Ростовые процессы в постуральной мышце в условиях гравитационной разгрузки и мышечного напряжения на ее фоне

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ростовые процессы в постуральной мышце в условиях гравитационной разгрузки и мышечного напряжения на ее фоне

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

постуральный мышца гравитационный

Актуальность проблемы

Скелетная мышца ? пластичный орган, что позволяет ей адаптироваться к изменению условий функционирования, воздействующих как на мышцу, так и на организм в целом. Хроническое снижение функциональной нагрузки на постуральные мышцы и, прежде всего, на m. soleus при длительном изменении действия гравитационных сил приводит к глубокой перестройке структурно-функциональной организации мышечной ткани, снижению сократительных возможностей (силы и работоспособности), снижению жесткости мышцы и ее волокон, к уменьшению размеров волокна, объема ядерного и миофибриллярного аппарата, т.е. атрофии [Allen et al.,1996; Falempin et al.,1998; Riley et al., 1990; Wang, 2006 и др. ]. Теоретически масса скелетной мышцы при разгрузке или нагрузке может меняться за счет изменения содержания белка, реализуемого через модуляцию числа миоядер, скорости процессов транскрипции, трансляции и интенсивности протеолиза [Favier et al.,2008].

Настоящая работа включает в себя исследования в области гравитационной физиологии, касающиеся механизмов мышечной пластичности в условиях моделируемой гравитационной разгрузки и мышечного напряжения на ее фоне.

При хроническом пассивном растяжении мышцы достигается длительное искусственное повышение механического напряжения структур мышечных волокон. Оно позволяет предотвратить большинство атрофических проявлений в постуральных мышцах млекопитающих, развивающихся при пребывании в условиях гравитационной разгрузки (уменьшение размеров мышечных волокон, снижение числа миоядер, содержания белка в мышечной ткани, изменение миозинового фенотипа) [Goldspink et al., 1986; Leterme et al., 1994; Немировская и др., 2003]. Пассивное растяжение m. soleus значительно увеличивает скорость синтеза мышечных белков [Goldspink, 1977]. Данные наших исследований свидетельствуют о том, что этот эффект растяжения зависит преимущественно от механизмов, локализованных в самой мышце (а не связан с работой проприоцепторов растяжения) [Nemirovskaya et al., 2002]. Однако клеточные механизмы профилактических эффектов растяжения на фоне функциональной разгрузки остаются в значительной степени неясными.

Поскольку механизмы гипертрофического действия пассивного растяжения интактной мышцы, как правило, идентичны механизмам, обеспечивающим гипертрофический эффект при резистивной физической нагрузке, мы предположили, что эти известные механизмы рабочей гипертрофии обеспечивают также и поддержание массы постуральной мышцы при ее пассивном растяжении на фоне гравитационной разгрузки.

Показано, что при растяжении мышцы происходит экспрессия ростового фактора MGF (сплайс-варианта инсулиноподобного фактора роста IGF-1) [McKoy et al., 1999], который стимулирует пролиферацию резидентных стволовых клеток (клеток-миосателлитов) в мышечной ткани [Adams et al., 1999]. Активация покоящихся миосателлитов, их введение в пролиферативный цикл с последующим слиянием с материнским волокном и увеличением, таким образом, его ядерного пула могла бы играть важную роль в развитии ростовых процессов; однако, нет работ, однозначно доказывающих необходимость включения ядер миосателлитов для поддержания размеров волокон разгруженной мышцы при растяжении.

Недавние работы свидетельствуют о возможной сигнальной роли белка дистрофина в предотвращении активации протеолиза в мышечной ткани при системной кахексии [Acharyya et al., 2005; Glass, 2005]. У мышей mdx с нарушенным синтезом дистрофина не происходит синтез механо-зависимого фактора роста MGF [Goldspink et al., 1996]. Это позволяет предположить, что дистрофин (или комплекс ассоциированных с ним белков) является сигнальным звеном, необходимым для реализации анаболического эффекта пассивного растяжения мышцы.

Известно, что рост мышцы может инициироваться действием IGF-1, а также непосредственным механическим раздражением за счет изменения структуры цитоскелетных белков. Цитоскелет выполняет важнейшие сигнальные функции, и были показаны его изменения при функциональной разгрузке [Lange et al, 2005; Kandarian, 2006 и др.]. Уже в течение первой недели разгрузки при использовании общепринятой модели антиортостатического вывешивания деструкция титина и небулина достигает предельных значений [Подлубная и др., 2006]. В то же время действие пассивного растяжения m. soleus после предшествующей функциональной разгрузки и деструкции цитоскелета в настоящее время не изучено.

Рост мышцы при гипертрофии неизменно сопряжен с активацией процессов синтеза белка на рибосомах [Bodine et al., 2001; Pallafacchina, 2002]. Cущественная роль системы фосфорилирования рибосомальных киназ (Akt/mTOR) была выявлена и при растяжении интактной m. soleus [Aoki et al., 2006]. При этом известно, что при гравитационной разгрузке функция этой системы подавляется [Bodine et al., 2001]. Вклад системы Akt/mTOR в поддержание синтеза белка в постуральной мышце при растяжении на фоне разгрузки также не изучен.

Таким образом, механизмы, запускающие ростовые процессы, лежащие в основе поддерживающего действия пассивного растяжения постуральной мышцы при гравитационной разгрузке, очевидно, отличны от таковых при растяжении интактной мышцы и в настоящее время требуют изучения.

Цель работы состояла в анализе феноменологии и механизмов изменения основных характеристик ростовых процессов в постуральной мышце млекопитающих в условиях моделируемой гравитационной разгрузки, а также разгрузки, сочетанной с хроническим растяжением мышцы.

Задачи работы:

- охарактеризовать основные параметры ростовых процессов в постуральной мышце млекопитающих (размеры волокон, концентрацию белка, состояние ядерного пула и количество клеток-миосателлитов) в условиях моделируемой гравитационной разгрузки и растяжения на фоне гравитационной разгрузки;

- исследовать действие пассивного растяжения на m. soleus крыс после 7 суток моделируемой гравитационной разгрузки;

- оценить роль клеток-миосателлитов в реализации профилактического действия пассивного растяжения m. soleus на фоне разгрузки;

- проверить гипотезу о триггерной роли белка дистрофина в ростовых процессах при растяжении на фоне разгрузки;

- проверить гипотезу об участии системы mTOR (фосфорилирования рибосомальных киназ) в реализации анаболического поддерживающего эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральной мышцы.

