Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

Автореферат

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа при старении эритроцитов

03.00.04. - Биохимия

Лакомая Юлия Александровна

Работа выполнена на кафедре биохимии и физиологии человека и животных биологического факультета Красноярского государственного университета.

Научный руководитель:

кандидат биологических наук Надежда Митрофановна Титова.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Владимир Георгиевич Соловьев,

доктор биологических наук, профессор Валентина Александровна Кратасюк.

Ведущая организация: Институт Биофизики СО РАН, г. Красноярск.

Защита состоится "__" октября 2006 г. в "___" часов на заседании диссертационного совета ДМ 212.274.07 при Тюменском государственном университете (625043, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3, биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменского государственного университета.

Автореферат разослан "__" сентября 2006 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Е.А. Чирятьев.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Одной из основных проблем современной биологии и медицины является выяснение молекулярных процессов, определяющих продолжительность жизни организмов. Удобным и информативным объектом для исследования процессов старения служат эритроциты млекопитающих - высокоспециализированные клетки, лишенные ядра, органелл и белоксинтезирующего аппарата. Кроме того, особые преимущества эритроцитов связаны с их легкой доступностью и возможностью разделения на возрастные группы.

Старение эритроцитов сопровождается существенным снижением их метаболической активности. Значительно уменьшается интенсивность гликолиза и пентозофосфатного пути окисления углеводов (Grimes A.J., 1986). Это в свою очередь приводит к целому ряду изменений в метаболизме клетки: снижению концентрации АТФ, НАДН и НАДФН (Богатская Л.Н., Рагимова А.А., 1986; Смолина Е.В., 1984); нарушению работы ионных насосов (Hadengue A.L., 1998), повышению внутриклеточной концентрации ионов Са ²⁺ (Minetti G. et al., 2001), вызывающее агрегацию мембранных белков (Jain S.K. et al., 1980; Preiano B.S., Guerini D., 1996), активации фосфолипазы А ₂ (Никитченко Ю.В., 1999) и накоплению лизофосфолипидов (Боровкова Г.И., 1983; Jain S.K., 1998; Kale M., 1998). Нарушается синтез низкомолекулярных соединений - глутатиона, фосфорибозилпирофосфата, НАД⁺, НАДФ⁺, ФАД (Piccinini G. et al., 1995) и накапливается метгемоглобин (Akintonwa D.A., 2000). При снижении концентрации АТФ происходит дефосфорилирование спектрина, приводящее к структурным перестройкам мембраны, гликопротеинового спектра, что приводит к изменению антигенной структуры эритроцитов и обеспечивает селективную элиминацию из кровяного русла старых клеток (Козлова Н.М. и др., 1998; Kay J.J., 1991).

На данном этапе развития науки существует огромное количество теорий, пытающихся объяснить прогрессирующие вредные изменения, происходящие при старении (Титов С. А., Крутько В.Н.,1996; Анисимов В.Н., 2000; Подколозин А.А. и др., 2001; Sharpless N.E., DePinho R.A., 2004). В настоящее время самой популярной теорией старения является свободнорадикальная теория, предложенная D. Harman в 1956. Согласно этой теории, неполное восстановление кислорода приводит к образованию ряда цитотоксичных активных форм кислорода (АФК), таких как супероксидный анион-радикал, перекись водорода и гидроксильный радикал. Эти высокореактивные АФК могут вызывать различные клеточные повреждения, включая перекисное окисление липидов, повреждение ДНК, изменение внутриклеточного окислительно-восстановительного потенциала и инактивацию ферментов (Halliwell B., Gutteridge M.C., 2003; Ozturk O., Gumuslu S., 2004). Для эритроцитов, чей род деятельности связан с транспортом высоких концентраций кислорода, данная теория является наиболее актуальной.

Процессы свободнорадикального окисления ограничиваются антиоксидантной системой. Самым важным антиоксидантным ферментом в эритроцитах является глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа - ключевой и скорость лимитирующий фермент пентозофосфатного пути окисления глюкозы. Роль этого фермента в метаболизме эритроцитов чрезвычайно велика, поскольку в ходе реакций, катализируемых Г 6ФД, а также 6-фосфоглюконатдегидрогеназой, происходит образование НАДФН, необходимого для поддержания функциональной активности и целостности эритроцита. Восстановленный НАДФ необходим для роста, дифференцировки и запрограммированной гибели клеток (Tain W-N. et al., 1998; Tian W-N. et al., 1999). Огромная роль НАДФН в эритроцитах состоит в регенерации окисленного глутатиона, который предотвращает денатурацию гемоглобина, предохраняет от окисления SH-группы мембранных белков красных клеток крови и участвует в обезвреживании пероксида водорода и активных форм кислорода (Deutsch J., 1990). Снижение активности Г 6ФД приводит к дефициту НАДФН и восстановленного глутатиона, что вызывает ранний гемолиз эритроцитов в селезенке.

В работах, посвященных исследованию активности Г 6ФД при старении клеток, возрастные изменения только констатируются без достаточного анализа их причин. Между тем, выяснение механизмов изменения активности фермента является существенным звеном для изучения причин снижения интенсивности и регуляции пентозофосфатного пути при старении эритроцитов.

