Возрастные особенности свободнорадикального гомеостаза и параметров ориентировочно-исследовательского поведения крыс при долгосрочной и срочной адаптации к холоду

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Возрастные особенности свободнорадикального гомеостаза и параметров ориентировочно-исследовательского поведения крыс при долгосрочной и срочной адаптации к холоду

Специальность 03.00.13 - Физиология (Биологические науки)

Позднякова Ольга Николаевна

Астрахань - 2010

Работа выполнена на кафедре морфологии и физиологии человека и животных Астраханского государственного университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Кондратенко Елена Игоревна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Тризно Николай Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Клаучек Сергей Всеволодович

Ведущая организация: ГОУ ВПО Саратовский государственный медицинский университет им. В.И. Разумовского

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования.

Температура тела является константой организма, определяющей постоянство скорости физиологических процессов - одного из важнейших условий жизнедеятельности организма. Проблема адаптации к холоду занимает одно из ведущих мест среди актуальных проблем биологической науки (Гуляева Н.В., 1989 г; Пашкова И.Г. и соавт., 1996; Барбараш Н. А., 1996; Гасангаджиева А. П., 1997; Колосова Н.Г.и соавт., 1999; Суворов В.В. и соавт., 2002; Поздняков О.Г. и соавт., 2003; Ахалая М.Я.и соавт., 2006).

Современные исследования доказывают, что уже повторное воздействие охлаждения перестраивает исходные связи в системе гомеостаза (Леутин В.П., Николаева Е.И., 1988; Ахалая М.Я.и соавт, 2006) и создает предпосылки для новой адаптации. В результате общей интенсификации окислительных процессов при холодовом воздействии (Артюхов В.Г., Наквасина М.А., 2000) у гомойотермных организмов происходит активация процессов свободнорадикального окисления (Панин Л.Е. и соавт., 1995), которую P. Kovacs с соавторами (1996) рассматривает как основное патогенетическое звено стресса. В ответ на интенсификацию свободнорадикальных процессов формируются защитные механизмы, которые снижают вероятность развития патологических процессов (Зайчик А.Ш. и соавт., 1999). Одним из элементов защитной антиоксидантной системы является ферментативное звено антиоксидантной системы (АОС). Нормализация уровня продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) активно используется в качестве необходимого и достаточного критерия эффективности адаптивных преобразований (Эмирбеков Э.З., Львова С.П., 1985). Таким образом, эффективность адаптации к стрессорным воздействиям определяется согласованностью изменений антиоксидантной ферментативной активности с интенсивностью ПОЛ (Нилова Н.С., Полежаева Л.Н., 1992). Динамика процессов свободнорадикального окисления (СРО) и антиоксидантной активности на ранних этапах охлаждения в процессе адаптации изучена недостаточно.

В отличие от постоянного, периодическое охлаждение в естественных условиях встречается чаще и способствует быстрой выработке адаптации к холоду (Radomski MW, Boutelier C., 1982; Golden F.S., Tipton M.J., 1988). Большой интерес представляет и возрастной аспект адаптации, так как возрастные отличия проявляются и в реакциях свободнорадикальных процессов (Imre S., Juhasz E., 1987; Matsugo S. et al, 2000), и в активации АОС (Воскресенский О.Н. и соавт., 1982; Selman C. et al, 2000).

Цель работы - исследовать возрастную специфику свободнорадикальных и антиоксидантных процессов и особенностей ориентировочно-исследовательского поведения при адаптации к периодическому охлаждению.

Основные задачи исследования:

Изучить изменение параметров ориентировочно-исследовательского поведения у половозрелых и неполовозрелых самцов белых крыс в процессе 20-тидневного периодического холодового воздействия.

Определить возрастные особенности динамики показателей сердечного ритма на ранних этапах охлаждения у адаптированных к периодическому охлаждению неполовозрелых и взрослых животных.

Исследовать динамику промежуточных продуктов перекисного окисления липидов (ПП ПОЛ), перекисного гемолиза эритроцитов (ПГЭ), уровня окислительно-модифицированных белков, активности супероксиддисмутазы (СОД), церулоплазмина и каталазной активности в плазме крови неполовозрелых и половозрелых самцов крыс в условиях адаптации к периодическому охлаждению.

Исследовать тканеспецифические особенности динамики накопления малонового диальдегида (МДА) в ткани печени и в миокарде на ранних этапах охлаждения (15, 30, 45, 60 и 90 минут) в условиях адаптации к холоду неполовозрелых и взрослых самцов крыс.

Научная новизна

Впервые установлено, что динамика ориентировочно-исследовательского поведения в процессе 20-дневного охлаждения имеет общие черты у неполовозрелых и взрослых животных: на 5-15 дни отмечено снижение исследовательской активности, а к 20-му дню охлаждения поведение обеих возрастных групп возвращается к показателям интактных животных.

Уточнена степень вовлечения звеньев про- и антиоксидантной системы в изменение окислительного гомеостаза после 20-дневного периодического охлаждения в зависимости от возраста животных. Впервые установлено, что у половозрелых животных происходят более значительные изменения уровня активности отдельных ферментов АОС, чем у неполовозрелых животных, а реакция показателей ПОЛ на 20-дневное периодическое охлаждение не зависела от возраста.

Установлено, что для периодически охлаждавшихся крыс по сравнению с неадаптированными животными характерны меньшие по амплитуде колебания интенсивности процессов СРО. После 20-дневной периодической адаптации половозрелые самцы быстрее и в полном объеме восстанавливают функциональные показатели. Впервые установлено, что в организме периодически охлаждавшихся половозрелых животных формируются новые корреляционные взаимосвязи между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты.