Научная новизна работы:

? впервые показано, что пассивное растяжение на фоне вывешивания позволяет предотвратить снижение массы и размеров волокон m. soleus мышей mdx, дефектных по гену дистрофина;

? впервые показано, что пассивное растяжение на фоне вывешивания приводит к резкому усилению процессов пролиферации в m. soleus и увеличивает количество клеток-миосателлитов, экспрессирующих М-кадгерин и NCAM;

? впервые показано, что поддержание площади поперечного сечения мышечных волокон и содержания белка в m. soleus при растяжении на фоне разгрузки происходит также и при дефиците делящихся клеток-миосателлитов, вызванном облучением;

? впервые установлено, что после 7 суток разгрузки (и развившейся некомпенсированной деструкции цитоскелета) профилактический эффект пассивного растяжения m. soleus сохраняется;

? установлено, что профилактический антиатрофический эффект пассивного растяжения m. soleus при вывешивании сохраняется при блокировании протеинкиназы mTOR.

Научная и практическая значимость

Полученные результаты расширяют представление о течении ростовых процессов в постуральной мышце млекопитающих в условиях гравитационной разгрузки и разгрузки в сочетании с пассивным растяжением (моделью эксцентрической нагрузки), а также механизмах, лежащих в основе анаболического эффекта растяжения. Исследование ростовых процессов в постуральной мышце имеет большое практическое значение для оценки эффективности мероприятий, направленных на профилактику атрофии мышц, в том числе - на предотвращение негативного влияния на них невесомости, а также создает предпосылки для совершенствования средств физической профилактики.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Миоядерный пул, клетки-миосателлиты, синтез белка - основные компоненты ростовых процессов в постуральной мышце - демонстрируют значительную редукцию в условиях моделируемой гравитационной разгрузки.

2. Применение пассивного растяжения на фоне гравитационной разгрузки как способа навязать мышце хроническое механическое напряжение приводит к поддержанию или увеличению всех основных компонентов ростовых процессов. Однако вклад каждого из этих компонентов в поддержание мышечной массы в этих условиях неодинаков. Искусственная редукция ядерного пула или снижение числа сателлитных клеток могут быть компенсированы при растяжении другими процессами и не оказывать влияния на поддержание мышечной массы.

3. Интенсификация синтеза белка для поддержания белковой массы мышцы при пассивном растяжении в условиях гравитационной разгрузки осуществляется на основе сигнальных путей, отличающихся от изученных путей, регулирующих рабочую гипертрофию мышцы.

Апробация работы

Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на 35-й и 36-й европейских мышечных конференциях (Гейдельберг, Германия, 2006; Стокгольм, Швеция, 2007); 28-м и 29-м Международных конгрессах по гравитационной физиологии (Сан Антонио, США, 2007; Анже, Франция, 2008); 16-м Международном симпозиуме «Человек в космосе» (Пекин, Китай, 2007); Международном симпозиуме «Биологическая подвижность» (Пущино, 2008); Российско-британском семинаре молодых ученых (Екатеринбург, 2007); 5-ой и 6-ой Конференциях молодых ученых, специалистов и студентов, посвященных дню космонавтики (ИМБП, Москва, 2007-2008).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 13 печатных работ, в том числе 2 статьи в журналах из перечня ВАК

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания организации экспериментов и методик обработки биологического материала, изложения результатов исследования и их обсуждения, общего заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 93 страницах печатного текста, включает 15 рисунков, 5 таблиц и список литературы из 203 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальный материал. В работе были использованы образцы мышечной ткани крыс и мышей, взятые после экспозиции животных в условиях моделируемой гравитационной разгрузки и разгрузки, сочетанной с пассивным растяжением камбаловидной мышцы. Для моделирования микрогравитации применялась модель вывешивания задних конечностей грызунов [Novikov, Ilyin E.A.,1981]. Растяжение экстензоров голени проводили, фиксируя голеностопный сустав в положении тыльного сгибания [Riley et al., 1990].

В экспериментах использовали половозрелых самцов крыс линии Вистар и мышей линии С57 black и mdx, в возрасте 2-х месяцев, выращенных в питомнике ГНЦ РФ-ИМБП РАН. Животных содержали в стандартных условиях. Все процедуры с животными были одобрены Комиссией по биомедицинской этике ГНЦ РФ - ИМБП РАН.

Взятие проб и хранение экспериментального материала.

После эвтаназии животных методом введения летальной дозы нембутала (70 мг/кг внутрибрюшинно) m. soleus обеих конечностей освобождали от соединительной и жировой ткани, из центральной ее части вырезали кусочки длиной 0,5 см, разрезали поперек, помещали на картон, покрывали средой для заключения Tissue Tek (O.C.T.^TM Compound 4583) и замораживали в изопентане, охлажденном в жидком азоте. Пробы хранили при - 80° C вплоть до обработки.

Определение общего белка в мышечной ткани

Камбаловидную мышцу гомогенизировали в 10 объемах лизирующего буфера и растворяли 1:1 в 2N NaOH при 37^оС в течение 30 мин [Goto et al., 2004]. Концентрацию белка в гомогенате определяли с помощью реактива Bredford (Bio Rad, Hercules, CA) и медицинского фотометра Пикон. По данным колориметрии рассчитывали процент общего белка в мышце.

Для иммуногистохимического анализа делали поперечные срезы мышечной ткани толщиной 10 мкм при -20С в криостате фирмы Leica. Срезы располагали на покрытых адгезивом гистологических стеклах. Иммуногистохимическое окрашивание включало следующие основные этапы: фиксация срезов и блокирование в нормальной сыворотке для предотвращения неспецифического связывания антител, инкубация с первичными антителами к исследуемому белку, инкубация с вторичными антителами, конъюгированными с флуоресцентной или пероксидазной меткой, при пероксидазном мечении - проявление окраски с помощью раствора диаминобензидина и перекиси водорода. Все этапы реакции проводились во влажной камере, после каждого этапа проводилась трехкратная пятиминутная отмывка препарата в PBS. При флуоресцентном мечении препараты заключали в среду, стабилизирующую флуоресцентную метку (Fluoromount-G), при пероксидазном - обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации и заключали в канадский бальзам.

Окрашивание против тяжелых цепей миозина

Инкубацию срезов мышечной ткани с первичными антителами против быстрых или медленных изоформ тяжелых цепей миозина проводили при температуре 37С в течение 60 мин, со вторичными антителами, конъюгированными с FITC,- в течение 60 мин в темноте при комнатной температуре.

