Особенности арборизации смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла

Размещено на http://allbest.ru

ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава РФ

Особенности арборизации смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла

Солянникова Д.Р., кандидат биологических наук

Брюхин Г.В. профессор, доктор медицинских наук

Введение

В современной науке и практической медицине остается высокой актуальность использования неинвазивных, малоинвазивных и достаточно быстрых в реализации методов диагностики физиологических и патологических состояний организма. К таким методам можно отнести кристаллоскопию, основанную на феномене кристаллизации биологических жидкостей [1, C. 116; 2, С. 92; 3, С. 65; 5, С. 3; 6, С. 6]. Известно, что у женщин состав слюнной жидкости и форма образующихся в ней кристаллов коррелируют с физиологическими изменениями в организме, в частности с фазами полового цикла, что, например, используется для экспресс-диагностики овуляции и гормональных нарушений [9, С. 21; 11, С. 52-54]. Однако подобные корреляции у наиболее часто используемого в научных исследованиях модельного организма - лабораторных крыс - не изучены.

В связи с этим, целью настоящего исследования явился анализ видового состава кристаллов смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла.

Материал и методы

Исследование было проведено на 16 половозрелых беспородных самках крыс, массой 150-195 г. из разных пометов в зимне-весенний период. Животные содержались в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. До начала эксперимента животных приручали к рукам (хендлировали) в течение 10 дней. Для определения фаз полового цикла экспериментальных животных был использован метод получения и анализа влагалищных мазков [4, С. 30-36; 8, С. 217-218]. Мазки получали 2 раза в сутки в одно и тоже время (утром и вечером) на протяжении 30 дней. Во влагалищном мазке подсчитывали относительное содержание эпителиальных клеток с мелкими, средними и крупными ядрами, клеток с пикнотическими ядрами, чешуек и лейкоцитов. Подсчет производили при увеличении Ч400 (окуляр Ч10, объектив Ч40, микроскоп Leica DMEE C3 (Германия). Анализ цитологических картин полученных мазков влагалищных выделений позволяет установить следующие фазы полового/эстрального цикла экспериментальных животных (по Эскину, Хипу): диэструс, проэструс, эструс и метаэструс. Из кристаллографических методов нами была использована «классическая» кристаллоскопия - оценка свободного (непосредственного) кристаллогенеза биосреды - ротовой (слюнной) жидкости в стандартных (комнатных) условиях [6, С. 6; 7, С. 45]. Забор слюны осуществляли в одинаковых условиях, дважды в сутки, одновременно с получением влагалищных мазков. Изучение, фотосъемку и обработку полученного изображения кристаллов ротовой жидкости проводили на морфометрической установке, с помощью лицензионной морфометрической программы «Motic Images Plus 2.0». Фотосъемку кристаллов проводили в течение 5-19 часов после полного высыхания пробы (структуры кристаллов слюны сохраняются неизменными до 36 часов) [9, С. 21]. Вначале осуществляли обзорную фотосъемку на малом увеличении Ч100 (окуляр Ч10, объектив Ч10), затем фиксировались все детали строения кристаллов на большом увеличении Ч400 (окуляр Ч10, объектив Ч40). При этом исследовались все поля зрения. Вычисляли относительную встречаемость (вероятность нахождения) каждого вида кристаллов из расчета на все случаи данной фазы, а также количество кристаллов по 3-х балльной шкале (много - 3 балла, среднее количество - 2 балла, мало/единичные - 1 балл). Общую интенсивность кристаллогенеза оценивали аналогично по 3-балльной системе. При обработке полученных результатов использовались методы вариационной статистики: определение среднего арифметического и его ошибки М±м. Достоверность результатов оценивалась с помощью непараметрического критерия Манна-Уитни с использованием программы “Statistica 6.0” (StatSoft Inc.).

Результаты исследования

При изучении слюнной жидкости самок крыс было выявлено несколько видов кристаллов, которые значительно отличаются от таковых у человека [10, С. 19-20] и несколько отличны от кристаллов смешанной слюны самцов лабораторных крыс [9, С. 22-29].