Подходом к изучению механизмов изменения и значения роли Г 6ФД в старении клеток может быть сравнительное исследование динамики активности и кинетических параметров фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, характеризуются укороченным сроком жизни, рядом метаболических и физико-химических особенностей (Поэтова В.Т. и др., 1967). Поведение Г 6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза не изучено.

Цель работы. Исследовать свойства Г 6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Задачи исследования.

1. Изучить динамику активности и кинетических параметров Г 6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза.

2. Изучить динамику активности и кинетических свойств Г 6ФД при старении эритроцитов напряженного эритропоэза.

3. Исследовать влияние температуры и рН среды на активность Г 6ФД в эритроцитах разного возраста, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза.

Научная новизна. Впервые показано, что при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, происходит изменение кинетических свойств Г 6ФД: повышение К_м для глюкозо-6-фосфата (Г 6Ф) и [S]_0,5 для НАДФ⁺; уменьшение кооперативных свойств фермента по отношению к НАДФ⁺, вплоть до полного исчезновения кооперативных взаимодействий в старых клетках; увеличение ингибирующего влияния НАДФН на активность фермента.

Впервые, изучены исследуемые параметры при старении эритроцитов, продуцированных при напряженном эритропоэзе, вызванного массивной, одноразовой кровопотерей. Показано, что Г 6ФД в эритроцитах, образованных в условиях напряженного эритропоэза первоначально характеризуется повышенной активностью и существенными отличиями в кинетических свойствах, что может свидетельствовать о качественном отличии эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, от клеток, образованных в нормальных условиях кроветворения. Впервые изучено влияние температуры и pH среды на активность Г 6ФД при старении эритроцитов нормального и напряженного эритропоэза.

Теоретическая и практическая ценность работы. Результаты работы вносят вклад в понимание механизмов снижения активности ферментов при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального и напряженного эритропоэза. Кроме того, исследования, проведенные в данной работе, свидетельствуют о том, что эритроциты, образованные после стресс-воздействия (массивной кровопотери), являются качественно иными по сравнению с клетками, образованными в условиях нормального эритропоэза.

Материалы, полученные в данной работе, используются при чтении лекций по спецдисциплинам (энзимология, кинетика и термодинамика ферментативных реакций, биохимия крови) студентам биологического факультета Красноярского Государственного Университета. Методики, изложенные в диссертации, включены в разделы большого и малого практикума по биохимии, энзимологии и кинетике ферментативных реакций на кафедре биохимии и физиологии человека и животных КрасГУ, а также используются студентами в процессе выполнения курсовых и дипломных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, сопровождается значительным снижением активности Г 6ФД и изменением кинетических параметров: увеличением константы Михаэлиса и снижением V_max для глюкозо-6-фосфата; уменьшением кооперативных взаимодействий и повышением [S]_0,5 для НАДФ⁺; усилением ингибирующего влияния НАДФН на активность фермента.

2. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа в эритроцитах, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, существенно отличается по активности и свойствам от Г 6ФД в клетках, образованных в условиях нормального кроветворения.

3. При старении эритроцитов, образованных в условиях как нормального, так напряженного эритропоэза оптимумы температуры и pH Г 6ФД меняется, но повышается чувствительность к воздействию высоких температур и значений pH-среды.

Апробация материалов диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на VI Международной научной конференции студентов и молодых ученых "Экология Южной Сибири и сопредельных территорий", Абакан, 2002; Межрегион. науч.-практич. конф. "Молодежь Сибири - науке России", Красноярск, 2003; Итоговой науч. конф. "Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири", Красноярск, 2003; Междунар. конф. "Механизмы функционирования висцеральных систем", Санкт-Петербург, 2003; XIX Съезде Физиол. общества им. И.П. Павлова, Екатеринбург, 2004.

Публикации. Основные положения диссертации опубликованы в 10 печатных работах.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на страницах машинописного текста. Состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, главы результатов исследований и их обсуждений, заключения, выводов и списка цитируемой литературы (источников, в том числе иностранных). Диссертация содержит 9 таблиц и 10 рисунков.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

Объектом исследований служили эритроциты кроликов породы Шиншилла весом 2,5-3 кг. Всего в работе было использовано 105 животных. Глубину кровопотери (43 % от общего объема крови) определяли исходя из того, что объем крови у теплокровных животных составляет около 7 % от массы тела. Через определенные временные интервалы осуществляли повторное взятие крови у анемизированных животных: на 7 сутки после кровопотери (1 группа животных) - в период высокого ретикулоцитоза, когда в кровяном русле циркулирует смешанная популяция клеток, образованных до и после кровопотери; на 20 сутки (2 группа животных) - когда эритроциты, образованные до кровопотери, покидают кровяное русло; и на 30 сутки (3 группа животных) - в период восстановления основных гематологических показателей. Забор крови проводили из уха путем надрезания краевой ушной вены; антикоагулянтом служил гепарин.

Исследования проводили во фракциях молодых (ФМЭ), старых эритроцитов (ФСЭ) и общей эритроцитарной массе (ОЭМ) у интактных кроликов и анемизированных животных на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери. Фракционирование эритроцитов достигалось многократным центрифугированием клеток, взвешенных в плазме, с последовательным отбором верхней (ФМЭ) и нижней (ФСЭ) части эритроцитарного столба (Авраамова Т.В., Титова Н.М., 1978).