Новизной работы является факт установления значительных возрастных особенностей в динамике параметров свободнорадикальных процессов. Для половозрелых самцов характерна консолидация всех параметров СРО, а у молодых животных динамика отдельных параметров отличалась разнонаправленностью и не всегда была согласованной. В ответ на охлаждение у адаптированных животных обеих возрастных групп происходила активация ферментативного звена АОС, степень которой также зависела от возраста животных. Установлено, что увеличение продуктов ПОЛ в процессе длительной адаптации не всегда отражает развитие деструктивных изменений, более значимыми являются данные о ранней динамике свободно-радикальных процессов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные результаты расширяют представления о возрастных аспектах развития свободнорадикальных процессов при развитии адаптации животных к периодическому охлаждению и могут быть использованы при оптимизации состояния организма людей, подверженных периодическому охлаждению по характеру работы, схемы физиотерапевтических процедур, связанных с охлаждением. В работе разработаны критерии адаптации к 20-дневному периодическому охлаждению на уровне свободнорадикальных параметров, параметров работы сердца и поведения животных в тесте открытое поле. Материалы диссертации включены в лекции курсов по физиологии, биохимии и экологии человека и животных Астраханского государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

Критериями адаптированности животных на уровне свободнорадикального гомеостаза к 20-дневному периодическому охлаждению является увеличение скорости нормализации показателей и отсутствие колебаний этих параметров на раннем этапе охлаждения (1,5-часовое охлаждение).

Критерием перехода к периоду долгосрочной адаптации к периодическому охлаждению является восстановление параметров исследовательского компонента ориентировочной реакции и уменьшение уровня тревожности.

Вегетативным критерием адаптированности к периодическому охлаждению является частоты сердечных сокращений. Этот критерий имеет зависимость от возраста.

Апробация работы

Результаты исследования докладывались и обсуждались на IХ Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы Бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2006), в материалах научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань - Волгоград - Москва, 2006), на итоговых научных конференциях студентов, аспирантов и преподавателей Астраханского государственного университета (Астрахань, 2006, 2007), на Международной научной конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и старение» (Астрахань, 2006), на Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт Петербург, 2007), на Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2008» (Москва, 2008), в материалах IV Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2008) и 12-ой международной Пущинской школы-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2008). По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ, 3 из которых - в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, глав, посвященных обзору литературы, описанию материалов и методов исследования, изложению и обсуждению результатов собственных исследований, выводов. Общий объем диссертации - 126 страниц, работа иллюстрирована 17 таблицами, 24 рисунками и 7 таблицами приложения. Библиографический список включает 243 источников, из них 102 - иностранных.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Проведено две серии экспериментов. В первой серии использовано 80 неполовозрелых 7-недельных (средняя масса в начале эксперимента - 65 г, к концу эксперимента - 95 г) и во второй - 77 половозрелых 18-недельных (со средней массой в начале эксперимента - 203 г и к концу эксперимента - 242 г) самцов беспородных белых крыс. Классификация животных соответствует классификации, предложенной И.П. Западнюк и соавторами, 1983. Животные содержались в стандартных условиях вивария при естественном освещении и свободном доступе к пище и воде. Проводимые эксперименты соответствуют этическим нормам, изложенным в Женевской конвенции (1971), «Международным рекомендациям по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1985). Декапитация проводилась после наркотизации животных путем внутрибрюшинного введения этаминала натрия в дозе 4 мг/100 г массы тела.

Холодовая адаптация. Для охлаждения крыс в индивидуальных клетках, не ограничивающих их подвижность (Линчевская А.А. и соавт., 1986), помещали в освещенную холодильную камеру в течение 3 часов на протяжении 20 дней при температуре +4^оС (Кормильцина Н.К., 1990). На 21-е сутки крыс охлаждали 15, 30, 45, 60 и 90 минут. Одна группа служила контролем, адаптированным к холодовому воздействию. Отдельная группа животных, не подвергавшихся охлаждению, являлась неадаптированным контролем.

Оценивалась динамика ориентировочно-исследовательской активности животных (Буреш Я.И. и соавторы, 1991), для чего крыс тестировали перед началом охлаждения и на 2-е, 5-е, 10-е, 15-е и 20-е сутки ежедневного охлаждения. Контрольную группу животных (n = 20 и n = 17 у неполовозрелых и половозрелых животных соответственно), тестировали в том же режиме, но без охлаждения. Для анализа уровня исследовательского компонента и коэффициента тревожности в процессе ежедневного охлаждения был использован метод Н.Р. Григорьева, 2007.

Динамику показателей сердечной деятельности регистрировали у адаптированных к периодическому холодовому воздействию животных до и после воздействия холодом различной длительности Определение параметров сердечной деятельности и показателей ПОЛ в миокарде проводили совместно с доцентом кафедры Физиологии и морфологии человека и животных Е.В. Курьяновой и А.Г. Дайнеко. Запись ЭКГ проводили на аппаратно-программном комплексе «Варикард» (Рамена, Россия), миниатюрные электроды-зажимы фиксировали в области хвостовой и правой и левой подключичных артерий. Рассчитывались частота сердечных сокращений (ЧСС), мода (Мо), амплитуда моды (АМо), индекс напряжения (ИН), рассчитывали по формуле (Баевский Р. М. и соавт., 1984), с учетом ширины класса гистограммы (7,8 мс), по которой определяется АМо: ИН = (AMo / 2 x ДХ x Mo) x (50/7,8).

Для определения степени перекисного гемолиза эритроцитов использовалась методика А.А. Покровского и соавт. (1964) в модификации, предложенной А.Е. Лазько, Р.И. Асфандияровым и А.А. Резаевым (1993).

