Влияние моделирования эффектов микрогравитации на цитоскелет и экспрессию генов у мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека in vitro

Рис.10. Влияние моделирования эффектов микрогравитации на относительный уровень экспрессии генов - маркеров остеогенного коммитирования ММСК.

А - Экспозиция ММСК в остеогенной среде на RPM в течение 10 сут. Б - Экспозиция ММСК в остеогенной среде на RPM в течение 20 сут. Уровень экспрессии генов в контрольной группе принят за единицу. (M±SD). * p< 0,01; ** p< 0,001.

Проведенные исследования позволили установить, что мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека, принадлежащие к компартменту клеток-предшественников взрослого организма, представляют собой клеточную популяцию, которая восприимчива к изменению гравитации, по крайней мере, в условиях in vitro. При моделировании эффектов микрогравитации с помощью одной из современных наземных моделей - dRPM, в культурах ММСК имеют место обратимые перестройки актинового цитоскелета и происходит изменение адгезивных свойств клеток, которое сопровождается перераспределением фокальных контактов, образованных винкулином, и активацией экспрессии некоторых поверхностных рецепторов адгезии, в частности б2-интегрина. На фоне выявленных морфофункциональных и физиологических ответных реакций в культурах ММСК наблюдается изменение уровня экспрессии генов структурных и регуляторных белков актинового цитоскелета (АСТА1, ACTG, RHOA, CFL) клеток, уже на самых ранних этапах экспозиции на RPM, начиная с 24 часов, которое достигает максимума после 48 часов. Тем не менее, эти изменения являются временными и частично нивелируются на более поздних этапах воздействия (120 часов), а также быстро возвращаются на исходный уровень при ре-адаптации клеток в статических условиях.

На более поздних этапах моделирования эффектов микрогравитации (120 часов), ответные реакции ММСК уже выражаются в изменении паттерна экспрессии генов - «маркеров стволовых клеток человека». В данном случае меняется экспрессия 54 генов, кодирующих целый спектр белков, вовлеченных в идентификацию, рост, самоподдержание и дифференцировку различных типов стволовых клеток человека. Моделирование эффектов микрогравитации приводит к активации или угнетению экспрессии разных генов, принимающих участие во внутриклеточной сигнализации, клеточной адгезии, регуляции пролиферации и дифференцировки клеток. И, наконец, коммитирование ММСК к остеогенезу в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации сопровождается подавлением экспрессии основных маркеров остеогенной дифференцировки клеток (ALPL, OMD), в том числе и ключевого мастер-транскрипционного фактора, контролирующего программу остеогенной дифференцировки ММСК - RUNX2.

Необходимость дальнейшего изучения влияния реальной микрогравитации на клетки-предшественники очевидна в связи выполняемой ими функцией тканевой репарации, особенно учитывая данные об ингибирующем влиянии моделирования эффектов микрогравитации на остеогенный потенциал культивируемых ММСК, что представляет интерес не только в фундаментальном, но также в практическом плане. Работы в этом направлении позволят расширить фундаментальные представления о механизмах гравитационной и механической чувствительности клеток-предшественников взрослого организма и их возможной вовлеченности в развитие локальных клеточных реакций, развивающихся в костной системе в условиях микрогравитации, что, в свою очередь, будет способствовать разработке новых подходов к лечению и средствам профилактики состояний, вызванных уменьшением гравитационной нагрузки на костную ткань.

ВЫВОДЫ

1) Моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM приводит к реорганизации актинового цитоскелета ММСК костного мозга человека (30 мин - 48 часов), которая является обратимой при более продолжительной экспозиции (120 часов) и при статической ре-адаптации в течение 24 часов, не оказывая влияния на организацию тубулинового цитоскелета.

2) На начальных этапах моделирования эффектов микрогравитации (24 - 48 часов) ухудшается способность ММСК к адгезии. При длительной экспозиции ММСК на RPM (120 часов) адгезия клеток восстанавливается, этот процесс сопровождается перинуклеарным перераспределением винкулиновых сайтов фокальной адгезии на фоне увеличения доли клеток, несущих рецептор адгезии - б2-интегрин и возрастания уровня экспрессии генов, вовлеченных в клеточную адгезию (CD44, NCAM-1, СDH1, CDH2).

3) Моделирование эффектов микрогравитации (24, 48, 120 часов) вызывает в ММСК транзиторное изменение уровня экспрессии генов, кодирующих белки актинового цитоскелета и ассоциированных с ним элементов (ACTA1, ACTG, RHOA, CFL1, VCL), которое частично компенсируется на конечных этапах (120 часов) и полностью при ре-адаптации клеток в статических условиях в течение 24 часов.