Окрашивание против дистофина (утрофина у mdx мышей) и выявление миоядер

Волокна контурировали антителами к субсарколеммальному белку дистрофину с одновременным окрашиванием ядер. Для предотвращения неспецифического связывания вторичных антител срезы мышечной ткани блокировали в течение 45 мин при комнатной температуре с антителами козы против иммуноглобулинов мыши. Срезы инкубировали с первичными антителами против дистрофина или утрофина (для mdx мышей) при температуре 37С в течение 60 мин. Использовали вторичные антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с флуоресцентной меткой FITC или Alexa, в темноте при комнатной температуре в течение 60 мин. На заключительном этапе реакции срезы инкубировали в течение 10 мин с DAPI в концентрации 1-2 мкг/мл для окраски миоядер.

Окрашивание на 5'-бром,- 2'- дезоксиуридин (BrdU) - выявление ядер делящихся клеток

Срезы мышц фиксировали в спиртовом растворе уксусной кислоты (90 % этанола, 5 % уксусной кислоты, 5 % воды) в течение 30 мин, после чего промывали в PBS. Cрезы блокировали в течение 45 мин антителами против иммуноглобулинов мыши. После этого наносили раствор нуклеазы с мышиными моноклональными антителами против BrdU (Amersham Bioscienses) и инкубировали 1 час при 37С. Срезы инкубировали при комнатной температуре в течение часа в биотинилированных овечьих антителах против иммуноглобулинов мыши (в разведении 1:200), а затем в течение 30 мин в стрептавидине, конъюгированном с пероксидазой хрена (1:100) (Amersham Bioscienses). Реакцию проявляли раствором DAB в PBS с 3% перекисью водорода.

Выявление клеток-миосателлитов

- Окрашивание на NCAM (CD 56) Блокирование проводили в 2% нормальной сыворотке, инкубацию с первичными антителами против CD 56 (Becton Dickinson) проводили в течение 2 часов при 37С. Инкубацию с вторичными антителами и проявление проводили как при окраске на BrdU. На заключительном этапе срезы окрашивали в течение 1 мин гематоксилином (для обнаружения ядер).

- Окрашивание на М-кадгерин Мышечные срезы фиксировали в 4% растворе параформальдегида в PBS 15 мин, затем отмывали. Срезы блокировали в течение 40 мин в 5% блокирующей сыворотке (Horse serum, Novocastra) содержащей 1% Triton X-100. Затем срезы инкубировали в первичных антителах против M-cad, разведенных в блокирующей сыворотке с добавлением 0,3% Triton X-100 при +4 ^оС в течение 15 часов. Были использованы первичные антитела goat monoclonal anti M-cadherin sc-6740 (Santa cruz). Вторичные антитела - rabbit anti goat FITC-conjugated (Имтек) разводили в PBS (1:150) с добавлением 5% блокирующей сыворотки и 0,1% Triton X-100 при комнатной температуре в темноте в течение часа. Для окрашивания ядер применяли DAPI.

Анализ полученных препаратов

Препараты фотографировали при 40-кратном увеличении с использованием флуоресцентного микроскопа фирмы Leica (Германия), снабженного цифровой видеокамерой Leica DC 300F. Все измерения проводили на фотографиях с помощью программного обеспечения Leica. При определении площади поперечного сечения мышечных волокон (ППС МВ) анализировали не менее 100 МВ, при измерении периметра и числа миоядер, количества ядер c включенным BrdU - не менее 200 МВ, при подсчете относительного содержания быстрых и медленных изоформ ТЦМ - не менее 500 МВ. При подсчете сателлитных клеток анализировали все волокна на срезе. Считали число меченных М-кадгерином или NCAM ядер, приходящихся на одно мышечное волокно.

Для визуализации окраски на дистрофин или ядра использовали соответствующие флуоресцентные фильтры. Фотографии одного поля зрения накладывали одну на другую в Adobe Photoshop, полученные изображения использовали для анализа. Все ядра, находящиеся в пределах области, ограниченной продуктами иммуногистохимической реакции, считали миоядрами. По этим же срезам рассчитывали среднюю ППС мышечных волокон. Рассчитывали число миоядер на одно МВ, число миоядер на 1 мм периметра волокна, среднюю ППС на одно миоядро, количество миоядер на длину сегмента МВ, объем цитоплазмы, приходящийся на 1 миоядро. Количество миоядер на длину сегмента МВ вычисляли по формуле X = NL/ (l+d), где Х - количество миоядер на сегмент МВ, N - число миоядер в волокне на его поперечном срезе, L - длина сегмента (принятая 1 мм), l - толщина среза и d - длина миоядра, равная 13, 4 мкм для m. soleus крысы [Schmalbruch еt al.,1977]. Объем цитоплазмы, приходящийся на 1 миоядро (Y), рассчитывали по формуле Y = (C L) / X, где C - ППС МВ, L - длина сегмента (1 мм), Х - количество миоядер на сегмент МВ [Rosser et al., 2002].

Статистическая обработка данных выполнена на персональном компьютере с использованием программ Excel и SigmaPlot. Различие средних значений показателя в сравниваемых выборках считали значимым при уровне значимости p?0,05. Результаты представлены в виде M±m.

РЕЗУЛЬТАТЫ ЭКСПЕРИМЕНТОВ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Ростовые процессы в постуральной мышце при гравитационной разгрузке и растяжении на фоне гравитационной разгрузки

После двухнедельного вывешивания мышей и крыс наблюдалась потеря массы m. soleus и почти в два раза сократилась ППС медленных волокон (рис. 1а). Аналогичные изменения в постуральных мышцах были неоднократно показаны после космических полетов и при наземном моделировании [Riley et al., 1990; Adams et al., 2003].

Известно, что пассивное растяжение постуральной m. soleus позволяет в значительной степени предотвратить развитие атрофических изменений при моделировании гравитационной разгрузки [Nemirovskaya et al., 2002; Riley et al., 1990 Goldspink et al., 1986; Leterme et al., 1994]. И в нашем эксперименте пассивное растяжение позволило полностью предотвратить 50% снижение сырого веса и ППС МВ камбаловидной мышцы, вызванное вывешиванием.

Уже после 14 суток вывешивания абсолютное содержание белка в m. soleus снизилось более чем вдвое по сравнению с контролем и продолжало снижаться с увеличением продолжительности вывешивания (рис. 1б). Уменьшение абсолютного содержания белка в m. soleus при гравитационной разгрузке без изменения относительного содержания было ранее установлено в работе Goto [Goto et al., 2004].