Уровень ПП ПОЛ определяли в плазме крови. Интенсивность образования промежуточных продуктов ПОЛ с изолированными двойными связями (ИДС) (220 нм), диеновых коньюгатов (ДК) (232 нм), кетодиенов и сопряжённых триенов (КДСТ) (278 нм) изучали спектрофотометрически по методу И.А. Волчегорского с соавт. (1989).

Интенсивность ПОЛ в тканях печени и миокарда определяли по исходному уровню и динамике накопления ТБК-активных продуктов по методу И.Д. Стальной и Т.Г. Гаришвили (1977) в модификации Е.А. Строева и В.Г. Макаровой (1986).

Для определения интенсивности окислительной модификации белков сыворотки крови определяли уровень алифатических альдегид-денитрофенилгидразонов (АДФГ) при 460 нм и алифатических кетон-денитрофенилгидразонов основного характера (АКФГ) при 540 нм по методу Е.Е. Дубининой и соавторов (1995).

Каталазную активность в плазме крови и эритроцитах определяли по методике М.А. Королюка и соавторов (1988). Активность церулоплазмина - по методике Э.В. Тэна (1981). Активность супероксиддисмутазы исследовали по методу С. Чевари и соавторов (1985).

Полученные данные подвергнуты статистической обработке с использованием критерия Стьюдента, дисперсионного анализа по Фишеру и корреляционного анализа (MS Excel) (Лакин Г.Ф., 1990; Козак М.Ф., 1995).

свободнорадикальный антиоксидантный адаптация охлаждение

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Возрастные особенности параметров ориентировочно-исследовательского поведения в динамике 20-дневного периодического охлаждения. Ориентировочно-исследовательское поведение представляет собой один из важнейших типов поведения и является психологическим механизмом адаптации высших позвоночных (Шаляпина В.Г., 2003), а так же может являться критерием адаптации (Гуляева Н.В., 1989). Возрастные особенности ориентировочно-исследовательского поведения проявились в тесте открытого поля с первого тестирования: неполовозрелые животные оказались в значительной степени более активны, чем половозрелые самцы.

У ежедневно охлаждавшихся неполовозрелых животных в сравнении с интактными отмечалось падение уровня тревожности на протяжении 20-ти дней охлаждения. У охлаждавшихся половозрелых самцов выделились несколько этапов изменения уровня тревожности: до 10 дня охлаждения - рост, на 15-й день - уровень тревожности не отличался от показателей интактной группы, к 20-ому дню - уменьшение уровня тревожности.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Динамика посещения животными периферических квадратов в процессе 20-дневного периодического охлаждения.

Условные обозначения: * - статистически значимые различия относительно контрольной группы (*- р < 0,05, **- р > 0,01, *** - р > 0,001).

При расчете коэффициентов исследовательской активности животных у охлаждавшихся половозрелых самцов было отмечено падение уровня исследовательского компонента на 5-е, 10-е и 15-е сутки эксперимента, на 20-й день - возврат показателя к контрольному уровню. У неполовозрелых животных отмечена сходная динамика, но 2-ой и 20-ый дни характеризуются ростом активности охлаждавшихся животных по сравнению с интактным контролем, что может являться следствием возрастных особенностей реагирования молодых животных по сравнению со зрелыми (Peng Y. I., Lin S.H., Chen T.J. et al., 1994). Отмеченное нами ослабевание исследовательской активности во всех группах животных на 5-15-ый дни тестирования, вероятно, связано с привыканием к тесту и исчезновением элемента новизны (Machida T., 1982).

На 20-ый день адаптации у неполовозрелых охлаждавшихся животных на фоне интактной группы произошло увеличение всех исследуемых показателей, кроме количества болюсов, а у половозрелых самцов часть показателей вернулось к контрольному уровню (посещение периферических квадратов, подъем в стойки без опоры на бортик, частота груминговых реакций), часть уменьшилась (длительность латентного периода, количество посещенных норок и количество болюсов). Частота подъема в стойки без опоры на бортик превысила уровень контрольной группы. Выравнивание показателей двигательной активности у охлаждавшихся и интактных животных на 20-ый день может служить доказательством формирования долговременной холодовой адаптации (Гуляева Н.В., 1989), а снижение у охлаждавшихся животных признаков тревоги свидетельствует, вероятно, об отсутствии срыва адаптации (Tang A.C., 2001).

Таблица 1

Динамика показателей сердечной активности при охлаждении половозрелых и неполовозрелых животных, предварительно адаптированных к холоду (M ± m).

Исследуемые показатели	ЧСС (M ± m)	Мода (M ± m)	Амплитуда Моды (M ± m)	Индекс напряжения (M ± m)
Этапы охлаждения адаптированных к холоду животных	Контроль n=10	НП	ПП	НП	ПП	НП	ПП	НП	ПП
		309,8±16,69	326,8±8,39	192,2± 8,75	182,7±5,01	41,5± 4,25	24,3± 1,96	0,0036 ± 0,000553	0,00249 ± 0,000405
	15 минут n=11	365,8±24,63	349,9±14,50	168,8± 12,77	176±13,923	40,9 ± 2,889	23,6± 2,58	0,0031 ± 0,000346	0,00196 ± 0,000385
	30 минут n=11	369,4±17,19*	350,7±23,48	163,5±7,82 *	173,5±10,31	43,5 ± 3,428	33,4± 5,06	0,0036 ± 0,000585	0,00215 ± 0,000385
	45 минут n=9	416,1±23,10 **	348,4± 14,94	148,2±8,07 **	169,1±7,81	41,4 ± 5,703	31,7± 4,21	0,0047 ± 0,000797	0,00203 ± 0,000433
	60 минут n=9	369,2±19,84 *	369,4± 11,01 **	164,5±8,35 *	162,7±4,99 *	37,9 ± 5,053	26,7± 2,95	0,0021 ± 0,000298 *	0,00313 ± 0,000645
	90 минут n=10	384,8±31,52 *	344,1±9,49	163,1±15,40	175,8± 4,94	51,9 ± 7,415	22,7± 2,16	0,0059 ± 0,000703 *	0,00175 ± 0,000308

Условные обозначения: НП - неполовозрелые, ПП - половозрелые; * - статистически значимые различия относительно контрольной группы (*- р < 0,05, **- р > 0,01, *** - р > 0,001).