Активность Г 6ФД определяли спектрофотометрическим методом (Beutler E., 1990). Кинетические параметры - К_м, V_max - для Г 6Ф определяли при фиксированной концентрации НАДФ⁺ и шести варьируемых концентрациях Г 6Ф. [S]_0,5, V_max и n_н для НАДФ⁺ определяли при фиксированной концентрации Г 6Ф и семи варьируемых концентрациях НАДФ⁺.

К_м и V_max для Г 6Ф рассчитывали графическим методом Вульфа-Хайнса (Диксон М., Уэбб Э., 1982). [S]_0,5 и V_max для НАДФ⁺ определяли графически в координатах Лайнуивера-Берка с учетом коэффициента Хилла, n_н - методом Силоновой с соавт.(Курганов Б.И., 1978).

Исследование влияния НАДФН на кинетику Г 6ФД-ной реакции проводили при фиксированной концентрации Г 6Ф, шести варьируемых концентрациях НАДФ⁺ и трех концентрациях НАДФН. Влияние АТФ на активность Г 6ФД изучали при фиксированной концентрации НАДФ⁺, шести концентрациях Г 6Ф и трех концентрациях АТФ. Для расчета константы ингибирования использовали метод Диксона (Диксон М., Уэбб Э., 1982).

Влияние температуры на активность Г 6ФД исследовали при значениях температуры 20 С, 30С, 40С, 50С и 55С. Влияние рН на активность фермента изучали при значениях рН 5,6,7,8 и 9.

Результаты экспериментов подвергали статистической обработке. Все серии опытов сравнивали по непараметрическим ранговым критериям Уилкоксона (Т-критерий) и Манна-Уитни (U-критерий). Различия во всех случаях считали значимыми при Р< 0,05.

Результаты исследований и их обсуждение.

Проведенное сравнительное изучение активности фермента во ФМЭ, ФСЭ и ОЭМ у интактных кроликов обнаружило снижение Г 6ФД от фракции молодых к фракции старых эритроцитов.

Фракция молодых эритроцитов характеризуется наибольшей активностью Г 6ФД - 9,21±0,03 мкмоль НАДФН/мин*гHb. В ОЭМ активность на 15,6 % ниже, чем во ФМЭ. Наиболее низкая активность фермента наблюдается во ФСЭ - она на 40,2 % ниже активности Г 6ФД во ФМЭ. фермент фосфатдегидрогеназа старение эритроцит

Снижение активности Г 6ФД с возрастом эритроцита может быть обусловлено несколькими причинами. Прежде всего, при старении может происходить уменьшение количества фермента. Необходимое количество фермента в клетке поддерживается в результате взаимодействия процессов синтеза и разрушения белковой молекулы. В зрелых эритроцитах, как известно, синтез белков, в том числе и ферментов, не происходит, а деградация может происходить. Белки разрушаются под действием мембраносвязанных, так и цитозольных эндопептидаз (Алексеенко Л.П. и др., 1982; Houben A. et al., 1984).

Определенный вклад в снижение активности фермента могут вносить и посттрансляционные модификации белковой молекулы. К этим модификациям относят агрегацию, полимеризацию, окисление свободных SH-групп (Демченко А.П., Орловская Н.Н., 1981; Gershon D. et al., 1982). Помимо этого, к посттрансляционным модификациям относят окислительную модификацию белков, которая имеет место при старении эритроцитов, в связи с усилением процессов свободнорадикального окисления (Levine R.L., Stadtman E.R., 2001; Linton S. et al., 2001; Beal M.F., 2002). Такие модификации, могут приводить к тому, что часть молекул фермента перейдет в неактивную форму, а это равносильно потере клеткой определенного количества ферментного белка. Модификации могут иметь и другой характер - затрагивая белковую молекулу, изменяя ее конформацию, они приведут к изменению кинетических, а возможно, и регуляторных свойств молекулы фермента.

Существуют разные методы, позволяющие выяснить, произошли или нет изменения свойств фермента в процессе старения белковой молекулы. Наибольшее распространение имеет исследование кинетических параметров фермента - константы Михаэлиса и максимальной скорости реакции, а в случае ферментов, обладающих кооперативными свойствами, коэффициента Хилла.

Поскольку Г 6ФД катализирует двухсубстратную реакцию, то для определения кинетических характеристик фермента необходимо было исследовать зависимость скорости реакции как от концентрации субстрата - глюкозо-6-фосфата, так и от концентрации кофермента - НАДФ⁺.

Зависимости скорости Г 6ФД-ной реакции от концентрации Г 6Ф следует кинетике Михаэлиса-Ментен, что подтверждается линеаризацией кривых в координатах Вульфа-Хайнса (рис. 1).

а)

б)

Рис. 1. Зависимость Г 6ФД-ной реакции от концентрации Г 6Ф у интактных кроликов в координатах Михаэлиса (а) и Вульфа-Хайнса (б)

Анализ кривых зависимости v Г 6ФД-ной реакции от [Г 6Ф] показал, что при старении эритроцитов сохраняется их гиперболический характер, однако происходит существенное изменение кинетических характеристик Г 6ФД: увеличение К_м для Г 6Ф и уменьшение максимальной скорости (табл. 1). Наименьшее значение К_м для глюкозо-6-фосфата найдено во ФМЭ. В ОЭМ К_м на 40,7 % выше, чем во ФМЭ, а во ФСЭ - на 185,7 %. Наибольшее значение максимальной скорости приходится на фракцию молодых эритроцитов. В ОЭМ она снижена на 18,9 % по сравнению с ФМЭ, во ФСЭ на 46,5 %.

