напротив, содержание ТБК-рп в БП снизилось настолько, что почти сравнялось с этим показателем в ПМ и СР мозге. Снижение в ходе старения СРО липидов в тканях мозга самок можно объяснить, вероятно, снижением интенсивности процессов митохондриального окисления (Кольтовер, 1998, 2000). Однако, при этом параллельно снижается мощность и надежность систем антиокислительной защиты, что может способствовать более выраженному повреждению тканей (Обухова и др., 1983, Shigenaga et al., 1994, Papa et al., 1997).

Рис. 1 Уровень ТБК-реактивных продуктов в разных отделах мозга самцов и самок белых крыс разного возраста

Примечание: ? - различие значимо по сравнению с молодыми животными; # - различие значимо по сравнению с самцами

Полученные нами результаты по изучению активности СОД в тканях мозга свидетельствуют о неодинаковой активности СОД в разных отделах ЦНС: у молодых самцов этот показатель значительно меньше в больших полушариях и мозжечке, чем в промежуточном и среднем мозге. По мере взросления активность СОД снижается и у самцов, и у самок и остается достоверно ниже, чем в промежуточном и среднем мозге. Причем с возрастом эта разница увеличивается. Наименьшая разница в значениях активности СОД имела место в продолговатом и спинном мозге, где активность СОД имела примерно одинаковые значения и у животных разного пола, и у животных разного возраста. Онтогенетических изменений в активности СОД не обнаружено в мозжечке, среднем мозге животных обоего пола, в промежуточном мозге самок и продолговатом мозге самцов.

2. Изучение влияния антиоксидантов на свободнорадикальные процессы плазмы крови и мозга самцов и самок белых крыс разного возраста и уровень их антиоксидантной защиты. Поведенческие аспекты

Учитывая изначально разный уровень свободнорадикальных процессов и антиоксидантного статуса разнополых животных, интерес представляло исследовать влияние б-токоферола и эмоксипина на оксидантный-прооксидантный гомеостаз плазмы крови, головного и спинного мозга интактных самцов и самок белых крыс и его изменение с возрастом на фоне введения этих препаратов.

Т.к. поведение является функциональной производной активности мозга, представляло интерес выяснить характер их действия на поведение животных в тесте открытого поля.

Обнаружены половые и возрастные особенности поведенческих реакций у интактных крыс и животных, получавший витамин Е и эмоксипин. Молодые самки проявляли более высокую горизонтальную подвижность, что выражалось в увеличении числа посещений центральной зоны площадки (Р<0,05), а также имели больше вертикальных стоек без опоры (Р<0,05) нежели самцы. С другой стороны число вертикальных стоек с опорой (Р<0,05) и количество заглядываний в норку (Р<0,05) у молодых самок было ниже, чем у самцов.

При сравнении поведенческих реакций животных двух возрастных групп обнаружено снижение и горизонтальной, и вертикальной двигательной активности у старых самцов. Помимо этого, если у молодых самцов отсутствовали болюсы, у старых животных этот показатель присутствует и свидетельствует о повышении «эмоциональности» животных. У самок с возрастом снизились число посещений центральной зоны (Р<0,05), вертикальных стоек с опорой (Р<0,05), частота актов груминга (Р<0,05), что может говорить об усилении чувства страха.

После введения витамина Е в группах молодых животных (> и +) произошло значимое увеличение вертикальной и горизонтальной активности и количество посещаемых норок, что говорит об усилении ориентировочно-исследовательской реакции. Появление болюсов говорит о повышении эмоциональной реактивности животных.

Введение эмоксипина молодым животным привело к увеличению числа пересеченных центральных квадратов (Р<0,05), вертикальной активности (Р<0,05) у самцов и увеличению вертикальной активности (Р<0,05) и числа посещений норок (Р<0,05) у самок. В этих группах болюсы отсутствуют, так же, как и в контроле. Таким образом, эмоксипин привел к увеличению меньшего числа параметров нежели витамин Е.

При сравнении этих же показателей на фоне введения антиоксидантов в группах старых животных обнаружено увеличение горизонтальной активности, числа стоек с опорой и болюсов, а также уменьшение посещений норок у самцов, получавших б-токоферол. У них же эмоксипин вызвал увеличение числа центральных квадратов, стоек с опорой, частоте актов груминга, но значимо снизил число стоек без опоры, норок и болюсов у старых самцов. У старых самок на фоне введения витамина Е имело место увеличение выходов в центральную зону, стоек с опорой, частоты актов груминга и появление болюсов. При этом снизилось число стоек без опоры. Введение эмоксипина также привело к разнонаправленному изменению изучаемых параметров у старых самок. Так, после двухнедельного введения эмоксипина у старых самок произошло увеличение посещений центральных квадратов, стоек с опорой и уменьшение пересеченных периферических квадратов, стоек без опоры и норок.