1. Кресты. Кристаллы «кресты» встречаются и у самцов лабораторных крыс [9, С. 22]. При этом кристаллы отличаются по толщине (тонкие/толстые), цвету (темные/белые), типу (равномерные: два отростка пересекаются под прямым углом, точка пересечения находится в центре каждого из стволов/неравномерные: два отростка пересекаются под прямым углом, точка пересечения смещена на один из концов одного ствола (рис. 1, 2, 4, 10)) и относительному размеру (мелкие, средние, крупные). Среди данных типов существуют кресты без дочерних веточек на стволах - «голые» и, соответственно, с дочерними веточками на стволах.

2. Снежинки. Кристаллы «снежинки» также обнаружены у самцов лабораторных крыс [9, С. 23]. Данные кристаллы также отличаются по цвету, размеру, толщине и виду (простые: пересекающиеся оси без дочерних ветвлений/сложные: пересекающиеся оси имеют дочерние ветвления (рис. 1, 3, 10)).

3. Папоротник. Группа кристаллов «папоротник» включает в себя несколько подвидов. Общим признаком данной группы кристаллов является сложная система ветвлений кристаллов. Также значительно отличаются по цвету, размеру и толщине. Мы выделили несколько разновидностей кристаллов «папоротник», при этом не все из них выявлены в слюне самцов лабораторных крыс [9, С. 27].

1) Папоротник с пересечением двух главных стволов. Кристалл имеет два главных ствола, которые пересекаются, как правило, под прямым углом, точка пересечения основных стволов при этом смещена на их периферию (рис. 4).

2) Простой папоротник. От главной оси отходит множество ветвей под прямым (А тип) (рис. 4, 5) либо острым (Б тип) (рис. 13) углом.

3) Сложный папоротник. Данный вид кристаллов имеет несколько степеней ветвлений (2, 3, 4-х этажные) (рис. 5, 8, 9, 10).

4) Папоротник с извилистыми стволами. Данный сложный папоротник имеет один или несколько извилистых главных или второстепенных стволов, напоминающих «реки» (рис. 6, 7).

5) Папоротник с изгибом стволов. Простой или сложный папоротник, имеющий выраженный изгиб основного ствола под тупым углом (рис. 6, 7).

6) Папоротник с дихотомически ветвящимися стволами. Кристалл, у которого наблюдаются многочисленные дихотомические ветвления стволов, при этом можно выделить «растительный» (рис. 11) и «геометрический» (рис. 12) типы.

7) Иглы. Кристалл, имеющий очень толстый, постепенно сужающийся основной ствол, с единичными дочерними ветвями или без них (рис. 8, 9). Утолщение кристаллов всегда «смотрит» в центр капли/зоны кристаллизации.

4. Группа редко встречающихся кристаллов. 1) Кристалл с наклоненным основным стволом [9, С. 22-23].

2) Т, Г, V, Х-образные кристаллы.

3) Смешанные/резко ассиметричные. Одна половина кристалла может быть отнесена к одному виду структур, другая - к совершенно другому (рис. 2, 3) [9, С. 24].

4) Аморфный матрикс. Бесструктурное образование, как правило, белого цвета, занимающее относительно большие площади стекла, может иметь разные формы: точечную, кустистую, истинно аморфную и др. (рис. 2, 3) [9, С. 24-25].

В ходе изучения фаций смешанной слюны самок крыс была отмечена определенная зависимость общей интенсивности ее арборизации от фазы полового цикла, в частности в периоды эструс и метаэструс интенсивность кристаллогенеза максимальна. В тоже время в периоды проэструс и диэструс она минимальна.

Причем в фазе метаэструс она статистически достоверно выше таковых в диэструсе и проэструсе. Однако важно отметить, что в каждой фазе встречались все уровни (по 3-балльной шкале) арборизации, поэтому данный показатель нельзя использовать как самостоятельный критерий для определения фазы эструс (и других) у крыс по аналогии с овуляцией у человека. Для этой цели мы попытались найти зависимость видового состава кристаллов фаций ротовой жидкости крыс от периода их эстрального цикла.