Возрастные особенности динамики показателей сердечного ритма на ранних этапах охлаждения адаптированных животных. При охлаждении у неполовозрелых животных увеличение ЧЧС происходило уже на 30-ой минуте холодовой экспозиции (р < 0,05) и сохранялась высокой на протяжении всего периода охлаждения (таблица 1), для половозрелых самцов повышение показателя отмечено лишь на 60-ой минуте экспозиции (р > 0,01). Соответственно изменялся и временной промежуток между RR-интервалами (показатель моды). При охлаждении животных обеих возрастных групп изменений амплитуды моды не выявлено, в этих условиях не происходит активации центрального контура управления и, как следствие, стабилизации сердечного ритма, увеличения количества однотипных по длительности интервалов, таким образом, нет признаков развития стрессорной реакции (Баевский Р.М., 2002).

Об активации симпатического отдела нервной системы у адаптированных неполовозрелых крыс говорит рост уровня ИН на 90-ой минуте охлаждения (р < 0,05). У адаптированных половозрелых животных уровень ИН не изменялся в зависимости от длительности холодовой экспозиции.

В опытах Е.В. Курьяновой и соавторов (2006) на неадаптированных половозрелых животных было выявлено, что наиболее показательным критерием стрессорной реакции у впервые охлаждавшихся животных было увеличение ЧСС. При однократном охлаждении животные реагируют значительным увеличением ЧСС (р < 0,001) и уменьшением Моды, эти реакции сохраняются до конца 1,5 часового воздействия. После 20-дневного периодического охлаждения нами был отмечен лишь однократный и менее значительный рост сердечной активности на 60-ой минуте.

Динамика сводобнорадикальных процессов при длительной и срочной адаптации к холоду.

90-минутное охлаждение не вызвало изменения интенсивности ПОЛ в печени предварительно адаптированных животных, но привело к некоторым колебаниям его уровня в миокарде (таблица 2).

Отличия в реакциях ПОЛ отдельных органов могут быть обусловлены различными механизмами адаптации, так по данным Э.Г. Серебрянниковой и Я.И. Векслера (1977) в процессе охлаждения в липидах миокарда усиливается образование ненасыщенных жирных кислот, а в ткани печени на фоне снижения их уровня значительно меняется соотношение отдельных ненасыщенных жирных кислот. Известно, что липиды ткани миокарда более подвержены процессам ПОЛ (Микаелян Е.М., 1987; Pamplona R. at all, 1999). Увеличение выработки АКМ в митохондриях печени в ответ на охлаждение (Swaroop A., 1983), сопровождается увеличением объема удаляемых перекисей (Venditti P., 2004), активизацией ферментов антиоксидантной защиты (Selman C., 2000; Sahinl E., 2004; Venditti P., 2006).

Таблица 2

Динамика интенсивности ПОЛ в печени и сердце адаптированных к периодическому охлаждению животных.

П Е Ч Е Н Ь	Показатели	К. н.а. n=10	Этапы охлаждения адаптированных к холоду животных
			К ад n=10	15 минут n=11	30 минут n=11	45 минут n=9	60 минут n=9	90 минут n=10
	Динамика исходного ПОЛ (нмоль МДА/ 500 мг ткани) (M ± m)	НП	5,12±0,358	4,18±0,238 *	3,97±0,211 *	4,23±0,746	3,81±0,564 *	4,36±0,238 *	4,53±0,238
		ПП	8,71±0,564	8,83±0,981	8,62±0,776	7,04±0,741	7,97±0,994	9,16±0,892	8,51±0,755
	Динамика аскорбатзависимого ПОЛ (нмоль МДА/час) (M ± m)	НП	76,30±3,996	56,38±6,358*	59,33±3,122 **	64,08±5,260	62,44±5,444 *	65,88±5,378	64,16±6,931
		ПП	76,72±4,702	76,79±5,62	66,36±8,492	77,98±6,487	71,92±9,323	72,77±5,445	70,22±6,844
	Динамика спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/час) (M ± m)	НП	27,36±1,814	21,94±2,477	22,15±1,836	21,18±2,734	23,81±1,416	28,61±1,990	25,47±1,509
		ПП	42,79±2,827	40,24±3,987	32,59±4,202	44,74±9,128	32,67±3,812 *	35,99±4,599	35,73±6,059
С Е Р Д Ц Е	Динамика исходного ПОЛ (нмоль МДА/ 500 мг ткани) (M ± m)	НП	2,00±0,145	2,07±0,398	1,95±0,267	2,95±0,483 *	1,78±0,391	2,44±0,382	1,31±0,240 *
		ПП	1,372±0,173	0,881±0,045 *	0,962±0,125	1,328±0,126 ##	0,811±0,038 **	0,997±0,077	0,883±0,038 *
	Динамика аскорбатзависимого ПОЛ (нмоль МДА/час) (M ± m)	НП	47,90±4,588	67,19±11,550	54,44±10,235	76,55±13,898	71,34±10,325	69,04±12,355	36,70±6,224 #
		ПП	13,43±1,552	18,64±2,831	16,72±2,757	18,23±1,542 *	13,10±1,446	13,45±1,635	10,70±1,478#
	Динамика спонтанного ПОЛ (нмоль МДА/час) (M ± m)	НП	3,11±0,590	3,75±0,458	7,88±1,609 # *	12,33±1,966 ### ***	5,27±0,946	17,79±2,216 ### ***	2,95±0,564
		ПП	10,66±1,183	8,14±0,398	6,67±0,489 **	12,53±1,108 #	7,59±0,432 *	8,20±0,390	7,59±0,548 *