Таблица 1. К_м, V_мах Г 6ФД для глюкозо-6-фосфата и K_i^АТФ во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов (Xm)

Фракции клеток	ФМЭ N=75 1	ОЭМ N=75 2	ФСЭ N=75 3
Км для Г 6Ф	70,00±0,80	98,51±1,12 P1 < 0,01	130,10±1,21 P1,2 < 0,01
Vмах для Г 6Ф	12,15±0,14	9,85±0,13 P1 < 0,01	6,50±0,08 P1,2 < 0,01
KiАТФ	5,21±0,33	4,15±0,21 P1 < 0,01	3,06±0,15 P1,2 < 0,01

Примечание: К_м - выражена в мкМ; K_i^АТФ - мМ; V_мах - мкмоль НАДФН/мин*гHb

Таблица 2. [S]_0,5, V_max, n_н Г 6ФД для НАДФ⁺ и К_i^НАДФН во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов (Xm)

Фракции клеток	ФМЭ N=75 1	ОЭМ N=75 2	ФСЭ N=75 3
[S]0,5	22,75±0,50	32,47±1,40 P1 < 0,01	54,11±2,10 P1,2 < 0,01
Vмах	12,53±0,21	10,11±0,12 P1 < 0,01	6,91±0,12 P1,2 < 0,01
nн	1,73±0,07	1,53±0,07 P1 < 0,01	0,97±0,03 P1,2 < 0,01
КiНАДФН	59,10±2,11	47,21±3,22 P1 < 0,01	32,61±2,21 P1,2 < 0,01

Примечание: [S]_0,5, K_i^НАДФН - выражены в мкМ; V_мах - мкмоль НАДФН/мин*гHb.

а)

б)

Рис. 2. Зависимость Г 6ФД-ной реакции от концентрации НАДФ⁺ у интактных кроликов в координатах Михаэлиса (а) и Вульфа-Хайнса (б)

Зависимость скорости Г 6ФД-ной реакции от концентрации НАДФ⁺ во ФМЭ и ОЭМ не подчиняется гиперболическому закону Михаэлиса-Ментен, поскольку кривые зависимости v от [НАДФ⁺] в этих фракциях не линеаризуются в области низких значений концентраций кофермента (рис. 2). Это, по-видимому, связано с наличием кооперативных эффектов по отношению к НАДФ⁺. Линеаризация наблюдается только во ФСЭ. В пользу нашего предложения свидетельствуют величины коэффициента Хилла (табл.2). Г 6ФД во ФМЭ и ОЭМ проявляет положительную кооперативность по отношению к НАДФ⁺. Коэффициент Хилла в этих фракциях клеток равен 1,73±0,07 и 1,53±0,07 соответственно. В ФСЭ он приближается к единице.

Расчет [S]_0,5 - концентрации субстрата, при которой скорость Г 6ФД-ной реакции достигает половины от максимальной, проведенный графически в координатах Лайнуивера-Берка с учетом величины коэффициента Хилла для ФМЭ, ОЭМ и ФСЭ показал, что наименьшая величина [S]_0,5 наблюдается во ФМЭ - и наибольшая - во ФСЭ (табл. 2).

Влияние НАДФН на скорость реакции в разных фракциях эритроцитов у интактных кроликов кривые зависимости скорости от концентрации НАДФ⁺ при различных концентрациях НАДФН проанализировали в координатах Лайнуивера-Берка (рис. 3а).

Графический анализ показал, что присутствие НАДФН изменяет характер зависимости скорости реакции от концентрации НАДФ⁺ во ФМЭ и ОЭМ: исчезает положительная кооперативность и зависимость скорости от концентрации НАДФ⁺ преобразуется в гиперболу Михаэлиса-Ментен.

Как конкурентный ингибитор, НАДФН не меняет максимальную скорость и увеличивает К_м для НАДФ⁺ от ФМЭ к ФСЭ. Действительно, в наших экспериментах в присутствии НАДФН наблюдается увеличение К_м, причем с увеличением концентрации НАДФН растет и величина К_м для всех фракций эритроцитов (табл.3).



Рис. 3. Зависимость скорости Г 6ФД-ной реакции от концентрации НАДФ+ при разных концентрациях НАДФН во фракции молодых эритроцитов у интактных кроликов

Рис. 4. Зависимость 1/v от концентрации НАДФН во фракции молодых эритроцитов у интактных кроликов

Константу ингибирования - К_i - рассчитывали методом Диксона (зависимость 1/v_i от [НАДФН]) (рис. 3б).

Величины K_i^НАДФН Г 6ФД во ФМЭ, ОЭМ и ФСЭ представлены в таблице 2. Как видно из приведенных в таблице данных наиболее сильное действие ингибитор оказывает на Г 6ФД во фракции старых эритроцитов.