Исследование показало, что наиболее специфичными признаками фации смешанной слюны самок крыс в фазу эструс обычно являются следующие (табл. 1).

Особенно хотим отметить, что чаще всего встречается большое количество кристаллов типа неравномерный «крест», причем образующих отдельно лежащие скопления с более крупными кристаллами в центре зоны кристаллогенеза (рис. 1).

Во все другие периоды полового цикла данные кристаллы также встречаются, но практически всегда они располагаются на периферии зоны кристаллогенеза или диффузно. Наблюдается также наличие умеренного или большого количества (2 - 3 балла) хотя бы одного из видов кристаллов группы «Редко встречающихся» (рис. 2, 3).

Таблица 1 - Видовой состав кристаллов смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла

Примечание: Относительная встречаемость (%) // Количество кристаллов (по 3-х балльной шкале). ИА - интенсивность арборизации. * - результаты статистически достоверны (р<0,05) (в скобках указано по сравнению с какой группой)

Рис. 1 - Фация смешанной слюны крысы в период эструс полового цикла: 1 - самостоятельная группа кристаллов «крест равномерного и неравномерного типа»; 2 - единичные кристаллы «сложная снежинка». Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Рис. 2 - Фация смешанной слюны крысы в период эструс полового цикла: 1 - кристалл «крест» с утолщенными концами (крайне редкая форма); 2 - аморфный матрикс кустистого типа; 3 - ассиметричные кристаллы. Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Рис. 3 - Фация смешанной слюны крысы в период эструс полового цикла: 1 - кристаллы «сложная снежинка»; 2 - кристалл «аморфный матрикс точечного типа»; 3 - ассиметричные кристаллы. Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 4 - Фация смешанной слюны крысы в период эструс полового цикла с кристаллами серого цвета: 1 - кристалл с двумя пересекающимися стволами; 2 - кристалл «простой папоротник»; 3 - кристалл «крест неравномерного типа». Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 5 - Фация смешанной слюны крысы в период эструс полового цикла: 1 - кристаллы «простой папоротник А типа» (крупные по размеру, толстые, белые); 2 - фрагменты кристалла «сложный папоротник». Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Наиболее специфичные признаки фации смешанной слюны самок крыс в фазу метаэструс также отражены в таблице 1. Причем в этот период выявляется самое высокое содержание кристаллов «папоротник с извилистыми стволами», занимающих большие площади фации, при этом, часто стволы очень длинные и многочисленные (рис. 6, 7). Однако, вероятность их присутствия в фации средняя. Кристаллы «иглы» всегда в фации присутствуют одновременно с «простым папоротником» или «сложным папоротником», при этом «иглы» лежат в центре, а «папоротник» на периферии зоны кристаллизации (рис. 8, 9). В случае присутствия (вероятность ниже среднего), кристаллы «кресты» и «снежинки» практически всегда толстые, белого цвета, располагаются, как правило, на периферии зоны кристаллизации или диффузно (рис. 10). Редкие типы кристаллов, в случае их наличия, развиты умеренно. При этом чаще присутствует аморфный матрикс.

Рис. 6 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла: 1 - кристалл «папоротник с извилистыми стволами»; 2 - «изогнутые стволы» кристаллов. Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 7 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла. Кристаллы «папоротник с изогнутыми и одновременно извилистыми стволами». Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 8 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла: 1 - кристаллы «игла» с дочерними ветвями и без них; 2 - слабый рисунок кристалла «сложный папоротник». Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Рис. 9 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла: 1 - формирующиеся кристаллы «игла»; 2 - кристаллы «сложный папоротник». Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Рис. 10 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла: кристалл «крест равномерного типа» (1) и неравномерного типа (2)»; 3 - кристалл «сложная снежинка»; 4 - кристалл «сложный папоротник». Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 11 - Фация смешанной слюны крысы в период метаэструс полового цикла: 1 - кристалл «папоротник с дихотомически ветвящимися стволами растительного типа»; 2 - круглые участками (капли) с отсутствием кристаллогенеза. Примечание: микрофото, увеличение Ч400

В фазу диэструс часто наблюдаются крупные капли, вокруг которых арборизация отсутствует, либо присутствует в небольшом количестве. Практически все наблюдаемые кристаллы, несмотря на высокое их содержание, очень тонкие и нечеткие.

