Антиатерогенные изменения у животных с гиперхолестеринемией под влиянием комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой

Размещено на http://www.allbest.ru/

14.00.16 - патологическая физиология

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

АНТИАТЕРОГЕННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ У ЖИВОТНЫХ С ГИПЕРХОЛЕСТЕРИНЕМИЕЙ ПОД ВЛИЯНИЕМ КОМПЛЕКСА СИМВАСТАТИНА С ГЛИЦИРРИЗИНОВОЙ КИСЛОТОЙ

Стахнёва Екатерина Михайловна

Новосибирск 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт терапии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск) и Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт молекулярной биологии и биофизики Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск)

Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор Рагино Юлия Игоревна

доктор медицинских наук, профессор Вавилин Валентин Андреевич

Официальные оппоненты

доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович

доктор биологических наук Гилинский Михаил Абрамович

Ведущая организация Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 001.048.01 в Учреждении Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН по адресу: ул. Академика Тимакова, 2, г. Новосибирск, 630117. Тел/факс 8 (383) 333-64-56

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук Пальчикова Н.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

симваглизин липидный кровь миотоксичный

Актуальность темы. Гиперхолестеринемия является одним из главных факторов риска атеросклероза и ишемической болезни сердца (Anderson K.M., Castelli W.P., Levy D., 1987), заболеваемость и смертность от которых продолжают оставаться чрезвычайно высокими в России (Оганов Р.Г., Масленникова Г.Я., 2002). В патогенезе атеросклероза, наряду с гиперхолестеринемией, важную роль играют воспаление, окислительный стресс, нарушение функции эндотелия, нарушения гемостаза и другие процессы (Fruchart J.С. et al., 2003, 2007). На сегодняшний день, в этиопатогенетической терапии атеросклероза и ИБС приоритет отдается применению холестерин снижающих лекарственных соединений, главными из которых являются статины - ингибиторы ключевого фермента синтеза холестерина - 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА редуктазы (Российские рекомендации ВНОК, 2007). Статины обладают комплексным антиатерогенным механизмом действия и, кроме снижения уровня холестеринемии, ингибируют процессы воспаления и окислительного стресса, нормализуют функцию эндотелия и систему гемостаза (Bellosta S. et al., 2000; Pereira EC. et al., 2004; Landmesser U. et al., 2005; Fruchart J.С. et al., 2003, 2007), что в конечном итоге приводит к регрессии атеросклеротических очагов и снижению сердечно-сосудистой смертности по данным мета-анализа на 30-40% (Executive Summary of the Third Report of the National Cholesterol Education, and Treatment of High Blood Cholesterol in Adults, ATP III, 2001, 2004).

Наряду с положительным антиатерогенным влиянием, у большинства статинов эффективная терапевтическая суточная доза (20-80 мг) приводит к возникновению нежелательных побочных эффектов - гепатотоксичности, миалгии, миопатии и в редких случаях - рабдомиолиза, обусловленных особенностью метаболизма этих соединений, сопряженного с процессом бета-окисления жирных кислот - основного источника энергии в мышечной ткани (Puddu Р. et al., 2001; Российские рекомендации ВНОК, 2007). Это обстоятельство подчеркивает постоянную актуальность поиска и создания новых статинов с более низкой суточной дозой, то есть более безопасных, и в то же время высоко эффективных в отношении описанного антиатерогенного механизма действия.

Одним из известных современных подходов к созданию новых лекарственных соединений является использование известных фармаконов в виде комплексов с природными комплексонами, в частности, с глицирризиновой кислотой. Ранее было продемонстрировано усиление лекарственного эффекта бутадиона, индометацина (Толстиков Г.А. и др., 1997) и нифедипина (Толстикова Т.Г. и др., 2006) при использовании их в комплексах с глицирризиновой кислотой. Этот подход был использован при создании на базе Новосибирского института органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН нового молекулярного комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой со стехиометрией 1:4 - симваглизина (Патент № 2308947: Толстиков Г.А., Никитин Ю.П., Ляхович В.В., Салахутдинов Н.Ф., Рагино Ю.И., Вавилин В.А. «Лекарственное средство с гиполипидемическим эффектом Симваглизин», 2007), биологические эффекты которого к началу исследования были не изучены.

Цель исследования: изучить прямой механизм и механизмы некоторых плейотропных влияний антиатерогенного действия in vitro и in vivo комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой у животных с экспериментальной гиперхолестеринемией.

Задачи исследования:

1. Исследовать силу и тип ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы in vitro в микросомах печени крыс под влиянием комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой.

2. Оценить влияние симваглизина на показатели липидного профиля крови (общий холестерин, липопротеины высокой плотности, триглицериды) в сравнении с симвастатином на модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

3. Исследовать гепато- и миотоксичные изменения под влиянием симваглизина по динамике изменений уровней ферментов аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы и креатинфосфокиназы в сравнении с симвастатином при экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

4. Исследовать влияние симваглизина на параметры окислительно-антиоксидантных нарушений в сравнении с симвастатином при экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo.

5. Исследовать влияние симваглизина на показатели функции эндотелия в модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo. Провести сравнительный анализ с симвастатином.

Научная новизна

Установлено наличие прямого и некоторых плейотропных антиатерогенных эффектов у нового комплексного соединения симвастатина с глицирризиновой кислотой - симваглизина. Механизм прямого антиатерогенного действия симваглизина состоит в ингибировании 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы. В отличие от симвастатина, известного конкурентного ингибитора фермента, симваглизин является ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы бесконкурентного типа.