Таблица 3. Влияние различных концентраций НАДФН на К_м кажущуюся НАДФ⁺ во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов

[НАДФН], мкМ	ФМЭ	ОЭМ	ФСЭ
25	68,97±1,21	75,17±1,81	82,76±2,70
50	77,59±1,32	82,76±2,40	93,10±2,46
100	101,72±3,71	106,9±3,91	117,24±4,51

Для определения влияния АТФ на скорость реакции в разных фракциях эритроцитов у интактных кроликов кривые зависимости скорости от концентрации Г 6Ф при различных концентрациях АТФ проанализировали в координатах Лайнуивера - Берка. Графический анализ показал, что зависимость скорости Г 6ФД-ной реакции от концентрации Г 6Ф в отсутствии и при разных концентрациях АТФ имеет гиперболический характер.

Как конкурентный ингибитор, АТФ не меняет максимальную скорость, а приводит к уменьшению сродства Г 6ФД к Г 6Ф во всех исследуемых фракциях эритроцитов.

Величины K_i^АТФ Г 6ФД во фракциях молодых и старых эритроцитов и эритроцитов и общей эритроцитарной массе представлены в таблице 1.

Во фракции молодых эритроцитов K_i имеет наибольшее значение, во фракции старых эритроцитов величина K_i наименьшая, что свидетельствует о более сильном ингибирующем эффекте АТФ на Г 6ФД в старых клетках.

Таким образом, при старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального эритропоэза, происходит снижение активности Г 6ФД-ной реакции, в основе которого лежит изменение кинетических свойств фермента. Уменьшаются кооперативные свойства Г 6ФД по отношению к НАДФ⁺, вплоть до полного исчезновения кооперативных взаимодействий во ФСЭ. Увеличиваются [S]_0,5 для НАДФ⁺ и К_м для Г 6Ф и ингибирующий эффект НАДФН и АТФ.

Наряду с изучением Г 6ФД при старении эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, исследовались активность и кинетические параметры фермента при старении эритроцитов, образованных в условиях напряженного эритропоэза. Сравнительное изучение Г 6ФД эритроцитов, продуцированных как в условиях нормального, так и напряженного эритропоэза, позволяет понять определенные закономерности в механизме изменения активности фермента в процессе старения.

Свойства Г 6ФД, скорость лимитирующего фермента пентозофосфатного пути, при старении эритроцитов, продуцированных в условиях напряженного эритропоэза, не изучены.

Исследование активности Г 6ФД во ФМЭ на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери показало, что молодые эритроциты, образованные в условиях напряженного эритропоэза, характеризуются повышенной активностью фермента по сравнению с молодыми клетками интактных кроликов. Выраженность изменений зависит от степени напряженности эритропоэза, определяемой временем после кровопотери. Максимальное увеличение активности наблюдалось на 7 сутки (на 53,9 % от фона), менее выраженное на 20 сутки (на 24,4 %), а к 30 суткам активность практически приходила к фоновому уровню (табл.4, 5).

Обнаруженное нами увеличение активности фермента во ФМЭ на 7 сутки после кровопотери может быть обусловлено как более молодым составом эритроцитов в этой фракции, так и особенностями клеток, образованных в условиях напряженного эритропоэза.

Увеличение активности Г 6ФД сопровождалось изменением кинетических свойств фермента: уменьшением К_м и увеличением максимальной скорости для Г 6Ф, увеличением сродства фермента к НАДФ⁺, снижением ингибирующего влияния НАДФН. Характер кривой зависимости v Г 6ФД-ной реакции от [Г 6Ф] и [НАДФ⁺] во ФМЭ, образованных в условиях напряженного эритропоэза, также как и у интактных кроликов подчиняется кинетике Михаэлиса-Ментен и Хилла соответственно. В изменении величин К_м для Г 6Ф и [S]_0,5 для НАДФ⁺ прослеживается та же тенденция, что и в изменении активности фермента: наибольшее снижение величины К_м отмечено во ФМЭ на 7 сутки после кровопотери, а к 30 суткам величина К_м практически не отличалась от фонового значения.

Изменение активности и кинетических свойств Г 6ФД по отношению к Г 6Ф и НАДФ⁺ в ОЭМ на 7, 20 и 30 сутки после кровопотери имели одинаковую направленность с молодыми клетками, но были менее выраженными.

Исследование ФСЭ на 20 сутки после кровопотери обнаружило увеличение активности Г 6ФД на 23 % по сравнению с аналогичной фракцией у интактных кроликов.

Таблица 4. Свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов и на 7 сутки после кровопотери (Xm)