Рис. 1. Площадь поперечного сечения мышечных волокон крыс (мкм ² ) и содержание белка в m. soleus при растяжении на фоне вывешивания

Растяжение на фоне разгрузки в течение 14 дней позволяет поддерживать содержание белка в m. soleus на уровне контрольных животных. В группах с растяжением m. soleus абсолютное содержание белка в мышце было достоверно выше, чем у животных вывешенных групп. Из литературы [Lougna et. Al, 1986; Cox et al., 2000] известно, что при растяжении, по сравнению с контролем, на 59% увеличивается скорость синтеза белка, что в сочетании с повышенным распадом приводит к существенному сокращению атрофии, вызванной вывешиванием. Было показано [Goldspink, 1977; Jaspers et al., 1988], что растяжение на фоне вывешивания предотвращает ингибирование белкового синтеза и утилизации аминокислот в m. soleus. Среди возможных механизмов, лежащих в основе увеличения интенсивности синтеза белка при растяжении, особое внимание привлекает возможность активации покоящихся резидентных стволовых клеток (клеток-миосателлитов), их введения в пролиферативный цикл с последующим слиянием с материнским волокном и увеличения, таким образом, его ядерного пула.

Процессы атрофии при разгрузке, напротив, сопровождаются уменьшением миоядерного числа, т.е. количества миоядер, приходящихся на поперечное сечение мышечного волокна. В нашем эксперименте в результате вывешивания миоядерное число в m. soleus снизилось примерно на 30% (рис. 2а).



Рис. 2.Количество миоядер и ядерный домен в волокнах m. soleus крыс при разгрузке и растяжении на фоне разгрузки

И другими авторами [Mitchell, Pavlath, 2001; Allen et al., 1997] также было показано, что уменьшение ППС МВ при вывешивании сопровождается сокращением числа миоядер, приходящихся на 1 мышечное волокно. Поскольку снижение миоядерного числа наблюдается при атрофии, вызванной изоляцией поясничного отдела спинного мозга [Allen et al., 1985], пребыванием в условиях космического полета [Allen et al., 1996; Hikida et al., 1997], а также хронической денервацией [Rodrigues, Schmalbruch, 1995], можно предположить, что уменьшение числа миоядер (вследствие апоптоза) в определенной степени может обусловливать атрофические процессы [Ohira et al., 1992, Allen et al., 1995].

Как и в других исследованиях [Ohira et al., 2002], в настоящей работе было обнаружено более глубокое уменьшение площади поперечного сечения волокон при вывешивании, чем уменьшение миоядерного числа. Это находит свое выражение в уменьшении площади поперечного сечения волокна, приходящейся на одно миоядро (ядерного домена). Размер ядерного домена уменьшился примерно на треть в результате вывешивания (рис. 2б). Это может свидетельствовать о более глубоком уровне распада цитоплазматических белков по сравнению с деградацией ядерных структур.

В настоящей работе мы обнаружили эффективное поддержание всех основных параметров, характеризующих состояние мышечной массы, а также предотвращение снижения миоядерного числа и поддержание размеров ядерного домена при сочетании разгрузки с пассивным растяжением мышцы. Количество миоядер в волокне могло бы поддерживаться ядрами, поступающими в волокно при слиянии с ним миосателлитных клеток. При размножении они могут сливаться друг с другом и с мышечными волокнами, способствуя мышечному росту [Schultz, McCormick, 1994], репарации и регенерации [Grounds, 1998; Russel, 1992]. В то же время, не исключено, что при растяжении уменьшена интенсивность апоптотических процессов и механизмы, обеспечивающие поддержание ядерного пула и размеров ядерного домена при растяжении, действуют внутри самого мышечного волокна.

Наши результаты свидетельствуют о значительном снижении пролиферации клеток-сателлитов при вывешивании (рис.3), что было и ранее показано в работе [Darr et al., 1989].

Рис. 3.Иммуногистохимическое мечение ядер пролиферирующих клеток (включение BrdU) в m. soleus мышей С57 black; а- «Контроль», б-«Вывешивание», в- «Вывешивание с растяжением».

Количество делящихся ядер (с включенным BrdU) после вывешивания мышей линии С57 black снизилось на 67% по сравнению с контрольной группой. Растяжение m.soleus на фоне вывешивания резко активизирует пролиферативные процессы, о чем свидетельствует пятикратное увеличение числа ядер с включенным BrDU по сравнению с группой без растяжения, причем интенсивность пролиферации почти вдвое превосходит таковую в контроле (рис.3). В настоящем исследовании мы обнаружили достоверное снижение количества клеток-миосателлитов, меченных M-кадгерином, в результате 14-суточного вывешивания (рис. 4).

Такое уменьшение было показано и ранее [Wang et al.,2006]. Однако нам впервые удалось обнаружить, что уменьшение клеточного пула миосателлитов при вывешивании происходит, главным образом, за счет клеток, не реагирующих с антителами против NCAM, т.e. в условиях разгрузки гибнут лишь молодые клетки-миосателлиты, находящиеся на этапе пролиферации. В пользу этого предположения свидетельствуют и результаты работы Ishido с соавторами [Ishido et al., 2006], где в период после функциональной перегрузки в m. plantаris происходит существенное увеличение количества сателлитных клеток, экспрессирующих M-сad, но не реагирующих с антителами к NCAM, т.е. идут активные пролиферативные процессы в мышечной ткани.

Рис. 4. Клетки-миосателлиты в m. soleus крыс при разгрузке и растяжении на фоне разгрузки

У животных, подвергнутых растяжению m. soleus на фоне разгрузки, мы не только не выявили какого-либо снижения числа миосателлитов, но обнаружили значительное повышение их количества, примерно в 2-2,5 раза по отношению к контрольной группе (рис.4). Повышение происходило за счет обеих клеточных популяций: как меченных NCAM, так и не меченных NCAM клеток. Эти данные хорошо согласуются с увеличением числа клеток, меченных BrDU, при растяжении m. soleus мышей на фоне вывешивания.