Возможно наличие группы «Редко встречающихся кристаллов» типа «аморфный матрикс».

В целом, не редко попадаются картины «без особенностей» с низкой степенью арборизации, достаточно сложные для идентификации.

В фазу проэструс кристаллы типа папоротник обычно в фации присутствуют одновременно, но их «окраска» часто слабая.

Могут, также как и в диэструс, встречаться крупные капли, вокруг которых нет арборизации (рис. 14).

Рис. 12 - Фация смешанной слюны крысы в период диэструс полового цикла. Кристалл «папоротник с дихотомически ветвящимися стволами геометрического типа». Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 13 - Фация смешанной слюны крысы в период диэструс полового цикла, общий рисунок арборизации слабый: 1 - кристалл «папоротник Б типа» (крупный по размеру, тонкий, серый) с дочерними ветвями под острым углом; 2 - букальный эпителий. Примечание: микрофото, увеличение Ч400

Рис. 14 - Фация смешанной слюны крысы в период проэструс полового цикла. Примечание: микрофото, увеличение Ч100

Обсуждение и заключение

Выявленные, в ходе исследования, типы кристаллов фации слюнной жидкости самок лабораторных крыс могут встречаться с разным уровнем вероятности во всех фазах полового цикла, т.е. среди них нет абсолютного маркера ни одного из периодов цикла, по крайней мере, в данный сезон года. Однако каждый из периодов характеризуется относительно специфической комплексной картиной, которую можно дифференцировать, изучая всю фацию в целом и имея определенный навык, что, в некоторых случаях, позволяет использовать его для идентификации фаз цикла наряду с методом влагалищных мазков. Так наибольший общий уровень арборизации слюнной жидкости и наибольшее разнообразие и выраженность ее кристаллов наблюдается в период метаэструс, а также эструс, т.е. в периоды активной выработки половых гормонов, что подтверждает предположение о их влиянии (напрямую или косвенно) на сложный физико-химический процесс кристаллизации данной биологической жидкости.

Следовательно, в случае дальнейшего усовершенствования, возможно использование данного метода в диагностике гормональных нарушений и других патологических состояний у данного вида животных. Наименьший общий уровень арборизации и видовое разнообразие, а также специфичность кристаллов наблюдается в периоды диэструс и проэструс, которые практически всегда значительно отличаются от вышеназванных фаз цикла. Поэтому, в случае возникновения сложности при дифференцировке периодов метаэструс и диэструс, что иногда имеет место быть у крыс, данный метод будет достаточно полезен. Также метод полезен для определения фазы цикла, в случае невозможности взятия влагалищного мазка, например, в период полового созревания, когда влагалище еще не открылось.

кристаллоскопия крыса овуляция гормональный

Список литературы / References

1. Гольбрайх Е. О формировании узора трещин в свободно высыхающей пленке водного раствора белка / Е. Гольбрайх, Е. С. Репис, С. С. Моисеев // Журнал технической физики. - 2003. - Т. 73. - № 10. - С. 116-117.

2. Заблоцкая Т. Ю. Анализ основных процессов и типов структур при дегидратации биологических жидкостей / Т. Ю. Заблоцкая // Електромеханiчнi i енергозберiгаючi системи. - 2010. - Вип. 4. - № 12. - С. 92-95.

3. Елизаров А. И. Явления самоструктурирования материи при дегидратации капель биологически активных жидкостей / А. И. Елизаров, Т. Ю. Заблоцкая, М. А. Елизаров // Вiсник КДПУ. - 2005. - № 1. - С. 65-68.

4. Кабак Я. М. Практикум по эндокринологии / Я. М. Кабак. - М. : Изд-во Моск. Ун-та, 1968. - 275 с.

5. Камакин Н. Ф. Современные подходы к кристаллоскопической идентификации состава биологических жидкостей организма человека / Н. Ф. Камакин, А. К. Мартусевич // Экология человека. - 2003. - № 5. - С. 3-5.