Параметры		ФМЭ N=25 1	ОЭМ N=25 2	ФСЭ N=25 3
Активность	Фон 7 сутки	9,12±0,06 14,04±0,15*	8,13±0,03 10,11±0,15* P1 < 0,01	5,81±0,15 8,61±0,14* P1,2 < 0,01
Км для Г 6Ф	Фон 7 сутки	71,00±2,41 35,51±1,52*	99,40±2,71 57,10±2,12* P1 < 0,01	132,10±2,90 81,10±2,60* P1,2 < 0,01
Vmax для Г 6Ф	Фон 7 сутки	12,10±0,31 18,50±0,41*	10,05±0,11 15,08±0,30* P1 < 0,01	6,45±0,11 9,31±0,11* P1,2 < 0,01
[НАДФ+]0,5	Фон 7 сутки	22,72±0,11 15,51±1,71*	30,41±0,09 22,74±2,32* P1 < 0,01	50,11±0,08 36,61±0,09* P1,2 < 0,01
Vmax для НАДФ+	Фон 7 сутки	12,21±0,07 18,10±0,41*	10,91±0,33 13,84±1,19* P1 < 0,01	6,55±0,60 9,84±0,51* P1,2 < 0,01
nн	Фон 7 сутки	1,71±0,07 1,81±0,08	1,54±0,08 1,63±0,04 P1 < 0,01	1,00±0,06 1,05±0,05 P1,2 < 0,01
KiНАДФН	Фон 7 сутки	59,00±2,81 75,00±3,12*	47,00±3,21 58,00±2,51* P1 < 0,01	32,00±2,11 47,00±4,10* P1,2 < 0,01
KiАТФ	Фон 7 сутки	5,20±0,33 6,00±0,21*	4,11±0,23 5,30±0,19* P1 < 0,01	3,05±0,15 4,13±0,35* P1,2 < 0,01

Примечание: P_{1 (1,2)} - сравнение фракций 7 суток между собой;

К_м, [НАДФ⁺]_0,5, K_i^НАДФН выражена в мкМ; K_i^АТФ - в мМ; активность Г 6ФД и V_max - в мкмоль НАДФ/мин*гHb;

* - сравнение соответствующих фракций (фоновые и 7 сутки) между собой; во всех случаях P<0,01, кроме n_н.(Р<0,1).

Таблица 5. Свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы во фракциях молодых, старых эритроцитов и общей эритроцитарной массе у интактных кроликов и на 20 сутки после кровопотери (Xm)

Параметры		ФМЭ N=25 1	ОЭМ N=25 2	ФСЭ N=25 3
Активность	Фон 20 сутки	9,19±0,04 11,36±0,07*	8,03±0,03 9,69±0,07* P1 < 0,01	5,63±0,02 6,95±0,08* P1,2 < 0,01
Км для Г 6Ф	Фон 20 сутки	70,51±2,10 43,33±1,51*	98,10±1,61 73,67±2,30* P1 < 0,01	131,50±1,12 105,87±1,82* P1,2 <0,01
Vmax для Г 6Ф	Фон 20 сутки	12,13±0,16 14,06±0,12*	9,95±0,11 11,84±0,11* P1 < 0,01	6,40±0,09 7,73±0,13* P1,2 <0,01
[НАДФ+]0,5	Фон 20 сутки	22,67±1,16 18,91±0,42*	31,51±2,82 26,70±2,10* P1 < 0,01	52,00±1,22 46,70±0,61* P1,2 <0,01
Vmax для НАДФ+	Фон 20 сутки	12,43±0,13 14,11±0,19*	10,54±0,09 11,08±0,21* P1 < 0,01	6,65±0,08 7,58±0,04* P1,2 <0,01
nн	Фон 20 сутки	1,72±0,06 1,79±0,03	1,52±0,04 1,60±0,04 P1 < 0,05	1,00±0,03 1,02±0,02 P1,2 <0,05
KiНАДФН	Фон 20 сутки	59,00±2,02 66,00±2,11*	47,00±3,20 53,00±2,51* P1 < 0,01	32,00±3,12 40,00±4,30* P1,2 < 0,01
KiАТФ	Фон 20 сутки	5,10±0,20 5,80±0,08*	4,10±0,20 5,00±0,14* P1 < 0,01	3,00±0,11 3,80±0,30* P1,2 < 0,01

Примечание: P_1(1,2) - сравнение фракций 20 суток между собой;

К_м, [НАДФ⁺]_0,5, K_i^НАДФН выражали в мкМ, K_i^АТФ - в мМ, активность Г 6ФД и V_max - в мкмоль НАДФН/мин*гHb.

* - сравнение соответствующих фракций (фоновые и 20 сутки) между собой; во всех случаях Р < 0,01, кроме n_н.(Р < 0,1).

ФСЭ на 20 сутки представлена клетками, значительно более молодыми, чем соответствующая фракция у интактных кроликов, поскольку эритроциты, образованные до кровопотери, по данным иммунных эритрограмм, к 20 суткам покидают кровяное русло. Средний возраст эритроцитов фракции старых клеток в этот период меньше, чем средний возраст общей эритроцитарной массы у интактных кроликов.

Сопоставление значений активности и кинетических параметров Г 6ФД старых клеток на 20 сутки с величинами этих показателей у интактных кроликов в ОЭМ свидетельствует, что активность Г 6ФД ниже, а К_м для Г 6Ф выше, чем в клетках соответствующего возраста у интакных кроликов. В этих клетках наблюдается уменьшение кооперативных свойств Г 6ФД в отношении связывания НАДФ⁺ и более выраженный ингибирующий эффект НАДФН по сравнению с соответствующими показателями в ОЭМ у интактных кроликов.

На 30 сутки после кровопотери во ФСЭ активность и кинетические свойства Г 6ФД практически не отличаются от аналогичных величин у интактных кроликов, хотя на 30 сутки эритроциты в этой фракции значительно моложе по календарному возрасту, чем старые клетки фоновых животных.