Увеличение пролиферации клеток-миосателлитов при растяжении мышцы было ранее показано различными авторами [Darr, Schultz, 1987; Winchester et al., 1991; Carson et al., 1996], однако, в наших исследованиях этот феномен был впервые продемонстрирован для m. soleus, растянутой в условиях гравитационной разгрузки. При обсуждении данного явления рассматриваются лишь два возможных механизма, ответственных за интенсификацию пролиферации клеток-миосателлитов в условиях растяжения мышцы. Это NO-зависимый механизм активации миосателлитов посредством повышенной экспрессии фактора роста гепатоцитов (HGF) [Tatsumi et al., 2006] и механо-зависимое повышение экспрессии инсулин-подобного фактора роста (IGF1) и его сплайс-варианта - MGF [Hill, Goldspink, 2003; Machida, Booth, 2004]. В отличие от экспериментов с активно работающими пассивно растянутыми мышцами [Loughna et al., 1992; Yang et al., 19977], в нашей лаборатории [Turtikova et al., 2008] не удалось обнаружить повышенного уровня экспрессии IGF-1 после 14 дней растяжения на фоне гравитационной разгрузки, при этом у части животных были обнаружены следы некоторого повышения продукции мРНК MGF, паракринного сплайс-варианта IGF-1. Мы предполагаем, что именно секреция MGF является стимулом для усиления пролиферации клеток-миосателлитов, но их слияния (поддержания миоядерного пула волокна) не происходит вследствие отсутствия изменения секреции IGF-1. Отсутствие увеличения экспрессии IGF-1 при пассивном растяжении мышцы на фоне вывешивания животного может быть еще одним свидетельством того, что клеточные механизмы, лежащие в основе ростовых процессов в растянутой мышце на фоне гравитационной разгрузки, отличаются от таковых, характерных для растянутой мышцы активного животного.

Таким образом, в настоящем исследовании у вывешенных животных наблюдали основные проявления гипогравитационной атрофии m. soleus: уменьшение массы мышцы, размеров мышечных волокон, снижение абсолютного содержания белка, сопровождавшиеся значительным снижением миоядерного числа и уменьшением пула миосателлитов. Вывешивание подавляет пролиферативную активность в камбаловидной мышце. Растяжение на фоне вывешивания полностью предотвращает атрофию m. soleus, изменения миоядерного пула и стимулирует увеличение количества клеток-миосателлитов.

2. Изучение механизмов профилактического действия пассивного растяжения m. soleus на фоне гравитационной разгрузки

2.1. Изучение вклада клеток-предшественников в поддержание морфологических характеристик m. soleus крыс при пассивном растяжении мышцы на фоне разгрузки

Для выяснения роли клеток-предшественников в ростовых процессах в m. soleus проводили растяжение на фоне разгрузки m. soleus интактных крыс и крыс, предварительно локально облученных в области голени ионизирующей радиацией в дозе, приводящей к деструкции пролиферирующих миосателлитов, не вызывая видимых повреждений мышечных волокон [Adams G.R., 2002].

Перед началом эксперимента животные были рандомизированы и поделены на 6 групп. Каждая группа кроме группы «Облучение» состояла из 7 животных. В группе «Облучение» было 8 животных. Продолжительность эксперимента составила 14 суток. Животные группы «Контроль» (С) в течение эксперимента находились в клетках в виварии. Голени крыс группы «Облучение» (I) за 5 дней до начала эксперимента облучали локально дозой в 2500 рад в течение 15 мин. Все последующее время животные находились в виварии. Животные группы «Вывешивание» (HS) были вывешены в течение всего эксперимента. Голени крыс группы «Вывешивание + облучение» (IHS) облучали также за 5 дней до вывешивания. Животных группы «Растяжение» (HSS) вывешивали с иммобилизацией голеностопных суставов обеих задних конечностей под углом 35^о при помощи гипсовой повязки в положении тыльного сгибания. Голени животных группы «Растяжение + облучение» (IHSS) облучали, затем животных вывешивали с иммобилизацией голеностопных суставов.

Наш эксперимент продемонстрировал, что облучение не препятствует эффекту хронического растяжения по поддержанию ППС МВ на фоне вывешивания. В группе «Растяжение» количество миоядер на поперечный срез одного мышечного волокна (миоядерное число) поддерживалось на уровне контроля, не превышая значений контрольных животных. После облучения наблюдалось снижение миоядерного числа по сравнению с аналогичными необлученными группами. При этом количество миоядер в группе «Вывешивание + облучение + растяжение» снизилось в 2 раза по сравнению с аналогичной необлученной группой (табл. 1).

Таблица 1.Параметры,характеризующие изменение ядерно-плазменного соотношения в m. soleus крысы

	Контроль	Облуч.	Вывешив.	Обл..+выв.	Выв.+раст.	Обл.+вывеш. +раст
ППС МВ, кв.мкм	2451±101	2530±114	1223±53*	1158±70 @	2660±240	2682±191
Миоядер /волокно	2,39±0,18	2,02±0,07	1,85±0,13*	1,31±0,07 #	2,03±0,11	1,07±0,16 $
ППС/миоядро	1053±76	1290±71	674±45*	887±50 @#	1308±87 #	2737±355#$

ППС МВ - площадь поперечного сечения мышечных волокон, ППС/ миоядро - ППС (кв. мкм), приходящаяся на одно миоядро. *, @, #, $ - достоверные отличия от групп

“Контроль”, “Облучение”, “Вывешивание”, “Вывешивание.+растяжение” соответственно (P < 0. 05).

Ранее была продемонстрирована необходимость миосателлитов для развития мышечной гипертрофии [Rosenblatt и Parry, 1992; Adams et al., 2002]. Применительно к гравитационной разгрузке было показано, что облучение приводит к неполному восстановлению мышц после атрофии, вызванной вывешиванием [Mitchell, Pavlath, 2001]. В то же время в эксперименте Lowe и Alway по растяжению облученных мышц крыльев японских перепелов размножение миосателлитов ингибировалось, однако гипертрофический эффект растяжения снижался незначительно [Lowe, Alway, 1999], т.е. гипертрофия, вызванная растяжением, развивалась даже в отсутствие делящихся миосателлитов. Некоторые авторы отрицают необходимость инкорпорации ядер миосателлитов в развитии мышечной гипертрофии [Kadi et al., 2004]. Данные Kadi с соавт. свидетельствуют о том, что умеренные изменения размеров мышечных волокон могут происходить без добавления новых миоядер.