Условные обозначения: * - статистически значимые различия относительно контрольной группы неадаптированных животных (* - р < 0,05; ** р<0,01); # - статистически значимые различия относительно группы адаптированных животных (# - р < 0,05, ## - р > 0,01, ### - р > 0,001); ПП - половозрелые животные, НП - не половозрелые животные; К н.а. - не адаптированный контроль, К.а. - адаптированный контроль.

Исследования, проведенные А.П. Божко (1994), позволяют предположить, что значительную роль в защите миокарда от холодового стресса играют не столько активация ферментативного звена АОС, сколько значительное усиление тиреоидной активности, которая зафиксирована у животных, подвергавшихся холодовой адаптации. Установленное при 1,5-часовом охлаждении животных повышение интенсивности ПОЛ в миокарде половозрелых и неполовозрелых животных связано, возможно, с активностью симпатоадреналовой системы (Hаggendal J., 1987).

Динамика ПП ПОЛ в плазме крови при 1,5-часовом охлаждении неполовозрелых адаптированных животных отличается колебаниями: для нее характерен рост ПП ПОЛ на 15-ой, 30-ой и 60-ой и уменьшение на 45-ой и 90-ой минутах охлаждения. Для половозрелых животных динамика ПП ПОЛ имеет следующий характер: значительное увеличение уровня ПП ПОЛ на 30-ой, 45-ой и 60-ой минутах холодовой экспозиции, после чего происходит возврат показателя к контрольным значениям или снижение его уровня. Возможно, это связано с увеличением концентрации свободных жирных кислот, холестерина, фосфолипидов и липопротеидов на начальных этапах охлаждения (Суворов В.В., 2002). В целом у половозрелых животных уровень гидроперекисей выше, чем у неполовозрелых (р > 0,01), что согласуется с результатами А.В. Котельникова (2004). Особенно это характерно для гидроперекисей с изолированными двойными связями.

Данные Е.М. Микаеляна (1987) подтверждают, что наиболее уязвимыми по сравнению с липидами других тканей в процессе адаптации остаются липиды крови в связи с быстрым истощением пула б-токоферола плазмы. Обнаруженное нами снижение уровня ПП ПОЛ в плазме половозрелых животных после 60-ой минуты охлаждения согласуется с данными о состоянии АОС (Дубинина Е.Е., 2001), что нашло отражение и в динамике ПГЭ и уровня продуктов СРО белковых молекул. Обнаружены значительные различия динамики свободнорадикальных процессов у впервые охлаждавшихся животных (Поздняков О.Г., 2003), у которых на первых минутах охлаждения отмечено уменьшение концентрации продуктов ПОЛ и увеличение активности АО ферментов, а к 90-ой минуте происходило увеличение процессов ПОЛ по сравнению с адаптированными.

Тенденция к увеличению уровня ИДС в плазме, выявленная у неадаптированных половозрелых животных (Поздняков О.Г. и соавт., 2004), после 20-дневного периодического охлаждения проявилась в виде роста продуктов ПОЛ уже на 30-ой минуте охлаждения, а с 60-ой минуты - возврата показателя к контрольным значениям. Возможно, реакция тренированных животных была ускорена по времени. Уровень ДК, значительно увеличившийся у неадаптированных животных, у предварительно охлаждавшихся половозрелых самцов к 90-ой минуте достоверно уменьшился относительно контроля. После периодического охлаждения ПП ПОЛ плазмы неполовозрелых животных увеличиваются только в отдельные временные промежутки, в то время, как у охлаждавшиеся впервые неполовозрелых самцов начиная с 15-ой минуты и до конца 1,5-часового охлаждения в плазме отмечен значительный рост ПП ПОЛ.

Полученное в наших опытах увеличение степени ПГЭ у адаптированных животных по сравнению с контрольными может быть следствием различных причин: в результате усиления процессов ПОЛ (Бондаренко Т.И., 1999) и свободнорадикального повреждения биополимеров (Дубинина Е.Е., 1993), перераспределения популяции эритроцитов, характеризующееся преобладанием клеток с уменьшенной стабильностью (Пеннер Ш.Д., 1975), а так же изменения жирнокислотного состава мембран эритроцитов в сторону уменьшения липидного компонента, что вызывает деформацию поверхности мембраны эритроцитов (Линчевская А.А., 1989).

Динамика степени ПГЭ адаптированных животных имеет значительные возрастные особенности: для половозрелых самцов характерно плавное снижение процента гемолизированных эритроцитов, для неполовозрелых - снижение ПГЭ, отмеченное на первых минутах охлаждения, к 60-ой минуте сменяется ростом показателя и возвратом к контрольным значениям.

Различия в реакции половозрелых и неполовозрелых животных на 1,5-часовое охлаждение в наших опытах объясняется, возможно, различными стратегиями компенсаторно-приспособительных реакций. Животные обеих возрастных групп, адаптированных к 20-дневному периодическому охлаждению имели высокий уровень ПГЭ по сравнению с интактным контролем, но неполовозрелые животные, имеющие меньший вес и, как следствие, меньшую возможность к самосогреванию (Гасангаджиева А.Г., 1997), были более подвержены воздействию холода, что, возможно, и привело к более интенсивной реакции уже на первых минутах воздействия.