Действие витамина Е сказалось в повышении эмоциональной реактивности животных (появление болюсов), что обычно отрицательно коррелирует с уровнем локомоторной и ориенторовочно-исследовательской активности (Титов С.Н. и др., 1980). Повышение уровня эмоциональной реактивности чаще всего означает усиление «страха» в обстановке опыта, однако более частое посещение центра арены свидетельствует об обратном.

Таким образом, результаты по исследованию поведенческих реакций при введении антиоксидантов позволяют утверждать, что вещества являющиеся ингибиторами СРО, проявляют нейротропное действие и влияют на состояние ЦНС.

Учитывая изначально разный уровень свободнорадикальных процессов в изучаемых отделах интерес представляло изучить влияние антиоксидантов на скорость пероксидации липидов и белков, а также антиоксидантный статус плазмы крови и разных отделов ЦНС.

В плазме крови введение витамина Е привело к снижению уровня ТБК-рп у молодых самцов (на 28,4%) и старых животных обоего пола (у самцов на 46,7%, у самок 76,8%). В плазме крови молодых самок произошло, напротив, увеличение этого показателя, что, вероятно связано со сложным характером вовлечения б -токоферола в антиоксидантный гомеостаз самок который за счет стероидного звена имеет большую емкость, чем у самцов. Таким образом б-токоферол оказал больший эффект на животных старшей возрастной группы, что, вероятно, связано с увеличением потребности организма в антиоксидантах. Это согласуется со снижением скоростей сп.ПОЛ и Аск.ПОЛ (Р<0,05) после введения б-токоферола у старых самцов группы, а также со снижением скорости Аск.ПОЛ у старых самок.

Содержание ОМБ после введения витамина Е в группах молодых животных не изменилось, за исключением молодых самок, у которых уровень ОМБ снизился на 20 % по сравнению с контролем. Повышенный с возрастом уровень ОМБ снизился на фоне дополнительного введения антиоксиданта и у самцов (на 60,6 %), так и у самок (на 86,5 %).

Уровень NО метаболитов после введения витамина Е снизился у молодых самок (на 28 %) и животных второй возрастной группы обоего пола.

Введение витамина Е привело к резкому увеличению ОВП в плазме молодых самок и к менее выраженному, но достоверному снижению этого показателя у старых самок.

Таким образом витамин Е снизил большее количество показателей СРО в плазме молодых самцов, а у молодых самок даже увеличил некоторые из них. Наибольший эффект этот препарат оказал на старых животных обоего пола, что связано со снижением антиоксидантного звена плазмы крови в ходе старения и своевременности введения антиоксиданта.

Введение эмоксипина привело к увеличению ОВП плазмы крови молодых самцов и самок, причем к более резкому у самок. У старых самцов эмоксипин вызвал снижение сп.ПОЛ (на 19 и увеличение ОВП в плазме крови. У старых самок введение эмоксипина привело к снижению уровня ТБК-рп (на 42 %), продуктов ОМБ (на 40,8 %) и ОВП.

АОА и каталаза плазмы крови остались на уровне контрольных значений у молодых животных обоего пола, а активность СОД снизилась у молодых самцов и под воздействием витамина Е (Р<0,05), и эмоксипина (Р<0,05), а у молодых самок только после введения витамина Е (Р<0,05). Содержание жирорастворимых антиоксидантов изменилось иначе. В результате введения б-токоферола у молодых самцов произошло увеличение уровня витамина А (Р<0,05), в-каротина, б-токоферола. Введение эмоксипина снизило содержание б-токоферола и б-ТФХ в плазме крови. У самок этой же возрастной группы б-токоферол вызвал увеличение всех изучаемых нами форм жирорастворимых витаминов, кроме ОТФ, а эмоксипин снизил уровень б-токоферола и его метаболитов.

В группах старых животных на фоне введения б-токоферола у самцов произошло увеличение АОА (Р<0,05), активности СОД (Р<0,05), уровня в-каротина (Р<0,05) и б-токоферола (Р<0,05), активность каталазы снизилась (Р<0,05). У них же эмоксипин вызвал увеличение АОА, СОД, и снижение активности каталазы и уровня б-токоферола. У старых самок витамин Е увеличил АОА, уровень витамина А, в-каротина, б-токоферола и ОТФ плазмы крови. Эмоксипин снизил активность каталазы (Р<0,05).