При исследовании влияния температуры на активность Г 6ФД, обнаружено, что как и у интактных кроликов, так и у кроликов на 7, 20, и 30 сутки после кровопотери во всех исследуемых фракциях активность фермента возрастала с увеличением температуры в интервале от 20С до 50С, при дальнейшем повышении температуры наблюдалось резкое снижение активности Г 6ФД (рис. 4). У интактных кроликов наибольшей активностью Г 6ФД обладала ФМЭ и при 50С составляла 13,45±0,89 мкмоль НАДФН/мин*гHb. В ОЭМ и ФСЭ при данной температуре активность фермента была ниже на 20,4 % и 40,2 % соответственно по сравнению со ФМЭ.

На 7 сутки после кровопотери при 20С активность Г 6ФД была повышена во всех фракциях эритроцитов по сравнению с фоновыми величинами: во ФМЭ - на 76,5 %, ОЭМ-48,7 % и ФСЭ - на 25,8 % (рис. 4 б). При 50С в этот период наибольшая активность фермента наблюдалась во ФМЭ и была выше на 61,3 % по сравнению с активностью фермента у интактных кроликов. В ОЭМ активность Г 6ФД выше фоновой величины на 38,3 %. Во фракции старых клеток активность фермента на 7 сутки после кровопотери достоверно не отличалась от таковой у интактных кроликов. При дальнейшем повышении температуры активность Г 6ФД снижалась во всех исследуемых фракциях клеток, но во фракции молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массе более медленно, чем у интактных кроликов. При 55С активность фермента в этих фракциях оставалась повышенной на 354,0 % во ФМЭ и на 215,2 % в ОЭМ по сравнению с фоновой величиной.

 а)

б)

в)

г)

Рис. 5. Влияние температуры на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у интактных кроликов (а) и на 7 (б), 20 (в), 30 (г) сутки после кровопотери

а)

б)

в)

г)

Рис. 6. Влияние рН на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы у интактных кроликов (а), и на 7 (б), 20 (в), 30 (г) сутки после кровопотери

На 20 и 30 сутки после кровопотери при всех значениях температур активность Г 6ФД достоверно не отличалась от активности фермента у интактных кроликов.

Результаты исследований влияния рН - среды на активность Г 6ФД представлены на рис 5.

Как видно из данных, у интактных кроликов активность фермента резко возрастала от рН 5 до рН 7 во всех фракциях эритроцитов. Оптимальное значение рН равно 8 во всех исследуемых фракциях клеток. Однако значения активности при рН 7, 8 и 9 достоверно не отличаются. Наибольшая активность фермента наблюдалась во ФМЭ и при рН 8 составляла 8,600,51 мкмоль НАДФН/мин*гHb. В ОЭМ и ФСЭ активность Г 6ФД была ниже на 23,3 % и 45,3 % соответственно по сравнению с ФМЭ.

На 7 сутки после кровопотери максимальная активность Г 6ФД резко возрастала от рН 5 до рН 8. Как и у интактных кроликов, в этот период, оптимум рН равен 8, однако активность фермента была повышена во всех фракциях клеток - на 101,2 % во ФМЭ, 68,2 % в ОЭМ и на 55,3 % во ФСЭ. В отличие от интактных кроликов, на 7 сутки после кровопотери при дальнейшем повышении рН происходит более выраженное снижение активности фермента, особенно во фракции молодых эритроцитов.

На 20 и 30 сутки после кровопотери активность фермента при всех значениях рН практически возвращается к фоновым значениям.

Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритрпоэза, являются качественно новыми клетками и отличаются от нормальных эритроцитов некоторыми метаболическими особенностями и физико-химическими свойствами.

Особенности "стресс" - эритроцитов могут быть связаны с перестройкой всего эритропоэтического процесса после массивной кровопотери, с запуском зарепрессированной в норме программы "терминального" или "резервного" эритропоэза. При терминальном эритропоэзе клетки эритроидного ряда анемизированных животных проходят ускоренный цикл развития в результате возможных перескоков делений эритроидных клеток на ранних стадиях развития. Стимуляция эритропоэза при этом выражается в индукции дифференцировки стволовых клеток в эритроидном направлении, укорочении интермитотического цикла редукцией оного или нескольких промежуточных митотических делений, уменьшением объема неэффективного эритропоэза, укороченным созреванием неделящихся клеток.

Таким образом, на основании представленного материала можно заключить, что эритроциты, продуцированные в ответ на стресс-воздействие, первоначально характеризуются повышенной активностью Г 6ФД, большим сродством фермента к Г 6Ф и НАДФ⁺, увеличением кооперативных свойств по отношению к НАДФ⁺, меньшим ингибирующим эффектом НАДФН и АТФ. На эти параметры оказывает влияние степень напряженности эритропоэза. Однако при старении этих клеток наблюдается более быстрое, чем в норме, снижение активности фермента и изменение кинетических свойств Г 6ФД: возрастание К_м для Г 6Ф, снижение кооперативных свойств, усиление ингибирующего влияния НАДФН, что может явиться косвенным подтверждением отличия свойств Г 6ФД в эритроцитах, образованных в разных условиях кроветворения.

ВЫВОДЫ

1. Зависимость скорости Г 6ФД-ной реакции от концентрации глюкозо-6-фосфата в эритроцитах кролика имеет гиперболический характер, который сохраняется при старении клеток.