При экспериментальной гиперхолестеринемии у крыс и кроликов in vivo показано, что равный по силе гипохолестеринемический эффект достигается дозами симваглизина, содержащими в 2-5 раз меньше симвастатина, чем при дозировании свободного симвастатина. При этом дозозависимость снижения уровня холестерина в крови под влиянием симваглизина имеет у крыс линейный, а у кроликов экспоненциальный характер.

У крыс и кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией in vivo миотоксические изменения под влиянием симваглизина выражены значительно ниже в сравнении с симвастатином.

Показаны некоторые плейотропные механизмы антиатерогенного действия симваглизина у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией in vivo. Так, под влиянием симваглизина в крови повышается уровень липопротеинов высокой плотности, что указывает на усиление обратного транспорта холестерина. Под влиянием симваглизина в крови снижается уровень малонового диальдегида и повышается активность параоксоназы, что свидетельствует об антиоксидантных изменениях. Снижение в крови уровней фактора Виллебранда и эндотелина-1 под влиянием симваглизина отражает нормализацию функции эндотелиоцитов. Дозы симваглизина, необходимые для проявления этих эффектов, по содержанию симвастатина в комплексе в 3-5 раз ниже, чем доза симвастатина.

Научно-практическая значимость. Теоретическое значение работы состоит в том, что в результате экспериментальных исследований симваглизина показано, что он является более эффективным и безопасным в сравнении с симвастатином гипохолестеринемическим соединением, что свидетельствует о возникновении фармакологического синергизма при комплексировании симвастатина с глицирризиновой кислотой. Продемонстрированые разные (прямой - холестеринснижающий, плейотропные - усиление обратного транспорта холестерина, антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия) потенциально антиатерогенные эффекты симваглизина отличаются разным характером дозозависимости (линейный, экспоненциальный, нелинейный обратный), что указывает на наличие у симваглизина, также как и других статинов, разных молекулярных мишеней.

Практическое значение работы состоит в том, что результаты экспериментальных доклинических испытаний симваглизина имеют значение для последующих клинических испытаний 1-й фазы, так как демонстрируют возможность снижения суточной дозы собственно симвастатина в симваглизине с целью уменьшения побочных эффектов препарата при сохранении его холестерин снижающей и в целом антиатерогенной эффективности.

Положения, выносимые на защиту:

1. Ингибирование активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы в микросомах печени крыс под влиянием симваглизина происходит по бесконкурентному типу.

2. У крыс и у кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина происходит выраженное снижение уровня общего холестерина в крови.

3. У кроликов с экспериментальной гиперхолестеринемией под влиянием симваглизина наблюдаются антиоксидантные изменения и нормализация показателей функции эндотелия в регуляции тонуса сосудов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены и обсуждены на Республиканской научной конференции "Создание новых лекарственных препаратов" (Томск, 2007), III съезде фармакологов России (С-Петербург, 2007), Российской научно-практической конференции "Профилактика сердечно-сосудистых заболеваний в первичном звене здравоохранения" (Новосибирск, 2008), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008), Российско-норвежском научном симпозиуме "Защита миокарда: молекулярные, патофизиологические и клинические аспекты" (С.-Петербург, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 10 научных работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация включает следующие разделы: введение, обзор литературы, описание материала и методов исследования, 3 главы с результатами исследования, обсуждение, выводы, список используемой литературы. Текст изложен на 122 страницах машинописного текста, иллюстрирован 15 таблицами и 9 рисунками. Список цитированной литературы включает 197 работ, из них 54 отечественных и 143 зарубежных источников.

Исследование проведено в рамках Интеграционного проекта СО РАН и СО РАМН № 053 «Поиск, создание и доклинические испытания новых биологически активных соединений сердечно-сосудистого, антивоспалительного и антипролиферативного действия. Изучение их биохимических и физиологических эффектов и механизмов взаимодействия с клеточными рецепторами». Учреждения-исполнители проекта: Новосибирский институт органической химии им. Н.Н. Ворожцова СО РАН (НИОХ СО РАН), Новосибирский институт химической кинетики и горения СО РАН (НИХКиГ СО РАН), НИИ терапии СО РАМН (НИИТ СО РАМН)), НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (НИИ МББ СО РАМН). Координаторы проекта: академик РАН Толстиков Г.А., академик РАМН Никитин Ю.П. На проведение исследований с использованием экспериментальных животных получено разрешение Этического Комитета при ГУ НИИ терапии СО РАМН от 25.01.2006 г., протокол № 02/06. Эксперименты на животных проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г., № 755).

Синтез симваглизина (СВГ) осуществлен в НИОХ им. Н.Н. Ворожцова СО РАН. Характеристики комплекса СВГ получены в НИХКиГ СО РАН с использованием методов ядерного магнитного резонанса и электронной оптической UV-Vis спектроскопии.