6. Камакин Н. Ф. Перспективы развития кристаллографических методов исследования / Н. Ф. Камакин, А. К. Мартусевич, А. Н. Кошкин // Вятский медицинский вестник. - 2003. - № 3. - С. 6-11.

7. Камакин Н. Ф. Биотехнология кристаллогенеза жидкостей организма (экспериментальная кристаллоскопия) / Н. Ф. Камакин, А. К. Мартусевич // Вятский медицинский вестник. - 2005. - № 3-4. - С. 44-51.

8. Методы биологии развития. Экспериментально-эмбриологические, молекулярно-биологические и цитологические. Серия «Проблемы биологии развития» / Акад. наук СССР, Научный совет по проблеме «Закономерности индивидуального развития животных и управление процессами онтогенеза» ; гл. ред. серии Б. Л. Астаурова ; отв. ред. тома Т. А. Детлаф. - М. : Наука, 1974. - 619 с.

9. Осочук С. С. Структура кристаллов смешанной слюны белых лабораторных крыс / С. С. Осочук, О. С. Лобкова // Вестник ВГМУ. - - Т. 13. - № 1. - С. 20-30.

10. Писчасова Г. К. Способ ранней диагностики начала разрушения эмали. Профилактика и лечение стоматологических заболеваний / Г. К. Писчасова // Тез. докл. XI обл. конф. стоматологов. - Омск, 1979. - С. 19-20.

11. Радыш И. В. Суточные изменения концентрации макро- и микроэлементов в слюне здоровых женщин / И. В. Радыш, В. Д. Брюнин, В. В. Скальный, Н. Д. Кислый // Вестник восстановительной медицины. - 2013. - № 2. - С. 52-54.

Аннотация

Особенности арборизации смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла. Солянникова Д.Р.1, Брюхин Г.В.2

1ORCID: 0000-0001-7749-3809, Кандидат биологических наук, 2ORCID: 0000-0002-3898-766X, Профессор, доктор медицинских наук, ФГБОУ ВО Южно-Уральский государственный медицинский университет Минздрава РФ

Целью исследования явился анализ видового состава кристаллов смешанной слюны самок крыс в разные фазы полового цикла. С помощью метода получения и анализа влагалищных мазков определяли фазы полового цикла крыс. Одновременно производили забор слюнной жидкости и с помощью классической кристаллоскопии определяли в ней видовой состав кристаллов в целом и применительно к каждой фазе полового цикла. Установлено, что в зимне-весенний период, специфических видов кристаллов, характерных только для определенных фаз полового цикла самок крыс нет. Однако каждая из фаз эстрального цикла животных характеризуется относительно специфической общей картиной видового состава, количества и степени выраженности кристаллов, что может быть использовано для идентификации фаз цикла и, возможно, диагностики ряда патологических состояний, в частности гормональных нарушений.

Ключевые слова: крысы, половой цикл, слюна, кристаллогенез.

Abstract

Features of mixed saliva ferning of female rats in different phases of sexual cycle. Soliannikova D.R.1, Brukhin G.V.2

1ORCID: 0000-0001-7749-3809, PhD in Biology, 2ORCID: 0000-0002-3898-766X, MD, The South Ural State Medical University of Health Ministry of the Russian Federation

The aim of the study was the analysis of species composition of the mixed saliva crystals of female rats in different phases of the sexual cycle. Using the method of preparation and analysis of vaginal smears the phases of sexual cycle of rats were determined. At the same time the saliva fluid was receiving and using classical crystalloscopy it was determined the species composition of the crystals in general and, in respect of each phase of the sexual cycle. It was established that in the winter-spring period, there is not the specific types of crystals, characteristic only for certain phases of female rats sexual cycle. However, each of the phases of the estrous cycle of animals is characterized by a relatively specific overall picture of species composition, quantity and degree of severity of crystals that can be used to identify the phases of the cycle and the diagnosis of several pathological conditions, in particular hormonal disorders.

Keywords: rats, sexual cycle, saliva, crystallogenesis.

Размещено на Allbest.ru