По-видимому, механизмы поддержания мышечной массы при растяжении отличны от таковых при развитии рабочей гипертрофии. Основываясь на наших результатах и литературных данных, можно предположить, что количество ядер не является существенным фактором также и для поддержания размера МВ при растяжении разгруженной мышцы. При растяжении мышцы на фоне гравитационной разгрузки размеры ядерного домена достигают контрольных значений, а поддержание размеров МВ при растяжении на фоне облучения, сопровождаемое возрастанием миоядерного домена, можно объяснить интенсификацией процессов белкового синтеза в МВ.

Таким образом, нами показано, что растяжение m. soleus крыс на фоне гравитационной разгрузки не приводит к изменению в ней количества миоядер, т.е. несмотря на интенсивную пролиферацию, не происходит слияния миосателлитов с мышечными волокнами. Облучение дозой, подавляющей пролиферативные возможности клеток, уменьшает число сателлитов, но не снижает при этом проявления противоатрофического действия растяжения.

2.2. Выяснение роли белка дистрофина в реализации анаболического эффекта пассивного растяжения разгруженной постуральной мышцы

В последние годы появились данные о важной сигнальной роли белка дистрофина в понижающей регуляции сигналов, запускающих протеолиз в мышечной ткани при системной кахексии [Glass, 2005; Acharyya et al., 2005]. У мышей mdx с нарушенным синтезом дистрофина не происходит синтез механо-зависимого фактора роста MGF [Goldspink et al., 1996]. Мы предположили, что дистрофин (или комплекс ассоциированных с ним белков) определенным образом сдерживает развитие атрофии также и при функциональной разгрузке.

Мы провели растяжение m. soleus мышей, у которых отсутствует дистрофин (мыши линии mdx). В течение всего эксперимента животные группы «Контроль С57black - СС» (n=7) и группы «Контроль mdx - МС» (n=6) находились в виварии в стандартных условиях кормления и содержания. Животные группы «Вывешивание С57black - CHS» (n=7) и группы «Вывешивание mdx - MHS» (n=6) находились в состоянии антиортостатического вывешивания.

Животные групп «Вывешивание на фоне растяжения С57black - CHSt» (n=7) и «Вывешивание на фоне растяжения mdx - MHSt» (n=6) были вывешены с одновременным растяжением m. soleus. Для обнаружения пролиферирующих клеток за день до завершения эксперимента животным был внутрибрюшинно введен BrdU (5'-бром,- 2'- дезоксиуридин) в дозе 100 мг на кг массы. Животных забивали методом цервикальной дислокации на 21-е сутки эксперимента.

После вывешивания масса мышцы достоверно уменьшалась на 43% у мышей С57 black и на 51 % у мышей mdx. Растяжение на фоне вывешивания приводило к восстановлению массы m.soleus. Достоверных отличий по массе мышцы у контрольных животных и у животных этой же линии после вывешивания с растяжением не наблюдалось (табл.2)

Таблица 2 Вес животных, вес m. soleus , размеры МВ и миоядерное число у мышей различных групп

Группа	Масса животных по окончании эксперимента, г	Масса вес m.soleus, мг	Средняя ППС МВ, кв. мкм	Число миоядер на поперечный срез МВ
«Контроль»	26,0±1,9	5,6±0,2#	1431±132	1,15±0,12
«Контроль mdx»	30,3±1,5	8,1±0,4 *	1513±123	0,90±0,06
«Вывешивание»	22,5±0,5	3.2±0.5 *	586±37*	0,75±0,08*
«Вывешивание mdx»	26,8±0,9	4.0±0.3 #	630±64#	0,69±0,12
«Вывеш.+растяж.»	21,1±0,8	5.0±0.6 @	969±44*	1,11±0,14
«Вывеш.+растяж. mdx»	22,5±1,0	7.4±1.1 $ &	1270±198	0,92±0,05

*- достоверные отличия от группы CC, # - от группы MC, @ - от группы CHS, $ - от группы MHS, & - от группы CHSt ( P < 0,05).

Степень редукции площади поперечного сечения волокон m. soleus у мышей с нормальным и отсутствующим дистрофином при гравитационной разгрузке отличалась незначительно (табл. 2). Обращает на себя внимание тот факт, что степень снижения миоядерного числа и площади поперечного сечения, приходящейся на одно ядро, оказывается весьма сходной у животных обеих линий. Т.е. можно предположить, что отсутствие нормального дистрофина не оказывает значительного влияния ни на ядерную, ни на цитоплазматическую составляющую атрофического процесса. Таким образом, предположение о роли дистрофина в негативной регуляции атрофических сигнальных механизмов в скелетной мышце не находит своего подтверждения в отношении атрофии, развивающейся при гравитационной разгрузке. Такой вывод вполне согласуется с данными лаборатории S. Kandarian о принципиальных отличиях NF-kB-зависимых сигнальных процессов, приводящих к усилению экспрессии ферментов убиквитин-протеосомного цикла, при вывешивании и при системной кахексии [Hunter et al., 2002; Kandarian, Stevenson, 2006].

2.3. Эксперимент с хроническим введением рапамицина - ингибитора mTOR на фоне вывешивания с растяжением

Основываясь на данных литературы о том, что увеличение синтеза белка на рибосомах через систему mTOR является основным механизмом роста мышечной массы при гипертрофии [Bodine et al., 2001; Hornberger et al., 2004; Spangenburg et al., 2006 и др.], мы предположили, что этот же механизм лежит в основе анаболического действия хронического пассивного растяжения на фоне разгрузки. Для выяснения роли этой системы в поддержании массы разгруженной мышцы при растяжении мы применили блокатор киназы mTOR при растяжении на фоне вывешивания. В эксперименте использовали 28 самцов крыс линии Wistar (по 7 животных в каждой из экспериментальных групп). Вывешивание или вывешивание с растяжением крыс проводилось в течение 14 дней. Животные группы «Контроль» (С) в течение всего эксперимента находились в условиях обычного содержания, группы «Вывешивание» (HS) - в течение 14 дней находились в состоянии антиортостатического вывешивания, группы «Вывешивание + растяжение» (HSS) в течение 14 дней находились в состоянии вывешивания с иммобилизацией голеностопных суставов (см. п. 2.1.). Животные группы «Вывешивание+растяжение+рапамицин» (HSSR) в течение 6 дней до начала вывешивания ежедневно получали рапамицин в виде внутрибрюшинных инъекций в дозе 5 мг/кг массы тела, а затем были вывешены с иммобилизацией голеностопных суставов, как в группе «Вывешивание + растяжение». В течение всего периода вывешивания животным ежедневно вводили рапамицин внутрибрюшинно в дозе 1,5 мг на килограмм массы тела. Крысам остальных групп делали внутрибрюшинные инъекции 5% диметилсульфоксида в физрастворе.