Эксперименты по оценке ингибирования активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы симваглизином in vitro выполнены на микросомах печени крыс с использованием 5 самцов крыс Вистар массой 180-200 г, содержащихся на стандартной лабораторной диете. Выделение микросом проводили общепринятым методом дифференциального центрифугирования в среде: 20 мМ Трис-HCl, рН 7.4, 0,15М KCl, 50мМ ЭДТА и 2мМ дитиотрейтол. Конечный осадок - фракцию микросом - ресуспендировали в среде, содержащей 0,1 М KH₂PO₄, 20% глицерин, рН 7,4. Концентрацию белка определяли методом Лоури. Микросомальный метаболизм ГМГ-КоА в экспериментах по определению Ki симваглизина проводили по описанию Kleinsek D.A. и соавт. (1980) с небольшими модификациями. В среду инкубации: 0,1M KH₂PO₄, рН 7.0, 4mM дитиотрейтол, 10mM ЭДТА, 10mM MgCl₂, 1mM NADPH, 4mM Гл-6-Ф, 2 ЕD Гл-6-ФДГ, - добавляли суспензию микросом и 2 мин преинкубировали при комнатной температуре. Затем вносили равные объемы СВГ для создания конечных концентраций 75, 150, 300 и 600 нМ и NADPH-генерирующую систему, инкубировали 8 мин при температуре 37^оС при постоянном встряхивании для наработки метаболита - ингибитора 3-ГМГ-КоА редуктазы. После этого добавляли меченый субстрат 3-ГМ[3-¹⁴C]Г-КоА в конечных концентрациях 28 или 47 мкМ. Общий объем реакционной смеси составлял 100 мкл, содержание белка 0,24 мг. Через 10 мин реакцию останавливали добавлением 2,4 М НСl и охлаждением на льду.

Подготовку проб к хроматографии начинали спустя 1 час после остановки реакции, необходимый для конверсии мевалоновой кислоты в форму лактона (Jemal M. et al., 2003). К пробам добавляли 10 М КОН для их частичной нейтрализации до величины рН 3,5-4,5, затем центрифугировали при 3000g в течение 5 мин. На колонку наносили 50 мкл надосадка. Разделение продукта (мевалоната) и субстрата (ГМГ-КoA) реакции проводили методом ион-парной обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии по методу Scharnagi H. и соавт. (1995) на колонке Нуклеосил С₁₈ 5 мкм 250 х 2 мм с предколонкой Vydac С₁₈ 30-40 мкм 30 х 2 мм. Мобильной фазой служил 53% водный раствор метанола (V/V) и 50 мМ тетрабутиламмоний фосфат, рН 5,1, Скорость потока - 150 мкл/мин. Для количественной оценки продукта реакции в виалы собирали 4-минутные хроматографические фракции. Содержимое виал высушивали в токе воздуха при комнатной температуре, сухой остаток растворяли в 7 мл диоксанового сцинтиллятора. Измерения радиоактивности в пробах проводили на бета-счетчике Delta 300 (Голландия).

Эксперименты по оценке гипохолестеринемического, антиоксидантного и нормализующего функцию эндотелия влияний симваглизина выполнены на 30 самцах крыс Вистар массой 180-200 г и 25 самцах кроликов Серый гигант массой 2,5-3 кг. Крысы содержались в клетках по 5 шт., а кролики в индивидуальных клетках. Все животные имели свободный доступ к воде и пище. Для создания экспериментальной гиперхолестеринемии (ГХС) животные находились на высокожировой холестериновой диете, которая широко применяется для развития экспериментальной ГХС с последующей оценкой холестеринснижающего эффекта различных соединений, в частности статинов (Kobayashi M., Ishida F. et al.,1989; Ishida F., Watanabe K. et al.,1990; Hayashi T., Rani P.J.A. et al.,2004). Далее, в период воздействия изучаемыми соединениями, животные вновь переводились на стандартную лабораторную диету, поэтому холестеринснижающий и другие эффекты СВГ оценивались в динамике обратного развития ГХС. При этом чувствительность сравнений возрастала в результате снижения вклада поступающего алиментарным путем холестерина (ХС).

Продолжительность эксперимента на крысах была 6 недель. В эксперимент вошли 30 самцов крыс Вистар массой 180-200 г.. В течение 4 недель создания ГХС животные получали диету, содержащую 3% ХС, 5% животного жира, 0,1% 6-N-пропил-2-тиоурацил (для подавления функции щитовидной железы) и 0,3% таурохолата для улучшения всасывания ХС (Swift L.L. et al., 1982; Salter A.M., Hayashi R. et al., 1991). Далее был 2-х недельный период воздействия, когда 30 крыс были разделены на 6 групп (по 5 в каждой). Группа 1, без фармакологического воздействия, служила контролем. Группы со 2 по 5 в период вмешательства получали гипохолестеринемические соединения: группа 2 - СВ в дозе 200 мкг/кг/сутки; группы 3, 4 и 5 - СВГ в дозах 400, 666 и 1000 мкг/кг/сутки, соответственно. В перерасчете на СВ, массовая доля которого в СВГ составляет 0,1 от молекулярной массы, эти дозы в 3, 4 и 5 группах соответствовали 40, 66 и 100 мкг/кг/сутки. Группа 6 получала глицирризиновую кислоту (ГК) в дозе 900 мкг/кг/сутки массы тела, что соответствовало её содержанию в максимальной дозе СВГ (9/10 от 1000 мкг/на кг веса/сутки). В период фармакологического воздействия все животные находились на стандартной лабораторной диете и получали препараты вместе с пищей. В дни забора крови в точках «0, 4 и 6 недель» утром у крыс забирали по 1 мл крови из хвостовой вены. За 12 часов до забора крови животные лишались корма при сохранении доступа к воде.

Эксперимент продолжительностью 80 дней был выполнен на 25 кроликах Серый гигант, массой 2,5- 3 кг. В течение 30 дней создания ГХС животные получали диету, содержащую 3% ХС и 5% животного жира. Далее был 30-дневный период воздействия, когда 25 кроликов были разделены на 5 групп (по 5 в каждой). Описание групп и доз препаратов в них было аналогичным эксперименту на крысах. Дозы препаратов вводили 1 раз в сутки per os в 1% крахмальной суспензии. В следовый период после введения препаратов (с 60 по 80 день) животные находились только на стандартной лабораторной диете. В дни забора крови в точках «0, 30, 40, 50, 60, 70 и 80 дней» утром у кроликов забирали по 3 мл крови из ушной вены. За 12 часов до забора крови животные лишались корма при сохранении доступа к воде.