4) При моделировании эффектов микрогравитации происходит достоверное изменение паттерна экспрессии «маркеров стволовых клеток» в ММСК человека: после 120 часов экспозиции экспрессия 54 генов из 84 исследуемых достоверно изменяется не менее чем в 5 раз, при этом уровень экспрессии 30 генов, включающих регуляторы клеточной пролиферации, адгезии и внутриклеточной сигнализации повышается, а 24 генов, большинство из которых контролирует клеточную дифференцировку - снижается.

5) В условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации в культурах, индуцированных к остеогенной дифференцировке ММСК достоверно подавляется экспрессия генов-маркеров остеогенеза - RUNX2, OMD (10, 20 сут), ALPL (10 сут) и активируется экспрессия анти-остеогенного гена - PPARг (20 сут).

6) Обнаруженные структурные и молекулярно-генетические изменения свидетельствуют о наличии гравитационно-зависимых регуляторных механизмов, опосредующих как ранние, так и поздние ответные реакции клеток-предшественников на моделирование эффектов микрогравитации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Buravkova L.B. Simulated microgravity alters actin cytoskeleton and integrin-mediated focal adhesions of cultured human mesenchymal stromal cells. // Jornal of Gravitational Physiology. 2008. Vol.15. №.1 Р. 203-204.

2. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Цитоскелет и адгезия культивируемых стромальных клеток-предшественников костного мозга человека при моделировании эффектов микрогравитации. // Цитология. 2009. Том.51. №11. С. 896-904.

3. Гершович Ю.Г., Гершович П.М., Буравкова Л.Б. Влияние клиностатирования на культивируемые мезенхимальные стромальные клетки костного мозга человека. // Технологии живых систем. 2009. №2. С. 3-9.

4. Буравкова Л.Б., Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Григорьев А.И. Механизмы гравитационной чувствительности остеогенных клеток-предшественников. // ACTA NATURAE. 2010. Том. 2. №1 (4). С. 30-39.

5. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. Роль мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток костного мозга в адаптации клеток остеогенного дифферона к микрогравитации. // Российский физиологический журнал имени Сеченова. 2010. Том 96. №.4. С. 406-418.

Тезисы докладов:

6. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Буравкова Л.Б. // Влияние клиностатирования на актиновый цитоскелет и адгезию мезенхимальных стромальных клеток-предшественников in vitro. Тезисы докладов. 11я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 2007. С.7.

7. Гершович П.М., Гершович Ю.Г. // Применение метода ПЦР в реальном времени для оценки влияния 3D-клиностатирования на экспрессию некоторых генов цитоскелета мезенхимальных стромальных клеток-предшественников человека in vitro. Сборник тезисов. 7я Конференция молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённая дню Космонавтики. Москва. 2008. С. 16-17.

8. Гершович Ю.Г., Гершович П.М., Буравкова Л.Б. // Гравирецепция в культуре мезенхимальных клеток-предшественников. Тезисы докладов. 12я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 2008.С.172.

9. Гершович П.М. // Реорганизация актинового цитоскелета и уровень экспрессии цитоскелетных генов в условиях моделированной микрогравитации. Сборник тезисов. 8я Конференция молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённая дню Космонавтики. Москва. 2009. С. 16-17.

10. Гершович П.М., Гершович Ю.Г., Жамбалова А.П., Буравкова Л.Б. // Экспрессия генов стволовых маркеров в культуре костномозговых стромальных клеток человека в условиях моделированной микрогравитации. Тезисы докладов. 14я международная Пущинская школа-конференция молодых ученых «Биология-наука XXI века». 2010. С. 203.

11. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Buravkova L.B. // The effects of 3D-clinorotation on cytoskeleton structures of mesenchymal stem cells derived from human bone marrow. Book of abstracts. International symposium «Biological motility»: Achievements and Perspectives. Pushchino. Part 2. 2008. P.218.

12. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Buravkova L.B. // Simulated microgravity alters actin cytoskeleton and integrin-mediated focal adhesions of cultured human mesenchymal stromal cells. Book of abstracts. 29th Annual International Physiology Meeting. Angers. France. 2008. P.143-144.

13. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Buravkova L.B. // Simulated microgravity and the pattern of actin and associated proteins gene expression in cultured human mesenchymal stromal cells. Book of abstracts. 17th Humans in Space Symposium. Moscow. 2009. P. 46.

14. Gershovich P.M., Gershovich J.G., Buravkova L.B. // The role of cytoskeleton in functioning of cultured MSC during simulated microgravity. Book of abstracts. French-Russian-Belarusian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers. France. 2010.

Размещено на Allbest.ru