2. Зависимость скорости реакции от концентрации НАДФ⁺ во фракции молодых эритроцитов и общей эритроцитарной массе следует кинетике Хилла, во фракции старых клеток - кинетике Михаэлиса-Ментен.

3. Старение эритроцитов, образованных в условиях нормального эритропоэза, сопровождается значительным снижением активности Г 6ФД и изменением кинетических параметров: увеличением константы Михаэлиса и уменьшением V_max для глюкозо-6-фосфата; уменьшением кооперативных взаимодействий и повышением [S]_0,5 для НАДФ⁺; усилением ингибирующего влияния НАДФН на активность фермента.

4. Эритроциты, продуцированные в условиях напряженного эритропоэза, первоначально характеризуются повышением активности Г 6ФД, V_max для глюкозо-6-фосфата и НАДФ⁺, увеличением кооперативных взаимодействий по отношению к НАДФ⁺, уменьшением К_м для глюкозо-6-фосфата и [S]_0,5 для НАДФ⁺, меньшим ингибирующим эффектом НАДФН. Выраженность изменений зависит от степени напряженности эритропоэза, определяемой временем после кровопотери. Старение этих клеток сопровождается более быстрым, чем в норме, снижением активности Г 6ФД, изменением кинетических параметров фермента.

5. При старении эритроцитов, образованных в условиях как нормального, так напряженного эритропоэза оптимум температуры не меняется, но повышается термочувствительность.

6. При старении эритроцитов, продуцированных в условиях нормального и напряженного эритропоэза, повышается чувствительность Г 6ФД к воздействию высоких значений рН.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Характеристика НАДФ-зависимых дегидрогеназ пентозофосфатного пути метаболизма глюкозы у млекопитающих / Ю.А. Лакомая, Н.М. Титова. - М.,2002. - 25 с. - Деп. В ВИНИТИ 25.09.02, №1617. - 25 с.

2. Использование свойств эритроцитарных ферментов в эколого-биохимическом мониторинге/ Ю.А. Лакомая, Г.Г. Корнюш //Экология Южной Сибири и сопредельных территорий: Материалы VI Международной научной школы-конференции студентов и молодых ученых 25-28 ноября 2002г. - Абакан, 2002. - с. 91-92.

3. Старение эритроцитов: состояние глутатионовой антиоксидантной системы / Ю.А. Лакомая, Н.М. Титова, А.М. Кудряшов, М.В. Колосова //Актуальные проблемы медицины и биологии: Сборник научных работ. Вып.2. - Томск, 2003. - с. 43-44.

4. Изменение свойств глутатион-S-трансферазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в онтогенезе эритроцитов / Ю.А. Лакомая, М.В. Колосова, Н.М. Титова // Науки о человеке: Сборник статей по материалам IV конгресса молодых ученых и специалистов 15-16 мая 2003г. - Томск, 2003. - с. 157-158.

5. Модификация свойств глюкозо-6-6фосфатдегидрогеназы при старении эритроцитов, образованных при напряженном эритропоэзе / Ю.А. Лакомая // Молодежь Сибири - науке России: Сборник материалов межрегиональной научно-практической конференции. - Красноярск, 2003. - с. 355-357.

6. Изменение свойств глутатион-S-трансферазы и глюкозо-6-6фосфатдегидрогеназы эритроцитов при напряженном эритропоэзе / Ю.А. Лакомая, М.В. Колосова, Н.М. Титова, А.А. Савченко //Вопросы сохранения и развития здоровья населения Севера и Сибири: Материалы итоговой научной конференции 1-2 октября 2003г. - Красноярск, 2003. - с. 195-197.

7. Адаптивно-компенсаторные изменения активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов напряженного эритропоэза / Ю.А. Лакомая // Механизмы функционирования висцеральных систем: Материалы Международной конференции 29 сентября - 1 октября 2003г. - Санкт-Петербург, 2003. - с. 174-175.

8. Изучение активности и кинетических свойств глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы эритроцитов, продуцированных после стресс-воздействия (массивной кровопотери) / Ю.А. Лакомая, Н.М. Титова // Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии: Сборник научных работ. Т.3 - Томск, 2004. - с. 84-85.

9. Изучение свойств ферментов в эритроцитах напряженного эритропоэза / Ю.А. Лакомая, М.В. Колосова, Н.М. Титова // Российский физиологический журнал им. И.М. Сеченова. - 2004. - №8. - с. 139.

10. Изучение кинетических свойств глутатион-S-трансферазы и глюкозо-6-6фосфатдегидрогеназы в эритроцитах нормального эритропоэза / Ю.А. Лакомая, М.В. Колосова, Н.М. Титова //Вестник КрасГУ. - 2004. - №7. - с. 163-166.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АФК - активныеформы кислорода;

Г 6Ф - глюкозо-6-фосфат;

Г 6ФД - глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа;

Км - константа Михаэлиса;

KiАТФ - константа ингибирования;

nн - коэффициент Хилла;

ОЭМ - общая эритроцитарная масса;

ФМЭ - фракци молодых эритроцитов;

ФСЭ - фракция старых эритроцитов.

Размещено на Allbest.ru

...