Рис. 2. Изменение процента ПГЭ при 1,5-часовом охлаждении животных.

Условные обозначения: * - статистически значимые различия относительно контрольной группы адаптированных животных (*- р < 0,05, **- р > 0,01, *** - р > 0,001), К.н.а. - контроль не адаптированный к периодическому охлаждению, К.а. - адаптированный контроль.

Повышение устойчивости эритроцитов неполовозрелых животных, может быть связано с активацией АОС, которое происходит уже на первых минутах охлаждения организма (Donaldson G.C., 1997). У неполовозрелых животных была выявлена отрицательная корреляционная связь показателя стабильности эритроцитов и каталазной активности (r= -0,82).

У половозрелых адаптированных животных на фоне неизменной каталазной активности при 1,5-часовом охлаждении снижение ПГЭ становится статистически значимым на 90-ой минуте воздействия. Значительную роль в этом играет, по-видимости, высокая степень устойчивости эритроцитов взрослых особей, а также повышение уровня неферментативных антиоксидантов.

Динамика уровня окислительно-модифицированных белков в плазме крови под влиянием 1,5-часового охлаждения как у неполовозрелых, так и у взрослых животных регистрировалась нами на фоне их достоверно высокого уровня после предварительной 20-дневной периодической холодовой экспозиции. Динамика модифицированных белков отражает баланс между скоростью окисления и скоростью деградации окисленных белков (Grune T., 2000) и имеет значительные возрастные особенности: у неполовозрелых самцов происходит снижение уровня модифицированных белков уже на первых минутах, а у взрослых животных отмеченный на первых минутах рост продуктов сменяется уменьшением уровня изучаемого показателя.

Таким образом, 20-дневная холодовая адаптация способствовала увеличению процента ПГЭ и повышению уровня окислительно-модифицированных белков в плазме крови в обеих возрастных группах. Уровень ПП ПОЛ не изменился, отмечено снижение концентрации МДА в сердце и печени животных обеих возрастных групп, скорости спонтанного ПОЛ в сердце половозрелых животных и аскорбатзависимого ПОЛ в печени неполовозрелых самцов.

Рассогласование процессов СРО белков и липидов в плазме адаптированных животных связано, вероятно, с мягким режимом охлаждения, что отмечалось в исследованиях В.Э. Цейликмана (2008). Известно, что все органы неодинаково реагируют на охлаждение (Yuksel S., 2008), характер ответа варьирует в зависимости и от режима охлаждения животных (Spasic M.B., 1993). Результаты, полученные нами, позволяют заключить, что после 20-дневной холодовой адаптации животных процессы ПОЛ в обеих возрастных группах либо вернулись к исходному уровню либо стали достоверно ниже уровня контрольной группы неохлаждавшихся животных. Корреляционный анализ позволил установить высокий уровень функциональной взаимосвязи между динамикой ПГЭ и СРО белков: r = 0,81 для неполовозрелых животных и r = 84 для половозрелых самцов. Корреляционная связь между уровнем ПГЭ и СРО белков возможна при активации радикального повреждения биополимеров (Дубинина Е.Е., 1993).

Исследование динамики активации ферментативных антиоксидантов при длительной и срочной адаптации к холоду. После 20-ти дней холодовой экспозиции уровень каталазной активности изменился только в плазме крови половозрелых животных, в эритроцитах дальнейшее охлаждение привело к увеличению активности перекись-утилизирующих ферментов на 15-ой и 30-ой минуте, в плазме - на 30-ой и 90-ой. У неполовозрелых животных увеличение каталазной активности в эритроцитах отмечено лишь на 15-ой минуте, а в плазме крови уровень показателя не изменялся до 90-ой минуты охлаждения.

Таблица 3

Динамика каталазной активности в плазме и эритроцитах при охлаждении неполовозрелых и взрослых самцов крыс, (мКАТ/л*103), M ± m.

	К. н.а. (M ± m) n=10	Этапы охлаждения адаптированных к холоду животных, M±m
		К ад n=10	15 мин n=11	30 мин n=11	45 мин n=9	60 мин n=9	90 мин n=10
НП	Плазма	118,1±24,83	184,6±21,92	218,4± 19,12 *	180,8±25,20	174,0±19,26	116,5±24,89	200,4±40,99
	Эритро-циты	175,6±33,45	160,2±26,60	261,2±16,74 * ##	222,7±32,45	199,5±30,31	168,8±22,01	203,6±24,38
ПП	Плазма	96,70±14,228	50,17±54,559 **	39,96±7,657 **	96,12±18,396 #	63,71±13,458	50,17±6,032 **	118,88±24,551 #
	Эритро-циты	413,49±18,524	483,70±55,153	526,99±12,667 ***	519,95±78,878 ***	425,04±50,377	454,65±40,967	472,98±24,816

Таблица 4

Динамика антиоксидантной активности плазмы крови периодически охлаждавшихся самцов крыс.