Показатели липидного профиля крови (общий холестерин (ХС), ХС липопротеинов высокой плотности (ЛВП-ХС), триглицериды (ТГ)) и активности аспартатаминотрансферазы (АСТ), аланинаминотрансферазы (АЛТ) и креатинфосфокиназы (КФК, фракция СK-Nac) в крови определяли с использованием наборов «Biocon» (Германия) на биохимическом анализаторе «Labsystem-F-900» (Финляндия).

Об антиоксидантном влиянии препаратов судили по уровню продуктов ПОЛ в сыворотке крови, который оценивали по концентрации МДА флюориметрическим методом (Schuh J. et al., 1978) на спектрофлюориметре «VersaFluor» (Bio-Rad, США) при длинах волн Ex 515 нм и Em 553 нм при использовании в качестве стандарта 1,1,3,3-тетраметоксипропанол (Sigma) и по активности параоксоназы (PON) в сыворотке крови, которую измеряли в трис-HCl буфере, рН=8,0 фотометрическим методом (Mackness B. et al., 1998).

О влиянии на функцию эндотелия судили по содержанию в сыворотке общего нитрита, который определяли фотометрическим методом с использованием реактива Грисса, детекция при 540 нм, измерения проводили на спектрофотометре «Unico1200/1201» (США); фактора Виллебранда, определяемого ИФА тест - системами «Technoclone», детекция при 450 нм и эндотелина-1 (ИФА тест - система «Biomedica Group», 450 нм). Все измерения проводили на ИФА анализаторе «Multiscan EX» (Финляндия).

Статистическую обработку результатов проводили в лицензионной версии программы SPSS for Windows с применением критерия Стьюдента, корреляционного и дисперсионного анализа (One-Way ANOVA) с использованием критерия Даннета для множественного сравнения. Значения в таблицах представлены как M±m, где M - среднее арифметическое значение, m - ошибка среднего. Непараметрические статистические расчеты, которые включали анализ различий для трех и более связанных групп по Фридмену, парные сравнения по Вилкоксону, анализ для трех и более независимых групп и парные сравнения по Манну-Уитни проводили с использованием программ Statistica 7.0. Константы ингибирования рассчитывали в программе Excel. Статистически достоверными считали различия при p<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

В настоящей работе основной антиатерогенный механизм действия СВГ как представителя класса статинов, заключающийся в прямом ингибировании синтеза ХС в клетке, был изучен в экспериментах in vitro с микросомами печени крыс и in vivo на модели экспериментальной ГХС у крыс и кроликов.

Ингибирование активности 3-гидрокси-3-метилглутарил-КоА редуктазы in vitro под влиянием симваглизина

Определение типа и константы ингибирования было проведено с использованием двух концентраций субстрата, равных 28 и 47 мкМ, и четырех концентраций СВГ, равных 75, 150, 300 и 600 нМ. Анализ типа ингибирования графическим методом Корниш-Боудена (рис. 1А) в координатах «отношение концентрации субстрата к скорости реакции» - «концентрация ингибитора» дал величину K_i= 94,18 нM и свидетельствовал о бесконкурентном типе ингибирования. Однозначным подтверждением бесконкурентного типа ингибирования являются параллельные прямые (рис. 1Б) для различных концентраций субстрата, получаемые в координатах «обратная скорость реакции» - «концентрация ингибитора» по методу Диксона, поскольку для такого типа ингибирования максимальная скорость реакции и константа Михаэлиса меняются в одинаковое число раз.

Как показано ранее, сам СВ является конкурентным ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А (ГМГ-КoA) редуктазы (Vickers S. et al., 1990; Hoffman W.F. et al., 1986). Рентгеноструктурный анализ показал, что это обусловлено оккупацией 3-метилглутарил-подобной частью статинов участка активного центра фермента, связывающего остаток 3-метилглутарил естественного субстрата - 3-метилглутарил-КоА (Istvan E.S., 2002).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 1. Графическое определение константы и типа ингибирования ГМГ-КoA редуктазы симваглизином. А - анализ по методу Корниш-Боудена; Б - анализ по методу Диксона

Физико-химической основой изменения типа ингибирования с конкурентного, присущего СВ, на бесконкурентный, выявленный для СВГ, по-видимому, является увеличение размера комплекса в сравнении с исходной молекулой СВ и наличие несущих заряд функциональных групп у остатков ГК, что усиливает взаимодействие. Последнее, вероятно, проявляется увеличением времени распада комплекса «фермент-продукт» - кинетической основы бесконкурентного типа ингибирования (Корниш-Боуден Э., 1979).

Полученные в условиях in vitro результаты о том, что СВГ снижает и K_m, и V_max синтеза мевалоната, обусловили целесообразность оценки его ожидаемого гипохолестеринемического эффекта у крыс и у кроликов с ГХС в условиях in vivo.