При применении блокатора системы mTOR рапамицина было показано, что абсолютное содержание белка в m. soleus не отличалось у крыс группы «Вывешивание+растяжение+рапамицин», крыс группы «Вывешивание+растяжение» и у животных контрольной группы, вес m. soleus в группе «Вывешивание+растяжение+рапамицин» не отличался от контроля (рис. 5). ППС медленных волокон животных группы «Вывешивание +растяжение+рапамицин» оказалась достоверно ниже (на 20%), чем в аналогичной группе без рапамицина, в то время как ППС быстрых волокон достоверно не отличалась ни от одной из экспериментальных групп. При этом ППС волокон (как быстрых, так и медленных) у животных вывешенных с растяжением мышцы с применением рапамицина достоверно не отличалась от значений интактного контроля.

Рис. 5 Площадь поперечного сечения мышечных волокон (мкм ²) и содержание белка в m. soleus крыс при растяжении на фоне вывешивания с применением рапамицина

Таким образом, наши данные указывают на несостоятельность гипотезы о ключевой роли системы mTOR в поддержании массы m. soleus при пассивном растяжении на фоне разгрузки. В то же время в работе Aoki [Aoki et al., 2006] была установлена существенная роль mTOR системы в реализации ростовых процессов в m. soleus при растяжении. Отличие нашего эксперимента от работы Aoki состоит в применении моделируемой гравитационной разгрузки (вывешивания) и более длительном сроке растяжения (14 дней против 10-ти в работе Aoki). По-видимому, гравитационная разгрузка в данном случае является определяющим фактором, ответственным за изменение сигнальных механизмов, обеспечивающих рост мышцы. В связи с полученными в нашем эксперименте результатами интересны работы Fluckey [Fluckey et al., 2004], в которых у вывешенных животных (в отличие от контрольных) в присутствии ингибитора mTOR инсулин восстанавливает уровень синтеза белка до уровня животных, вывешенных без применения ингибитора. Это указывает на существование альтернативных путей, влияющих на синтез белка при вывешивании. Авторы делают вывод о том, что при вывешивании происходит уменьшение вклада рапамицин - зависимых механизмов в поддержание белкового синтеза. Поскольку в наших экспериментах профилактический антиатрофический эффект пассивного растяжения m. soleus при вывешивании сохранялся при блокировании mTOR системы, мы склонны считать, что он в большей степени обусловлен рапамицин-независимыми альтернативными механизмами. Не следует исключать возможности, что каскад сигнальных реакций, происходящих вследствие активации системы Akt-mTOR при растяжении на фоне разгрузки, может вообще не выполнять своей функции по активации синтеза белка вследствие высокого уровня протеолиза при растяжении на фоне разгрузки и деградации основной регуляторной субъединицы трансляционного фактора EIf3. [Loughna et al., 1986].

2.4. Роль напряжения цитоскелетных структур в инициации анаболических процессов при растяжении на фоне разгрузки

После недели антиортостатического вывешивания деструкция цитоскелетных белков титина и небулина достигает предельных значений, а при пассивном хроническом растяжении мышцы снижение содержания цитоскелетных белков предотвращается [Подлубная З.А., 2004]. Поскольку при деструкции титина инициируется протеолиз [Lange, 2005], мы предположили, что создание пассивного растяжения после 7-10 суток разгрузки (и соответствующей некомпенсированной деструкции цитоскелета) должно

привести к меньшему анаболическому эффекту, чем при использовании растяжения инактивированной мышцы без предшествующей функциональной разгрузки. В эксперименте использовали 35 самцов крыс линии Wistar (по 7 животных в каждой из пяти экспериментальных групп). Животные группы «Контроль» (С) находились в обычных клетках в виварии в течение всего эксперимента. Животных группы «Вывешивание 14 дней» (HS 14) вывешивали в течение 14 дней. Крысы группы «Вывешивание 7 дней» (HS7) в течение 7 дней находились в виварии, а затем их вывешивали в течение 7 дней. Животные группы «Вывешивание 7 дней + растяжение 7 дней» (HSHSS) были вывешены в течение 7 дней, после этого обе их тазовые конечности были иммобилизированы при тыльном сгибании голеностопного сустава в течение 7 дней. Крысы группы «Растяжение 7 дней» (CHSS) находились в виварии в течение 7 дней, а затем были вывешены с растяжением и иммобилизацией обеих тазовых конечностей. На 15-й день эксперимента животных забивали внутрибрюшинной инъекцией нембутала.

Рис. 6Площадь поперечного сечения мышечных волокон и содержание белка в m. soleus крыс при вывешивании и растяжении после предшествующей функциональной разгрузки

Растяжение на фоне вывешивания уже в течение 7 дней способствовало росту мышцы и возвращало на контрольный уровень ППС мышечных волокон, атрофия которых была вызвана предшествующей функциональной разгрузкой (рис.6). В группах животных, где применялось растяжение m. soleus c предшествующей разгрузкой или без нее, абсолютное содержание белка в мышце достоверно выше, чем у животных вывешенных групп и поддерживается на уровне контроля. Площадь поперечного сечения мышечных волокон у животных группы «Вывешивание 7 дней + растяжение 7 дней» также не отличается от показателей контрольной группы.

Аналогичных работ по растяжению m. soleus после предшествующей функциональной разгрузки в литературе не отмечено, однако, описаны данные об эффективности перемежающейся кратковременной нагрузки в режиме ходьбы для предотвращения атрофии m. soleus при вывешивании [Pierotti et al., 1990]. Перемежающаяся резистивная нагрузка, применяемая у крыс через день с определенным протоколом с четвертого дня разгрузки, также предотвращает снижение массы мышцы и поддерживает синтез белка на уровне, близком к контрольному [Fluckey et al., 2004]. Таким образом, несмотря на предшествующую функциональную разгрузку и деструкцию (перестройку) цитоскелетных структур, растяжение оказывает анаболический эффект и способствует поддержанию синтеза белка в m. soleus при вывешивании.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

При растяжении m. soleus на фоне разгрузки для поддержания массы мышцы, сохранения площади поперечного сечения мышечных волокон и содержания белка в ней не являются необходимыми инкорпорация ядер клеток-миосателлитов, наличие в мышечном волокне белка дистрофина или сохранение целостности цитоскелета волокна. Очевидно и то, что синтез белка в растянутой разгруженной постуральной мышце регулируется механизмами, не зависящими от активности протеинкиназы mTOR.