		Активность церулоплазмина, Ед. опт. пл. (M ± m)	Активность СОД, % (M ± m)
		Неполовозрелые	Половозрелые	Неполовозрелые	Половозрелые
	К н.а. n=10	0,299±0,0211	0,370 ± 0,0253	44,84±2,244	34,21 ± 2,782
Этапы охлаждения адаптированных к холоду животных	К ад. n=10	0,222±0,02 *	0,416 ± 0,005 *	42,91±2,5	26,96 ± 1,089 *
	15 минут n=10	0,240±0,0133 **	0,415±0,0206	36,96±2,974 *	26,25 ± 3,019
	30 минут n=10	0,241±0,0109 *	0,438±0,0137 **	43,72±1,695	27,96 ± 3,790
	45 минут n=10	0,205±0,0119 **	0,427 ± 0,0304	46,64±1,386	40,54 ± 0,587 * ###
	60 минут n=10	0,247±0,0259	0,432 ± 0,0065 * #	50,20±0,700* #	36,34 ± 1,394 ###
	90 минут n=10	0,248±0,0150	0,436 ± 0,0079** #	51,48±1,416 * #	34,95 ± 1,986 ###

Уровень активности церулоплазмина после адаптации у половозрелых животных значительно возрос (р < 0,05), а у молодых - уменьшился (р < 0,05). Дальнейшее охлаждение привело к росту активности фермента, но лишь у половозрелых крыс это увеличение достигло статистически значимого уровня по сравнению с группой периодически охлаждавшихся животных.

После 20-дневного периодического охлаждения активность СОД в плазме половозрелых животных уменьшилась, но 1,5-часовая холодовая экспозиция адаптированных животных вызвала активацию фермента, особенно выраженную на 45-ой минуте (р > 0,001). У неполовозрелых животных активность СОД также имела тенденцию к увеличению с первых минут охлаждения, но статистически значимым это увеличение становилось к 60-ой минуте охлаждения.

В ответ на охлаждение у половозрелых и неполовозрелых животных происходила активация ферментативного звена АОС, разница проявилась в динамике и интенсивности ответа. Более интенсивная реакция со стороны половозрелых животных может объясняться рядом причин: разной массой животных и, как следствие, разной способностью к самосогреванию. Можно предположить, что более мощная ответная реакция АОС плазмы взрослых животных, в которую вовлечены все ее компоненты, связана с уже сформировавшейся системой антиоксидантной защиты (Gumuslu S., 2001) и произошла на фоне незрелости структур, участвующих в ответе на холодовое воздействие у неполовозрелых самцов

В сравнении в нетренированными животными (Поздняков О.Г., Кондратенко Е.И., 2005) были выявлены следующие отличия, характеризующие уровень приспособительных реакций АОС: нет временных промежутков на которых отмечается уменьшение активности ферментов, основной тенденцией является увеличение изучаемых показателей к 90-ой минуте, после адаптации к холоду у самцов крыс произошло увеличение скорости реагирования АОС.

В исследованиях С.Г. Кривощекова и соавторов (2004) было установлено, что процесс адаптации отличается этапностью: на первом этапе происходит разрушение внутри- и межсистемных связей, а на втором - формирование новых корреляционных взаимодействий. Таким образом, закрепление адаптации появляется в межсистемной координации функций, поэтому формирование новых корреляционных взаимосвязей между процессами свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты, реализующихся в ответ на охлаждение - ключевой момент изменений, произошедших в организме периодически охлаждавшихся половозрелых животных. Подобной консолидации параметров свободнорадикального гомеостаза мы не наблюдали ни у молодых тренированных, ни у впервые охлаждавшихся половозрелых животных.

Значительные изменения в реакциях адаптированных животных по сравнению с впервые охлаждавшимися проявились как на уровне параметров работы сердца, так и в значительных сдвигах ранней динамики свободнорадикального гомеостаза. После периодического 20-дневного охлаждения было отмечено повышение активности отдельных ферментов АОС, снижение активации ЧСС. Изменения в динамике свободнорадикальных процессов имели значительные возрастные особенности. По мере постнатального развития происходит совершенствование и корректировка механизмов адаптации и возрастные различия играют в этом процессе значительную роль. Они проявились и активности ферментативного звена АОС и на уровне процессов СРО. Несмотря на повысившейся уровень показателей свободнорадикальных процессов, половозрелые животные проявляют большую скорость восстановления гомеостаза, что является признаком более развитых регуляторных механизмов, по сравнению с молодыми и неадаптированными животными.

ВЫВОДЫ

Для динамики поведенческих реакций в процессе адаптации к ежедневному периодическому охлаждению характерна общая закономерность вне зависимости от возраста: на первых этапах происходит уменьшение исследовательского компонента, а к 20-ому дню охлаждения - его возвращение к уровню интактных животных.

В изменении ЧСС в ответ на 1,5 часовое охлаждение адаптированных к периодическому холодовому воздействию обнаружены возрастные различия: у неполовозрелых животных отмечена активация ЧСС и рост ИН, у половозрелых животных степень увеличения этих показателей менее выражена. Показатель амплитуды Моды не изменялся в зависимости от длительности охлаждения.

Вне зависимости от возраста после 20-тидневного периодического охлаждения интенсивность окислительной модификации белков плазмы крови и степени ПГЭ значительно увеличивается, а интенсивность ПОЛ в плазме остается на уровне, характерном для неадаптированных животных. Ранняя динамика СРО в крови половозрелых животных, адаптированных к периодическому охлаждению, характеризуются интенсификацией на 30-ой - 60-ой минутах воздействия. К 90-ой минуте интенсивности свободнорадикальных процессов становится ниже контрольного уровня или имеет тенденцию к уменьшению.

Активность антиоксидантной системы после 20-ти дней периодической холодовой экспозиции имеет значительные возрастные различия: у неполовозрелых животных активации ферментов плазмы крови не происходит, у взрослых каталазная активность плазмы крови уменьшается, а активность супероксиддисмутазы и церулоплазмина увеличивается.

У животных в ответ на 1,5-часовое охлаждение происходит активация антиоксидантной системы. У половозрелых животных активность супероксиддисмутазы, церулоплазмина и каталазная активность в плазме достоверно увеличивается в процессе холодового воздействия. На фоне общей тенденции к увеличению активности АОС у неполовозрелых самцов происходит активация СОД в плазме и каталазной активности в эритроцитах на разных этапах охлаждения.