Холестеринснижающее воздействие симваглизина у крыс с гиперхолестеринемией in vivo

Результаты проведенного анализа показывают (табл. 1), что во всех группах в результате диетической нагрузки было достигнуто статистически значимое увеличение уровня общего ХС крови, а через две недели экспериментального воздействия - снижение этого показателя. Тем не менее, при сравнении показателей в нулевой точке и на 6 неделе статистически достоверными оставались различия в группе «контроль», группе с минимальной дозой СВГ и в группе с ГК. Это доказывает, что процессы спонтанного обратного развития экспериментальной ГХС с прекращением диетической нагрузки еще не завершились в группе «контроль», и фармакологические эффекты минимальной дозы СВГ и ГК были недостаточны для их завершения. И только в группах, получавших СВ в дозе 200 мкг/кг/день и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день снижение показателя привело к исчезновению различий с исходной точкой, что свидетельствует об эффективности исследуемых доз СВГ (табл. 1).

Анализ различий в содержании общего ХС крови между группами крыс по методу Краскела-Уоллеса в разные сроки эксперимента выявил их отсутствие в нулевой точке (критерий Н=21,63; р=0,22) и после 4-недельного кормления крыс высоко жировой диетой (Н=3,82; р=0,575). Напротив, анализ результатов на 6 неделе эксперимента показал сильные эффекты исследуемых субстанций на уровень общего ХС крови крыс (Н=21,63, р=0,0006), поэтому были выполнены парные сравнения по критерию Манна-Уитни.

Таблица 1. Изменения уровня общего холестерина крови (мг/дл) у крыс в динамике эксперимента in vivo

Примечание: р - уровень значимости различий показателей;

* - p < 0,05, где р - уровень значимости различий показателей на 0 и 4 неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона;

^ - p < 0,05, где р -уровень значимости различий показателей на 4 и 6 неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона;

# - p < 0,05, где р -уровень значимости различий показателей на 0 и 6 неделях эксперимента в парных сравнениях по критерию Вилкоксона.

В результате парных сравнений (табл. 2) было установлено, что:

1) группы, получавшие СВ и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день, имеют достоверно более низкие величины общего ХС в сравнении с контрольной группой;

2) группы, получавшие СВ и СВГ в дозах 666 и 1000 мкг/кг/день, имеют достоверно не различающееся содержание общего ХС в крови, то есть сходное по силе свободного СВ воздействие достигается в 2-3 раза более низкими дозами СВ в комплексе с глицирризиновой кислотой;

3) имеет место статистически значимое дозо-зависимое нарастание воздействие СВГ;

4) глицирризиновая кислота в испытанной дозе не обладает самостоятельным холестерин снижающим эффектом.

Таблица 2. Уровни значимости различий в содержании общего холестерина между группами на 6 неделе эксперимента в парных сравнениях по критерию Манна-Уитни

Снижение уровня общего ХС крови в сравнении с контролем в процентом выражении составило у животных, получавших СВ в суточной дозе 200 мкг/кг 10%. Дозо-зависимое снижение от доз 666 и 1000 мкг/кг/сутки СВГ, равных в весовом эквиваленте 66 и 100 мг СВ, привело к достоверному снижению уровня общего ХС крови на 9% и 11%. В группе с ГК снижения уровня общего ХС крови в сравнении с контролем отмечено не было.

Полученные результаты свидетельствуют о более выраженном у СВГ в сравнении с СВ гипохолестеринемическом действии в условиях in vivo, что создает возможность снижения его дозы, имея ввиду содержание СВ в СВГ. Относительно механизмов, лежащих в основе этого усиления, можно предположить, что у комплекса большее число молекулярных мишеней, принимая во внимание его химическое строение. Кроме того, и у СВ и у СВГ мишенью является ГМГ-КоА редуктаза. Симвастатин, обладая структурным сходством с ГМГ-КоА, оккупирует его участок связывания в активном центре ГМГ-КоА редуктазы. При этом размеры фермент-статинового комплекса таковы, что NADPH-связывающий участок остается совершенно не затронутым (Istvan E. и Deisenhofer J., 2001). Эти авторы предположили, что создание статинов, покрывающих NADPH-связывающий участок, позволит улучшить их характеристики. Вероятно, увеличение размера комплекса СВГ и наличие в комплексе функциональных групп ГК приводит к увеличению количества точек его связывания в активном центре и за его пределами, что ведет к более выраженному холестеринснижающему влиянию СВГ.

В отличие от выраженного влияния на содержание общего ХС, статистически значимые эффекты в отношении ЛВП-ХС у крыс практически отсутствовали. Исключение составили только различия между 4 и 6, 0 и 6 неделями в группе с минимальной дозой СВГ и различия между 4 и 6 неделями в группе со средней дозой СВГ. В результате анализа по методу Краскела-Уоллеса было выявлено отсутствие различий между группами по этому показателю во все сроки эксперимента. В нулевой точке Н=8,05, р=0,15, после диетической нагрузки (4 недели) Н=5,71, р=0,335, после фармакологического воздействия (6 недель) Н=8,89, р=0,114.

Согласно данным других авторов, статистически достоверные изменения этих показателей можно достигнуть при использовании доз СВ, на порядок превышающие использованные нами. Так, симвастатин в суточной дозе 2,5-10 мг/кг в течение 4-6 недель у кроликов с ГХС повышает уровень ЛВП-ХС на 5-15% и снижает уровень ТГ на 10-30% (Kobayashi M. et al., 1989; Plosker G.L., McTavish D., 1995), причем в работе Plosker G.L. и McTavish D. статистическая достоверность не достигается. Оценки эффектов симвастатина у 4444 пациентов с ИБС показали, что уровень ЛВП-ХС повысился в среднем на 8% после приема доз СВ 20-40 мг/сутки (Scandinavian Simvastatin Survival Study (4S), Lancet, 1994). Известно также, что действие СВ на ТГ крови опосредованное и связано со снижением образования и секреции гепатоцитами липопротеинов очень низкой плотности (ЛОНП), содержащих около 30% ТГ, и усилением связывания и катаболизма ремнантов ЛОНП апо-В,Е-рецепторами гепатоцитов (Alberts A.W., 1990; Ginsberg H.N. et al., 1987).