В результате проведенных исследований нам не удалось сформулировать четкой концепции, позволяющей объяснить механизмы предотвращения атрофии постуральной мышцы при пассивном растяжении на фоне гравитационной разгрузки. Однако, понятно, что механизмы поддержания массы разгруженной m. soleus при пассивном растяжении отличны от механизмов, обеспечивающих рост мышцы при рабочей гипертрофии.

Полученные данные позволяют предположить направления будущих исследований. По-видимому, следует рассмотреть функцию ERK-MAP-киназного каскада в синтезе белка при растяжении на фоне разгрузки. При этом среди внешних регуляторов синтеза белка при данном воздействии можно предположить участие иных сплайс-вариантов фактора роста IGF-1, в отличие от ранее известных, и измененного уровня (или, напротив, отсутствие изменений) IGF-1 в крови. При этом низкий уровень IGF-1 может вызывать снижение фосфорилирования Akt, перемещение в ядро фактора транскрипции атрогенов Foxo и стимулировать распад белка. Следует иметь в виду, что при растяжении на фоне разгрузки в m. soleus, возможно, происходит активация систем синтеза белка, не связанная с открытием механочувствительных каналов, которые, вероятно, являются сенсорами удельной силы и выполняют свою функцию при гипертрофии, а не при поддержании нормальных размеров мышечных волокон. Все вышеизложенное заставляет рассматривать другие системы регуляции массы m. soleus при растяжении на фоне гравитационной разгрузки.

ВЫВОДЫ

1. При моделируемой гравитационной разгрузке происходит уменьшение количества миоядер и клеток-миосателлитов в m. soleus крыс;

2. Пассивное растяжение на фоне разгрузки резко увеличивает пролиферативные процессы и число клеток - миосателлитов, экспрессирующих NCAM и M-кадгерин в камбаловидной мышце;

3. Растяжение на фоне вывешивания позволяет предотвратить снижение размеров волокон, содержания белка и числа миоядер в m. soleus крыс, происходящее при гравитационной разгрузке;

4. Поддержание массы m. soleus и площади поперечного сечения мышечных волокон на уровне контроля при растяжении на фоне разгрузки происходит и при дефиците делящихся клеток-миосателлитов, обусловленном облучением;

5. При пассивном растяжении на фоне вывешивания в m. soleus мышей линии mdx, дефектных по гену дистрофина, наблюдается поддержание массы и размеров волокон на уровне животных с нормальной двигательной активностью. Гипотеза о триггерной роли дистрофина в ростовых процессах при пассивном растяжении на фоне разгрузки не нашла своего подтверждения;

6. Пассивное растяжение на фоне блокирования протеинкиназы mTOR предотвращает атрофию m.soleus крыс при вывешивании, что указывает на ведущую роль в этом процессе иных механизмов, регулирующих синтез белка;

7. Профилактический эффект пассивного растяжения m. soleus крыс сохраняется после 7 суток разгрузки (и соответствующей некомпенсированной деструкции цитоскелета).

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1) Effects of gravitational unloading in soleus fibers of distrofin-deficient mice 35^th Eur. Muscle Conf. Heidelberg. Abstract. // J Muscle Res Cell Motil. - 2006. - V.27. - P.510 (coauthors E. Altaeva, I. Chistyakov, O. Turtikova, A. Malashenko, B. Shenkman)

2) Dystrophin in unloaded and strained slow muscle. Does it affect fiber atrophy and membrane permeability? Biochemistry of Exercise. -13^th International Conference. Abstract.- Seoul, South Korea. - 2006. - P.38. (coautors Shenkman B.S., Gasnikova N.M., Tarakina M.V., Altaeva E.G., Litvinova K.S.)

3) What signal mechanisms are involved in maintaining stretched muscle mass during gravitational unloading? Abstract of Rusian-British young scientists workshop. Yekaterinburg. - 2007. - P. 19

4) Предотвращение атрофии волокон разгруженной камбаловидной мышцы при растяжении не зависит от вклада клеток-предшественников. // Тезисы VI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики. - Москва. - 2007. - С.59 (соавт. Таракина М.В.)

5) Cellular mechanisms involved in the soleus fiber alterations during gravitational unloading 36^th Eur. Muscle Conf. Stockholm. Abstract. // J Muscle Res Cell Motil.- 2007.- V. 28. -- P. 472. (coauthors B. Shenkman, E. Altaeva, E. Kachaeva, M. Tarakina, E.Nikolsky, T. Nemirovskaya)

6) Muscle progenitor cells proliferation didn't sufficiently contribute to maintaining stretched soleus muscle mass during gravitational unloading.// Acta astronautica Special Issue: 16th IAA Humans in Space.- V.63 (7-10). - 2008. - P. 706-713. (coauth. M.V. Tarakina, T. L. Nemirovskaya, A.A. Kokontcev, B.S. Shenkman)

7) Muscle progenitor cell proliferation during passive stretch of unweighted soleus in dystrophin deficient mice. 28^th Annual International Gravitational Physiology Meeting. Abstract. San Antonio, TX.-2007. - P.166

8) Muscle progenitor cell proliferation during passive stretch of unweighted soleus in dystrophin deficient mice.// Journal of gravitational physiology.-2007.- V.14(1). - P.95-96. (coauth. E.G. Altaeva, M. V. Tarakina, A. M. Malashenko, T. L. Nemirovskaya1, B. S. Shenkman)

9) Исследование механизмов, ответственных за подержание массы растянутой камбаловидной мышцы крыс на фоне разгрузки. // Тезисы VI Конференции молодых ученых, специалистов и студентов, посвященной дню космонавтики. - Москва. - 2008. - С. 66. (соавт. Алтаева Э.Г.)

10) Роль клеток-предшественников в поддержании морфологических характеристик m. soleus крыс при пассивном растяжении мышцы на фоне гравитационной разгрузки. // Цитология. - 2008. - Т.50 (2). - С. 140-146. (соавт. Таракина М.В., Немировская Т.Л., Коконцев А.А., Шенкман Б.С.)

11) Клеточные эффекты функциональной разгрузки и пассивного напряжения m. soleus мышей, дефектных по дистрофину. // Цитология. 2008. ? Т.50 (2). ?С.132-139. (соавт. Алтаева Э.Г., Таракина М.В., Малашенко А.М., Немировская Т.Л., Шенкман Б.С.)

...