Адаптивные изменения в тканях сердца и печени в процессе 20-дневного периодического охлаждения проявлялись в снижении исходного уровня ПОЛ в сердце и исходного уровня ПОЛ и скорости аскорбатзависимого ПОЛ в печени. 90-минутная холодовая экспозиция адаптированных животных приводит к кратковременной активации ПОЛ только в ткани миокарда.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Позднякова, О.Н. Сравнительный анализ ранней динамики содержания первичных промежуточных продуктов перекисного окисления липидов в плазме крови у крыс [Текст] / О.Г. Поздняков, С.Н. Касимова // Материалы 5-ой научно-практической конференции с международным участием. Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины. - Астрахань - Волгоград - Москва: Издательство Астраханской государственной медицинской академии. - 2006. - С 313 - 317. - 0,31 п.л., личный вклад 33,3%.

Позднякова, О.Н. Динамика активности каталазы в плазме и эритроцитах крови адаптированных к холодовому воздействию крыс [Текст] / О.Н. Позднякова // Свободные радикалы, антиоксиданты и старение: материалы Международной научной конференции. 1-3 ноября 2006 г. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет». - 2006. - С. 105-106. ISBN 5-88200-909-х. - 0,12 п.л., личный вклад 100%.

Позднякова, О.Н. Ранние изменения уровня продуктов перекисного окисления липидов в крови у крыс, адаптированных и неадаптированных к холоду [Текст] / Л.А. Просина, Е.И. Кондратенко, О.Г. Поздняков // Вестник Астраханского Государственного Технического Университета. - 2006. - Т. 32, № 3. - С. 207 - 213. ISSN 1812-9498 (Издание рекомендованное ВАК). - 0,43 п.л, личный вклад 25%.

Позднякова, О.Н. Особенности ориентировочно-исследовательской реакции у крыс в процессе выработки адаптации к холоду [Текст] / Л.А. Просина // Эколого-биологические проблемы бассейна каспийского моря: материалы IX Международной конференции. 10-11 октября 2006 года. - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет», 2006. - С. 184 - 186. ISBN 5-88200-907-3. - 0,18 п.л., личный вклад 50%.

Позднякова, О.Н. Ранние изменения уровня продуктов перекисного окисления липидов в крови и тканях у крыс, адаптированных к холодовому воздействию [Текст] / Л.А. Просина, О.Г. Поздняков, Е.И. Кондратенко, Е.В. Курьянова // Вестник Поморского Государственного Университета. Серия «Естественные и точные науки» - 2006. - № 3. - С. 42 - 45. ISSN 1728-7340. (Издание рекомендованное ВАК) - 0,25 п.л., личный вклад 20%.

Позднякова, О.Н. Динамика процессов перекисного окисления липидов в тканях печени и сердца половозрелых и неполовозрелых крыс, адаптированных к воздействию холодом [Текст] / О.Н. Позднякова // Фундаментальные исследования в биологии и медицине: сборник научных трудов. - Вып. 3. - Ставрополь: Изд-во СевКавГТУ. 2007. - С: 56 - 63. - п.л. 0,5, личный вклад - 100%.

Позднякова, О.Н. Динамика антиокислительной ферментативной активности в крови половозрелых крыс, адаптированных к воздействию холодом [Текст] / Е.И. Кондратенко // Человек и животные: материалы IV Международной научно-практической конференции (г. Астрахань, 15-16 мая 2008 г.). - Астрахань: Издательский дом «Астраханский университет». 2008. - С. 67-70. ISBN 978-5-99-26-0122-0. - 0,25 п.л., личный вклад - 50%.

Позднякова, О.Н., Динамика про- и антиоксидантной активности в плазме половозрелых крыс, адаптированных к воздействию холодом [Текст] / Е.И. Кондратенко, А.Г. Дейнеко // Естественные науки. - 2008. - Том 24, № 3. - С. 67 - 71. ISSN 1818-507х (Издание рекомендованное ВАК). - 0,31 п.л., личный вклад - 33,3%.

Позднякова, О.Н. Динамика процессов перекисного окисления в крови адаптированных к холоду половозрелых самцов крыс [Текст] / О.Н. Позднякова // Ломоносов - 2008: Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых; секция «Биология»; 8-11 апреля 2008 г.; Москва, МГУ имени М.В. Ломоносова, биологический факультет: Тезисы докладов. - М.: МАКС Пресс. - 2008. - С. 18-19. ISBN 978-5-317-02290-7. - 0,12 п.л., личный вклад 100%.

Позднякова, О.Н. Возрастные аспекты ранней динамики ПОЛ в ткани сердца и ВСР у адаптированных к холоду крыс [Текст] / Д.Д. Теплый // Биология - наука XXI века: 12-ая Пущинская научная школа-конференция молодых ученых, (Пущино, 10-14 ноября 2008 года). Сборник тезисов. - Пущино. - 2008. - С. 146 - 147. ISBN 987-5-904201-01-2. - 0,12 п.л., личный вклад - 50%.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АДФГ - альдегид-денитрофенилгидразоны

АКФГ- кетон-денитрофенилгидразоны

АМо - амплитуда моды

АОС - антиоксидантная система

ДК - диеновые коньюгаты

ИДС - промежуточные продукты ПОЛ с изолированными двойными связями

ИН - индекс напряжения

КДСТ - кетодиены и сопряженные триены

МДА - малоновый диальдегид

Мо - мода

ПГЭ - перекисный гемолиз эритроцитов

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПП ПОЛ - промежуточные продукты ПОЛ

СОД - супероксиддисмутаза

СРО - свободно-радикальное окисление

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ЧСС - частота сердечных сокращений

Размещено на Allbest.ru

...