Холестеринснижающее воздействие симваглизина у кроликов с ГХС in vivo

Результаты измерения показателей липидного профиля крови у кроликов показали, содержание их на холестериновой диете в течение первых 30 дней эксперимента привело к развитию выраженной ГХС (2309,0±223,2 мг/дл) (табл. 3). В контрольной группе снижение уровня общего ХС достигло статистической значимости в сравнении с исходным значением ГХС через 20 дней - на 35%. В то же время, в группах СВ и 3-х разных доз СВГ уже через 10 дней приема препаратов было получено снижение уровня общего ХС на 30-36%.

Важно отметить, что в группах, получавших СВГ и СВ, показатели снижения общего ХС были сходными, несмотря на то, что дозы СВГ были в 2, 3 и 5 раза меньше дозы СВ (табл. 3). Во всех опытных группах в сравнении с контрольной через 20 дней приема препаратов наблюдалась достоверная сходная разница в снижении уровня общего ХС на 36-47%. Существенно, что холестеринснижающий эффект СВГ не уступал таковому у собственно СВ, несмотря на уменьшение его дозы в 2-5 раз в составе комплекса. Из этого следует, что сила воздействия СВГ превышает таковую у СВ. При сравнении силы холестеринснижающего воздействия СВГ у кроликов не было получено достоверных различий между дозами СВГ, в отличие от крыс.

Таблица 3. Изменение уровня общего холестерина крови (мг/дл) у кроликов в динамике эксперимента (M±m)

Примечание: # - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (p<0,05)

Поскольку достоверных различий не наблюдалось и в сравнениях эффектов всех доз СВГ с эффектом симвастатина, это указывает на то, что в использованном интервале доз сила эффекта приближается к насыщению в соответствии с известным экспоненциальным характером дозозависимости холестеринснижающего эффекта статинов (Князькова И.И. и др., 2006). В эксперименте на кроликах с ГХС, в отличие от крыс с ГХС это подтверждается особенно ярко. По-видимому, кролики не только более подвержены развитию ГХС путем кормления ХС per os, но и более восприимчивы к воздействию статинов и имеют иную зависимость эффекта от дозы СВГ в сравнении с крысами, и линейный участок дозовой зависимости у них лежит в области более низких концентраций СВГ, чем использованные в данной работе.

Уровень ЛВП-ХС в контрольной группе в динамике эксперимента не изменился. В группе СВ и в группе с максимальной дозой СВГ - значимо повысился через 20 дней приема препаратов на 25-29% в сравнении с величиной показателя 30-го дня эксперимента (29,8±3,0 мг/дл), а через 30 дней введения препаратов был достоверно выше на 20-26% в сравнении с контролем. Полученный результат подтверждает известный имеющийся у СВ дополнительный антиатерогенный механизм действия по активации обратного транспорта ХС (Шевченко О.П., Шевченко А.О., 2003) и указывает также на его наличие и у СВГ.

Влияния исследуемых препаратов на уровень ТГ крови в динамике эксперимента не отмечено.

Таким образом, в условиях in vivo холестеринснижающее воздействие СВГ превосходит таковое у СВ. Это свидетельствуют о фармакологическом синергизме в результате образования комплекса симвастатина с глицирризиновой кислотой. Аналогичные проявления комплексообразования уже были показаны ранее на примере антиаритмических и гипотензивных препаратов (Толстиков Г.А. и др., 1997; Толстикова Т.Г. и др., 2006). Исходя из химического строения СВГ, можно предположить большее, чем у СВ, число молекулярных мишеней, формирующих механизм его гипохолестеринемического эффекта in vivo. Вероятно, реализуются все присущие СВ фармакологические свойства: ингибирование ГМГ-КoA редуктазы, что приводит к снижению синтеза ХС в гепатоцитах; стимуляция синтеза апо-В,Е-рецепторов к ЛНП на плазматических мембранах гепатоцитов, увеличение захвата гепатоцитами ЛНП из крови и снижение уровня холестеринемии (Lennernas H., Fager G., 1997); ингибирование синтеза апо-В и за счет этого снижение образования гепатоцитами ЛНП и ЛОНП, усиление связывания и катаболизма ремнантов ЛОНП апо-В,Е-рецепторами (Ginsberg H.N. et al., 1987).

Миотоксические изменения под влиянием симваглизина in vivo

Известно, что наряду с ценным терапевтическим гипохолестеринемическим эффектом, статинам присущ ряд неблагоприятных свойств, среди которых выделяются гепато- и миотоксичность. Поэтому необходимо было оценить полученный комплекс в этом отношении.

Какого-либо повышения уровней печеночных АСТ и АЛТ в крови в динамике экспериментов у крыс и у кроликов, получавших СВ и СВГ, выявлено не было, что указывает на отсутствие гепатотоксичности препаратов в использованных дозах. Более того, ранее показан гепатопротекторный эффект ГК, выражающийся в снижении активности трансаминаз и липидных пероксидов в гепатоцитах при воздействии таких токсикантов, как аллилформиат, четыреххлористый углерод (Толстиков Г.А. и др., 1997).