Анализируя полученные нами результаты, можно заключить, что введение антиоксидантов молодым животным не всегда снижает скорость СРО в плазме крови, а иногда (молодые самки) влечет за собой их увеличение. Это еще раз доказывает важную роль свободных радикалов и необходимость поддержания радикальных реакций окисления липидов и белков на определенном уровне, свойственном для каждого органа.

С возрастом применение антиоксидантов становится более целесообразным, что подтверждается снижением ПОЛ и ОМБ в плазме крови у животных обоего пола под действием и витамина Е, и эмоксипина. Но все же большее число показателей СРО в плазме крови снизилось на фоне введения б-токоферола, нежели эмоксипина, что может быть связано с различиями в токсикокинетике и токсикодинамике этих препаратов.

Анализ полученных результатов по влиянию антиоксидантов на состояние прооксидантной -- антиоксидантной системы в больших полушариях дает основание полагать, что введение молодым животным б-токоферола и эмоксипина вызывает ряд компенсаторных изменений в активности антиоксидантов и позволяет сохранять АОА этой ткани БП. Так, у молодых крыс активность СОД на фоне антиоксидантной коррекции уменьшалась (Р<0,05). Это обнаружено в равной степени и при введении б -токоферола, и эмоксипина. Витамин Е повышал уровень тканевого б-токоферола (Р<0,05) при неизменном уровне б-ТФХ и ОТФ у молодых самцов. У молодых самок же повышался уровень и б-токоферола, и его метаболитов, что может косвенно свидетельствовать о более высокой скорости расходования этого антиоксиданта у самок. Напротив, эмоксипин не приводил к достоверному снижению жирорастворимых антиоксидантов. Уровни активности каталазы, витамина А и в-каротина заметно не изменились под воздействием антиоксидантов у животных разного пола.

Несмотря на неизменный антиоксидантный статус, токоферол снизил сп.ПОЛ у молодых самок (Р<0,05) и Аск.ПОЛ (Р<0,05) у самцов в ткани больших полушарий. Эмоксипин же не снизил ни показатели ПОЛ, ни ОМБ.

С возрастом у самцов произошло увеличение уровня ТБК-рп и ОМБ в больших полушариях. б-Токоферол снизил содержание ТБК-рп (Р<0,05) и увеличил ОВП (Р<0,05) ткани БП, а эмоксипин снизил не только уровень ТБК-рп, но и сп.ПОЛ. С другой стороны эмоксипин значимо увеличил скорость Аск.ПОЛ. При введении токоферола старым самцам в БП обнаружено увеличение его эндогенного уровня (Р<0,001) и метаболитов (ТФХ -- Р<0,001, ОТФ -- Р<0,01). Эти изменения привели к вполне закономерному увеличению содержания витамина А и в -каротина, снижению активности СОД. Введение эмоксипина снизило лишь активность СОД, при сохранении других изучаемых показателей на уровне контрольных значений.

Введение витамина Е старым самкам также повысило уровень тканевого токоферола (Р<0,01) и его метаболитов (Р<0,05), но с меньшей степенью достоверности, чем у самцов. Дополнительное введение витамина Е привело к увеличению уровня ТБК-рп и сп.ПОЛ в ткани БП. Это в свою очередь может быть проявлением прооксидантных свойств витамина Е. Однако, учитывая, что в ходе старения у самок все показатели ПОЛ достоверно снизились по сравнению с молодыми, такое увеличение ПОЛ на фоне введения витамина можно рассматривать как регуляторное.

Эмоксипин не привел к изменению показателей свободнорадикального процесса в больших полушариях молодых самок. В антиоксидантном звене снизилась только активность СОД (Р<0,05).

В промежуточном мозге введение витамина Е привело к повышению уровня ТБК-рп у молодых самцов и старых самок. Похожая картина получена нами в больших полушариях старых самок и может быть объяснена аналогичным образом. Повышение же этого показателя у молодых самцов под действием биоантиоксиданта может косвенно свидетельствовать о превышении оптимальной физиологической концентрации б -токоферола и реализации его прооксидантных свойств, которые обусловлены многими факторами, среди которых отсутствие восстановителей токоферильных радикалов, превалирование жирных кислот над б-токоферолом и др.