Миотоксичность характерна для всех статинов. Экспериментальные исследования указывают на повреждение митохондрий в качестве возможной причины миотоксичности статинов. Так, Bergman M. et al., 2003, обнаружили некроз и дегенерацию мышечных фибрилл при световой микроскопии и набухание митохондрий и разрушение миофибрилл при электронной микроскопии у мышей Balb, получавших правастатин. Сила миотоксичности статинов прямо коррелирует с их гидрофобностью (Diaz-Zagoya et al., 1999). Поперечно-полосатая мускулатура более чувствительна к повреждающему действию статинов в сравнении с сердечной мышцей и печенью (Bergman M. et al., 2003). В качестве молекулярных механизмов миотоксичности статинов предполагают ингибирование ими бета-гидрокси-ацил-КоА-дегидрогеназы и ацил-КоА-дегидрогиназы - ферментов цикла бета-окисления жирных кислот, в результате блокады которого нарушается синтез АТФ в митохондриях мышц и возникают миотоксические структурные изменения (Kauffmann P. et al., 2006).

Уровень активности КФК в крови у крыс после 2-х недельного воздействия исследуемыми препаратами повысился. У крыс, получавших СВ, этот показатель возрос на 79%, а у получавших СВГ - на 30-36% (табл. 4). В группе животных, получающих ГК в период 2-х недельного активного вмешательства, уровень КФК крови значимо не изменился, что указывает на отсутствие миотоксических биохимических изменений у животных этой группы.

Таблица 4. Изменения уровня креатинфосфокмназы крови (ЕД/л) у крыс в динамике эксперимента in vivo

Примечание: * - статистически значимые отличия по сравнению с данными 4 недель (p<0,05); ^ - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (p<0,05); ** - статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (p<0,05).

Результаты измерения уровня активности КФК в крови у кроликов в динамике эксперимента показали, что в группе СВ этот показатель через 30 дней введения был на 64% выше, чем в контрольной группе. В трех группах, получавших СВГ, уровень КФК в динамике эксперимента повышался менее выражено. Повышение было недостоверным как в сравнении с исходными значениями, так и с показателями контрольной группы, а через 30 дней введения препаратов (точка «60 дней») в группах, получавших СВГ, этот показатель был на 24-29% ниже, чем в группе СВ.

С учетом содержания СВ в СВГ, можно констатировать сходство в силе миотоксического эффекта двух этих препаратов. Однако, более сильный гипохолестеринемический эффект обеспечивает большую безопасность СВГ, чем СВ.

Таким образом, СВГ является более эффективным и безопасным в сравнении с СВ гипохолестеринемическим соединением. Результаты работы подтверждают полученные ранее данные (Толстиков Г.А. и др., 1997; Толстикова Т.Г. и др., 2006) об эффекте фармакологического синергизма при комплексировании некоторых фармакологических соединений с ГК. В данном случае показана возможность снижения суточной дозы собственно СВ в комплексном соединении СВГ, приводящая к уменьшению побочных эффектов при сохранении эффективности.

Антиоксидантные изменения и нормализация функции эндотелия под влиянием симваглизина у кроликов с ГХС in vivo

Из известных для статинов плейотропных эффектов их в целом антиатерогенного механизма действия, осуществляемых через активацию ядерных PPAR-альфа рецепторов (C.-J. Fruchart et al., 2003, 2007), в настоящей работе, наряду с эффектом активации обратного транспорта ХС, были также оценены антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия эффекты СВГ.

Механизмы антиоксидантных изменений под влиянием статинов связаны с увеличение числа апо-В,Е-рецепторов на мембранах гепатоцитов и укорочением времени циркуляции частиц ЛНП в крови. Кроме того, антиоксидантные изменения под влиянием статинов напрямую могут быть обусловлены активацией обратного транспорта ХС, повышением количества частиц ЛВП и активности, связанного с ними фермента параоксоназы (PON). В совокупности эти факторы приводят к уменьшению окислительной модификации ЛНП.

Так как ранее было показано, что СВ снижает активность окислительных процессов (Pereira E. et al., 2004) и нормализует функцию эндотелия (Huggies et al., 1998; Laufs et al., 1998; Mullen et al., 1997; Landmesser U. et al., 2005) у пациентов с ГХС и ИБС, то были исследованы антиоксидантное и нормализующее функцию эндотелия воздействие СВГ.

Оценка антиоксидантного воздействия препаратов в динамике показала, что в группе СВ после 20 дней введения препарата и далее уровень продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в крови был ниже на 23-31% в сравнении с контролем. В группах, получавших СВГ с уменьшенной в 3 и 5 раз дозой СВ, выраженное снижение этого показателя было отмечено через 10 дней воздействия (в точке «40 дней») в сравнении с контролем на 21% и 37% и в сравнении с группой СВ на 27% и 41%, соответственно.

Активности связанному с ЛВП антиоксидантному ферменту PON, способному при взаимодействии с частицами ЛНП сдерживать их окислительную модификацию, придается важное значение в патогенезе атеросклероза (Mackness B., Mackness M., 1998). Результаты настоящего исследования показали, что в группе СВ и в 3-х группах СВГ со сниженными в 2, 3 и 5 раз дозами СВ имело место сходное повышение этого показателя в сравнении с контролем на 42-60%, 48-54%, 29-39% и 37-45%, соответственно, что указывает на антиоксидантную активность всех исследованных доз СВГ (табл. 5).

Возможное влияние СВГ на эндотелий мы оценивали по уровню в крови таких биомаркеров, как метаболиты оксида азота (NO), являющегося основным вазодилататором, постоянно секретирующимся эндотелиоцитами, фактор Виллебранда (ФВ), выделяющийся эндотелиоцитами в кровь при их стимуляции, активации или повреждении и эндотелин-1 (ЭТ1) - фактор, секреция которого при нормальной функции эндотелиоцитов не происходит, но резко увеличивается при их активации (Landmesser U. et al., 2005).

Таблица 5. Изменение активности параоксоназы крови (нМ/мин/мл сыворотки, разница в %) у кроликов в динамике эксперимента

Примечание: # - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (p<0,05)

Результаты измерений метаболитов NO показали, что в группах СВ и СВГ этот показатель был выше, чем в контрольной группе. Наибольшее его повышение в сравнении с контролем - более, чем в 2 раза - наблюдалось в группе СВ, а в группах 3-х доз СВГ он был повышен в меньшей степени - на 34-41%, 49-51% и 59-75%, соответственно.

Таблица 6. Изменение уровня фактора Виллебранда в крови (мЕД/мл) у кроликов в динамике эксперимента

Примечание: # - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (p<0,05), * - статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (p<0,05).

Оценки содержания ФВ не выявили различий между группами СВ и контрольной (табл. 6), но в группах СВГ со сниженными в 2-3 раза дозами СВ после 30 дней введения этот показатель стал ниже, чем в контроле и в группе СВ на 22-26% и 26-33%, соответственно. В группе же СВГ с минимальной дозой СВ этот показатель на протяжении всего периода введения препаратов и после него был значимо ниже - на 51-61% и 58-64% в сравнении с контролем и группой СВ, соответственно. Значимого влияния СВ и СВГ со сниженной в 2 раза дозой СВ на уровень ЭТ1 не выявлено (табл. 7).

В период после 20 и 30 дней приема препаратов СВГ со сниженными в 3 и 5 раз дозами СВ этот показатель стал ниже, чем в контроле на 32-40% и 38-44%, соответственно, и чем в группе СВ на 21-27% и 29-32%, соответственно.

Таблица 7. Изменение уровня эндотелина-1 в крови (фмоль/мл) у кроликов в динамике эксперимента

Примечание: # - статистически значимые отличия по сравнению с контролем (p<0,05), * - статистически значимые отличия по сравнению с группой СВ (p<0,05).

Корреляционный анализ выявил обратные связи между дозой СВ в СВГ и его эффектами по снижению в крови уровней продуктов ПОЛ (r Пирсона = -0,349, p<0,01), ФВ (r Пирсона = -0,289, p<0,05), ЭТ1 (r Пирсона = -0,380, p<0,01) и повышению активности ПО крови (r Пирсона = -0,237, p<0,05).

Таким образом, полученные данные свидетельствуют об антиоксидантной активности симваглизина. Вероятно, отчасти это является результатом повышения активности PON крови, в основе которого лежит увеличение при введении СВГ содержания ЛВП-ХС, отражающего увеличение количества частиц ЛВП, с которыми связан этот фермент, активация обратного транспорта ЛВП-ХС (за счет увеличения синтеза апоАI и апоАII и активации ЛХАТ ЛВП, липопротеинлипазы). СВГ обладает также эффектом нормализации функции эндотелия, который проявляется снижением в крови содержания ФВ и ЭТ1. Все эти воздействия симваглизина реализуются в области более низких, в сравнении с эквивалентом симвастатина, доз.

Существенно, что антиоксидантное и эндотелий-стабилизирующее воздействие симваглизина характеризуются иной дозовой зависимостью, нежели описанная выше линейная дозовая зависимость гипохолестеринемичекого влияния. Очевидно, различия в характере дозовых зависимостей этих и гипохолестеринемического эффектов обусловлены тем, что они реализуются с участием разных молекулярных мишеней. Последний, как показано выше, обусловлен способностью симваглизина ингибировать ГМГ-КоА редуктазу - скорость-лимитирующий фермент в синтезе холестерина. Опыт исследований биологических эффектов химических соединений свидетельствует о том, что отличные от линейной зависимости «доза-эффект» - U-образные и гормезис - имеют достаточно широкое распространение (Eaton D.L., Klaassen C.D., 2001). Полученные результаты свидетельствуют о том, что эндотелий-стабилизирующее воздействие СВГ может быть достигнуто в области более низких концентраций, чем холестерин снижающее воздействие.

Заключая в целом полученные результаты, необходимо отметить, что симваглизин, являясь бесконкурентным ингибитором 3-ГМГ-КoA редуктазы - ключевого скорость-лимитирующего фермента синтеза ХС в организме, продемонстрировал высокую фармакологическую активность в отношении снижения уровня общего ХС крови, превышающую таковую у симвастатина. Холестерин снижающее воздействие симваглизина in vivo является более выраженным и более безопасным в сравнении с таковым у симвастатина, что свидетельствует о наличии возможности снижения суточной дозы собственно симвастатина в симваглизине при его применении для терапии ГХС и атеросклероза. Другие имеющиеся плейотропные и потенциально антиатерогенные эффекты симваглизина - антиоксидантный и нормализующий функцию эндотелия - также дополнительно положительно характеризуют новый молекулярный комплекс.

ВЫВОДЫ

1. Симваглизин является бесконкурентным ингибитором 3-гидрокси-3-метилглутарил-коэнзим А редуктазы с константой ингибирования K_i= 94,18 нM.

2. Cимваглизин снижает уровень общего холестерина в моделях экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов. Гипохолестеринемическое воздействие симваглизина, в дозах, сниженных по симвастатину в 2-5 раз, сравнимо с таковым у средней терапевтической дозы симвастатина.

3. В модели экспериментальной гиперхолестеринемии in vivo у крыс и у кроликов симваглизин в исследуемых дозах не обладает гепатотоксичностью и н...